JP2018538007A - エクストリーム逆転写pcr - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、合衆国法典第35巻119条(e)に基づき、その全体の内容が参照により本明細書の一部をなすものである2015年11月5日付けで出願された米国仮出願第62/251,400号の利益を主張する。
特に他の指定がない限り、50mMのトリス(25℃でpH8.3)、3mMのMgCl2、200μMの各dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、500μg/mlの非アセチル化ウシ血清アルブミン(Sigma)、2%(v/v)グリセロール(Sigma)、50ngの精製ヒトゲノムDNA、および1×LCGreen(登録商標)プラス(BioFire Diagnostics)を含有する5μlの反応体積でPCRを行った。プライマー濃度およびポリメラーゼ濃度は、具体的な実験プロトコールに従って変更した。Klentaq1(商標)DNAポリメラーゼをAB Peptides、St.Louis、MOまたはワシントン大学(St.Louis)のWayne Barnesのいずれかから得た。KlenTaqの分子量は62.1kDであり、280nmにおける吸光係数は、配列から計算した場合、69,130M−1cm−1である(米国特許第5,436,149号)。質量分析法で、主たる分子量は62kDであることが確認され、変性ポリアクリルアミドゲルで、主要なバンドは合計で80%より高い純度を有することが示された。吸光度および純度を使用して濃度を計算したところ、10%グリセロール中、80μMのストックであることが示された。最終的なポリメラーゼ濃度は、典型的には0.25〜16μMであった。1μMのKlenTaqは、0.75U/μlに等しく、この場合の1ユニットは、活性化サケ精子DNAを用いて72℃で30分で合成された生成物10nmolと定義される。ユタ大学のコア施設でプライマーを合成し、脱塩し、濃度をA260によって決定した。各プライマーの最終濃度は、典型的には2.5〜20μMの間で様々であった。
この実施例では、インターロイキン10ベータ受容体中のA>Gバリアント(rs番号2834167)を間に挟む58bpのフラグメントを、プライマーCTACAGTGGGAGTCACCTGC(配列番号4)およびGGTACTGAGCTGTGAAAGTCAGGTT(配列番号5)を用いて増幅し、以下のアンプリコン:CTACAGTGGGAGTCACCTGCTTTTGCC(A/G)AAGGGAACCTGACTTTCACAGCTCAGTACC(配列番号6)を生成した。実施例1で説明したようにして、図1aに示される機器を使用してエクストリームPCRを行った。1μMのポリメラーゼ、10μMの各プライマー、および1.3%グリセロールを使用した(全プライマーに対するポリメラーゼのパーセンテージは5%)。ポリメラーゼがより高い伸長速度を有する場合、ポリメラーゼ伸長のために温度を70〜80℃に増加させるために、様々な位置決定プロトコールを使用した。アニーリング温度に達した後、モニターするために空気中で即座に位置決定する代わりに、伸長温度に達するまでサンプルを高温の水槽に移した。次いでサンプルを高温の水槽の真上の空気中に配置させて、図4aおよび4bに示した温度サイクルを生じさせることにより、70℃から77℃の間の最適な温度でより速いポリメラーゼ伸長を可能にした。3種の異なる遺伝子型をそれぞれ、0.97秒のサイクルを使用して39サイクルを38秒で完了させるエクストリームPCRによって増幅した。エクストリームPCRの後、LC24キャピラリーが適合するように改変されたHR−1機器で各遺伝子型の高解像度融解曲線を得た。図4cから明らかなように、3種の遺伝子型全てが予想通りに増幅され、区別された。
実施例1における反応混合物はエクストリームPCRおよび迅速サイクルPCRの両方で同じであるが、見たところ図3aで観察されるTmのシフトの原因と思われるポリメラーゼおよびプライマーの量、ならびにグリセロール濃度のわずかな差が認められた。この実施例およびこの先全ての実施例において、グリセロール濃度は、必要に応じてその濃度を均一化することにより2%に保持された。エクストリームPCRの場合、1μMのポリメラーゼおよび10μMの各プライマーを使用し、迅速サイクルPCRの場合、0.064μMのポリメラーゼおよび0.5μMの各プライマーを使用した。上記で論じられたように、より速いアニーリング時間は、プライマー特異性の向上をもたらすと考えられる。この特異性の向上に伴い、増加させたプライマー濃度を使用してもよく、それにより、プライマーの結合が促進されてアニーリング時間が短くなると考えられる。同様に、増加させたポリメラーゼ濃度によりアニールしたプライマーへの結合も促進されて、完全な伸長の前にポリメラーゼが離れた場合に、不完全なアンプリコンへの再結合も促進される。加えて、ポリメラーゼ濃度が高ければ高いほど、PCRの後半でさえもより大量のプライマーが結合したテンプレートが一度に伸長でき、1つのポリメラーゼが伸長させなければならないテンプレート数が少なくなるため、全体の伸長時間が短くなる。
熱の移動とサイクル速度を増加させるために、19ゲージの鋼の皮下注射針で8μMのポリメラーゼおよび20μMの各プライマーを用いて、実施例3におけるのと同じPCR標的を増幅した。全プライマーに対するポリメラーゼのパーセンテージは20%であった。図1bの機器で増幅を行ったところ、各0.46秒で35サイクル(図6a)、91℃から59〜63℃の間のサイクリングを使用して、16秒で増幅が完了した。サイクリング中の最大の加熱速度は407℃/秒であり、最大の冷却速度は815℃/秒であったことから、保持を行わずに400℃/秒より速い傾斜速度でPCRを実行できることが実証された。4%NuSieveの3:1アガロースゲルでの生成物分析により、正しいサイズの強い特異的なバンドが現れた(図6b)。テンプレート非含有対照は、49bpで生成物を示さなかったが、陽性サンプルに類似した顕著な量のプライマーバンドを示した。
プライマーCTCTGTGCTTTCTGTATCCTCAGAGTGGCATTCT(配列番号10)およびCGTCTGCTGGAGTGTGCCCAATGCTATA(配列番号11)、ならびにリアルタイム要素を用いない図1bの機器を使用して、NQO1遺伝子の102bpのフラグメントを増幅した。ポリメラーゼ濃度を0.25から4μMの間で変更し、各プライマー濃度を0.5から8μMの間で変更した。併合されたアニール/伸長期での伸長がポリメラーゼにとってより最適な温度で起こるように、より高温で(低出力で70秒)アニールするようにプライマーを設計した。これらの温度でのより速い重合速度は、より長い生成物の増幅を可能にすると期待された。より低温の水槽を72℃に制御して、アニール/伸長期の終了を温度ではなく時間(1秒)で誘発した。30サイクルの間の72℃から90℃の間のサイクリングには、1.93秒のサイクルを使用したところ58秒を要した(図7a)。図7aで観察されるように、サンプルの温度は、空気を通って高温の水槽まで移動する間にアニール/伸長温度から約3℃低くなる。図7bは、図5aに示されるように融解曲線を定量することによって得られた増幅した生成物の量を示す。融解曲線分析では、84℃のTmを有する唯一の生成物が示された。0.25μMのポリメラーゼまたは1μMの各プライマーでは極めてわずかな生成物しか観察されなかった。2μMの各プライマーでもある程度の増幅は起こり、最良の増幅は2〜4μMのポリメラーゼおよび8μMの各プライマーで起こる。2〜4μMのプライマー濃度では、ポリメラーゼ濃度が増加するにつれて収量は減少するが、これは8μMのプライマー濃度では観察されなかった。熱的サイクリングおよび標的長さが実施例3とは異なるが、プライマーの総濃度に対するポリメラーゼ濃度が、3.1から50%のときに最良の増幅が起こる。
図1bに示される機器をリアルタイムモニタリングしながら使用して、BBS2遺伝子の135bpおよび337bpのフラグメントをエクストリームPCRにより増幅した。エクストリームPCRに対する生成物の長さの影響と、様々なプライマーの起こり得る交絡的影響の調整を研究するために、まず共通の5’末端伸長部分を有するプライマーを使用してゲノムDNAからフラグメントを増幅した。135bpのフラグメントの場合、プライマーは、ACACACACACACACACACACACACACACACACACACAAAAATTCAGTGGCATTAAATACG(配列番号12)およびGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAAAAACCAGAGCTAAAGGGAAG(配列番号13)であった。337bpのフラグメントの場合、プライマーは、ACACACACACACACACACACACACACACACACACACAAAAAGCTGGTGTCTGCTATAGAACTGATT(配列番号14)およびGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAAAAAGTTGCCAGAGCTAAAGGGAAGG(配列番号15)であった。ゲノムDNAからの標準的なPCR増幅の後に、プライマーおよびdNTPをExoSAP−IT(Affymetrix、CA)によって分解し、続いてQuickStep(商標)2PCR精製キット(カタログ番号33617、Edge BioSystems、Gaithersburg、MD)を使用してPCR生成物を精製した。PCR生成物をおよそ100万倍に希釈し、標準的なリアルタイムPCRにより得られたCqを等しくすることにより等しい濃度に調節し、25サイクルのCq(反応液10μlあたりおよそ10,000コピー)を達成した。
実施例5のNQO1の102bpのフラグメントおよび実施例1のKCNE1の45bpのフラグメントに関して、ヒトゲノムDNAの希釈系列を使用して、NQO1には2μMのKlenTaqおよび8μMの各プライマー、ならびにKNCE1には8μMのKlenTaqおよび20μMの各プライマーを使用して、図1bのリアルタイム機器を使用してPCRの定量性能を評価した。図9aおよび図9bで見られるように、少なくとも40のダイナミックレンジを用いたところ、標準曲線から計算された増幅効率は、NQO1では95.8%であり、KCNE1では91.7%であった。テンプレート不使用の対照反応では、50サイクル後に増幅は起こらず、単一コピーの複製物(平均コピー数は、1反応あたり1.5コピー)は、増幅曲線の形状および強度においてより高い濃度と類似していた(図9Aおよび図9C)。0.15コピー/反応の平均コピー数では、二項展開により計算された0.13コピー/反応の期待値を用いたところ、(NQO1の試験とKCNE1の試験の両方を合わせた)17の反応のうち2つの反応が陽性であった。
リアルタイムPCRを使用する際、様々な生成物の長さに応じた伸長時間が必要である(図10a〜c)。様々なプライマーの起こり得る交絡的影響を調整するため、100〜500bpの合成テンプレートと共に以下の共通の高いTm(77℃)を有するプライマーを使用した。
ACTCGCACGAACTCACCGCACTCC(配列番号18)およびGCTCTCACTCGCACTCTCACGCACA(配列番号19)
100bpのテンプレート:
ACTCGCACGAACTCACCGCACTCCGGATGGATTGTGAAGAGGCCCAAGATACTGGTCATATTATCCTTTGATCTAGCTCTCACTCGCACTCTCACGCACA(配列番号20)
ACTCGCACGAACTCACCGCACTCCTCAATGCTGACAAATCGAAAGAATAGGAATAGCGTAATTACTAGAGGACTCCAATATAGTATATTACCCTGGTGACCGCCTGTACTGTAGGAACACTACCGCGGTTATATTGACAGCTTAGCAATCTACCCTGTTGGGATCTGTTTAAGTGGCTCTCACTCGCACTCTCACGCACA(配列番号21)
ACTCGCACGAACTCACCGCACTCCCCTTCGAATATAAAGTACGACATTACTAGCAATGACAGTTCCAGGATTTAAGAAAGTAGTGTTCCACATCAATGCATATCCAGTGAAAGCATAACGTCAAAAAAAGCCTGGCACCGTTCGCGATCTGGACTTACTTAGATTTGTTGTAGTCAAGCCGGCTATCAGCGATTTATCCCGGAAACACATACTAGTGAGTTATTTGTATGTTACCTAGAATAGCTGTCACGAATCACTAATACATTCACCCACCAGCTCTCACTCGCACTCTCACGCACA(配列番号22)
ACTCGCACGAACTCACCGCACTCCTGAATACAAGACGACAGTCCTGATTATATTTTCATTTAATTACGCCAATTTAATTATGATGAATATTAACGGAATTAAATATGTATTGATAAGTACTAAGTAATGGTTTACCCACGGCGATCTATATGCAAGGGAAACATTAACAAATTTAAACATCTGATGTGGACAAAACTTGTAATGTGGTATAGTTAAAAATATAGGTTTCAGGGACACGTAAGTATCTATCTTGAATGTTTAAGTAGGTCCTGTCTACCATTCTGAAATTTAGAAAATCGCGTTCATCGGGCTGTCGGCTACACCTCAGAAAACCATTTCGTGTTGCACAGGAGGAACTTTCGAGGGTTCGTATGAGCTCTCACTCGCACTCTCACGCACA(配列番号23)
ACTCGCACGAACTCACCGCACTCCACCGCTTGACGACGTAGGGTATTTGGTATCTGAATCTACTCATTTACCTACATACTGAAGATTTTGCGATCGTCTAATATATTGGACTAATGCCCGATTTCTGATCAATTACTCTAGGCGATACTTCATCGCTGGCCTTATTTGGATTTTGCTCAAGTGCTAAACTCTCTGCGCGTCAATACTAGTCTGACATCAGTCAAGACCTGCTATCTGAAAACTACTAGAGAGATATACCTAACAACTTTAGTGGATAAATCAGGTCTGGAGATTGTCATATAATGCCACTAGGGTCAGAAGGCTGTGTCAAAGTTAGTGGTTAGTAGGTCTCCGCTCTGCGGTACTATTCTTATATTCTCTTACTATGCATCAAACAAAATAGAATGCATAGACAAACCGCCTGCCAAGTTTACAAGATAACTTGCGTATAGGTTTATAAGGGTTCTTCTGTATCGCTCTCACTCGCACTCTCACGCACA(配列番号24)
必要な伸長時間=k2*(伸長の長さ)/([ポリメラーゼ]*(ポリメラーゼ速度))
エクストリームPCR時間は、高いMg++濃度を用いて短くすることもできる。プライマー:GCTTGGAAGATTGCTAAAATGATAGTCAGTG(配列番号25)およびTTGATCATACTGAGCCTGCTGCATAA(配列番号26)を用いてAKAP10の60bpのフラグメントを増幅し、アンプリコンGCTTGGAAGATTGCTAAAATGATAGTCAGTGAC(A/G)TTATGCAGCAGGCTCAGTATGATCAA(配列番号27)を生成した。
エクストリームPCRで使用される高濃度のプライマーおよびポリメラーゼは、より遅いサイクル速度で使用すると有害作用を有する場合がある。それぞれ32倍または106倍遅い迅速サイクルまたはブロックベースの機器では、非特異的生成物が生じた。図14a〜bは、実施例9で使用されたAKAP10の60bpの生成物の増幅を比較した結果を示すが、この場合、増幅は、20μMの各プライマー、8μMのKlenTaq、および10ngのヒトゲノムDNAを使用して、(1)およそ17秒の総時間をもたらす94℃で0.5秒および60℃で0.2秒の設定時間を用いたエクストリームPCR、(2)およそ9分の総時間をもたらす94℃で10秒の最初の変性、続いて0秒で85℃および0秒で60℃のサイクルの設定時間を使用した迅速サイクルPCR(Roche LightCycler)、および(3)およそ30分の総時間をもたらす94°で10秒の最初の変性、続いて85℃で0秒および60℃で5秒の温度サイクリングを用いた旧来の(ブロック)温度サイクリング(Bio−Rad CFX96)を40サイクルで使用して行われた。示されたように、LightCyclerの迅速サイクリングでさえもかなりの非特異的増幅を生じたが、エクストリームサイクリング条件では単一の融解ピークと、ゲルにおける最小の非特異的増幅が達成された。
PCRは、特異的なDNAフラグメントの検出および定量化のための調査および臨床診断における基本的な方法であるが、RNAは、PCRで直接増幅することができない。RNAは、まずDNAに逆転写しなければならない。典型的には、これは、「逆転写酵素」と呼ばれる酵素によって、酵素的になされる。酵素反応は時間を要し、逆転写に推奨される典型的な時間は、30〜50分である(例えば、Superscript II逆転写酵素、MAN0001342の製品説明書、報告日:2010年5月20日、Invitrogen/Life Technology/ThermoFisherを参照)。
RT−PCRの一貫性および品質は、特異的なタイプのRT酵素などの多くの事柄によって決まる(60)。RT−PCRには2つのタイプのRT酵素が一般的に使用され、1つはマウス白血病ウイルス(モロニーマウス白血病ウイルス−MMLV)由来であり、1つはトリウイルス(トリ骨髄芽球腫ウイルス−AMV)由来であるが、他のRT酵素も当分野において知られており、RNアーゼH活性がより低く(またはより高く)、温度安定性が増加したMMLVの操作されたバリアントが商業的に利用可能である。Bustin(60)は、数種の逆転写酵素を一貫性および収量に関して試験し、より優れた酵素の1つが、iScript(Bio−Rad)として販売されているMMLVであることを決定した。
RNAは、DNAより高度な二次構造を有し、強い二次構造がRTを阻害すると考えられる。温度を上昇させることは、RNAの逆転写がより簡単になるようにRNAの二次構造を緩める1つの方法である。しかし、一般的に使用されるRT酵素は熱不安定性であると考えられ、したがって逆転写酵素を不活性化することなく二次構造がフォールディングしないようにどの程度サンプルを加熱できるかにも限界がある。より短い反応時間が、いずれかのRNアーゼへの曝露時間を制限することと、化学分解を制限することの両方によって、PCRのために生成した核酸のより多くを保存することが期待されると予想される。
トレハロースは、RT酵素を熱安定化および熱活性化するのに使用されてきた糖であり、PCRのエンハンサーとして使用することができる(63)。0.6MのトレハロースありおよびなしのiScript MMLVの温度プロファイルを、2ステップRT−PCRで測定した。RNA源が5ng/μlで包含される複数の組織から得られたヒト参照全RNAサンプル(Stratagene)であり、逆転写のインキュベーションが42〜69℃の温度で20秒間であったことを除いて、条件は、実施例13と同じであった。キャピラリーを60秒かけて125ミリ秒で85℃の水槽に移動させることによる即時のRT不活性化を用いて、様々な温度で、水槽中のキャピラリーでRTを行った。次いでサンプルを希釈し、実施例12に記載したようにして、qPCRのためのキャピラリーLightCyclerに移動させた。テンプレートなしの対照は陰性であり、42℃で30分のRT運転によりサンプルを陽性対照と比較した。RTステップにおける55〜63℃で、トレハロースは保護的作用を有し、qPCRで測定したところ生成物の量が20〜40%増加した(図19a)。
実施例14で決定されたように、逆転写に0.6Mのトレハロースおよび56℃を使用して、1〜8μMのプライマー濃度を2ステップRT−PCRで研究した。56℃で20または60秒で、それ以外は実施例14の手順に従って、逆転写を行った。60秒のRTを用いたところ、プライマーが4μMまでは相対量が増加し、次いで4〜8μM間で横ばいになった(図20)。20秒のRTを用いたところ、プライマーが8μMまでは相対量が増加し続けたことから、より短い時間は、RTプライマーの濃度をより高くすることで補うことができることが示唆される。
上記の実験は、全RNAから特異的なmRNAの転写物を増幅した。RT−PCRの別のごく一般的な用途は、RNAウイルスの検出および定量化における用途である。例えば、HIVおよびHCVのためのウイルス負荷量アッセイは多くの需要があり、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)などの呼吸器ウイルスの検出である。
1秒未満に短くした逆転写インキュベーションを用いたRSVのRNAの1ステップRT−PCR増幅を行った。実施例16の場合と同様にして、5,000コピーのRSVのRNAを初期テンプレートを用いてRT−PCRを行った。全ての溶液を氷上で混合して、56℃で反応を開始させる前のいかなる逆転写も制限した。56℃でのRT時間は、20秒間から1秒未満まで様々であった。最短の期間は、「10ミリ秒」と標識され、これは、キャピラリーが静止しているときの56℃の水槽中の時間を示す。水槽へのおよび水槽からの移動を包含する時間および10ミリ秒の静止状態の保持は、サンプルを所定温度にするための56℃における十分な曝露ではなかった場合がある。驚くべきことに、全てのサンプルが、20、10、5、2、1秒、および「10ミリ秒」のRT時間で強い特異的なPCR生成物を示したが、NTC(テンプレートなしの対照)は陰性のままであった(図22)。図23に、5秒のRTステップでのリアルタイムのサンプルのモニタリングを示す。
さらに、RTに対するトレハロースおよびスクロースの作用を検査した。0.6Mのトレハロースありおよびなしの実施例17の、1、2、5および10秒のRTインキュベーションの条件を使用して、反応あたり5,000コピーのRSVのRNAおよび45サイクルの1ステップPCRを用いて試験した。図25に結果を示す。図25において、トレハロースのセットは左側であり、(左から右に)テンプレートなしの対照、ブランク、1、2、5、および10秒のインキュベーション、続いて同じ順番のトレハロースなしのセットである。ゲルは終点で採取されるが、トレハロースは最終的な収量を増加させると考えられる。トレハロースを、0.2、0.4および0.6Mスクロースのスクロースと比較したところ、融解分析によれば全てのサンプルがよく増幅し、0.4Mのスクロースが最大の収量をもたらしたことが示された(データは示さず)。スクロースは、トレハロースと同等に優れているかまたはそれより優れているようであり、これは、グルコースおよびフルクトースなどの他の糖も類似の作用を有し得ることを示唆している。他の安定剤も同様に使用される場合がある。
New England BiolabsからのAMV−RTは、クローニングされた天然のRTであり、通常、ジチオスレイトール(10〜250mM)などの還元剤、高いMg++濃度(8〜13mM)、および高いKCl(75mM)の存在下で42℃で使用される。製造元の緩衝液(反応液中の最終濃度)は、50mMのトリス、pH8.3、75mMの酢酸K、8mMの酢酸Mg、および10mMのDTTであった。この混合物に、ガラスキャピラリーチューブとの適合性のためにBSA(500μg/mlの反応液中の最終濃度)を補充した。この緩衝液を、最終的な反応液中に10mMのDTTおよび10mMのMg++(合計13mMのMg++)が補充された実施例11の迅速PCRのマスター溶液と比較した。2つの緩衝液間の主要な差は、迅速PCR混合物中にはK+が含まれないが、製造元の緩衝液には75mMのK+が包含されていることである。カリウムイオンの存在は、これまでにRT反応にとって重要であるとみなされている(64)。2ステップRT−PCR反応を行った。各緩衝液に、250コピー/μLのRSVのRNA、2.5U/μlのAMV−RT、および15μMのリバースRSVプライマーを添加し、RTを42℃で1秒、5秒、20秒、1分、または10分間行った。RT後、逆転写酵素を93℃で60秒間不活性化し、室温に冷却し、キャピラリーLightCyclerでのPCRのために1:10に希釈した。各10μlのPCRは、迅速PCRのマスター溶液中、0.5μMのRSVプライマーおよび2μlの1:10のcDNAを包含していた。94から55℃の間で45サイクル(保持なし)でサイクリングすることによりリアルタイムPCRを行った。次いでサンプルを、95℃での瞬時の変性によりLightCycler中で融解させ、60℃に冷却し、最終的に0.2℃で95℃に加熱することによって蛍光を獲得した。
NEBから入手した天然のMMLVを、Bio−Radから入手した遺伝子改変されたMMLVであるiScriptと比較した。iScriptの製造元は、iScriptは、より大きいRNアーゼH活性およびより大きい熱安定性を有すると主張している。RSVのRNAを含む実施例11の迅速PCRのマスター溶液および0.6Mのトレハロース中の56℃で5秒間のRTを使用した初期の研究から、iScript(10U/μl)を使用した場合、良好な特異的融解曲線が示されたが、天然のMMLV(2.5U/μl)では増幅しなかった。各酵素を4倍に増加した場合、類似の結果が見出された。最後に、20秒のRTステップを用いてRT温度を37、42、または47℃に低くした。結果は良好な増幅を示すiScriptと同じであったが、天然のMMLVは増幅を示さなかった。反応液にDTTまたはK+は全く含有されていなかった。
45サイクルのエクストリームPCRの後にゲルまたは融解分析によってPCR生成物を分析する場合(図21、22、24、および25)、ほとんどの定量的情報が失われる。その原因は、ゲルのバンドが逆転写(RT)の時系列後では等しく見えるとしても、PCR要素の濃度を制限することによってサンプル間のあらゆる定量的な差が均一化され得ることである可能性がある。定量結果に関して、リアルタイムPCRは、ゲルまたは融解分析よりかなり優れていることが多い。各リアルタイム曲線から誘導される定量サイクル(Cq)は、最初のテンプレート濃度のlogに反比例する。それゆえに、低いCqは、大量の最初のテンプレートを示し、これは逆転写では逆転写反応によって生成したcDNAの量と同等である。
クローニングされた天然型AMV(NEB)を希釈して、低いCq値によって決定された最適な濃度を決定した。製造元によるRT−PCRにおけるAMVの推奨濃度は、1.25U/μLである。しかし、初期の実験から、最適な濃度はそれより低いことが示された。1.25、0.63、0.31、0.156、0.078、および0.039U/μLのAMV濃度で反応を試験した。
MMLVを使用したエクストリーム1ステップRT−PCRを、RTステップに関する様々な温度(37、42、45、および48℃)および保持時間(2.5、5、10、20、40、および80秒)にわたり分析した。RT−PCRは、MgCl2濃度を7.4mMとし、1.25U/μLのMMLVを使用したことを除いて実施例21に従った。全体的に、Cqは、必ずではないが、RT時間が増加するにつれて減少した(図32)。さらに、MMLVにとって最適な温度を決定することはできなかった。
反応時間を低減するマグネシウムの触媒性の能力のために、MMLVとAMVの両方を用いてMgCl2濃度を研究した。上述したように(実施例21および22)RSVを用いて1ステップRT−PCRを行った。全てのサンプルを、45℃で2秒(AMV)または2および5秒(MMLV)のRT保持で処理し、続いて即座に33サイクルのPCR増幅によって処理した。
先の実施例で決定されたAMVおよびMMLVの反応条件下で、1ステップRT−PCRに必要な最小の臨界的なRT保持の再確立を行った。RT−PCR反応の大多数をAMVおよびMMLVのために最適化して、Cqに対するRT保持時間の作用を再度分析した。両方の逆転写酵素反応を、45℃のRT温度および95℃から55℃の間の33回のサイクリングで行った。
プライマーおよびポリメラーゼ濃度を増加させたエクストリーム条件下での1ステップRT−PCRの感受性は、低い特異性のために限定される場合がある。標的に応じて、テンプレートなしの対照の明白な増幅が観察される場合があり、テンプレートなしの対照と低コピー数の陽性サンプルとの間のCqの差はわずかである。さらに、このような反応で生成したプライマー二量体は、特異的な生成物融解温度でまたはその近傍で融解する場合があるため、プライマー二量体を望ましい生成物と区別しにくくしている。これらの作用を軽減するために、ホットスタート技術が考慮された。熱活性化されたポリメラーゼ、プライマー、およびdNTPは商業的に入手可能であるが、いずれも活性化するのに、エクストリームRT−PCRに必要な時間より長い数分を要し、このようなホットスタート技術は、方法の価値の多くを低減する場合がある。またポリメラーゼに対する抗体も入手可能であるが、エクストリームPCRの場合のようにポリメラーゼ濃度を10〜20倍に増加させる場合、抗体の必要量およびコストがどちらも高い。別の選択肢は、例えばFilmArray(BioFire Diagnostics 、LLC)などの混合中に溶液を高温で保持する機器内で要素を混合することである。高温は、反応開始前にプライマー結合を低減したりまたは無くしたりするが、これは、特殊化した機器を必要とし、このような機器は多くの用途にとって必要でない可能性がある。
RT温度のRT−PCRへの作用を、2秒のRTを使用した氷結技術により研究した。実施例26の実験3で概説した手順をジカプライマーを使用して行い、陽性(5μLのRT−PCRあたり1250コピー)およびテンプレートなしの対照の両方を30から90℃のRT温度の範囲にわたり分析した。Cq値は、4〜8サイクルのΔCqで60℃の温度範囲にわたり極めて一定であった(図43)。エクストリームRT−PCR条件を使用したMMLVの場合、50〜60℃が最適であった。氷結技術を使用しても、なお向上の余地がある。陽性対照とテンプレートなしの対照との間のより大きいΔCqが、感受性をさらに改善すると予想される。
エクストリームRT−PCRにおけるテンプレートなしの対照の「プライマー二量体」増幅を減少させるための手段として、アプタマーを調査した。アプタマーはこれまで、DNAを標的とするDNAポリメラーゼ(69〜70)およびRNAを標的とするDNAポリメラーゼ(71)の両方に特異的に重合反応を阻害するのに過去に使用されてきた。アプタマーは、インビトロでの進化的選択によって誘導される。本明細書において研究されたアプタマーの塩基配列は、以下に列挙した通りである(5’−3’):
Taqアプタマー配列(70):
6−10:CAAGACGGGCGGGTGTGGTAGGCGCCCGTG(配列番号34)
4−1:ACTTGATGGCGGGTGTGGTAGGCGCCATCT(配列番号35)
Stoffel(KlenTaq)アプタマー配列(69):
Trnc.A−30:AAGACCAGACAATGTACAGTATTGGCCTGA(配列番号36)
Trnc.2−30:GCCGGCCAATGTACAGTATTGGCCGGC(配列番号37)
Tctw.A−30:CCGGACAATGTACAGTATTGGCCCGG(配列番号38)
MuLVアプタマー配列(71):
dm.1.1:UUACCACGCGCUCUUAACUGCUAGCGCCAUGGC(配列番号39)
m.1.1:CUUACCACGCGCUCUUAACUGCUAGCGCCAUGGCCAAAACU(配列番号40)。
Claims (48)
- 増幅中の生体サンプル中の標的RNAを増幅する方法であって、
前記生体サンプル、逆転写酵素、熱安定性ポリメラーゼ、および前記生体サンプル中の前記標的RNAを増幅するように構成されたプライマーを含む反応混合物を提供するステップと、ここで、前記ポリメラーゼが少なくとも0.5μMの濃度で提供され、かつ、プライマーがそれぞれ少なくとも2μMの濃度で提供され、
5分以下の逆転写時間にわたりインキュベートすることによって前記RNAをDNAに逆転写するステップと、
エクストリーム温度サイクリングプロファイルを使用して、複数の増幅サイクルにわたり少なくとも変性温度と伸長温度との間で前記生体サンプルを熱的にサイクリングすることによるポリメラーゼ連鎖反応によって、前記DNAを増幅するステップと、ここで、各サイクルが1サイクルあたり20秒未満のサイクル時間で完了する、
を含む方法。 - 前記逆転写時間が、1分以下である、請求項1に記載の方法。
- 前記逆転写時間が、16秒以下である、請求項2に記載の方法。
- 前記逆転写時間が、8秒以下である、請求項2に記載の方法。
- 前記逆転写時間が、4秒以下である、請求項2に記載の方法。
- 前記逆転写時間が、2秒以下である、請求項2に記載の方法。
- 前記生体サンプルに糖もさらに添加される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記糖が、少なくとも0.2Mのトレハロースである、請求項7に記載の方法。
- 前記逆転写するステップが、54℃から62℃の間の温度で起こる、請求項1から8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記逆転写するステップが、56℃の温度で起こる、請求項9に記載の方法。
- 前記プライマーがそれぞれ、少なくとも4μMの濃度で提供される、請求項1に記載の方法。
- 前記プライマーがそれぞれ、少なくとも6μMの濃度で提供される、請求項1に記載の方法。
- 前記増幅するステップが、前記逆転写するステップと同じ反応混合物中で起こる、請求項1に記載の方法。
- 前記反応混合物が、10mM以下のKCl濃度を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記反応混合物が、カリウムを実質的に含まない、請求項1に記載の方法。
- 前記反応混合物が、還元剤をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記逆転写酵素が、約1.0から約50U/μlで提供されるMMLVである、請求項1に記載の方法。
- 前記転写酵素が、4.0ユニット/μL以下の濃度で提供されるMMLVである、請求項1に記載の方法。
- 前記逆転写酵素が、約0.1から約10U/μlで提供されるAMVである、請求項1に記載の方法。
- 前記逆転写酵素が、0.8ユニット/μL以下の濃度で提供されるAMVである、請求項1に記載の方法。
- 前記増幅するステップが、前記サイクル時間に前記サイクルの回数をかけた値に等しい増幅時間を有し、
前記方法が、前記逆転写時間と前記増幅時間との合計に等しい全体時間を有し、
前記逆転写時間が、前記全体時間の50%以下である、請求項1に記載の方法。 - 前記逆転写時間が、前記全体時間の20%以下である、請求項21に記載の方法。
- 前記逆転写時間が、前記全体時間の10%以下である、請求項21に記載の方法。
- 前記反応混合物が、6〜12mMの間のMgCl2を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記反応混合物の第1の部分が凍結された状態で提供され、前記反応混合物の第2の部分が冷却された状態で提供され、前記逆転写するステップの前に前記第1の部分および前記第2の部分を混合するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第2の部分中に、dNTPおよびMgCl2が提供される、請求項25に記載の方法。
- 前記反応混合物の第1の部分が、第1のプライマーと共に提供され、前記反応混合物の第2の部分が、第2のプライマーと共に提供され、前記逆転写するステップの前に前記第1の部分および前記第2の部分を混合するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の部分または前記第2の部分の少なくとも一方が、混合前に遠心分離される、請求項25〜27のいずれか1項に記載の方法。
- 前記混合するステップが完了して1秒以内に、前記逆転写するステップが始まる、請求項28に記載の方法。
- 前記第1の部分および前記第2の部分の一方が、前記逆転写酵素を含み、前記第1の部分および前記第2の部分の他方が、前記熱安定性ポリメラーゼを含む、請求項25〜27のいずれか1項に記載の方法。
- 前記反応混合物が、アプタマーをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記アプタマーが、少なくとも1μMの濃度で提供される、請求項31に記載の方法。
- 前記アプタマーが、RNAアプタマーである、請求項31に記載の方法。
- 前記アプタマーが、RNAアプタマーおよびDNAアプタマーの混合物である、請求項31に記載の方法。
- 前記アプタマーが、3’−ブロッカーで修飾されている、請求項31に記載の方法。
- 前記3’−ブロッカーが、C6−アミノ末端修飾剤である、請求項35に記載の方法。
- 前記3’−ブロッカーが、正電荷を有する、請求項35に記載の方法。
- 前記アプタマーが、安定化されたヘアピンループを有する、請求項31に記載の方法。
- RNAに対してRT−PCRを行うためのキットであって、
dNTPと、
逆転写酵素と、
少なくとも0.5μMの濃度で提供されるポリメラーゼと、
少なくとも2μMの濃度でそれぞれ提供される、標的核酸を増幅するように構成された一対のプライマーと
を含むキット。 - 糖をさらに含む、請求項39に記載のキット。
- 前記糖が、トレハロースおよびスクロースからなる群から選択される、請求項40に記載のキット。
- 前記糖が、0.6Mで提供される、請求項40に記載のキット。
- 前記糖が、0.2Mで提供される、請求項40に記載のキット。
- 還元剤をさらに含む、請求項39に記載のキット。
- 前記dNTP、前記逆転写酵素、前記ポリメラーゼ、および前記一対のプライマーが、カリウムを実質的に含まない混合物中に提供される、請求項39に記載のキット。
- RNAに対してRT−PCRを行うための反応混合物であって、
dNTPと、
逆転写酵素と、
少なくとも0.5μMの濃度で提供されるポリメラーゼと、
少なくとも2μMの濃度でそれぞれ提供される、標的核酸を増幅するように構成された一対のプライマーと
を含む反応混合物。 - 10mM以下のKCl濃度を有する、請求項46に記載の反応混合物。
- カリウムを実質的に含まない、請求項47に記載の反応混合物。
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