JP2008253263A - 急速ワンステップrt−pcr - Google Patents
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Abstract
【解決手段】a)標的RNAを含むとされる試料を提供する工程
b)該標的RNAをcDNAに逆転写するためおよび該cDNAの少なくとも一部を増幅するために必要な全ての試薬を含む反応混合物を添加する工程
c)20℃〜65℃の温度で0秒〜40秒の時間間隔の間、該試料をインキュベートする工程
d)該試料の温度が、少なくとも90℃〜100℃の第1の温度と50℃〜75℃の第2の温度との間で変化する、複数サイクルの熱サイクリングプロトコールに供する工程
を含む、標的RNAを増幅するためのワンステップRT−PCRを実施する方法。
【選択図】なし
Description
本発明は、生じたcDNAの量を定量するために逆転写酵素反応および続くポリメラーゼ連鎖反応を実施することによってmRNA発現を分析する分野に関する。より具体的に、本発明は、このような逆転写酵素反応のための時間が最小化されることを特徴とするワンステップRT-PCRを実施する改善された方法に関する。
70年代の逆転写酵素の発見は、DNAからRNAを介したタンパク質への一方向プロセスとしての情報伝達について分子生物学の「セントラルドクマ」の反証を挙げた(非特許文献1;非特許文献2)。これらのRNA依存性DNAポリメラーゼの酵素の性格付けは、現在の理解について、RNAウイルスの増幅サイクルに対する基礎であり、従ってこの型のウイルスによって引き起こされる疾患(癌、AIDS等)の発症および蔓延に対する基礎でもある。
〔1〕a)標的RNAを含むとされる試料を提供する工程
b)該標的RNAをcDNAに逆転写するためおよび該cDNAの少なくとも一部を増幅するために必要な全ての試薬を含む反応混合物を添加する工程
c)20℃〜65℃の温度で0秒〜40秒の時間間隔の間、該試料をインキュベートする工程
d)該試料の温度が、少なくとも90℃〜100℃の第1の温度と50℃〜75℃の第2の温度との間で変化する、複数サイクルの熱サイクリングプロトコールに供する工程
を含む、標的RNAを増幅するためのワンステップRT−PCRを実施する方法。
〔2〕前記工程c)の時間間隔が20秒未満であることを特徴とする〔1〕記載の方法。
〔3〕前記時間間隔が0秒であることを特徴とする〔2〕記載の方法。
〔4〕工程c)の温度が、37℃〜55℃であることを特徴とする〔1〕〜〔3〕いずれか記載の方法。
〔5〕前記ワンステップRT−PCR反応が、DNA依存性ポリメラーゼ活性および逆転写酵素活性を含む熱安定性ポリメラーゼによって触媒されることを特徴とする、〔1〕〜〔4〕いずれか記載の方法。
〔6〕前記ポリメラーゼがサーマスサーモフィラスから得られ得ることを特徴とする〔5〕記載の方法。
〔7〕前記ワンステップRT−PCR反応が、少なくともDNA依存性ポリメラーゼ活性を含む熱安定性ポリメラーゼおよび逆転写酵素の混合物によって触媒されることを特徴とする、〔1〕〜〔4〕いずれか記載の方法。
〔8〕前記cDNAの前記一部が0.2kbより短いことを特徴とする〔1〕〜〔7〕いずれか記載の方法。
〔9〕前記ワンステップRT−PCR反応の進行がリアルタイムでモニターされることを特徴とする〔1〕〜〔8〕いずれか記載の方法
に関する。
上記の先行技術を考慮して、逆転写酵素工程が非常に短い時間間隔に短縮され得るか、あるいはプレインキュベーションさえも完全に省略され得ることは非常に驚きであった。したがって、本発明は、
a) 標的RNAを含むとされる試料を提供する工程
b) 前記標的RNAをcDNAに逆転写するためおよび前記cDNAの少なくとも一部を増幅するために必要な全ての試薬を含む反応混合物を添加する工程
c) 20℃〜65℃の温度で0秒〜40秒の時間間隔の間、前記試料をインキュベートする工程
d) 前記試料の温度が少なくとも90℃〜100℃の第一の温度と50℃〜75℃の第二の温度の間で変化する、複数サイクルの熱サイクリングプロトコールに前記試料を供する工程
を含む、標的RNAを増幅するためのワンステップRT-PCRを実施する方法に関する。
本発明はワンステップRT-PCR反応を実施するための改善された方法を提供する。改善は、ワンステップRT-PCRの逆転写酵素反応が、PCR熱サイクリングプロトコールの第一サイクル中の変性のための温度上昇と共に、適切な温度での非常に短い時間間隔のフリーインキュベーションの後に完了されるという驚くべき事実に基づく。より正確に、本発明は、
a)標的RNAを含むとされる試料を提供する工程
b)前記標的RNAを一本鎖cDNAに逆転写するためおよび前記一本鎖cDNAの少なくとも一部を増幅するために必要な全ての試薬を含む反応混合物を添加する工程
c)20℃〜65℃の温度で0秒〜40秒の時間間隔の間、前記試料をインキュベートする工程
d)前記試料の温度が少なくとも90℃〜100℃の第一の温度と50℃〜75℃の第二の温度の間で変化することを特徴とする、複数サイクルの熱サイクリングプロトコールに前記試料を供する工程
を含む、標的RNAを増幅するためのワンステップRT-PCRを実施する方法に関する。
- 1秒あたり10℃以下(好ましくは1秒あたり5℃以下)の温度移行速度で90℃〜100℃の温度に試料の温度を上昇する工程
- 50℃〜75℃の第二の温度に前記試料の温度を低下する工程
を含むように定義され得る。
a)標的RNAを含むとされる試料を提供する工程
b)該標的RNAをcDNAに逆転写するためおよび該cDNAの少なくとも一部を増幅するために必要な全ての試薬を含む反応混合物を添加する工程であって、該反応混合物がサーマスサーモフィラスDNAポリメラーゼを含む、工程
c)該試料を、5秒以下の時間37℃〜65℃の温度でインキュベーションする工程
d)該試料を複数サイクルの熱サイクリングプロトコールに供する工程であって、該サイクルの温度が、少なくとも90℃〜100℃の第1の温度と50℃〜75℃の第2の温度との間で変化する、工程
を含む。
一本鎖ハイブリダイゼーションプローブは、2つの構成要素で標識される。第1の構成要素が適切な波長の光で励起される場合、吸収されたエネルギーは、蛍光共鳴エネルギー移動の原理に従って、第2の構成要素、いわゆるクエンチャーに移される。PCR反応のアニーリング工程の間、ハイブリダイゼーションプローブは、標的DNAに結合し、続く伸長反応の間、Taqポリメラーゼの5’−3’エキソヌクレアーゼ活性によって分解される。励起された蛍光構成要素とクエンチャーが互いに空間的に分離された結果、第1の構成要素の蛍光放出が測定され得る。TaqManプローブアッセイは、US 5,210,015、US 5,538,848、およびUS 5,487,972に詳細に開示される。TaqManハイブリダイゼーションプローブおよび試薬混合物は、US 5,804,375に開示される。
これらのハイブリダイゼーションプローブはまた、第1の構成要素およびクエンチャーで標識され、この標識は、好ましくは、プローブの両端に位置する。プローブの二次構造の結果として、両構成要素は、溶液中で空間的に近位にある。標的核酸へのハイブリダイゼーションの後、両構成要素は、互いから分離され、その結果、適切な波長の光での励起の後、第1の構成要素の蛍光放出が測定され得る(US 5,118,801)。
FRETハイブリダイゼーションプローブ試験フォーマットは、全ての種類の相同ハイブリダイゼーションアッセイに特に有用である(Matthews, J.A., and Kricka, L.J., Analytical Biochemistry 169 (1988) 1-25)。これは、同時に使用され、増幅された標的核酸の同じ鎖の近接部位に相補的である2つの一本鎖ハイブリダイゼーションプローブを特徴とする。両方のプローブは、異なる蛍光構成要素で標識される。適切な波長の光で励起される場合、第1の構成要素は、蛍光共鳴エネルギー移動の原理に従って、第2の構成要素に吸収したエネルギーを移動し、その結果、両方のハイブリダイゼーションプローブが検出される標的分子の近接位置に結合する場合、第2の構成要素の蛍光放出が測定され得る。FRET受容体構成要素の蛍光の増加をモニタリングする代わりに、ハイブリダイゼーション事象の定量的測定として、FRET供与体構成要素の蛍光減少をモニターすることも可能である。
増幅産物が二本鎖核酸結合部分を使用して検出される場合、本発明に従う添加物の存在下でリアルタイムPCRが実施されるかどうかもまた、本発明の範囲内である。例えば、各々の増幅産物はまた、適切な波長の光での励起の後、二本鎖核酸との相互作用の際に対応する蛍光シグナルを放出する蛍光DNA結合色素によって、本発明に従って検出され得る。色素SybrGreenIおよびSybrGold(Molecular Probes)は、本願に特に適切であることが証明された。インターカレーティング色素は、代替的に使用され得る。しかし、異なる増幅産物を区別するために、このフォーマットについて、各々の融解曲線分析を実施することが必要である(US 6,174,670)。
リアルタイムワンステップRT−PCR反応のために、ABCC2 RNA(GenBank アクセッション番号: U63970)を、増幅標的として選択した。順方向プライマーの配列は、位置2728〜2748に位置し、逆方向プライマーの配列は、位置2788〜2807に位置する。検出を、TaqMan加水分解プローブ原理に従って実施した(US 5,804,375)。ABCC2 RNAの位置2750〜2780に由来するプローブを、5’末端をFAMで3’末端をTAMRAで標識した(Langmann, T., et al., Clinical Chemistry 49 (2003) 230-238)。
100pgまたは10pgのヒト肝臓細胞由来の全RNA、
7.4μlのRNA Master、
3.25mMの酢酸マンガン、
0.5μMの各プライマー、
0.25μMの加水分解プローブ。
逆転写を、Lightcycler 480 (Roche Applied Science Catalog No. 04 640268001)で、25℃で0分、5分、10分および20分実施した。PCRを、95℃で30秒の初期変性ならびに95℃15秒および60℃60秒の45サイクルで実施した。全ての加熱速度は、4.8℃/sであるのに対し、全ての冷却速度は、2.5℃/sであった。増幅をリアルタイムでモニターした。結果を、図1〜4および以下の表1に示す。
プレインキュベーション工程を、63℃で0秒、3秒、10秒または3分で実施したことを除いて、実施例1に従う完全な実験を実施した。結果を、図5〜8および以下の表2に示す。
(i)Tthポリメラーゼの代わりに1反応あたり0.6U AMV逆転写酵素と0.4U Taq DNAポリメラーゼの混合物を使用し、(ii)プレインキュベーション工程を、55℃で30秒、50秒、または10分実施し、(iii)使用したRNAが10pg、100pg、または1ngであった以外は、実施例1に従って、完全な実験を実施した。結果を以下の表3に示す。
熱サイクリングプロトコールの前のプレインキュベーションに種々の時間および温度を使用してABCC2 RNAを増幅するためのリアルタイムRT PCR。各図の左の2つの曲線は、いつも100pg mRNAの試料に対応する。各図の右の2つの曲線は、いつも10pg mRNAの試料に対応する。
Claims (9)
- a)標的RNAを含むとされる試料を提供する工程
b)該標的RNAをcDNAに逆転写するためおよび該cDNAの少なくとも一部を増幅するために必要な全ての試薬を含む反応混合物を添加する工程
c)20℃〜65℃の温度で0秒〜40秒の時間間隔の間、該試料をインキュベートする工程
d)該試料の温度が、少なくとも90℃〜100℃の第1の温度と50℃〜75℃の第2の温度との間で変化する、複数サイクルの熱サイクリングプロトコールに供する工程
を含む、標的RNAを増幅するためのワンステップRT−PCRを実施する方法。 - 前記工程c)の時間間隔が20秒未満であることを特徴とする請求項1記載の方法。
- 前記時間間隔が0秒であることを特徴とする請求項2記載の方法。
- 工程c)の温度が、37℃〜55℃であることを特徴とする請求項1〜3いずれか記載の方法。
- 前記ワンステップRT−PCR反応が、DNA依存性ポリメラーゼ活性および逆転写酵素活性を含む熱安定性ポリメラーゼによって触媒されることを特徴とする、請求項1〜4いずれか記載の方法。
- 前記ポリメラーゼがサーマスサーモフィラスから得られ得ることを特徴とする請求項5記載の方法。
- 前記ワンステップRT−PCR反応が、少なくともDNA依存性ポリメラーゼ活性を含む熱安定性ポリメラーゼおよび逆転写酵素の混合物によって触媒されることを特徴とする、請求項1〜4いずれか記載の方法。
- 前記cDNAの前記一部が0.2kbより短いことを特徴とする請求項1〜7いずれか記載の方法。
- 前記ワンステップRT−PCR反応の進行がリアルタイムでモニターされることを特徴とする請求項1〜8いずれか記載の方法。
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