JP7032818B2 - エクストリームpcr - Google Patents
エクストリームpcr Download PDFInfo
- Publication number
- JP7032818B2 JP7032818B2 JP2020069158A JP2020069158A JP7032818B2 JP 7032818 B2 JP7032818 B2 JP 7032818B2 JP 2020069158 A JP2020069158 A JP 2020069158A JP 2020069158 A JP2020069158 A JP 2020069158A JP 7032818 B2 JP7032818 B2 JP 7032818B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- pcr
- polymerase
- concentration
- temperature
- cycle
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L7/00—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices
- B01L7/02—Water baths; Sand baths; Air baths
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L7/00—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices
- B01L7/52—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices with provision for submitting samples to a predetermined sequence of different temperatures, e.g. for treating nucleic acid samples
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L7/00—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices
- B01L7/52—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices with provision for submitting samples to a predetermined sequence of different temperatures, e.g. for treating nucleic acid samples
- B01L7/525—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices with provision for submitting samples to a predetermined sequence of different temperatures, e.g. for treating nucleic acid samples with physical movement of samples between temperature zones
- B01L7/5255—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices with provision for submitting samples to a predetermined sequence of different temperatures, e.g. for treating nucleic acid samples with physical movement of samples between temperature zones by moving sample containers
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
- B01L2200/06—Fluid handling related problems
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2300/00—Additional constructional details
- B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
- B01L2300/0627—Sensor or part of a sensor is integrated
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2300/00—Additional constructional details
- B01L2300/18—Means for temperature control
- B01L2300/1894—Cooling means; Cryo cooling
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
- B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
- B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
- B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Clinical Laboratory Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Crystals, And After-Treatments Of Crystals (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Apparatus For Radiation Diagnosis (AREA)
- Prostheses (AREA)
- Management, Administration, Business Operations System, And Electronic Commerce (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
Description
る。その名称は、その主要な構成要素の1つである、インビトロでの酵素的複製によって
DNA断片を増幅するのに使用されるDNAポリメラーゼに由来する。PCRが進行する
につれて、生成したDNA(アンプリコン)はそれ自身、複製のためのテンプレートとし
て使用される。それにより連鎖反応が始まり、DNAテンプレートが指数関数的に増幅す
る。PCRを用いれば、DNA断片の単一のコピーまたは少数のコピーを数桁を越えて増
幅して、数百万またはそれより多くのDNA断片のコピーを生成することが可能になる。
PCRは、熱安定性ポリメラーゼ、dNTP、および一対のプライマーを用いる。
期間起こると考えられる。このようなPCRの「平衡パラダイム」は、サイクルごとに3
つの温度で3つの期間にわたり起こる3つの反応(変性、アニーリング、および伸長)に
よって容易に理解される。しかし、この平衡パラダイムは、物理学的な実態とはあまりよ
く合致しない。即時の温度変化が起こらない、すなわちサンプルの温度を変化させるには
時間がかかる。さらに、個々の反応速度が温度に応じて変動し、一度プライマーのアニー
リングが起これば、それに続いてポリメラーゼ伸長が即座に起こる。特に迅速PCR(r
apid PCR)の場合、反応速度と温度が常に変化するという動力学的パラダイムが
より正確である。生成物が変性しプライマーがアニールしさえすれば、PCR中に温度を
一定に保つことは必ずしも必要ではない。PCRの動力学的パラダイムのもとでは、生成
物の変性、プライマーのアニーリング、およびポリメラーゼ伸長は、一時的に重複し、そ
れらの速度は温度に応じて連続的に変動する場合がある。平衡パラダイムのもとでは、サ
イクルは、それぞれ所定期間保持される3つの温度によって定義されるが、それに対して
動力学的パラダイムは、遷移速度と標的温度を必要とする。図15a~15bに、平衡パ
ラダイムと動力学的パラダイムの例示的な時間/温度プロファイルを示す。しかし、これ
らの温度プロファイルは単に例示的なものであって、いくつかのPCRの実行においては
、必要な温度が2つだけになるようにアニーリング工程と伸長工程とが一緒になっている
ことが理解される。
っている。平衡パラダイムは理解が簡単であり、工学的な見方および機器製造に向いてい
る。動力学的パラダイムは、生化学、迅速サイクルPCR、および融解曲線分析により大
きく関連する。
プロトコールは、変性は94℃で1分、アニーリングは55℃で2分、および伸長は72
℃で3分であった。温度間の遷移時間が含まれる場合、8分のサイクルが典型的であり、
その結果、30サイクルが完了するのに4時間を要した。サイクル時間の25パーセント
が温度遷移に費やされていた。サイクル速度が増加するにつれて、温度遷移に費やされる
時間の比率も増加することから、動力学的パラダイムがますます重要となっていった。迅
速サイクルPCR中、通常、温度は変化している。短い生成物(<100bp)の迅速サ
イクルPCRの場合、時間の100%が温度遷移に費やされる場合があり、保持時間は必
要ではない。より長い生成物の迅速サイクルPCRの場合、温度を最適な伸長温度で保持
することを含む場合がある。
PCRは、4時間と比べれば迅速であるが、15分と比べると遅い。さらに、より高いテ
ンプレート濃度で開始したり、またはより少ないサイクルを使用したりすれば、PCRプ
ロトコールをより短くできる。より具体的な尺度は、各サイクルに必要な時間である。し
たがって、1994年に、「迅速サイクルPCR」(または「迅速サイクリング」)は、
10~30分で完了する30サイクルと定義され(1)、この場合、それぞれのサイクル
は20~60秒になる。これらの各段階間で温度に傾斜をつけるのに時間を要するため、
この各サイクルの実際の時間は、多くの場合、変性、アニーリング、および伸長に関して
プログラムされた時間の合計よりも長い。1990年代初頭における初期の研究で、温度
制御にキャピラリーチューブと熱風を使用した迅速サイクリングの実行可能性が確立され
た。長年かけて、システムはより速くなり、変性、アニーリング、および伸長の動力学的
な必要条件がより明確になってきた。
素およびファン、熱電対、ならびにキャピラリーチューブ中のPCRサンプルが同梱され
ていた(2)。ファンは、熱電対およびキャピラリーを通過する加熱空気の迅速フローを
生じさせた。熱電対の熱的応答をサンプルと合致させることにより、温度が変化している
間でさえも熱電対の温度を厳密にサンプルの温度に合わせて変化させた。空気の熱伝導率
は低いが、キャピラリーによって晒された大きい表面積に対して空気を迅速に移動させる
ことは、変性、アニーリング、および伸長温度間でサンプルをサイクリングさせるのに十
分であった。電子制御器により温度をモニターし、加熱要素への出力を調節することによ
り求められるタイミングとサイクル数が達成された。冷却するために、制御器によりソレ
ノイドを活性化することにより、入口を外気に向かって開いて、別の方法で閉じたチャン
バーに冷却空気を導入した。
熱質量チャンバー、循環空気、およびガラスキャピラリー中のサンプルを使用して、わず
か10分のPCR(各20秒の30サイクル)の後に、500bpより大きいPCR生成
物をエチジウムブロマイドで染色したゲルで可視化した(3)。生成物の収量は、伸長時
間とポリメラーゼ濃度の影響を受けた。30秒サイクル時間(伸長は、70℃から80℃
の間で約10秒)の場合、ポリメラーゼ濃度を反応液10μlあたり0.1ユニットから
0.8ユニットに増加させるにつれてバンドの強度も増加した。ポリメラーゼのユニット
の定義は紛らわしいことがあることが知られている。天然型Taqポリメラーゼの場合、
0.4U/10μlは、典型的な迅速サイクリング条件下では約1.5nMである(50
)。
瞬時または「0」秒である。すなわち、温度-時間プロファイルは、変性およびアニーリ
ングの際の温度の急激な上昇は示すが最高温度および最低温度の保持は示さない。変性お
よびアニーリングは、極めて急速に起こる場合がある。
。例示的なヒトゲノムDNAの536bpのフラグメント(β-グロビン)の場合、91
℃から97℃の間の変性温度が、1秒未満から16秒までの変性時間と同等に有効であっ
た。しかし、実際には16秒よりも長い変性時間は生成物の収量を減少させることが見出
された。プライマーのアニーリングにかかる時間が制限される限りは、50~60℃のア
ニーリング温度で特異的生成物が優れた収量で得られた。すなわち、変性からアニーリン
グへの迅速な冷却と1秒未満のアニーリング時間によって最良の特異性が得られた。75
~79℃の伸長温度で収量は最大になり、最大約40秒の伸長時間で増加した。
るため、変性温度を保持する必要はない、2)プライマーのアニーリングは極めて急速に
起こる場合があるため、アニーリング温度の保持は必要ではない場合がある、および3)
必要な伸長時間は、PCR生成物の長さとポリメラーゼ濃度によって決まる。また迅速サ
イクルPCRは、温度を正確に制御しさえすれば、より速いだけでなく、特異性および収
量に関してもより優れている(4、5)。PCRの速度は、利用され得る生化学によって
制限されないが、サンプルの温度を厳密にまたは迅速に制御しない機器によっては制限さ
れる。
に関する性能はあまり高くなく、多くは「0」秒の保持期間のプログラミングすら不可能
である。コニカルチューブの壁を介して熱が移動することによる時間遅延、低い表面積対
体積の比率、および大きいサンプルの加熱のために、ほとんどの機器は、サンプルが確実
に望ましい温度に達するようにするために変性時間およびアニーリング時間の延長に頼ら
ざるを得ない。これらの時間遅延により、時間経過に対する正確な温度が不確定になる。
その結果、市販品における再現性は悪く、市販品間でのばらつきが大きい(6)。多くの
機器は、温度遷移中に著しい温度の変動を示す(7、8)。温度のアンダーシュートおよ
び/またはオーバーシュートは、試みられたサンプル体積に依存するソフトウェアでの予
測ではほとんど解決しない慢性的な問題である。このような難点は、経時的に変化する場
合がある機器の熱的性質によってさらに悪化する。
低熱質量のブロック、および他の「速い」改変により、従来のヒートブロック機器はより
速くなりつつある。それにもかかわらず、これらのシステムにとって、60秒未満でサイ
クルを完了させる程度に迅速にサイクリングすることはめったにない。ほんの少数のヒー
トブロックシステムが60秒未満のサイクルを達成できるが、通常は制限された温度範囲
での2温度サイクリングに限定される。サンプル容器を平板化すれば、抵抗加熱と空気冷
却によって(9)、または一定温度に維持された加熱ゾーン間をフレキシブルなチューブ
でサンプルを移動させることによって迅速サイクリングを達成できる(米国特許第6,7
06,617号)。
(1)、リアルタイムPCR用のものは1996年から利用できるようになった(10、
11)。他の機器の迅速サイクリング性能は、初めて20~60秒のサイクルを実証した
空気/キャピラリーの標準品と比較されることが多い。不思議なことに、長年にわたりキ
ャピラリー/空気システムをより遅く運用する傾向があるが、おそらくこれは、多くの使
用者による「0」秒の変性時間およびアニーリング時間への不信感を反映しているのであ
ろう。また熱で活性化される酵素は長い活性化期間も必要とすることから、「速い」活性
化酵素が使用されたとしても運転時間も二倍になることが多い。迅速サイクリングからの
別の妥協点は、プラスチックキャピラリーの使用である。これらのキャピラリーは機器と
熱的に適合していないため、標的温度に達するまで変性およびアニーリング時の20秒の
保持が必要になることが多い(12)。
が起こっており、この場合、処理される体積は当然ながら小さい(13、14)。しかし
、高い表面積対体積比を有するサンプルチャンバーを用いたとしても、加熱要素が高い熱
質量を有し、チャンバーの外部にある場合、サイクルは長くなる場合がある(15)。サ
ンプル近傍で薄膜の抵抗加熱器と温度センサーを用いることにより、10~30分の増幅
が達成できる(16、17)。
されるが、いくつかの興味深い加熱方法が開発されている。赤外線放射は、温度のモニタ
リングのための較正された赤外線高温測定(19)を用いて加熱に使用できる(18)。
あるいは、ガラスキャピラリー上の薄い金属膜が、迅速サイクリングのための抵抗加熱要
素と温度センサーの両方として役立つ場合がある(20)。最後に、電解質の抵抗による
PCR溶液の直接のジュール加熱と温度モニタリングが考えられ、キャピラリーで実施も
されている(21)。上記の方法はいずれも、固定されたサンプルに熱を移動させたり、
固定されたサンプルから熱を移動させたりするものである。
槽へ、または固定された温度ゾーンを有するチャネルを介してサンプルを物理的に移動さ
せてもよい。PCRの流体がチャネル内で変性温度、アニーリング温度、および伸長温度
で維持された様々なセグメントを通過するマイクロ流体工学的な方法が普及するようにな
ってきた。連続流型PCRは、3つの温度ゾーンを行き来する蛇行チャネル内(22)で
、さらに半径が徐々に増加または減少する3つの温度セクターを通過するループ内で実証
されている(23)。蛇行レイアウトを有する改変型は、PCRの動力学的パラダイムに
より厳密に適合させるために、等温ゾーンの代わりに固定された熱勾配を使用している(
24)。PCRに必要なマイクロチャネルの長さを制限するために、いくつかのシステム
は、二方向性の圧力駆動のフロー(25)、空気力学(26)、または動電学的な力(2
7)によって温度ゾーン間で前後にサンプルを往復させる。直線的なサンプル往復の代わ
りに、単一の円形のチャネルを、強磁性流体として(28)、または対流によって(29
)駆動するサンプルの動きと共に使用できる。連続流方式を包含するマイクロシステムP
CRの考えられる利点の1つは、サイクル速度である。
多くは、迅速サイクルPCRの20~60秒のサイクル範囲で稼働する(13、30)。
赤外線加熱の場合、16~37秒の範囲の最小のサイクル時間が報告されている(18、
19)。金属でコーティングされたキャピラリーは、40秒のPCRサイクルを達成して
おり(20)、一方で直接の電解質加熱は、21秒のサイクルで増幅した(20)。閉ル
ープ対流型PCRの場合、24~42秒の範囲の最小のサイクル時間が報告されている(
29、31)。いくつかのグループは、PCRサイクル時間を、1990年に最初に実証
された迅速サイクルPCRの元の定義よりも速い20秒未満に短くすることに注目してき
た。静止サンプルの薄膜抵抗加熱は、25μlのサンプルではサイクル時間を17秒に短
くし(32)、100nlのサンプルでは8.5秒に短くした(17)。連続流システム
は、熱勾配PCR(24)とサンプル往復(26)を用いて12~14秒のサイクルを達
成したが、強磁性流体ループにより9秒のサイクルでのPCRが成功したことが主張され
ている(28)。ガラス基板およびプラスチック基板による連続流システムは、様々なサ
イズのPCR生成物で6.9秒(22)および5.2秒(23)のサイクル時間を達成し
ている。アルミニウム基板を介した交互の熱水および冷水の伝導により、油の下で1μl
の液滴を5.25秒のサイクルで増幅した(33)。同様に、多孔質の銅ブロックを介し
た水の伝導により、5μlのサンプルを4.6秒のサイクルで増幅した(34)。蒸気圧
によって増大した1μlの反応プラグの連続流デバイスは、3秒のサイクルを達成した(
35)。加えて、ペルチエ素子の間に挟まれたガリウムにキャピラリーを浸漬することに
よって、キャピラリー中で大腸菌のStxバクテリオファージの85bpのフラグメント
を2.7秒のサイクルで増幅することを主張する報告がなされている(36)。あるいは
、加圧した熱いガスおよび冷たいガスでサイクリングしたキャピラリーでのPCR増幅に
より、2.6秒のサイクルが達成された(48)。
クル時間を最小化するための研究を要約する。過去20年にわたり、サイクル速度をさら
に向上させた新しいプロトタイプ機器が開発されてきた。しかし、実用的なPCR性能(
効率および収量)が不十分であることが多い。一般的な原則として、サイクルが短くなれ
ばなるほど、PCRの成功に求められることは、より高い開始濃度で使用される標的(細
菌、ファージ、多コピープラスミド、またはさらにはPCR生成物)の複雑度がどれだけ
低いかに関わってくる(例えば、初発サンプルとして5ngのアンプリコンが使用された
米国特許第6,210,882号を参照)。実際に、表1で列挙した研究のうち、20秒
未満のサイクルで例えばヒトDNAなどの複雑な真核DNAを使用したものは皆無である
。成功が求められる前にほとんど増幅しなくてもいいように、初発のテンプレート分子の
コピー数が極めて高いことが多い(例えば、1μlあたり180,000,000のλフ
ァージのコピー)。さらに、多くの研究において、特に高いテンプレート濃度を用いた環
境での肯定的な結果の有効性に関して、テンプレート非含有対照がないことが疑問視され
ることもない。ある機器に注目した報告は、熱的サイクリングデバイスの設計およびモデ
リングについて広範に調べており、最後の短時間PCRの実証では、高濃度の複雑度が低
い標的を使用している。PCRサンプル非存在下でのモデリングおよび測定に基づいて、
加熱速度および冷却速度(最大175℃/秒)が報告されている(17)。
にPCRプロトコールにバリエーションを導入することである。より長いプライマーはよ
り高いTmを有するため、アニーリング温度が高くなる場合がある。生成物の長さとその
Tmを制限することによって、生成物のTmをわずかに超えた温度まで変性温度を低くで
きる。より高いアニーリング温度とより低い変性温度とを組み合わせることにより、増幅
の成功に必要な温度範囲を減少させる。また3工程サイクリング(変性、アニーリング、
および伸長)を2工程(変性および併合されたアニール/伸長工程)に減らすことも、温
度サイクリングの必要条件を簡易化する。温度範囲の減少と2工程サイクリングはいずれ
も、表1に記載された20秒未満のサイクル時間を用いた研究において典型的である。し
かし、併合されたアニール/伸長工程が、70℃よりも低い温度から、ポリメラーゼが最
も活性化する最適な80℃までの温度で行われる場合、2工程サイクリングはポリメラー
ゼ伸長速度を遅くする場合がある。ポリメラーゼ伸長速度は、約70~80℃までの温度
では対数線形を示し、60~120bp/秒の最大値が報告されている(50)。
合、対照反応と比較して、増幅効率および収量は不十分であることが多い(22、23)
。これらのより速いPCRに向けられた努力は工学面に偏りすぎているようであり、生化
学面はほとんど注目されていない。サイクル時間が20秒から2秒に短くなるにつれて、
PCR収量は減少し、最終的には収量ゼロになるが、これは、単純な標的を高コピー数で
用いた場合でさえもロバスト性が欠如することを反映している。
に適している場合がある。本明細書において開示されたように、プライマー、ポリメラー
ゼ、およびMg++の濃度を高めることに注目することにより、反応ロバスト性と収量を
保持しつつ「エクストリームPCR(extreme PCR)」(20秒未満のサイク
ル(10分未満で30サイクル)のPCR)が実現化される。
供され、本方法は、熱安定性ポリメラーゼおよび標的核酸配列を増幅するように構成され
たプライマーを生体サンプルに添加する工程であって、該ポリメラーゼが少なくとも0.
5μMの濃度で提供され、該プライマーがそれぞれ、少なくとも2μMの濃度で提供され
る工程と、エクストリーム温度サイクリングプロファイルを使用して、複数の増幅サイク
ルにわたり少なくとも変性温度と伸長温度との間で生体サンプルを熱的にサイクリングす
ることによるポリメラーゼ連鎖反応によって、標的核酸配列を増幅する工程であって、各
サイクルが1サイクルあたり20秒未満で完了する工程とを含む。
提供され、該方法は、熱安定性ポリメラーゼおよび標的核酸配列を増幅するように構成さ
れたプライマーを生体サンプルに添加する工程であって、該ポリメラーゼとプライマーの
比率は、(約0.03~約0.4のポリメラーゼ):(プライマーの総濃度)であり、該
ポリメラーゼの濃度が少なくとも0.5μMである工程と、エクストリーム温度サイクリ
ングプロファイルを使用して、複数の増幅サイクルにわたり少なくとも変性温度と伸長温
度との間で生体サンプルを熱的にサイクリングすることによるポリメラーゼ連鎖反応によ
って、標的核酸配列を増幅する工程であって、各サイクルが20秒未満で完了する工程と
を含む。
スは、PCRサンプルを保持するためのサンプル容器と、サンプルを加熱する手段と、サ
ンプルを冷却する手段と、サンプルを加熱する手段およびサンプルを冷却する手段にサン
プル容器を繰り返し晒して、サンプルを少なくとも200℃/秒の傾斜速度で熱的にサイ
クリングするための制御手段とを含む。
ットは、dNTPと、少なくとも0.5μMの濃度で提供されるポリメラーゼと、少なく
とも2μMの濃度でそれぞれ提供される、標的核酸を増幅するように構成された一対のプ
ライマーとを含む。
ましい実施形態の詳細な説明を考察すれば、本発明の追加の特徴が当業者に明らかになる
であろう。
複数を意味し、状況が不適切でない限り複数形を包含するものと定義される。範囲は、本
明細書では、「およその」1つの特定の値から、および/または「およその」別の特定の
値までと表される場合がある。用語「約」は、本明細書では、およそ、ほぼ、だいたい、
または概ねを意味するものとして使用される。用語「約」が数値範囲と共に使用される場
合、「約」は、明示された数値よりも上および下に境界を広げることによりその範囲を修
正する。一般的に、用語「約」は、本明細書では、述べられている値よりも5%の偏差で
上および下に数値を修正するために使用される。このような範囲が示される場合、他の実
施形態は、1つの特定の値から、および/または他の特定の値までを包含する。同様に、
接頭語「約」の使用によって値が近似値として示される場合、特定の値により他の実施形
態が形成されるものと理解されよう。さらに、それぞれの範囲の端点は、他方の端点と関
連して、かつ他方の端点とは独立してどちらも有意であることが理解されよう。
か1つのものを意味し、さらにその列挙されたもののいずれかの組み合わせも包含する。
接採取した細胞、または培養物中で維持された細胞もしくは培養細胞株からの細胞のいず
れか);細胞溶解産物(または溶解産物画分)または細胞抽出物;細胞、細胞材料、また
はウイルス材料から誘導された1種または複数の分子(例えばポリペプチドまたは核酸)
を含有する溶液;または本明細書で説明されているようなアッセイされる天然に存在する
核酸もしくは天然に存在しない核酸を含有する溶液を意味する。またサンプルは、細胞、
細胞成分、または核酸を含有する任意の体液または排出物(例えば、これらに限定されな
いが、血液、尿、便、唾液、涙、胆汁など)であってもよい。
クレオチドもしくはポリヌクレオチドを指し、これらは、DNAまたはRNAまたはDN
A-RNAハイブリッド、一本鎖または二本鎖、センスまたはアンチセンスかどうかにか
かわらず、ワトソン-クリック塩基対形成によって相補的核酸にハイブリダイズ可能なも
のである。また本発明の核酸は、ヌクレオチド類似体(例えば、BrdU、dUTP、7
-デアザ-dGTP)、およびヌクレオシド間の非ホスホジエステル結合(例えば、ペプ
チド核酸(PNA)またはチオジエステル結合)を包含していてもよい。特に、核酸とし
ては、これらに限定されないが、DNA、RNA、cDNA、gDNA、ssDNA、d
sDNA、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
る第二のDNA分子またはRNA分子(「標的」)と塩基対を形成できる限定された配列
の一本鎖のDNA分子またはRNA分子を意味する。その結果得られたハイブリッドの安
定性は、長さ、GC含量、最隣接のスタッキングエネルギー、および発生する塩基対形成
の程度によって決まる。塩基対形成の程度は、例えばプローブと標的分子との相補性の程
度などのパラメーター、およびハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーの程度
の影響を受ける。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーの程度は、例えば温度、
塩濃度、および例えばホルムアミドなどの有機分子の濃度といったパラメーターの影響を
受け、当業者に公知の方法によって決定される。プローブ、プライマー、およびオリゴヌ
クレオチドは、当業者に周知の方法で、放射性標識、蛍光標識、または非放射性標識のい
ずれかによって検出できるように標識されていてもよい。dsDNA結合色素(二本鎖D
NAに結合すると、一本鎖DNAに結合するかまたは溶液中で遊離状態である場合よりも
強い蛍光を発する色素)を使用して、dsDNAを検出することができる。「プライマー
」は、ポリメラーゼによって伸長するように特異的に構成されるが、それに対して「プロ
ーブ」または「オリゴヌクレオチド」は、そのように構成されていてもよいし、または構
成されなくてもよいことが理解されている。
ドが、高いストリンジェンシー条件下で実質的に相補的な核酸(例えばサンプル核酸)を
認識し物理的に相互作用して(すなわち塩基対を形成して)、他の核酸とは実質的に塩基
対を形成しないことを意味する。
7.2、7%SDS、1mMのEDTA、および1%BSA(Fraction V)を
含有する緩衝液中で、または42℃の温度で、48%ホルムアミド、4.8×SSC、0
.2Mのトリス-Cl、pH7.6、1×デンハルト溶液、10%硫酸デキストラン、お
よび0.1%SDSを含有する緩衝液中で、長さが少なくとも40ヌクレオチドのDNA
プローブを使用した結果起こるハイブリダイゼーションと同等のハイブリダイゼーション
が起こる条件を意味する。例えばPCR、ノーザン、サザン、またはインサイチュハイブ
リダイゼーション、DNA配列決定などの高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーシ
ョンのための他の条件は、分子生物学分野の当業者にとって周知である(47)。
施形態では10秒未満、5秒未満、2秒未満、1秒未満、および0.5秒未満のサイクル
時間を使用したPCRのための方法およびキットが提供される。これらのサイクル時間を
用いれば、30サイクルのPCRは、それぞれ10分未満、5分未満、2.5分未満、1
分未満、30秒未満、および15秒未満で完了する。PCR速度が速くなればなるほど、
プライマー濃度とポリメラーゼ濃度とが増加することによりPCR効率および収量が維持
される。
ート変性)のどれが不十分になっても、PCRの効率および収量が制限される場合がある
。例えば、プライマーがテンプレートの95%にしかアニールしない場合、たとえそのテ
ンプレートの100%が変性してプライマーが結合したテンプレートの100%が伸長し
て全長生成物になったとしても、PCR効率が95%よりも大きくなることはできない。
同様に、伸長効率がわずか95%である場合も、可能な最大のPCR効率は95%でしか
ない。PCR生成物濃度をサイクルごとに2倍にするためには、全ての要素が、100%
の達成率を得なければならない。以降の段落で、変性、アニーリング、および伸長を順次
考察する。
びエクストリームPCR(20秒未満のサイクル)の温度サイクリングにおいて、PCR
の失敗に関する一般的な原因は、不十分な変性である。目標は、各サイクルでの変性を完
全に行い、プライマーのアニーリングで定量的なテンプレートが利用できるようにするこ
とである。PCR前の最初のテンプレートの変性、特にゲノムDNAの変性は通常、PC
R中の増幅生成物の変性よりもより厳しい条件を必要とする。元の迅速サイクルPCRの
最適化(4)は、テンプレートを沸騰させた後に行われているが、これは、最初のゲノム
DNAを確実に変性させる優れた方法である。不完全な最初の変性は、高いTmを有する
標的、特に高い安定性のフランキング領域を有する標的の場合に起こる場合がある(37
)。そのために、特に、変性中のわずかな温度差がPCR効率に影響を与える場合、例え
ばゲノムの挿入または欠失に関して、定量的PCRの性能が損なわれる場合がある(37
~39)。先に行われた沸騰または制限消化(37)が望ましくなく、より高い変性温度
がポリメラーゼ性能を損なう場合、生成物のTmを下げるアジュバントを使用して変性を
補助してもよい。
であることはめったにない。PCR生成物は、主にGC含量と長さに応じて40℃より高
い温度範囲で融解する(43)。PCR生成物が、より低い変性温度が使用できるように
十分低い温度で融解する場合、低い変性標的温度は、速度の利点と特異性の利点の両方を
有する。変性温度が低ければ低いほど、サンプルはより速く変性温度に到達でき、より速
くPCRを行うことができる。より高い変性温度で発生し得る生成物は二本鎖のままであ
り、プライマーのアニーリングに利用できないと予想されるため、これらの発生し得る全
ての生成物を排除することによりさらに特異性が高められる。高いTmの生成物を増幅す
るために、標的温度を94℃より高くする必要がある場合がある。しかし、現行の熱安定
性ポリメラーゼのほとんどは97℃より高温で変性し始め、PCR溶液は標高に応じて9
5℃から100℃の間で沸騰する場合があるため、温度を高める余地がさほどない。1価
の塩およびMg++濃度を低くすると、生成物のTmが下がる。同様に、dUTPおよび
/または7-デアザ-dGTPを取り込むことによっても生成物のTmは下がるが、ポリ
メラーゼ伸長速度を減少させる場合がある。ほとんどの独自のPCRの「エンハンサー」
は、生成物のTmを下げて高いTmの生成物の変性(および増幅)を可能にする単純な有
機物質である。これらのなかでも最も一般的に普及しているものは、DMSO、ベタイン
、グリセロール、エチレングリコール、およびホルムアミドである。Tmを下げることに
加えて、これらの添加剤のうちいくつかは、PCR混合物の沸点も上昇させる(特に高い
標高で有用である)。エンハンサー濃度が増加するにつれ、生成物のTmは下がるが、ポ
リメラーゼ阻害が増加する場合がある。
なぜなら、温度が生成物のTmからわずかしか上回っていなくても、DNAの巻き戻しが
最初に極めて速く起こる(10~100ミリ秒)ためである。変性は、増幅生成物のTm
よりも測定が困難な2~3℃高い温度で迅速に起こるが、アンプリコンの完全な変性はお
そらく0.1秒未満で起こる。複数のドメインで生成物が融解する場合、標的の変性温度
は、最も高い融解ドメインよりも2~3℃高いと予想される。サンプルがこの温度に到達
する限りは、長い生成物であったとしても変性は極めて速い。キャピラリーおよび水槽を
使用すれば(40)、20kBを超えるPCR生成物の完全な変性が1秒未満で起こる(
52)。生成物のTmおよび融解ドメインは、例示的には、DNA色素および高解像度融
解を用いて実験的に決定される(41)。Tmの推測はソフトウェアでの予測により達成
できるが(42)、その精度は限定的である。さらに、観察されたTmは、例えば塩濃度
および任意の色素やアジュバントの存在などの局所的な反応条件に強く依存する。したが
って、観察されたTmは通常、より反応条件に適合されている。
aおよび図6aで示されるように200~400℃/秒であってもよい。これらの速度で
は、変性温度に到達するのに約0.1~0.2秒しか要さない。しかし、標的温度に接近
するときのより遅い速度は、標的温度を上回る危険を減少させ、起こり得るポリメラーゼ
の不活性化または溶液の沸騰を回避する。より遅い接近温度を達成する例示的な方法の1
つは、標的温度よりも5~10℃高い温度の高温槽にサンプルを浸すことである。標的と
槽温度との温度差により指数関数的な接近曲線が定められ、差が小さくなるにつれてこの
接近曲線は自動的に遅くなる。温度を連続的にモニタリングすることによって、変性の目
標が達成されたら次の相(アニーリングまで冷却すること)が始動する。まとめると、P
CRにおける完全な生成物の変性は、生成物の最も高い融解ドメイン温度よりも2~3℃
高い温度で0.2秒未満を必要とし、可能な限り迅速に、例示的には40~400℃/秒
で変性温度に接近し得る。変性は最初に起こるため、その速度は生成物の濃度にのみ依存
し、効率(または変性される生成物のパーセンテージ)は生成物の濃度とは無関係である
。
る場合がある。全てのテンプレート部位にプライマーが結合しない場合に、効率が低くな
る。さらに、望ましくない部位でプライマー結合が起こる場合、別の生成物が生産される
場合がある。目標は、実質的に、各サイクルで望ましい部位でのみ完全なプライマーのア
ニーリングを達成し、ポリメラーゼ伸長のために定量的なプライマーが結合したテンプレ
ートを提供することである。
のTmよりも5℃低い温度で1秒未満のアニーリング時間を提唱している(52)。20
秒未満のサイクルを試みた機器の場合のプライマー濃度は、それぞれ200~1,000
nMの範囲である(表1)。これらの濃度は、長いアニーリング時間が使用される従来の
PCR(60秒未満のサイクル)で使用される濃度に類似している。プライマー濃度を低
くすることは、特異性を向上させるために使用されることが多く、プライマー濃度を増加
させることは、非特異的増幅に関する懸念のために考慮されることはまれである。しかし
、迅速サイクリングを用いる場合、特異性の向上はより短いアニーリング時間に起因して
いる(5)。この傾向が継続すれば、エクストリームPCRの極めて短いアニーリング時
間は、高いプライマー濃度を容認するものと想像できる。アニーリングを促進するために
、20~60秒のサイクルの場合、プライマーのTmよりも5℃低いアニーリング温度が
推奨される。Tmは、増幅で使用されるのと同じ緩衝液条件下で飽和させたDNA色素お
よびオリゴヌクレオチドを使用した融解分析によって最もよく実験的に測定される。プラ
イマーを、ダングリング末端(dangling end)として5’-伸長部分を有す
るその相補標的と組み合わせることにより、そのテンプレートにアニールしたプライマー
の安定性を最適に概算し、融解分析が行われる。
リングは、極めて速いサイクル速度で制限的になる場合がある。プライマーのアニーリン
グは、2番目に起こる反応であり、プライマー濃度と標的濃度の両方に依存する。しかし
、多くのPCRにおいて、プライマー濃度は標的濃度よりもかなり高く、実際的にはアニ
ーリングは擬似的に最初に起こり、プライマー濃度にのみ依存する。このケースにおいて
、プライマーが結合した生成物の比率(アニーリング効率)は、プライマー濃度にのみ依
存して生成物濃度には依存しないことから、より高いプライマー濃度は、より短いアニー
リング時間を可能にすると予想される。さらに、理論にとらわれずにいえば、その関係は
直線的であると考えられる。アニーリング時間がより短くなればなるほど、PCRの効率
および収量を維持するためにはプライマー濃度の増加が必要になる。例えば、迅速サイク
リングは、プライマーのTmよりも5℃低い温度で約1~3秒のアニーリングを可能にす
る(3)。エクストリームPCRにおいて、このアニーリング時間(Tm-5℃、または
それより低い温度で)を10倍短くする場合、プライマー濃度を10倍増加させれば類似
のプライマー結合効率が期待される。有効なアニーリング時間が次第に短くなるにつれて
、プライマー濃度もほぼ同じ倍率で次第に高くなるべきである。典型的な迅速PCRプロ
トコールは、500nMの各プライマーを使用する。エクストリームPCRにおいてアニ
ーリング時間が3倍から40倍短くなると、同じプライマー結合効率を得るのに必要なプ
ライマー濃度は、各プライマーで1,500~20,000nMである。これは、プライ
マーの合計で3,000~40,000nMと同等であり、表1に記載されたいずれのプ
ライマー濃度よりも高い。これは、先に行われた試みで20秒未満のサイクリングでの効
率が不十分であることの理由の1つは、不十分なプライマー濃度の後に起こる不十分なア
ニーリング効率であることを示唆している。エクストリームPCRでは、プライマー濃度
をそれぞれ1.5~20μMに増加させることにより、0.05~0.3秒のアニーリン
グ時間にもかかわらず優れたアニーリング効率を達成している。増加させたプライマー濃
度を使用すれば、アニーリング時間の短縮を相殺して同じアニーリング効率を達成するこ
とが可能なため、さらにより短いアニーリング時間でさらにより高いプライマー濃度を考
慮できる。市販されているほとんどの機器は少なくとも1秒の保持時間を必要とし、わず
かな機器が「0」秒の保持時間を許容することが知られているが、わずかな秒の保持時間
を許容する市販の機器はない。エクストリームPCRのいくつかの実例について、0.1
秒または0.01秒きざみの保持時間が望ましい場合がある。
の方法は、Mg++濃度を増加させることである。アニーリング速度は、イオン強度の増
加に伴い増加し、プライマーのアニーリングを包含するハイブリダイゼーション速度を増
加させるには2価カチオンが特に有効であることが当分野において知られている。
ば、200~800℃/秒で(図2aおよび図6a)、0.05~0.2秒でアニーリン
グ温度に到達することが可能である。また迅速な冷却も、全長生成物の再ハイブリダイゼ
ーションを最小化する。冷却中に二重鎖増幅生成物が形成される程度になると、プライマ
ーは二重鎖生成物にアニールできないため、PCR効率は低下する。これはPCR初期で
はめったに起こらないが、生成物濃度が増加するにつれて、冷却中に二重鎖がますます形
成されるようになる。SYBR(登録商標)グリーンIを用いた連続的なモニタリングか
ら、このような生成物の再アニーリングが、PCRがプラトーになる主な原因である場合
があることが示唆される(44)。
がある。より長い生成物は、PCR中により長い伸長時間を必要とすることが知られてお
り、推定上全ての生成物の伸長を完了させるために、PCRの最後に数分の最終的な伸長
が付け足されることが多い。長い生成物のための通常のアプローチは、伸長にかかる時間
を長くすることである。プライマーのアニーリングおよびポリメラーゼ伸長が同じ温度で
行われる2工程サイクリングのいくつかのケースと同様に、より低い伸長温度を使用する
ことにより必要な時間がさらに長くなる。
の実質的に完全な伸長が必要である。ほとんどのポリメラーゼ伸長速度は、温度に伴い所
定の最大値まで増加する。Taqポリメラーゼの場合、最大値は75~80℃で約100
ヌクレオチド/秒であり、温度が10℃低下するごとに約4倍減少する(50)。536
bpのベータグロビン生成物の場合、迅速サイクルPCRでは76℃が最適であることが
見出された(4)。近年、商業的な要求に応じて、全体のPCR時間を短くできるより速
いポリメラーゼが導入されつつあり、これは、このようなポリメラーゼが、より長い生成
物のための伸長保持時間を不要にするかまたは短くできることを示唆している。
濃度を増加させると必要な伸長時間が短くなることが発見された。500nMの各プライ
マーと共に、PCRにおいて標準的なTaqポリメラーゼ濃度(0.04U/μl)また
は1.5nM(49)を使用すると仮定すれば、各プライマーがテンプレートに結合する
場合、一度にテンプレートの0.15%が伸長する程度のポリメラーゼしか存在していな
いため、新しいプライマーが結合したテンプレート全てを伸長させるためにはポリメラー
ゼをそれらに何度も再利用することが必要となる。ポリメラーゼ濃度を増加させることに
より、プライマーが結合した有効なテンプレートのより多くが一度に伸長され、テンプレ
ート全てを伸長させるのに必要な時間を短くするが、これはおそらく、より速い伸長速度
によるのではなく、いずれの時点においてもプライマーが結合したテンプレートのより高
い比率を伸長することによるものと予想される。
、酵素の重合速度(それ自身が温度の関数である)およびポリメラーゼ濃度に正比例する
ようである。また必要な時間は、伸長させようとするテンプレートの長さ(生成物の長さ
からプライマーの長さを引いた長さ)に反比例する。ポリメラーゼ活性を、PCRにおい
て標準的な活性である0.04U/μlの20~300倍に増加させることにより、20
秒未満のサイクルを用いたエクストリームPCRは、特異的生成物の高い収量を達成でき
る。すなわち、0.8~12U/μl(1~16μMのKlenTaq)の活性は、0.
1~1.0秒の併合されたアニール/伸長時間を用いた2工程のエクストリームPCRを
可能にする。これまでに使用された最大のポリメラーゼ活性は、0.5U/μlであった
(表1)。エクストリームPCRの実例で使用される2工程PCRの場合、70~75℃
での併合されたアニール/伸長工程がより速い重合速度にとって有利である。さらに、2
工程PCRは温度サイクリングを簡易化するため、エクストリームサイクリング(20秒
未満のサイクル)の実例では典型的には2工程PCRが使用され、迅速なアニーリングと
迅速な伸長の両方が、併合されたアニール/伸長工程の間に起こらなければならない。そ
れゆえに、実例では増加させたプライマー濃度と増加させたポリメラーゼ濃度の両方が使
用され、その結果として、エクストリーム2温度サイクリング下でロバストなPCRがも
たらされる。例示的には、以下に記載される実施例で例示されるように、50~75℃で
0.05~5.0秒の併合されたアニール/伸長時間を用いる場合、それぞれ1.5~2
0μMのプライマー濃度と、任意の標準的なポリメラーゼの0.4~12U/μlのポリ
メラーゼ濃度(0.5~16μMのKlenTaq)とが必要である。アニーリングおよ
び伸長の両方に対して1つのPCRサイクリングセグメントしかないため、エクストリー
ムPCR条件は、例示的にはプライマー濃度とポリメラーゼ濃度の両方を増加させること
によって両方のプロセスを強化することを必要とする。
よび伸長工程は異なる温度で別々に維持される。このケースにおいて、アニーリング工程
および伸長工程に配分される時間を個々に制御して、具体的な要求に合わせることが可能
である。例えば、アニーリング時間のみが短く(0.05~0.2秒)伸長時間が比較的
長く維持される場合(例示的には1、2、5、10または15秒)、効率的なPCRのた
めにはプライマー濃度だけを増加させればよい。あるいは、伸長時間は短いが(70~8
0℃の範囲内で1秒未満)、アニーリング時間は長い場合、効率的なPCRを達成するた
めにはポリメラーゼ濃度だけを増加させればよいと考えられる。効率的なPCRとは、例
示的には少なくとも70%の効率、より例示的には少なくとも80%の効率、さらには少
なくとも90%もの効率を有するものと理解される。
、高いポリメラーゼ濃度と増加させた伸長時間との組み合わせを必要とする場合がある。
ポリメラーゼが過量に存在する場合、例示的には、最小の時間は、塩基の伸長の長さ(生
成物の長さからプライマーの長さを引いた長さと定義される)を塩基/秒単位のポリメラ
ーゼ伸長速度で割った値であるはずである。しかし、これまで述べてきたように、ポリメ
ラーゼが飽和しているのは通常、テンプレート濃度がポリメラーゼ濃度よりも大きくなる
前、PCRの開始時のみである。サイクル時間を短くする方法の1つは、ポリメラーゼの
最大温度近傍、典型的には70~80℃で、2温度PCRを使用することである。必要な
伸長時間は、リアルタイムPCRを使用して定量サイクル、すなわちCqをモニタリング
することによって実験的に決定できる。例えば、75℃で100塩基/秒のポリメラーゼ
伸長速度では、ポリメラーゼ濃度が過量である場合、200bpの生成物は、約2秒を要
すると予想される。同様に、400bpの生成物は、これと同じポリメラーゼを使用した
場合、その濃度が、伸長されるテンプレートの濃度よりも高い限りは約4秒を要すると予
想される。ポリメラーゼが過量ではない場合、より多くのポリメラーゼを添加することに
よって、より多くのテンプレートが同時に伸長されて、ポリメラーゼ濃度に比例して必要
な伸長時間を短くすることが可能になる。
情報が得られるか、およびどの程度難しいかによって決まる。従来のクローニング技術と
比較して、PCRは速くかつ簡単である。迅速サイクルPCRおよびエクストリームPC
Rは、必要な時間の連続的な短縮に重点を置いている。リアルタイムPCRは、各サイク
ルでデータを得ることにより情報量を増加させる。PCR中またはPCR後に融解分析を
行って、温度を増加させながらDNAハイブリダイゼーションを連続的にモニターできる
。
5b)、100bp未満の生成物のエクストリームPCRは、動力学的モデルがよく当て
はまることが実証されている。温度は常に変化しており、変性、アニーリング、および伸
長の速度は温度依存性であることから、PCRの適切な評価は、温度全域にわたる各要素
の反応速度を統合することでしか得られない。100bpより大きい生成物の場合、より
長い伸長時間を要する場合があり、反応速度論モデルと平衡モデルのどちらの要素でも適
切である。
つかの実施形態に関して例示すれば、2秒未満のサイクル時間を用いて、完全な増幅のた
めに1分未満で、極めて速い速度でPCRを行うことができることが発見された。例示的
には、このエクストリームPCRに、増加させたポリメラーゼ濃度とプライマー濃度との
様々な組み合わせが使用される。いずれの特定の理論にとらわれずにいえば、過剰な濃度
のプライマーは、概して完全なプライマーのアニーリングを可能にし、それによってPC
R効率を増加させると考えられる。同様にいずれの特定の理論にとらわれずにいえば、ポ
リメラーゼ濃度を増加させることによっても、より完全な伸長がもたらされるためにPC
R効率が向上すると考えられる。ポリメラーゼ濃度を増加させることにより、アニールし
たプライマーへの結合が促進され、さらに完全な伸長の前にポリメラーゼが離れた場合で
も再結合が促進される。以下に記載の実施例で、複雑な真核生物ゲノムDNAを用いて開
始した場合でもエクストリームPCRが成功したことを示す。
熱安定性ポリメラーゼが、ポリメラーゼ伸長速度を考慮した類似の方式でエクストリーム
PCRで性能を発揮すると考えられる。本明細書で提示されたように、例示的には酵素の
活性化率(activity rate)の差で調節することにより濃度を増加させて使
用した場合、エクストリームPCRを可能にすると予想されるポリメラーゼの市販の調製
物としては、例えば、Herculase、Kapa2G FAST、KOD Phus
ion、天然のまたはクローニングしたサーマス・アクアティカス(Thermus a
quaticus)のポリメラーゼ、Platinum Taq、GoTaq、およびF
ast Startが挙げられる。
み立てて、エクストリームPCRの構想の証明試験を行った。しかし、システム4は例示
的なものであり、迅速に熱サイクリング可能な他のシステムも本開示の範囲内であること
が理解される。図1aで示されるように、95.5℃(本発明の実施例が行われた場所で
あるユタ州ソルトレイクシティでの沸騰水の温度)の高温の水槽10、および30~60
℃の低温の水槽14を使用して、サンプル容器20中に入れられた1~5μlのサンプル
の温度を変化させる。例示的な水槽10、14は4.5クォートのステンレス鋼製ドレッ
シング用ジャー(Lab Safety Supply、番号41634)であるが、い
くつかの実施例では500mlのガラスビーカーを使用して、磁気撹拌しながら電気ホッ
トプレート12、16(Fisher Scientific Isotempデジタル
ホットプレート(番号11-300-49SHP)で加熱が行われる。しかし、他の実施
形態が、サンプルを加熱したり冷却したりするのに使用され得ることが理解される。図1
aに示される実施形態において、サンプル容器20は、ガラス/プラスチック複合材の反
応チューブ(BioFire Diagnostics、番号1720、内径0.8mm
および外径1.0mm)である。しかし、他の実施例では、サンプル容器20として、皮
下注射針(Becton Dickenson、番号305187、内径0.042イン
チ、外径0.075インチ)と、ステンレス鋼管材料で構成されBioFireチューブ
のプラスチックの頂上部に適合させたステンレス鋼/プラスチック複合材の反応チューブ
(Small Parts、内径0.042インチ/外径0.075インチ、内径0.0
35インチ/外径0.042インチ、または内径0.0265インチ/外径0.035イ
ンチ)とを使用した。その他のサンプル容器も本発明の範囲内であるが、大きい表面積対
体積比を有し、速い熱伝達速度を有するサンプル容器が望ましい。所定の実施形態に関し
て、金属管材料の開放端をガス炎を使用して赤色から白色に加熱し、万力で圧縮すること
によって密封した。リアルタイムPCRの場合、光学的に透明であるか、または光学的に
透明な部分を有するチューブが望ましい。短時間の遠心分離によりサンプルを各チューブ
の底部に沈降させた。
けられたチューブホルダー22によって保持される。反応溶液が6.5~7.5cmの半
径で保持されるように2~5個のサンプル容器20を保持するためのチューブホルダー2
2を、黒いデルリン(Delrin)プラスチックから機械製作した(図1aでは1つの
サンプル容器20のみを図示したが、このようなサンプル容器20の列が存在してもよい
)。図1aでは図示されていないが、熱電対(Omega type T precis
ion細線熱電対、番号5SRTC-TT-T-40-36、36インチのリード線、0
.003インチの直径、テフロン(登録商標)製絶縁材を有する)を使用して、温度を測
定できる。図1bと類似したチューブホルダーおよびアームを示す図1dを参照すれば(
同様の数値は類似の構成要素を示す)、2つのサンプル容器を保持するように設計された
チューブホルダー222が存在しており、チューブホルダー222における一方の場所は
熱電対228によって占められている。本明細書で説明される実施形態のいずれにおいて
も、図1dで示されるように、任意の数のサンプル容器20または220を熱電対と共に
使用してもよいし、熱電対熱電対なしで使用してもよいことが理解される。熱電対による
増幅および線状化は、Analog Devices AD595チップ(示さず)を用
いて行われる。まず、T型電圧=(AD595の出力/247.3)-11μVに従って
、AD595の出力から熱電対の電圧を計算した。次いで、T型熱電対の電圧/温度相関
に関するアメリカ国立標準技術研究所の係数を使用して熱電対の電圧を温度に変換した。
アナログシグナルをデジタル化し(PCIe-6363収集ボード)、CPU40にイン
ストールされたLabViewソフトウェア(バージョン2010、National
Instruments)で処理し、ユーザーインターフェース42に表示した。例示的
には、ステッパーの動きを87~92℃および60~75℃で動的に引き起こすか、また
はコンピューターで制御された期間にわたり各水槽中にステッパーを保持してもよい。典
型的には30~50サイクルが行われる。
く移動して、サンプルが入っている各サンプル容器20の一部が完全に浸されるように、
ステッピングモーター24(Applied Motion Products、番号H
T23-401、3V、3A)が水槽10と水槽14との間に配置される。ステッピング
モーター24は、例示的には4SX-411nuDrive(National Ins
truments、示さず)で作動し、PCI-7344運動制御器とCPU40にイン
ストールされたNI-Motionソフトウェア(バージョン8.2、National
Instruments)とで制御される。ステッピングモーター24は、水槽10と
水槽14との間を約0.1秒で回転する。図2aは、90℃および50℃でステッパーの
動きが引き起こされた運転に関して、サンプル容器20の位置の軌跡(点線)の上にサン
プルの温度の軌跡(直線)を重ねて示す。図2からわかるように、50℃よりも低い温度
にいくつかのオーバーシュートがあるが、これは水槽14からサンプル容器20に移動さ
せるのに必要な時間によるものと推定される。したがって、上記で論じられたように、い
くらかより高い温度でステッピングモーター24を始動させることが望ましい場合がある
。以下の実施例において、示された温度は、到達したサンプルの温度であって、トリガー
温度ではない。図2aから計算された最大の加熱速度は385℃/秒であり、最大の冷却
速度は333℃/秒である。例示的には、エクストリームPCRは、少なくとも200℃
/秒の傾斜速度で行ってもよい。他の実施形態において、傾斜速度は、300℃/秒であ
ってもよいし、またはそれよりも大きくてもよい。
れる。図1aで示されるように、リアルタイムモニタリングの場合、サンプル容器20が
ステッピングモーター24により高温の水槽10から低温の水槽に移動したとき、このモ
ニタリング位置を保ちながら、または保たずにサンプル容器20が光ファイバーチップ5
0を通過するように、光学素子ブロック25の光ファイバーチップ50がサンプル容器2
0上に取り付けられる。この例示的な実施形態において、光ファイバーチップは、水槽の
上の空気中に提供される。熱的サイクリングデバイス4をCPU40によって制御してユ
ーザーインターフェース42に表示してもよい。
高温の水槽210および低温の水槽214の温度を制御するために備えられている。ステ
ッピングモーター224は、例示的にはアルミニウムで作製されたアーム221とチュー
ブホルダー222を動かしてサンプル容器220と熱電対228(図1dに示される)を
動かすために備えられている。しかし、この実施形態において、ブロック254を配置さ
せることにより、光ファイバーケーブル252のチップ250は水槽214中に保持され
る。光ファイバーケーブル252は、ポート248を介して水槽214に入り、光学素子
ブロック225にシグナルを与える。熱的サイクリングデバイス204をCPU240に
よって制御してユーザーインターフェース242に表示してもよい。
ーケーブル252(Ocean OpticsのP600-2-UV-VIS、ファイバ
ーコア直径600μm)によって440+/-20nmの励起干渉フィルター、ビーム分
割のための458nmのダイクロイックフィルターおよび490+/-5nmの放出フィ
ルター(全てSemrockより、示さず)を備えたHamamatsu Optics
の光学素子ブロック258に導いた。より低温の水槽中に配置されたきに、1つのサンプ
ルのキャピラリーからおよそ1~2mmの距離で一列に置かれた別の光ファイバーケーブ
ル(示さず)を用いて、キャピラリーの落射蛍光照明が達成された。放出検出は、Ham
amatsuのPMT62を用いて行われた。
水槽310、30~60℃の低温の水槽314、および70~80℃の中程度の温度の水
槽313を使用して、サンプル容器320中に入れられている1~5μlのサンプルの温
度を変化させ、磁気撹拌しながら3つの電気ホットプレート312、316、および31
8で加熱する。サンプル容器320は、アーム321でステッピングモーター324に取
り付けられたチューブホルダー322によって保持される。また熱電対328も、チュー
ブホルダー322によって保持される。ステッピングモーター324が回転するときに、
アーム321を持ち上げることができる。光ファイバーチップ350は、例示的には、中
程度の温度の水槽313中に提供されるが、図1aの場合のように空気中に置かれていて
もよいことが理解される。この例示的な実施形態の構成のために、3つの水槽310、3
13、および314を互いに等距離で設けることは不可能であった。したがって、サンプ
ルの冷却は高温の水槽310と低温の水槽314との間でなされることが望ましく、それ
に対してサンプルの加熱は、サンプルがその他の水槽間を移動することによってなされる
ために、高温の水槽310と低温の水槽314との間に最も大きいスペースを設けた。し
かし、この構成は単なる例示であり、他の構成も本開示の本質の範囲内であることが理解
される。2つのステッピングモーターが同時に使用されるために(一方はキャピラリーを
水から持ち上げるためであり、もう一方は水槽間を移動させるためである)、それぞれの
角運動を最小化することにより、槽間の運動時間を短くできる。2つの水槽によるシステ
ムでは、槽間でサンプルを移動させるのに必要なステッパーの角運動は、270度よりも
大きい。しかし、3つの水槽によるシステムでは、サンプルを持ち上げるステッピングモ
ーターは45度未満で横断する必要があり、一方でサンプルを水槽間で移動させるステッ
パーは、わずか90度またはそれ未満で移動する必要がある。また水槽は、必要な角運動
をさらに制限するために円形のセクター(扇形のくさび)として構成されてもよい。角運
動を最小化することにより、水槽間の移動時間が短くなる。100ミリ秒未満の移動時間
、または50ミリ秒未満もの移動時間が想定される。このシステム304の他の構成要素
は図1a~bに示されるシステム4、204と類似しており、図1cでは示されていない
。
l2、200μMの各dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、500μ
g/mlの非アセチル化ウシ血清アルブミン(Sigma)、2%(v/v)グリセロー
ル(Sigma)、50ngの精製ヒトゲノムDNA、および1×LCGreen(登録
商標)プラス(BioFire Diagnostics)を含有する5μlの反応体積
でPCRを行った。プライマー濃度およびポリメラーゼ濃度は、具体的な実験プロトコー
ルに従って変更した。Klentaq1(商標)DNAポリメラーゼをAB Pepti
des、St.Louis、MOまたはワシントン大学(St.Louis)のWayn
e Barnesのいずれかから得た。KlenTaqの分子量は62.1kDであり、
280nmにおける吸光係数は、配列から計算した場合、69,130M-1cm-1で
ある(米国特許第5,436,149号)。質量分析法で、優勢な分子量は62kDであ
ることが確認され、変性ポリアクリルアミドゲルで、主要なバンドは合計で80%より高
い純度を有することが示された。吸光度および純度を使用して濃度を計算したところ、1
0%グリセロール中、80μMのストックであることが示された。最終的なポリメラーゼ
濃度は、典型的には0.25~16μMであった。1μMのKlenTaqは、0.75
U/μlに等しく、この場合の1ユニットは、活性化サケ精子DNAを用いて72℃で3
0分で合成された生成物10nmolと定義される。ユタ大学のコア施設でプライマーを
合成し、脱塩し、濃度をA260によって決定した。各プライマーの最終濃度は、典型的
には2.5~20μMの間で様々であった。
TCCTTCTCTTGCCAGGCAT(配列番号2)を使用して、ヒトゲノムDNA
からKCNE1の45bpのフラグメントを増幅した。これらのプライマーは変異体rs
番号1805128(c.253G>A)を間に挟み、配列:CCCATTCAACGT
CTACATCGAGTCC(G/A)ATGCCTGGCAAGAGAAGGA(配列
番号3)を増幅した。
したPCR生成物の融解曲線が示され、この場合、0.64μMのKlenTaqおよび
10μMの各プライマーを使用して、図2bで示されるように91℃から50℃の間で、
35サイクルおよび28秒の総増幅時間でサイクリングされた。各サイクルは0.8秒を
要した。さらに図3aには、LightCyclerでの迅速サイクリングによって生成
した同じアンプリコンの融解曲線も示され、この場合、0.064μMのKlenTaq
および0.5μMの各プライマーを使用して、35サイクルおよび12分の総増幅時間で
、90℃から50℃の間でサイクリングされた(図2c)。各サイクルは10.3秒を要
した。図2bおよび2cでは時間の尺度が異なるため、図2bの全体のエクストリームP
CRプロトコールは、それに対応する迅速サイクルの2サイクル未満で完了することに留
意されたい。両方の反応により、類似のTmを有しゲル電気泳動で強いバンドを示すアン
プリコンが生産されたのに対し(図3b)、陰性対照は融解分析またはゲル電気泳動のど
ちらによっても増幅は示されなかった。この実例において、エクストリームPCR条件は
、ゲルで分析したところ(図3b)、迅速サイクルPCR条件よりも高い収量を示した。
融解曲線におけるTmの0.5℃の差は、ポリメラーゼ貯蔵緩衝液中のグリセロール含量
から生じる、各反応液におけるグリセロールの量の違いに起因すると考えられる(PCR
におけるグリセロールの最終濃度は、エクストリーム条件下では1.3%であり、迅速条
件下では0.1%であった)。また、図3bからも、アンプリコンのサイズが類似してお
り、予測通りであったことが確認される。加えて、ポリメラーゼ濃度とプライマー濃度と
が高いにもかかわらず、反応は特異的のようであり、非特異的生成物は認められなかった
。しかし、高解像度融解分析では3種の遺伝子型を区別することはできなかった。プライ
マーの総濃度に対するポリメラーゼの化学量論的なパーセンテージは、エクストリームP
CRの場合は3%であり、迅速サイクルPCRの場合は6.4%であった。
して、45bpのKCNE1の反応をリアルタイムでモニタリングした。図1aのデバイ
スを使用して、2つの水槽間の空気中のサンプルを各サイクルでモニターした。密封され
たチャンバーの空気の温度を70℃に保持し、各サイクル0.2秒でサンプルを調査した
。温度参照キャピラリーで測定しながら、サンプルを図3cで示されるように60℃から
90℃の間でサイクリングした。位置決めと測定の時間が追加されたために、サイクル時
間が0.8秒から1.12秒に増加した。したがって、50サイクルは56秒で完了した
。約30サイクルでの、すなわち約34秒後の蛍光の増加から、増幅が認められた(図3
c)。測定のためにサンプルが空気中にあり、ポリメラーゼの伸長速度が制限される間も
、温度はほぼ60℃に保たれた。
するが、少なくとも50サイクルまではプラトーにはならないようである。またこの反応
は64サイクル後に停止したため、アンプリコンの量が増加し続け、かなり後にならない
とプラトーに達しない場合もある。理論にとらわれずにいえば、プライマー濃度を増加さ
せることにより、収量を向上させ、さらに、プラトーを例示的にはCq後に20サイクル
、より例示的にはCq後に25サイクルまたはそれより多くのサイクル遅延させることが
できると考えられる。
34167)を間に挟む58bpのフラグメントを、プライマーCTACAGTGGGA
GTCACCTGC(配列番号4)およびGGTACTGAGCTGTGAAAGTCA
GGTT(配列番号5)を用いて増幅し、以下のアンプリコン:CTACAGTGGGA
GTCACCTGCTTTTGCC(A/G)AAGGGAACCTGACTTTCAC
AGCTCAGTACC(配列番号6)を生成した。実施例1で説明したようにして、図
1aに示される機器を使用してエクストリームPCRを行った。1μMのポリメラーゼ、
10μMの各プライマー、および1.3%グリセロールを使用した(全プライマーに対す
るポリメラーゼのパーセンテージは5%)。ポリメラーゼがより高い伸長速度を有する場
合、ポリメラーゼ伸長のために温度を70~80℃に増加させるために、様々な位置決定
プロトコールを使用した。アニーリング温度に達した後、モニターするために空気中で即
座に位置決定する代わりに、伸長温度に達するまでサンプルを高温の水槽に移した。次い
でサンプルを高温の水槽の真上の空気中に配置させて、図4aおよび4bに示した温度サ
イクルを生じさせることにより、70℃から77℃の間の最適な温度でより速いポリメラ
ーゼ伸長を可能にした。3種の異なる遺伝子型をそれぞれ、0.97秒のサイクルを使用
して39サイクルを38秒で完了させるエクストリームPCRによって増幅した。エクス
トリームPCRの後、LC24キャピラリーが適合するように改変されたHR-1機器で
各遺伝子型の高解像度融解曲線を得た。図4cから明らかなように、3種の遺伝子型全て
が予想通りに増幅され、区別された。
で同じであるが、見たところ図3aで観察されるTmのシフトの原因と思われるポリメラ
ーゼおよびプライマーの量、ならびにグリセロール濃度のわずかな差が認められた。この
実施例およびこの先全ての実施例において、グリセロール濃度は、必要に応じてその濃度
を均一化することにより2%に保持された。エクストリームPCRの場合、1μMのポリ
メラーゼおよび10μMの各プライマーを使用し、迅速サイクルPCRの場合、0.06
4μMのポリメラーゼおよび0.5μMの各プライマーを使用した。上記で論じられたよ
うに、より速いアニーリング時間は、プライマー特異性の向上をもたらすと考えられる。
この特異性の向上に伴い、増加させたプライマー濃度を使用してもよく、それにより、プ
ライマーの結合が促進されてアニーリング時間が短くなると考えられる。同様に、増加さ
せたポリメラーゼ濃度によりアニールしたプライマーへの結合も促進されて、完全な伸長
の前にポリメラーゼが離れた場合に、不完全なアンプリコンへの再結合も促進される。加
えて、ポリメラーゼ濃度が高ければ高いほど、PCRの後半でさえもより大量のプライマ
ーが結合したテンプレートが一度に伸長でき、1つのポリメラーゼが伸長させなければな
らないテンプレート数が少なくなるため、全体の伸長時間が短くなる。
Rサイクリングの結果を要約する。この実施例において、インターロイキン10ベータ受
容体の49bpのフラグメントを、プライマーGGGAGTCACCTGCTTTTGC
C(配列番号7)およびTACTGAGCTGTGAAAGTCAGGTTCC(配列番
号8)、ならびに3mMのMgCl2を用いて増幅して、GGGAGTCACCTGCT
TTTGCCAAAGGGAACCTGACTTTCACAGCTCAGTA(配列番号
9)を生成した。各エクストリームPCR反応で、図1bに示されるデバイスを、リアル
タイムでモニタリングせずに使用した。図5bで示されるように、26秒より少し短い総
反応時間(0.73秒のサイクル)で、90℃から63℃の間で35サイクルで温度をサ
イクリングした。図5aで示されるようにポリメラーゼおよびプライマーの量を変更した
こと以外は、実施例1で論じられた通りの反応条件を用いた。図5aの縦軸は、HR-1
機器で正規化しないで得られた融解曲線の負の微分プロットのピークとして数値化したも
のである。0.5μMのポリメラーゼでは、いずれのレベルのプライマー濃度でも実質的
に増幅は観察されなかった。しかし、1.0μMのポリメラーゼでは、5μMおよびそれ
を超えるプライマー濃度で認識できるレベルの増幅が観察された。ポリメラーゼレベルが
増加するにつれて、アンプリコンの量も最大約4μMのレベルまで増加する。8μMのポ
リメラーゼでは、アンプリコンの量はプライマー濃度に応じてプラトーになるかまたは低
下し、より低いプライマー濃度では16μMで有意な低下がみられた。これらの49bp
の生成物の場合のエクストリーム温度サイクリング条件下では、ポリメラーゼの好ましい
濃度範囲は、プライマー濃度に応じて、約1μMから8μMの間であり、より具体的には
2μMから8μMの間であると考えられる。
5μMのプライマーでは、2~8μMのKlenTaq濃度を用いたところ増幅が成功し
、増幅は濃度の増加に伴い向上し続けた。約10~20μMのプライマー濃度を用いたと
ころ優れた増幅が達成された。図5cは、4μMのKlenTaqで様々なプライマー濃
度を用いた場合の融解曲線を示し、一方で図5dは、プライマー濃度を10μMに保持し
ながらポリメラーゼ濃度を変更したときの生成物のサイズを実証している。高濃度のポリ
メラーゼおよびプライマーにもかかわらず、非特異的増幅は観察されていない。
、酵素の量とプライマーの量との比率が、エクストリームPCRサイクリングにとって重
要であると考えられる。上記の量は、各プライマーをベースにして示されることに留意さ
れたい。ポリメラーゼが二重鎖になったプライマーのそれぞれに結合することを考えれば
、プライマーの総濃度が最も重要である場合がある。KlenTaqの場合、好適な比率
は0.03~0.4(プライマーの総濃度に対して3~40%の酵素)であり、例示的に
は最小で約0.5μMのKlenTaq濃度であり、より例示的には、エクストリームP
CRの場合、約1.0μMである。プライマーは、等モル量で提供されてもよいし、また
は非対称PCRの場合のように一方が過量に提供されてもよい。最適なポリメラーゼ:プ
ライマーのパーセンテージはまた、温度サイクリング条件と生成物のサイズにも依存し得
る。例えば、標準的な(遅い)温度サイクリングは、かなり低いプライマーに対するポリ
メラーゼのパーセンテージを使用することが多く、典型的には、1.5nM(0.04U
/μl)のポリメラーゼ(49)および0.15%のパーセンテージの1,000nMの
プライマーの総濃度が使用され、これは、エクストリームPCRに関して有効であると見
出されたパーセンテージよりも10倍以上低い。
ポリメラーゼおよび20μMの各プライマーを用いて、実施例3におけるのと同じPCR
標的を増幅した。全プライマーに対するポリメラーゼのパーセンテージは20%であった
。図1bの機器で増幅を行ったところ、各0.46秒で35サイクル(図6a)、91℃
から59~63℃の間のサイクリングを使用して、16秒で増幅が完了した。サイクリン
グ中の最大の加熱速度は407℃/秒であり、最大の冷却速度は815℃/秒であったこ
とから、保持を行わずに400℃/秒より速い傾斜速度でPCRを実行できることが実証
された。4%NuSieveの3:1アガロースゲルでの生成物分析により、正しいサイ
ズの強い特異的なバンドが現れた(図6b)。テンプレート非含有対照は、49bpで生
成物を示さなかったが、陽性サンプルに類似した顕著な量のプライマーバンドを示した。
(配列番号10)およびCGTCTGCTGGAGTGTGCCCAATGCTATA(
配列番号11)、ならびにリアルタイム要素を用いない図1bの機器を使用して、NQO
1遺伝子の102bpのフラグメントを増幅した。ポリメラーゼ濃度を0.25から4μ
Mの間で変更し、各プライマー濃度を0.5から8μMの間で変更した。併合されたアニ
ール/伸長期での伸長がポリメラーゼにとってより最適な温度で起こるように、より高温
で(低出力で70秒)アニールするようにプライマーを設計した。これらの温度でのより
速い重合速度は、より長い生成物の増幅を可能にすると期待された。より低温の水槽を7
2℃に制御して、アニール/伸長期の終了を温度ではなく時間(1秒)で誘発した。30
サイクルの間の72℃から90℃の間のサイクリングには、1.93秒のサイクルを使用
したところ58秒を要した(図7a)。図7aで観察されるように、サンプルの温度は、
空気を通って高温の水槽まで移動する間にアニール/伸長温度から約3℃低くなる。図7
bは、図5aに示されるように融解曲線を定量することによって得られた増幅した生成物
の量を示す。融解曲線分析では、84℃のTmを有する唯一の生成物が示された。0.2
5μMのポリメラーゼまたは1μMの各プライマーでは極めてわずかな生成物しか観察さ
れなかった。2μMの各プライマーでもある程度の増幅は起こり、最良の増幅は2~4μ
Mのポリメラーゼおよび8μMの各プライマーで起こる。2~4μMのプライマー濃度で
は、ポリメラーゼ濃度が増加するにつれて収量は減少するが、これは8μMのプライマー
濃度では観察されなかった。熱的サイクリングおよび標的長さが実施例3とは異なるが、
プライマーの総濃度に対するポリメラーゼ濃度が、3.1から50%のときに最良の増幅
が起こる。
の135bpおよび337bpのフラグメントをエクストリームPCRにより増幅した。
エクストリームPCRに対する生成物の長さの影響と、様々なプライマーの起こり得る交
絡的影響の調整を研究するために、まず共通の5’末端伸長部分を有するプライマーを使
用してゲノムDNAからフラグメントを増幅した。135bpのフラグメントの場合、プ
ライマーは、ACACACACACACACACACACACACACACACACAC
ACAAAAATTCAGTGGCATTAAATACG(配列番号12)およびGAG
AGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAG
AGAAAAACCAGAGCTAAAGGGAAG(配列番号13)であった。337
bpのフラグメントの場合、プライマーは、ACACACACACACACACACAC
ACACACACACACACACAAAAAGCTGGTGTCTGCTATAGAA
CTGATT(配列番号14)およびGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAG
AGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAAAAAGTTGCCAGAGCTA
AAGGGAAGG(配列番号15)であった。ゲノムDNAからの標準的なPCR増幅
の後に、プライマーおよびdNTPをExoSAP-IT(Affymetrix、CA
)によって分解し、続いてQuickStep(商標)2PCR精製キット(カタログ番
号33617、Edge BioSystems、Gaithersburg、MD)を
使用してPCR生成物を精製した。PCR生成物をおよそ100万倍に希釈し、標準的な
リアルタイムPCRにより得られたCqを等しくすることにより等しい濃度に調節し、2
5サイクルのCq(反応液10μlあたりおよそ10,000コピー)を達成した。
よび2%グリセロールと共に共通のプライマーACACACACACACACACACA
CACACACACACACACACAAAAA(配列番号16)およびGAGAGAG
AGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAA
AAA(配列番号17)をそれぞれ2μMで使用してエクストリームPCRを行った。1
35bpのBBS2フラグメントからは226bpの生成物が得られ、(プライマーに応
じて)176塩基または185塩基の伸長を必要としたが、337bpのBBS2フラグ
メントからは428bpのPCR生成物が得られ、378塩基または387塩基の伸長を
必要とした。アガロースゲルで、さらに融解分析によって特異的増幅を検証した。図8a
に、226bpの生成物に使用された、75℃の1秒の併合されたアニール/伸長および
87℃の変性を含むエクストリームPCRの温度プロファイルを示す。さらに同じ温度で
2秒のアニール/伸長期も行った(軌跡示さず)。図8cに示されたこれらの増幅に関す
るリアルタイムPCRの結果から、1秒の伸長を用いた場合、2秒の伸長と比較してCq
が約5サイクル高くシフトしたことが明らかになったが、これはおそらく伸長時間が短く
なるにつれて効率も減少したことを反映しているものと思われる。図8bに、75℃の4
秒の併合されたアニール/伸長および87℃の変性を示し、これは、428bpの生成物
に使用されたエクストリームPCRの温度プロファイルを示す。さらに同じ温度で5秒の
アニール/伸長期も行った(軌跡示さず)。図8dに示されたこれらの増幅に関するリア
ルタイムPCRの結果から、4秒の伸長を用いた場合、5秒の伸長と比較してCqが約2
サイクル高くシフトしたことが明らかになったが、これはおそらく伸長時間が短くなるに
つれて効率も減少したことを反映しているものと思われる。
pのフラグメントに関して、ヒトゲノムDNAの希釈系列を使用して、NQO1には2μ
MのKlenTaqおよび8μMの各プライマー、ならびにKNCE1には8μMのKl
enTaqおよび20μMの各プライマーを使用して、図1bのリアルタイム機器を使用
してPCRの定量性能を評価した。図9aおよび図9bでみられるように、少なくとも4
0のダイナミックレンジを用いたところ、標準曲線から計算された増幅効率は、NQO1
では95.8%であり、KCNE1では91.7%であった。テンプレート不使用の対照
反応では、50サイクル後に増幅は起こらず、単一コピーの複製物(平均コピー数は、1
反応あたり1.5コピー)は、増幅曲線の形状および強度においてより高い濃度と類似し
ていた(図9Aおよび図9C)。0.15コピー/反応の平均コピー数では、二項展開に
より計算された0.13コピー/反応の期待値を用いたところ、(NQO1の試験とKC
NE1の試験の両方を合わせた)17の反応のうち2つの反応が陽性であった。
(図10a~c)。様々なプライマーの起こり得る交絡的影響を調整するため、100~
500bpの合成テンプレートと共に以下の共通の高いTm(77℃)を有するプライマ
ーを使用した。
ACTCGCACGAACTCACCGCACTCC(配列番号18)およびGCTCTCACTCGCACTCTCACGCACA(配列番
号19)
100bpのテンプレート:
ACTCGCACGAACTCACCGCACTCCGGATGGATTGTGAAGAGGCCCAAGATACTGGTCATATTATCCTTTGATCTAGCTCT
CACTCGCACTCTCACGCACA(配列番号20)
ACTCGCACGAACTCACCGCACTCCTCAATGCTGACAAATCGAAAGAATAGGAATAGCGTAATTACTAGAGGACTCCAATA
TAGTATATTACCCTGGTGACCGCCTGTACTGTAGGAACACTACCGCGGTTATATTGACAGCTTAGCAATCTACCCTGTTG
GGATCTGTTTAAGTGGCTCTCACTCGCACTCTCACGCACA(配列番号21)
ACTCGCACGAACTCACCGCACTCCCCTTCGAATATAAAGTACGACATTACTAGCAATGACAGTTCCAGGATTTAAGAAAG
TAGTGTTCCACATCAATGCATATCCAGTGAAAGCATAACGTCAAAAAAAGCCTGGCACCGTTCGCGATCTGGACTTACTT
AGATTTGTTGTAGTCAAGCCGGCTATCAGCGATTTATCCCGGAAACACATACTAGTGAGTTATTTGTATGTTACCTAGAA
TAGCTGTCACGAATCACTAATACATTCACCCACCAGCTCTCACTCGCACTCTCACGCACA(配列番号22)
ACTCGCACGAACTCACCGCACTCCTGAATACAAGACGACAGTCCTGATTATATTTTCATTTAATTACGCCAATTTAATTA
TGATGAATATTAACGGAATTAAATATGTATTGATAAGTACTAAGTAATGGTTTACCCACGGCGATCTATATGCAAGGGAA
ACATTAACAAATTTAAACATCTGATGTGGACAAAACTTGTAATGTGGTATAGTTAAAAATATAGGTTTCAGGGACACGTA
AGTATCTATCTTGAATGTTTAAGTAGGTCCTGTCTACCATTCTGAAATTTAGAAAATCGCGTTCATCGGGCTGTCGGCTA
CACCTCAGAAAACCATTTCGTGTTGCACAGGAGGAACTTTCGAGGGTTCGTATGAGCTCTCACTCGCACTCTCACGCACA
(配列番号23)
ACTCGCACGAACTCACCGCACTCCACCGCTTGACGACGTAGGGTATTTGGTATCTGAATCTACTCATTTACCTACATACT
GAAGATTTTGCGATCGTCTAATATATTGGACTAATGCCCGATTTCTGATCAATTACTCTAGGCGATACTTCATCGCTGGC
CTTATTTGGATTTTGCTCAAGTGCTAAACTCTCTGCGCGTCAATACTAGTCTGACATCAGTCAAGACCTGCTATCTGAAA
ACTACTAGAGAGATATACCTAACAACTTTAGTGGATAAATCAGGTCTGGAGATTGTCATATAATGCCACTAGGGTCAGAA
GGCTGTGTCAAAGTTAGTGGTTAGTAGGTCTCCGCTCTGCGGTACTATTCTTATATTCTCTTACTATGCATCAAACAAAA
TAGAATGCATAGACAAACCGCCTGCCAAGTTTACAAGATAACTTGCGTATAGGTTTATAAGGGTTCTTCTGTATCGCTCT
CACTCGCACTCTCACGCACA(配列番号24)
セグメントを1サイクルあたり4.9秒で使用して、プライマーおよびポリメラーゼの最
適な濃度を決定した(図10a)。次いで全ての生成物の長さに関して、同一のプライマ
ー濃度(4μM)およびポリメラーゼ濃度(2μM)を使用して、最小の伸長時間を決定
した(図11a~e)。生成物の長さに応じて、伸長時間が増加すると、さらなる変化が
観察されなくなるまでの定量サイクル(Cq)がわずかに減少したことから、効率的なP
CRに必要な最小の伸長時間が示された。例えば、図10Bに、KAPA2G(商標)F
ASTポリメラーゼ(Kapa Biosystems)を使用した500bpの生成物
に関する増幅曲線を示す。KAPA2G FASTポリメラーゼを使用した場合の最小の
伸長時間は3秒であり、これに対してKlenTaq1(Taqポリメラーゼの欠失突然
変異体、AB Peptides)を使用した場合は7秒であった。ポリメラーゼの同一
性が一定に維持される場合、より長い生成物はより長い伸長時間を必要とした(図10c
)。KlenTaq1ポリメラーゼの場合、60bpごとに約1秒を要し、一方でKAP
A2G FASTポリメラーゼの場合、158bpごとに1秒を要する。これらの2種の
ポリメラーゼは十分な濃度で市販されているが、その他ほとんどのポリメラーゼはこのよ
うな高濃度では市販されていないために、これらのポリメラーゼが選ばれたことに留意さ
れたい。伸長に必要な時間は、伸長させようとする長さに直接的かつ直線的に依存してお
り、ポリメラーゼ濃度およびポリメラーゼ速度とは反比例することが理解される。これら
の3種のパラメーターを関連付ける比例定数(k2)は、以下のように定義することがで
きる。
必要な伸長時間=k2*(伸長の長さ)/([ポリメラーゼ]*(ポリメラーゼ速度))
イマー:GCTTGGAAGATTGCTAAAATGATAGTCAGTG(配列番号
25)およびTTGATCATACTGAGCCTGCTGCATAA(配列番号26)
を用いてAKAP10の60bpのフラグメントを増幅し、アンプリコンGCTTGGA
AGATTGCTAAAATGATAGTCAGTGAC(A/G)TTATGCAGC
AGGCTCAGTATGATCAA(配列番号27)を生成した。
.07秒、60℃の水槽中で0.1~0.4秒)、2~7mMのMgCl2を使用して行
われた。サンプル体積は1μlであり、5ngのヒトゲノムDNA、20μMのプライマ
ー、および8μMのポリメラーゼを含んでいた。1サイクルあたり0.42秒のプロトコ
ールを使用したところ、MgCl2が2~3mMのときに、融解曲線(図12a)および
ゲル(図12b)で生成物は観察されなかった。4mMで最低限の生成物が存在したが、
5~7mMのMgCl2で増幅した後に大量の生成物が観察された。5mMのMgCl2
では、0.32秒のサイクル時間を用いた場合、融解曲線(図13a)およびゲル(図1
3b)で生成物は観察されなかったが、0.42秒、0.52秒、および0.62秒のサ
イクル時間では大量の生成物が示され、このことは、15秒(14.7秒で35サイクル
)で行われたPCRにおいて特異的な高収量の60bpの生成物が得られることを実証し
ている。したがって、例示的なMg++濃度は、少なくとも4mM、少なくとも5mM、
少なくとも6mM、少なくとも7mM、またはそれより高く、これらの例示的なMg++
濃度は、本明細書で説明される実施形態のいずれかと共に使用できることが理解される。
いサイクル速度で使用すると有害作用を有する場合がある。それぞれ32倍または106
倍遅い迅速サイクルまたはブロックベースの機器では、非特異的生成物が生じた。図14
a~bは、実施例9で使用されたAKAP10の60bpの生成物の増幅を比較した結果
を示すが、この場合、増幅は、20μMの各プライマー、8μMのKlenTaq、およ
び10ngのヒトゲノムDNAを使用して、(1)およそ17秒の総時間をもたらす94
°で0.5秒および60°で0.2秒の設定時間を用いたエクストリームPCR、(2)
およそ9分の総時間をもたらす94°で10秒の最初の変性、続いて0秒で85°および
0秒で60°のサイクルの設定時間を使用した迅速サイクルPCR(Roche Lig
htCycler)、および(3)およそ30分の総時間をもたらす94°で10秒の最
初の変性、続いて85°で0秒および60°で5秒の温度サイクリングを用いた旧来の(
ブロック)温度サイクリング(BioRad CFX96)を40サイクルで使用して行
われた。示されたように、LightCyclerの迅速サイクリングでさえもかなりの
非特異的増幅を生じたが、エクストリームサイクリング条件では単一の融解ピークと、ゲ
ルにおける最小の非特異的増幅が達成された。
ラーゼ濃度によっても収量が強化される。比較のために定量的PCRを使用したところ、
エクストリームPCRは迅速サイクルPCRと比較して30倍を超える量の生成物を生産
した(データ示さず)。
たはこれらの構成にわずかな改変を施したものを使用して行われた。しかし、本明細書で
説明される方法および反応は、様々な機器で起こる場合があることが理解される。これら
の実施例で使用される水槽およびチューブは、濃度を高めたプライマーおよびポリメラー
ゼの作用を研究するのに十分な迅速な温度変化をもたらす。しかし、他の実施形態が商業
的により好適である場合がある。低容量および高い表面積対体積比のマイクロ流体システ
ムが、エクストリームPCRによく適している場合がある。このようなシステムは、エク
ストリームPCRで使用される高濃度のプライマーおよびポリメラーゼで求められる迅速
な温度変化を可能にする。マイクロ流体システムは、サンプルを変性ゾーン、アニーリン
グゾーン、および伸長温度ゾーンに繰り返し通す小型化されたチャネルを取り入れたマイ
クロフローシステム(35、53)を包含する。これらのシステムのいくつかは、複雑度
がより低い標的で3秒もの速いサイクル時間の有効なPCRであることがすでに実証され
ている。ポリメラーゼが少なくとも0.5μMの濃度で提供され、プライマーはそれぞれ
少なくとも2μMの濃度で提供される場合、このようなシステムでより複雑な標的を増幅
できることが期待される。また定置式のPCRチップおよびPCR液滴形成システム(5
4)は、1nlまたはそれ未満もの小さい体積が可能であり、さらに極めて迅速なサイク
リングを許容するほど十分に低くできることから、プライマーおよびプローブの濃度の増
加によって利益を得る場合もある。より遅いサイクル速度でより高いプライマー濃度を用
いることに伴う特異性を損なうことなく増加させたプライマー濃度およびポリメラーゼ濃
度を利用できるほど十分速く機器の温度がサイクリングするのであれば、本発明にとって
正確な機器は重要ではないことが理解される。
核酸増幅方法にも増加したプライマー濃度および酵素濃度とより短い増幅時間との組み合
わせが想定されることが理解される。規模を増加させることができる例示的な酵素活性と
しては、重合(DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼまたは逆転写酵素)、ライゲー
ション、へリックスの巻き戻し(ヘリカーゼ)、またはエキソヌクレアーゼ活性(5’か
ら3’または3’から5’)、鎖の置換および/もしくは切断、エンドヌクレアーゼ活性
、ならびにDNA/RNAハイブリッドのRNA消化(RNアーゼH)が挙げられる。増
幅反応としては、これらに限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、
転写介在増幅(例えば転写ベースの増幅システム、自家持続配列複製法、および核酸配列
ベースの増幅など)、鎖置換増幅、全ゲノム増幅、多置換増幅、アンチセンスRNA増幅
、ループ介在増幅、線形結合増幅(linear-linked amplificat
ion)、ローリングサークル増幅、分岐増幅(ramification ampli
fication)、等温オリゴヌクレオチド増幅、ヘリカーゼ連鎖反応、および連続侵
入シグナル増幅(serial invasive signal amplifica
tion)などが挙げられる。
イマーを包含する反応の場合、プライマー濃度が変化すると、同じ倍率で増幅時間は反比
例して変化する。プライマーと酵素の両方が増幅に必要な場合、反応速度を最大化するた
めには酵素濃度とプライマー濃度の両方を変化させるべきである。増幅サイクルの固有の
セグメント(例えば、3温度PCR中の固有の温度)でプライマーのアニーリングが起こ
る場合、そのセグメントにおいてプライマーのアニーリングが十分に完了するのに必要な
時間は、プライマー濃度と反比例すると予想される。同様に、増幅サイクルの固有のセグ
メント(例えば、3温度PCR中の固有の温度)で酵素活性が必要な場合、そのセグメン
トにおいて酵素的なプロセスが十分に完了するのに必要な時間は、所定の範囲内で酵素濃
度に反比例すると予想される。プライマー濃度または酵素濃度の変更は、それら個々のセ
グメントに要する時間を変化させるのに使用でき、または同じ条件下で(例えば2温度P
CRにおいて、または等温反応プロセス中に)その両方が起こる場合、1つの反応が反応
速度を制限しないように両方の濃度の変更が必要であることが予想される。増幅プロセス
をさらに加速するために、Mg++濃度の増加を酵素濃度およびプライマー濃度の増加と
組み合わせて使用してもよい。より高いMg++濃度は、プライマーのアニーリングの速
度を増加させ、かつ核酸増幅で使用される多くの酵素反応にかかる時間を短くする。
ントと共に使用される場合、特に有用である。時間を短くしないでより高い濃度を使用す
ると、いくつかのケースにおいて、反応の「ストリンジェンシー」が低下するために非特
異的な増幅生成物が生じる場合がある。増幅時間またはセグメント時間(秒)を短くする
ことは、増加した反応物濃度によるストリンジェンシーの損失を埋め合わせるように見え
るより高いストリンジェンシーを導入する。逆に言えば、増幅時間またはセグメント時間
を増加させることによりこれらのより低い濃度を相殺すれば、反応物濃度を低下させるこ
とによって試薬のコストを最小化できる。
0kbである場合のPCRに必要な時間を短くできる。大きい標的を増幅するには、典型
的には10分~30分の伸長期間が使用されるが、これはなぜなら、1)ポリメラーゼが
単一の標的の伸長を完了させるため、および2)再利用された酵素が、追加のプライマー
が結合したテンプレートを重合させるためにそのような時間が必要になるほど大きい標的
が長いためである。PCRの開始時には、利用可能な酵素のほうがプライマーが結合した
テンプレート分子よりも多く存在するため、このようなポリメラーゼの再利用は必要ない
。しかし、対数期が終わる前でも、ポリメラーゼ分子の数が限界になることがしばしばあ
り、酵素の再利用が必要である。ポリメラーゼ濃度を増加させることによって、高いプラ
イマー濃度に起因する収量増加を維持しつつ必要な伸長期間を5分未満まで、場合によっ
ては2分未満まで短くできる。実際の酵素の速度は増加しないが、それほど再利用は必要
ではなく、必要な最小の時間は、ほぼ直線的に酵素濃度の影響を受ける。
時間も短くできる。典型的には、標準的なサイクルシーケンシングにおいて、プライマー
濃度は0.16μMであり、併合されたアニール/伸長期間は50~60℃で10分であ
る。プライマー濃度とポリメラーゼ濃度とを10倍増加させることによって、アニール/
伸長に必要な時間をおよそ10倍短くできる。長いPCRとサイクルシーケンシングの両
方において、予想される必要な時間は、ポリメラーゼまたはプライマー濃度のどちらか限
定的なほうに反比例する。
/またはMg++とを組み合わせることによって、大規模並列配列決定のための調製にお
いてプライマーとして使用されるリンカーがライゲーションしたフラグメントのPCRを
、現行のものよりもかなり短い時間で完了させることができる。
される。当業者であれば、高いプライマー濃度およびポリメラーゼ濃度は非特異的増幅に
よる問題を引き起こすことを想像するであろうが、全体のサイクル時間および/または個
々のセグメント時間を最小化することにより、PCRの高い特異性および効率がもたらさ
れる。
に関するポリメラーゼおよびプライマー濃度の最適化実験以外の全てのデータが示される
。表3に、変数間の定量的な関係が詳述されている。必要なアニーリング時間をプライマ
ー濃度に関連付ける反比例関係はほぼ一定(k1)であり、方程式(必要なアニーリング
時間)=k1/[プライマー]によって定義される。旧来の(標準)PCR、迅速サイク
ルPCR、およびエクストリームPCRの条件下でこれらの変数の典型的な値の範囲を使
用することにより反比例定数の範囲が得られ、その大部分は重複している(旧来のPCR
は0.75~30、迅速サイクルPCRは0.2~10、およびエクストリームPCRは
1~20である)。この反比例定数によって、現行のものの範囲から外れる望ましいアニ
ーリング時間は、望ましい時間に必要なプライマー濃度を予測するのに使用できる。例え
ば、0.01秒のアニーリング時間で5(秒*μM)の定数を使用すれば、500μMの
プライマー濃度の計算が可能である。逆に言えば、0.01μMのプライマー濃度が望ま
しい場合、必要なアニーリング時間は500秒と予想される。これらの条件は旧来のPC
RおよびエクストリームPCR両方の範囲の外側であるが、これらの条件によりPCRの
成功に有用なプライマー濃度とアニーリング時間との関係が予測される。旧来のPCR、
迅速サイクルPCR、およびエクストリームPCR全てにおいて適切なk1の範囲は、0
.5~20(秒×μM)であり、より好ましくは1~10(秒×μM)であり、最も好ま
しくは3~6(秒×μM)である。
メラーゼ速度、および増幅させようとする生成物の長さとを関連付けることができる。し
かし、長期にわたり様々な実験室で行われてきた旧来のPCR、迅速サイクルPCR、お
よびエクストリームPCRに影響を与える多くの追加の変数(ポリメラーゼ、Mg++、
緩衝液)については、本明細書において変数間の反比例関係を確立するために示されたよ
く制御されたエクストリームPCR条件を調べることが最善である場合がある。それによ
り、エクストリームPCR条件下でのポリメラーゼ濃度、ポリメラーゼ速度、生成物の長
さ、および必要な伸長時間を定量的に表すことができる。定義方程式は、(必要な伸長時
間)=k2(生成物の長さ)/([ポリメラーゼ]*(ポリメラーゼ速度))である。実
験的に決定されたk2は、上記の方程式において、温度、Mg++、ポリメラーゼのタイ
プ、緩衝液、添加剤、およびdsDNA色素濃度を一定にした条件下での比例定数と定義
される。[ポリメラーゼ]および[プライマー]の二次元最適化がなされた3種のエクス
トリームPCR標的に関して、プライマー濃度全体にわたり成功した増幅の境界線にある
[ポリメラーゼ]を見極めて、他の3つの変数と関連付けることができる。表3で示され
るように、これらの3種の異なる標的に関するk2値は2未満の倍率で変化していること
から、k2は定数であり、他方がわかっているときにある変数を予測するのに使用できる
と推測される。必要な伸長時間は、伸長の長さ(生成物の長さからプライマーの長さを引
いた長さ)に比例し、ポリメラーゼ速度とポリメラーゼ濃度に反比例する。k2は(1/
μM)の単位で示され、本明細書において使用されるエクストリームPCR条件にとって
最適な値は、0.3~0.7(1/μM)の範囲のうち0.5(1/μM)である。ポリ
メラーゼのタイプ、Mg++濃度、または異なる緩衝液もしくは色素の状態の点で異なる
他の反応条件でも、類似のk2値が誘導される場合がある。
クストリームPCRを行うことができる。標準的なチューブおよびキャピラリーに加えて
、油のストリーム中に懸濁した水性反応物の微小液滴または薄い2次元ウェーハが、優れ
た熱的接触をもたらす。エクストリームPCRの速さに必要な温度制御のための優れた方
法は、空間的なセグメントを様々な温度で通過するサンプルストリームの連続流PCR(
液滴として分散する、気泡で分離する、または他の手段で混合を防ぐことのいずれか)で
ある。
記載および定義された本発明の範囲および趣旨内にある変更形態および改変形態が存在す
る。
Claims (21)
- 標的核酸に対して、各サイクルが1サイクルあたり20秒未満のサイクル時間で完了する温度サイクリングプロファイルを使用したPCRを行うためのキットであって、
dNTPと、
ポリメラーゼと、
前記標的核酸を増幅するように構成された一対のプライマーと
を含み、
前記ポリメラーゼが、前記dNTP、前記一対のプライマーおよび前記標的核酸と混合されたときに少なくとも0.5μMの濃度になるような濃度で提供され、かつ、前記プライマーのそれぞれが、前記dNTP、前記ポリメラーゼおよび前記標的核酸と混合されたときに少なくとも2μMの濃度になるよう濃度で提供される、キット。 - それぞれの前記プライマーの濃度が、2.5μMより大きい、請求項1に記載のキット。
- 少なくとも4mMの前記Mg++をさらに含む、請求項1に記載のキット。
- 各サイクルが1サイクルあたり20秒未満のサイクル時間で完了する温度サイクリングプロファイルを使用してPCRを行うための説明書をさらに含む、請求項1に記載のキット。
- 前記サイクル時間が1サイクルあたり10秒未満である、請求項4に記載のキット。
- 前記ポリメラーゼが、少なくとも1.0μMの濃度で提供されるKlenTaq(商標)である、請求項1に記載のキット。
- 前記標的核酸が真核生物由来であり、真核生物ゲノムDNAを増幅するように構成されている、請求項1に記載のキット。
- 標的核酸に対して、各サイクルが1サイクルあたり20秒未満のサイクル時間で完了する温度サイクリングプロファイルを使用したPCRを行うためのキットであって、
dNTPと、
熱安定性ポリメラーゼと、
前記標的核酸配列を増幅するように構成されたプライマーと
を含むキットであって、前記ポリメラーゼとプライマーの比率が、(約0.03~約0.4のポリメラーゼ):(プライマーの総濃度)であり、前記ポリメラーゼの濃度が少なくとも0.5μMである、キット。 - 前記プライマーが少なくとも5μMの総濃度である、請求項8に記載のキット。
- 前記ポリメラーゼが、少なくとも1.0μMの濃度で提供されるKlenTaq(商標)である、請求項8に記載のキット。
- 各サイクルが1サイクルあたり20秒未満のサイクル時間で完了する温度サイクリングプロファイルを使用してPCRを行うための説明書をさらに含む、請求項8に記載のキット。
- 前記サイクル時間が1サイクルあたり10秒未満である、請求項8に記載のキット。
- 前記標的核酸が真核生物由来であり、真核生物ゲノムDNAを増幅するように構成されている、請求項8に記載のキット。
- 標的とする真核生物DNAに対して、各サイクルが1サイクルあたり20秒未満のサイクル時間で完了する温度サイクリングプロファイルを使用したPCRを行うための反応混合物であって、
dNTPと、
少なくとも0.5μMの濃度で提供されるポリメラーゼと、
少なくとも2μMの濃度でそれぞれ提供される、前記標的とする真核生物DNAを増幅するように構成された一対のプライマーと、
真核生物ゲノムDNAのサンプルを
を含む、反応混合物。 - それぞれの前記プライマーの濃度が、2.5μMより大きい、請求項14に記載の反応混合物。
- 少なくとも4mMの前記Mg++をさらに含む、請求項14に記載の反応混合物。
- 各サイクルが1サイクルあたり20秒未満のサイクル時間で完了する温度サイクリングプロファイルを使用してPCRを行うための説明書をさらに含む、請求項14に記載の反応混合物。
- 前記サイクル時間が1サイクルあたり10秒未満である、請求項17に記載の反応混合物。
- 前記ポリメラーゼが、少なくとも1.0μMの濃度で提供されるKlenTaq(商標)である、請求項14に記載の反応混合物。
- PCRを行うためのデバイスであって、
PCRサンプルを保持するためのサンプル容器と、ここで、前記サンプル容器が、標的核酸と、dNTPと、少なくとも0.5μMの濃度で提供されるポリメラーゼと、少なくとも2μMの濃度でそれぞれ提供される前記標的核酸を増幅するように構成された一対のプライマーとを含み、
前記サンプル容器中のサンプルの温度を変化させるための熱伝達デバイスと、ここで、前記熱伝達デバイスがジュール加熱および複数の温度ゾーンを含み、前記サンプル容器が前記温度ゾーンのそれぞれにおいて流路を画定し、
前記サンプルを少なくとも200℃/秒の傾斜速度で繰り返し加熱および冷却するように前記熱伝達デバイスを制御するための温度制御器と、ここで、前記温度制御器が、前記温度ゾーンのそれぞれへの前記サンプルのフローを制御する、
を含むデバイス。 - PCRを行うためのデバイスであって、
PCRサンプルを保持するためのサンプル容器と、ここで、前記サンプル容器が、標的核酸と、dNTPと、少なくとも0.5μMの濃度で提供されるポリメラーゼと、少なくとも2μMの濃度でそれぞれ提供される前記標的核酸を増幅するように構成された一対のプライマーとを含み、
前記サンプル容器中のサンプルの温度を変化させるための熱伝達デバイスと、ここで、前記熱伝達デバイスが複数の温度ゾーンを含むヒートブロックであり、前記サンプル容器が前記温度ゾーンのそれぞれにおいて流路を画定し、
前記サンプルを少なくとも200℃/秒の傾斜速度で繰り返し加熱および冷却するように前記熱伝達デバイスを制御するための温度制御器と、ここで、前記温度制御器が、前記温度ゾーンのそれぞれへの前記サンプルのフローを制御する、
を含むデバイス。
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201261651161P | 2012-05-24 | 2012-05-24 | |
US61/651,161 | 2012-05-24 | ||
US201361811145P | 2013-04-12 | 2013-04-12 | |
US61/811,145 | 2013-04-12 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2018060111A Division JP6731012B2 (ja) | 2012-05-24 | 2018-03-27 | エクストリームpcr |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2020115878A JP2020115878A (ja) | 2020-08-06 |
JP7032818B2 true JP7032818B2 (ja) | 2022-03-09 |
Family
ID=49624526
Family Applications (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2015514196A Active JP6316802B2 (ja) | 2012-05-24 | 2013-05-23 | エクストリームpcr |
JP2018060111A Active JP6731012B2 (ja) | 2012-05-24 | 2018-03-27 | エクストリームpcr |
JP2020069158A Active JP7032818B2 (ja) | 2012-05-24 | 2020-04-07 | エクストリームpcr |
Family Applications Before (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2015514196A Active JP6316802B2 (ja) | 2012-05-24 | 2013-05-23 | エクストリームpcr |
JP2018060111A Active JP6731012B2 (ja) | 2012-05-24 | 2018-03-27 | エクストリームpcr |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (5) | US9932634B2 (ja) |
EP (3) | EP3957748A1 (ja) |
JP (3) | JP6316802B2 (ja) |
CN (2) | CN108251271A (ja) |
AU (1) | AU2013266246B2 (ja) |
CA (1) | CA2873991C (ja) |
DK (2) | DK3539666T3 (ja) |
ES (2) | ES2749700T3 (ja) |
PL (1) | PL3539666T3 (ja) |
PT (2) | PT2855692T (ja) |
SG (3) | SG10201800645WA (ja) |
WO (1) | WO2013177429A2 (ja) |
Families Citing this family (41)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9932634B2 (en) | 2012-05-24 | 2018-04-03 | University Of Utah Research Foundation | Methods for fast nucleic acid amplification |
WO2015069743A1 (en) * | 2013-11-05 | 2015-05-14 | Biofire Diagnostics, Llc | Induction pcr |
WO2016011280A1 (en) * | 2014-07-16 | 2016-01-21 | Tangen Biosciences, Inc. | Isothermal methods for amplifying nucleic acid samples |
EP3215260B1 (en) | 2014-11-03 | 2020-01-15 | Tangen Biosciences Inc. | Apparatus and method for cell, spore, or virus capture and disruption |
CA2967011C (en) * | 2014-11-07 | 2019-01-08 | Gna Biosolutions Gmbh | Pcr method for super-amplification |
TW201641687A (zh) * | 2014-12-31 | 2016-12-01 | 卡尤迪生物科技(北京)有限公司 | 用于進行化學反應的設備和方法 |
WO2016106717A1 (en) * | 2014-12-31 | 2016-07-07 | Coyote Bioscience Co., Ltd. | Apparatus and methods for conducting chemical reactions |
ES2867949T3 (es) | 2015-06-02 | 2021-10-21 | Biofire Defense Llc | Muestra para secuenciar |
JP7126445B2 (ja) | 2015-11-02 | 2022-08-26 | バイオファイア・ダイアグノスティクス,リミテッド・ライアビリティ・カンパニー | 扱いにくい試料タイプのための試料調製 |
ES2916153T3 (es) | 2015-11-05 | 2022-06-28 | Univ Utah Res Found | PCR extrema para transcripción inversa |
CN109642198A (zh) * | 2016-02-10 | 2019-04-16 | 卡尤迪生物科技(北京)有限公司 | 用于分析核酸的方法和系统 |
AU2017223404B2 (en) | 2016-02-22 | 2022-09-22 | Biofire Defense, Llc | Devices and methods for rapid PCR |
JP6979029B2 (ja) | 2016-03-24 | 2021-12-08 | バイオファイア・ダイアグノスティクス,リミテッド・ライアビリティ・カンパニー | 定量的増幅方法 |
US11786906B2 (en) | 2016-04-15 | 2023-10-17 | Biofire Defense, Llc | Resistive heaters and anisotropic thermal transfer |
SG10201700260XA (en) * | 2016-06-10 | 2018-01-30 | Star Array Pte Ltd | Rapid thermal cycling for sample analyses and processing |
WO2017213586A1 (en) * | 2016-06-10 | 2017-12-14 | Star Array Pte Ltd | Rapid thermal cycling for sample analyses and processing |
WO2018022971A1 (en) | 2016-07-28 | 2018-02-01 | Biofire Diagnostics, Llc. | Self-contained nucleic acid processing |
JP2018023360A (ja) * | 2016-07-29 | 2018-02-15 | セイコーエプソン株式会社 | 核酸増幅反応方法、試薬、および試薬の使用方法 |
US10434515B2 (en) | 2016-10-03 | 2019-10-08 | University Of Utah Research Foundation | Thermal gradient plug flow microfluidic devices for extreme PCR |
US20190344280A1 (en) * | 2016-12-29 | 2019-11-14 | Biofire Defense, Llc | Fast pcr with molecular crowding |
WO2018204592A1 (en) * | 2017-05-04 | 2018-11-08 | University Of Utah Research Foundation | Micro-fluidic device for rapid pcr |
WO2018217929A1 (en) | 2017-05-24 | 2018-11-29 | Biofire Defense, Llc | Systems and methods for point of use evacuation of an array |
CN107502657A (zh) * | 2017-07-12 | 2017-12-22 | 浙江大学 | 一种极速pcr(聚合酶链式反应)扩增和终点检测方法 |
WO2019018099A1 (en) | 2017-07-21 | 2019-01-24 | Biofire Diagnostics, Llc | DETECTION USING CONCURRENT FUSION CURVES |
CN107930716B (zh) * | 2017-12-31 | 2023-05-09 | 江苏科泰检测技术服务有限公司 | 检测室用自动旋转式梯度恒温水浴锅及其使用方法 |
CN108251501A (zh) * | 2018-02-08 | 2018-07-06 | 中国农业大学 | 一种转基因作物双重基因的可视化定量筛查新方法 |
US20210180112A1 (en) | 2018-04-20 | 2021-06-17 | Biofire Diagnostics, Llc | Methods for normalization and quantification of sequencing data |
US20210123089A9 (en) | 2018-06-07 | 2021-04-29 | Biofire Diagnostics, Llc | Rapid thermocycling methods |
KR102116118B1 (ko) * | 2018-07-18 | 2020-05-27 | 주식회사 케이티앤지 | 에어로졸 생성장치의 히터의 온도를 구간별로 제어하는 방법 및 그 방법을 구현하기 위한 에어로졸 생성장치 |
GB201812192D0 (en) | 2018-07-26 | 2018-09-12 | Ttp Plc | Variable temperature reactor, heater and control circuit for the same |
CN108752418B (zh) * | 2018-08-08 | 2024-01-30 | 湖南科技学院 | 一种多通道多肽合成反应装置及其操作方法 |
CN110114475B (zh) * | 2018-12-20 | 2021-06-18 | 广州市华南医学研究中心 | 一种极速核酸扩增的方法及其设备和应用 |
CN113727841B (zh) | 2018-12-21 | 2024-05-14 | 拜奥法尔诊断有限责任公司 | 用于反应容器的原位密封的设备、方法和系统 |
WO2020150442A1 (en) * | 2019-01-17 | 2020-07-23 | Northwestern University | Rapid reverse transcription quantitative polymerase chain reaction |
CN110387325A (zh) * | 2019-08-13 | 2019-10-29 | 广州市华南医学研究中心 | 一种极速pcr反应检测装置及检测方法 |
CN113493823A (zh) * | 2020-04-07 | 2021-10-12 | 中国农业大学 | 一种基于超速pcr与功能核酸的可视化检测方法 |
CN111974480A (zh) * | 2020-09-02 | 2020-11-24 | 杭州潘达科技有限公司 | 一种稳定效果好的具有多隔层的恒温水浴锅 |
CN113967487B (zh) * | 2021-10-11 | 2022-12-02 | 华中科技大学 | 一种喷嘴、液滴光热操控系统及其应用 |
GB202115637D0 (en) | 2021-11-01 | 2021-12-15 | Anglia Ruskin Univ Higher Education Corporation | Nucleic acid amplification method |
CN114214465A (zh) * | 2022-01-26 | 2022-03-22 | 山东仕达思生物产业有限公司 | 一种缩短新型冠状病毒检测时间的引物、探针、试剂盒及检测方法 |
WO2024110392A1 (en) | 2022-11-22 | 2024-05-30 | bioMérieux | New nucleic acid binding compounds and uses |
Family Cites Families (26)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2065719A1 (en) * | 1991-04-30 | 1992-10-31 | John B. Findlay | Nucleic acid amplification and detection methods using rapid polymerase chain reaction cycle |
US5436149A (en) | 1993-02-19 | 1995-07-25 | Barnes; Wayne M. | Thermostable DNA polymerase with enhanced thermostability and enhanced length and efficiency of primer extension |
WO1995004161A1 (en) | 1993-07-29 | 1995-02-09 | Sergio Danilo Junho Pena | Method for recognition of the nucleotide sequence of a purified dna segment |
JP4335975B2 (ja) | 1995-06-07 | 2009-09-30 | ギリード・サイエンシズ・インコーポレーテッド | Dnaポリメラーゼに対する結合・阻害核酸リガンド |
AU7073096A (en) | 1995-09-19 | 1997-04-09 | University Of Massachusetts | Inhibited biological degradation of oligodeoxynucleotides |
US6210882B1 (en) | 1998-01-29 | 2001-04-03 | Mayo Foundation For Medical Education And Reseach | Rapid thermocycling for sample analysis |
US6780588B2 (en) * | 2001-05-07 | 2004-08-24 | Applera Corporation | Methods for the reduction of stutter in microsatellite amplification |
KR20030073875A (ko) | 2002-03-13 | 2003-09-19 | 주식회사 하이닉스반도체 | 반도체소자의 소자분리패턴 형성방법 |
US20040241655A1 (en) * | 2003-05-29 | 2004-12-02 | Yuchi Hwang | Conditional touchdown multiplex polymerase chain reaction |
US8232091B2 (en) * | 2006-05-17 | 2012-07-31 | California Institute Of Technology | Thermal cycling system |
KR20080029233A (ko) | 2006-09-28 | 2008-04-03 | 삼성전자주식회사 | 핵산 증폭 및 혼성화를 단일 고체 지지체에서 수행하는방법 및 장치 |
JP5191041B2 (ja) | 2007-04-05 | 2013-04-24 | エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | 急速ワンステップrt−pcr |
WO2009105499A1 (en) * | 2008-02-20 | 2009-08-27 | Termaat Joel R | Thermocycler and sample vessel for rapid amplification of dna |
CA2658520C (en) | 2008-03-19 | 2016-11-08 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Nucleic acid amplification in the presence of modified randomers |
AU2009242546B2 (en) | 2008-04-30 | 2015-01-22 | Integrated Dna Technologies, Inc. | RNase-H-based assays utilizing modified RNA monomers |
US8349563B2 (en) | 2008-11-18 | 2013-01-08 | Life Technologies Corporation | Sequence amplification with target primers |
CN101407850B (zh) * | 2008-11-20 | 2011-01-05 | 江苏出入境检验检疫局动植物与食品检测中心 | 猴痘病毒的pcr快速检测试剂盒及检测方法 |
EP2406614A1 (en) * | 2009-03-10 | 2012-01-18 | Agency For Science, Technology And Research | Apparatus for processing a biological and/or chemical sample |
EP2539472B1 (en) * | 2010-02-26 | 2015-05-20 | Life Technologies Corporation | Fast pcr for str genotyping |
US9005895B2 (en) | 2010-06-21 | 2015-04-14 | Life Technologies Corporation | Compositions, methods and kits for nucleic acid synthesis and amplification |
JP2012118055A (ja) * | 2010-11-12 | 2012-06-21 | Sony Corp | 反応処理装置及び反応処理方法 |
EP2651560B1 (en) * | 2010-12-17 | 2020-03-18 | BJS IP Limited | Methods and systems for fast pcr heating |
WO2013132645A1 (ja) * | 2012-03-09 | 2013-09-12 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | 核酸増幅方法 |
US9932634B2 (en) | 2012-05-24 | 2018-04-03 | University Of Utah Research Foundation | Methods for fast nucleic acid amplification |
US9353409B2 (en) | 2013-01-15 | 2016-05-31 | Jun Euihum Lee | Compositions and methods for RT-PCR |
WO2015069743A1 (en) | 2013-11-05 | 2015-05-14 | Biofire Diagnostics, Llc | Induction pcr |
-
2013
- 2013-05-23 US US14/403,369 patent/US9932634B2/en active Active
- 2013-05-23 DK DK19166256.8T patent/DK3539666T3/da active
- 2013-05-23 ES ES13793389T patent/ES2749700T3/es active Active
- 2013-05-23 CA CA2873991A patent/CA2873991C/en active Active
- 2013-05-23 EP EP21184359.4A patent/EP3957748A1/en active Pending
- 2013-05-23 CN CN201810059052.4A patent/CN108251271A/zh active Pending
- 2013-05-23 EP EP19166256.8A patent/EP3539666B1/en active Active
- 2013-05-23 PT PT137933891T patent/PT2855692T/pt unknown
- 2013-05-23 JP JP2015514196A patent/JP6316802B2/ja active Active
- 2013-05-23 SG SG10201800645WA patent/SG10201800645WA/en unknown
- 2013-05-23 PL PL19166256T patent/PL3539666T3/pl unknown
- 2013-05-23 SG SG11201407427WA patent/SG11201407427WA/en unknown
- 2013-05-23 ES ES19166256T patent/ES2889348T3/es active Active
- 2013-05-23 EP EP13793389.1A patent/EP2855692B1/en active Active
- 2013-05-23 AU AU2013266246A patent/AU2013266246B2/en active Active
- 2013-05-23 PT PT191662568T patent/PT3539666T/pt unknown
- 2013-05-23 WO PCT/US2013/042473 patent/WO2013177429A2/en active Application Filing
- 2013-05-23 DK DK13793389.1T patent/DK2855692T3/da active
- 2013-05-23 CN CN201380039367.8A patent/CN104662160B/zh active Active
- 2013-05-23 SG SG10201810110RA patent/SG10201810110RA/en unknown
-
2018
- 2018-02-07 US US15/890,843 patent/US10144960B2/en active Active
- 2018-03-27 JP JP2018060111A patent/JP6731012B2/ja active Active
- 2018-11-02 US US16/179,383 patent/US11021744B2/en active Active
-
2020
- 2020-04-07 JP JP2020069158A patent/JP7032818B2/ja active Active
-
2021
- 2021-04-29 US US17/244,000 patent/US11834708B2/en active Active
-
2023
- 2023-10-25 US US18/494,072 patent/US20240068021A1/en active Pending
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
TaqMan(R) EZ RT-PCR Kit Protocol,Applied Biosystems,2002年04月,1-6 |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7032818B2 (ja) | エクストリームpcr | |
JP7319646B2 (ja) | エクストリーム逆転写pcr | |
EP3066222B1 (en) | Induction pcr | |
US20190344280A1 (en) | Fast pcr with molecular crowding |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200408 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20200408 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200619 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20210423 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210720 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20211012 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220107 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20220121 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20220217 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7032818 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |