WO2013132645A1 - 核酸増幅方法 - Google Patents

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WO2013132645A1
WO2013132645A1 PCT/JP2012/056079 JP2012056079W WO2013132645A1 WO 2013132645 A1 WO2013132645 A1 WO 2013132645A1 JP 2012056079 W JP2012056079 W JP 2012056079W WO 2013132645 A1 WO2013132645 A1 WO 2013132645A1
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WO
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pcr
temperature
nucleic acid
temperature zone
acid amplification
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PCT/JP2012/056079
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秀典 永井
雄介 渕脇
Original Assignee
独立行政法人産業技術総合研究所
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction

Definitions

  • the present invention relates to a method for amplifying nucleic acid in a meandering flow path at an extremely high speed. More specifically, the present invention uses a continuous-flow microfluidic system to provide fluid delivery conditions and flow path design for precise temperature control and to perform ultrafast polymerase chain reaction (PCR). Regarding the method.
  • PCR polymerase chain reaction
  • Genetic testing is at the heart of various fields such as drug development, forensic medicine, clinical testing, identification of crops and pathogenic microorganisms, disease and risk diagnosis, search for markers, food and environmental safety assessment, crime It has become a universal technology for verification. It is a well-known fact that it is also used for definitive tests for infectious diseases such as foot-and-mouth disease and new influenza that became a problem last year. In 2007, the Ministry of Health, Labor and Welfare Insurance Bureau approved the inclusion of insurance for cancer genetic testing, and clinical testing companies announced the commercialization of genetic testing equipment and kits. It is starting to turn.
  • One of the most powerful basic technologies for detecting a small amount of nucleic acid, which is a gene, with high sensitivity is a technique for analyzing a product obtained by exponentially duplicating part or all of a nucleic acid sequence.
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • millions of copies of DNA fragments can be generated from a single template DNA for a target DNA sequence in the template DNA.
  • PCR repeats a three-phase temperature condition called a thermal cycle to denature DNA into single strands, anneal denatured DNA single strands and primers, and extend primers with a thermostable DNA polymerase enzyme. Individual reactions are repeated sequentially. This cycle is repeated until a sufficient copy number is obtained for analysis. In principle, it is possible to double the number of copies in one cycle of PCR.
  • the PCR method is a powerful technique for exponentially amplifying genes by thermal cycling, but the general-purpose thermal cycler device used for PCR has a slow temperature control due to the huge heat capacity of the aluminum block part that is a heater.
  • the conventional PCR operation of 30 to 40 cycles usually takes 1 to 2 hours. For this reason, even if the latest genetic testing device is used, it takes a total of several hours for analysis, and speeding up the PCR operation has been a major issue since the technology appeared.
  • microfluidic devices related to DNA amplification by PCR have also been developed.
  • Sample thermal cycling is typically done in one of three ways.
  • the first method is a method in which a sample solution is introduced into the device, and temperature cycling is performed over time while the solution is held in the same part.
  • This is very similar to a conventional PCR instrument (Non-patent Documents 1 and 2 and Patent Document 1).
  • this method aims to reduce the heat capacity by reducing the sample amount and speed up the thermal cycle, there is a limit to reducing the heat capacity of the chamber and the heater itself, so in order to perform a sufficient amplification reaction, At least about 30 seconds per cycle is required, and even the earliest apparatus to complete the PCR reaction must spend 15 minutes or more.
  • a plurality of spatially separated temperature zones are connected by a micro flow channel, and the sample solution is repeatedly repeated on the same flow channel so that the sample solution stops in these temperature zones for a predetermined time. It is a method of moving alternately and heating. Although this method is excellent in that each temperature time can be freely set and thermal cycling is possible, a large number of integrated units are used to introduce samples and feed them to those temperature zones by rotating them using a pump. Therefore, it is difficult to reduce the size of the apparatus (Patent Document 3).
  • the third method is a continuous flow PCR in which a sample solution moves through a plurality of temperature zones spatially separated through a microchannel, and the sample solution is continuously fed without stopping. It is a method of calling.
  • these continuous flow PCR methods attention has been focused on a method for controlling the sample temperature at a high speed by flowing it through three meandering channels controlled by a constant temperature (Non-patent Document 3). Since this method does not require temperature changes in external devices such as containers and heaters, the theoretically the fastest temperature control can be expected, and development was carried out with the aim of commercialization, but bubbles were accidentally generated in the heating area. However, due to problems such as frequent stopping of the flow, it has not yet been put into practical use.
  • the PCR sample is continuously fed so as to fill the entire microchannel through two or three separate temperature regions.
  • a continuous flow requires a large amount of PCR sample and requires complicated control.
  • bubbles are likely to be generated in the denaturation temperature region of 95 ° C., and the flow is frequently disturbed or stopped.
  • the fluid resistance is large and the liquid feeding speed is slow, so it is efficient and high speed. As a result, it took about one hour until the end of continuous flow PCR, even if it was a high-speed system, it took more than 15 minutes.
  • genetic testing in cancer treatment has been clarified in terms of its usefulness, such as EGFR gene mutation as an indication of application of anticancer drug Iressa, so that EGFR gene, K-RAS gene, Genetic testing for the EWS-Fil gene, TLS-CHOP gene, SVT-SSX gene, and c-kit gene has recently become an insurance application.
  • Patent No. 3041423 US Pat. No. 6,960,437 WO2006 / 124458
  • An object of the present invention is to provide a method for amplifying nucleic acid in a flow path at an ultra-high speed.
  • the present inventor does not continue to flow the sample solution as in the continuous flow PCR that fills the whole of the conventional microtube and the microchannel, but sends the solution in the size of several microliters with air.
  • the influence of bubble generation was eliminated, and further, high-speed annealing due to high-speed convection inside the sample liquid and high-speed liquid feeding due to low pressure loss were achieved.
  • the sample solution moves slowly in the temperature rising direction and moves fast in the temperature decreasing direction due to a change in vapor pressure during sequential heating in the middle of liquid feeding, while ensuring a long extension reaction time, and a transition temperature. It is a high-speed and highly efficient PCR technique that can suppress the extension of by-products in
  • the present invention appropriately sets the flow channel design and liquid feeding conditions for accurately controlling the temperature with respect to the PCR sample flowing in the segment flow using the micro flow channel, and the nucleic acid in the flow channel is determined.
  • the present invention provides the following nucleic acid amplification method.
  • Item 1 In a nucleic acid amplification method for performing a PCR reaction by supplying a PCR sample solution to a nucleic acid amplification device having a meandering flow path capable of performing at least one PCR cycle, the nucleic acid amplification device corresponds to a loop portion on one side.
  • an annealing temperature zone corresponding to the loop portion opposite to one denaturation temperature zone
  • an extension temperature zone between the annealing temperature zone and the DNA denaturation temperature zone is gas
  • gas A nucleic acid which is fed into a meandering channel by a pump in the shape of a sandwiched sample plug and supplied into the meandering channel in a state separated by one cycle of PCR or more by gas.
  • Amplification method Item 2.
  • a temperature control method that secures an extension reaction time and conversely accelerates the liquid feeding speed in the cooling process from the DNA denaturing temperature zone to the annealing temperature zone and allows the passage speed faster than the heating process is used.
  • Item 2. The nucleic acid amplification method according to Item 1.
  • Item 3. The nucleic acid amplification method according to claim 1 or 2, wherein the PCR sample solution is supplied in a volume equal to or less than the volume of the linear portion of the meandering channel.
  • Item 4. Item 4. The method for amplifying nucleic acid according to any one of Items 1 to 3, wherein a thin film for observing the temperature of the solution in the channel in the chip is used.
  • the temperature control method for the sample plug is as follows: (i) cooling the annealing heater temperature for lowering the temperature to 40 ° C. or less; (ii) maintaining the heat capacity at 200 ⁇ m or more between the parallel flow paths of the meandering flow path And (iii) at least one temperature control method in which the aspect ratio of the cross section of the flow path is set to be larger than 1/8 and smaller than 1 for the generation of bubbles and stable liquid feeding. 5.
  • the nucleic acid amplification method according to any one of 4 above.
  • FIG. 1 shows a DNA denaturation heater block 7
  • temperature control 2 (about 72 ° C.) is an extension reaction heater block 6
  • temperature control 3 (about 55 ° C.) is annealing.
  • Heater block 5 and sample solutions 1 to 3 are sample plugs 8.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing measurement points on a meandering channel for measuring the temperature of a sample plug passing through a microfluidic device for continuous flow PCR. It is a figure which shows the measurement result of the temperature in each point of FIG.
  • FIG. 5 is a diagram showing measurement results at each point in FIG. 4 when the time per cycle on the microfluidic device for continuous flow PCR is 1 to 10 seconds.
  • FIG. 5 is a diagram showing fluorescence intensity detected at the meandering channel outlet of a continuous-flow PCR microfluidic device as a result of performing continuous-flow PCR on a Bacillus subtilis gene by changing the amount of Bacillus subtilis mixed in the sample plug. is there. It is a figure which shows the relationship between the measured fluorescence amount of FIG. 9, and the quantity of Bacillus subtilis previously mixed with the sample plug.
  • the present invention relates to a method for amplifying a nucleic acid by polymerase chain reaction (PCR) at extremely high speed in a microchannel that repeatedly passes through a plurality of temperature zones while meandering. More specifically, the present invention is a flat plate microfluidic system for continuous flow PCR, which uses a microchannel to accurately control the temperature of a PCR sample sandwiched between gases and flowing as a sample plug. It is an object of the present invention to provide a method for amplifying nucleic acid in a flow path at an ultra-high speed by appropriately setting a flow path design and liquid feeding conditions.
  • PCR polymerase chain reaction
  • examples of the plurality of temperature zones include a temperature zone for DNA denaturation, a temperature zone for annealing, and a temperature zone for extension. These three temperature zones may be clearly distinguished by a heating device (heater) or cooling device, etc., and adjacent temperature zones (DNA denaturation temperature zone and extension temperature zone, or extension temperature zone and annealing).
  • the boundary of the temperature zone is not necessarily clear.
  • the temperature zone for extension and the temperature zone for annealing may appear to be one temperature zone that appears to be integrated, but in this specification, even in such a case, the higher temperature part is stretched.
  • the temperature range is expressed as a temperature range, and the lower temperature portion is expressed as an annealing temperature range.
  • FIG. 1 shows a schematic diagram of a microfluidic device 4 for continuous flow PCR for carrying out the present invention.
  • This device includes a PCR reagent inlet 1, a meandering channel 2, and a reservoir 3 for storing a solution after the PCR reaction.
  • One cycle of PCR is a unit consisting of a pair of loop portions on both sides (corresponding to a high temperature denaturation region (corresponding to the temperature region for DNA denaturation) and a low temperature annealing region), and two linear portions connecting the loop portions.
  • the high temperature denaturation region corresponds to the “DNA denaturation temperature region”
  • the low temperature annealing region corresponds to the “annealing temperature region”
  • the two linear portions connecting the loop portions correspond to the “annealing temperature region”.
  • this unit may be formed by one meandering channel 3 or may be formed by a meandering channel 3 in which a large number of the units are connected.
  • one PCR sample solution advances in the meandering channel, one cycle of PCR reaction or multiple cycles of PCR reaction is performed according to the number of units in the meandering channel, and the necessary number of PCR products are formed. Released into the reservoir.
  • the microfluidic device 4 for continuous flow PCR shown in FIG. 1 uses, for example, an NC processing machine and a flow path shape designed on CAD on a cycloolefin resin (COP) flat plate having a length of 76 mm, a width of 52 mm, and a thickness of 2 mm. It was made by cutting.
  • the material of the microfluidic device may be acrylic resin, polycarbonate resin, polystyrene resin, fluorine resin, or the like other than polyolefin resin such as COP.
  • the flow path shape may be formed by a method that can be used for resin microfabrication such as injection molding, nanoimprinting, or soft lithography.
  • a micro flow path is cut using a resin end mill having a diameter of 200 ⁇ m, and the cross section of the flow path has a width of 10 to 1000 ⁇ m, a depth of 10 to 1000 ⁇ m, preferably a width of 400 ⁇ m and a depth of 500 ⁇ m.
  • a straight groove having a width and depth of 0.65 mm is cut from the injection side end of the microchannel to the end of the COP plate, and the exit end has a diameter of 2 mm.
  • a cylindrical reservoir was connected.
  • the microplate seal (97M manufactured by 3M) was joined to the entire surface of the meandering flow path including the metal tube portion, thereby producing a microfluidic device for continuous flow PCR incorporating a PCR sample injection tube.
  • the PCR sample injection tube may not be made of metal, but may be made of resin such as a silicon tube, or may be a tube using a rubber material or a glass material.
  • fusion by a different sealing agent, a tape agent, or a resin material may be sufficient.
  • the seal at the portion covering the reservoir on the microchannel outlet side was cut.
  • three heater blocks 5, 6, and 7 (temperature control 3, 2, and 1 respectively) with a length of 150mm, a width of 15mm, and a height of 10mm with built-in heaters are approximately 0.5mm to 1mm in parallel. 2 were arranged at intervals of and were brought into contact with the microfluidic device for continuous flow PCR produced thereon, whereby the temperature was controlled individually and locally in the three contact areas.
  • Each heater block has the ability to uniformly heat the heater block surface to 120 ° C or higher, and has a function of cooling to 5 ° C or lower by bonding a Peltier element to the bottom side. .
  • each aluminum block 5, 6 and 7 is kept uniform and constant by a heater or Peltier element by PID control based on a temperature sensor provided inside.
  • the set temperatures of the individual aluminum blocks 5, 6, and 7 shown in FIG. 2 were set so that the temperature of the sample solution was 95 ° C., 72 ° C., and 55 ° C. necessary for PCR denaturation, extension, and annealing. It is not necessary to change the temperature of the aluminum block once set as long as continuous flow PCR is performed under the same conditions.
  • the serpentine channel that folds continuously with an interval of 10 to 1000 ⁇ m, preferably 400 ⁇ m every 30 mm length, and three heater blocks and the meandering flow
  • the design was such that the paths were orthogonal and the looped portion of the meandering flow path was in contact with the heater blocks at both ends by 7 mm.
  • the position of the meandering flow path in contact with the heater blocks at both ends can be appropriately changed according to the target temperature and control time.
  • the heater block for continuous flow PCR uses a structure made of stainless steel having a length of 150 mm, a width of 15 mm, and a thickness of 10 mm with a built-in temperature sensor and arranged at intervals of 1 to 2 mm. Of these, one end side was brought into contact with a Peltier to control the temperature to below room temperature. Moreover, it was set as the design which can perform the thermal cycle required for PCR 40 times by making it the design which folds back 40 times each on the heater block of both ends among three heater blocks. 1 and 2 show an example using a meandering flow path capable of executing 40 thermal cycles and three temperature zones, but the meandering flow path may be designed so that a thermal cycle can be executed once. You may design so that there may be two temperature zones.
  • the number of meandering channels can be designed to be two or more. However, in order to enable rapid analysis, it is preferable that the number of channels be one (single).
  • Continuous flow PCR microfluidic device for extension reaction corresponding to one DNA denaturing heater block corresponding to one loop part, annealing heater block corresponding to the other loop part, and straight part connecting both loop parts
  • the heater block has three temperature zones, it should be set to the recommended ratio shown in Table 1 above.
  • One heater block for DNA denaturation corresponding to the loop portion on one side and the other loop portion / straight line When PCR is performed with two temperature settings of the heater block (extension process is performed at a temperature midway from the annealing temperature to the denaturation temperature) that can perform the extension process corresponding to the part, the recommended ratio in Table 1 is used. What is necessary is just to carry out so that it may correspond.
  • the temperature of each heater block was controlled to a target temperature by PID control.
  • the surface temperature of the heater block surface or the microfluidic device for continuous flow PCR is confirmed by a contact-type or non-contact-type temperature sensor as necessary, and the temperature required for each PCR reaction as shown in Table 1 Thus, the temperature of the heater block can be adjusted.
  • the temperature of the surface of the continuous-flow PCR microfluidic device or the flowing fluid, or the surface of the peripheral portion of the microfluidic device for continuous-flow PCR is measured with an infrared camera. Adjustments were made to achieve temperature.
  • PCR PCR reagents
  • PCR reagents were prepared according to the kit. The composition and concentration of reagents such as PCR primers and probes can be changed according to the type of gene to be detected.
  • the PCR sample was fed using a syringe pump filled with a gas in excess of the volume of the continuous flow PCR microfluidic device and the sample injection tube connected in the middle.
  • a syringe pump filled with a gas in excess of the volume of the continuous flow PCR microfluidic device and the sample injection tube connected in the middle.
  • a PCR sample injection tube of a microfluidic device for continuous-flow PCR is passed through a silicon tube with an inner diameter of 0.5 mm, in which 1 to 30 ⁇ L of 300 ⁇ L or more of a PCR reagent is connected to a syringe pump (Model 11 manufactured by Harvard). Injected from. At that time, the syringe pump is prefilled with 300 ⁇ L of air so that the sample solution can flow from the PCR sample injection tube of the continuous flow PCR microfluidic device to the reservoir at the outlet of the microchannel.
  • the flow rate of the syringe pump was set to 65 to 225 ⁇ L / min, and the solution was continuously fed until it was discharged to the reservoir at the outlet end of the microchannel. This corresponds to 1 sec / cycle to 10 sec / cycle as the time required to flow through the flow path length for one cycle in continuous flow PCR.
  • the pump for feeding the PCR sample may be any pump other than a syringe pump as long as it can feed a small amount of solution. Thereby, as shown in FIG. 2, the method of performing continuous flow PCR which sends a very small amount of PCR sample in the shape of a sample plug was established.
  • a high-speed convection and a diffusion-controlled annealing reaction can be achieved in the sample liquid by supplying a segment flow of several microliters and continuing to push with air.
  • One feature of the present invention is that the PCR solution can quickly pass through the high temperature region before the flow becomes unstable due to the generation of bubbles.
  • the fluorescence intensity of the PCR sample after PCR is directly measured with a SELFOC fluorescent fiber detector placed on a meandering channel or in a reservoir position.
  • the PCR sample was transferred to a microplate and then measured using a fluorescence microreader.
  • the use of a microfluidic device for continuous-flow PCR using a sample plug is considered to enable rapid flow and simple PCR control, but excessively rapid liquid delivery is the temperature required for PCR above each temperature zone. There is a possibility of passing before reaching. Therefore, in the present invention, in order to ensure a sufficient reaction time for each of the DNA denaturation, annealing, and elongation reactions, the vapor pressure generated at the interface with the gas before and after the sample plug in the microchannel is effective.
  • the liquid feeding speed is varied so that the sample plug passes through each heater block over a period of time required for each reaction of PCR.
  • Fig. 3 shows the results of measuring the time and speed at which the sample plug passes over the heater block for each reaction using a video camera.
  • the passage time became longer in the heating process related to the extension reaction in the parallel linear flow path portions on the meandering flow path. This is because the high vapor pressure generated in the DNA denaturation reaction heater block is decelerated because it works in the direction opposite to the progress of the sample plug.
  • the sample plug was accelerated by the influence of the same vapor pressure difference, so that the transit time was the shortest. Since the denaturation and annealing of PCR proceed very rapidly, the ratio of each reaction time is equivalent to that in Table 1, so it is optimal for PCR and significantly increases the time for enzymatic extension reaction that proceeds relatively slowly. Suitable for securing.
  • the liquid feeding speed is constant, and the DNA denaturation temperature zone to the annealing temperature zone. Also in the cooling process toward the bottom, it moves at a low speed as in other temperature zones.
  • the annealing process at a transient temperature where the primer cools to the transition temperature at which it binds to the target DNA sequence, the primer may bind to a site other than the target sequence, which generates by-products other than the target gene sequence.
  • the high-speed cooling realized by the present invention is advantageous in that it suppresses the generation of by-products and is advantageous for accurate DNA amplification.
  • the passage speed of each heater block varies as shown in FIG. 3. Therefore, it is necessary to optimize the flow path design and set temperature to reach the set reaction time and temperature. Become. Only when these conditions are satisfied, accurate DNA amplification is realized. For this purpose, it is necessary to accurately measure the temperature in each temperature region including the temperature gradient between the heaters on the chip. Therefore, in the implementation of the present invention, the measurement of the temperature of the PCR sample flowing inside the microchannel with an infrared camera through a polyolefin thin film as a sealing material was examined.
  • the film thickness of the polyolefin sealing material used in the practice of the present invention is 50 ⁇ m, and the temperature of the sample plug can be measured via the sealing material.
  • the film thickness of the sealing material is preferably 0.5 mm or less, or 50 ⁇ m or less
  • the material of the thin film used as the sealing material is not limited to polyolefin resin such as COP, but also acrylic resin or polycarbonate. It may be a series resin, polystyrene resin, or fluorine resin.
  • One feature of the present invention is that it has a method of accurately measuring the temperature of the sample plug inside the meandering flow path by using a thin film sealing material, cover material or film material.
  • the measurement points on the meandering channel are shown in FIG. Moreover, the measurement result of the temperature in each point of FIG. 4 is shown in FIG.
  • the important point in rapid temperature control by liquid feeding using the sample plug is that the cooling process time for annealing is quite short, so the temperature of the annealing heater block is set to 55 to 65 ° C, which is the normal annealing temperature. Even in this case, as shown in FIG. 5, it was not cooled to the set temperature, and the cooling effect was insufficient.
  • each heater temperature is heated or cooled more than the normal annealing temperature for high-speed temperature control on the sample plug.
  • FIG. 6 shows the measurement result of the temperature in the case of the above.
  • the temperature required for PCR was not reached in all temperature ranges.
  • the temperature of the annealing heater block was 20 ° C., it was found that when the time per cycle was 7 s or more, the temperature was excessively cooled and reached 40 ° C. or less where misannealing was likely to occur.
  • optimization of the set temperature and flow rate of each heat block is important for temperature control of continuous flow PCR using a sample plug.
  • the temperature of the annealing heater block is 20 ° C.
  • the optimal flow rate was 5-6 s per cycle.
  • Amplification of DNA by PCR is confirmed by collecting the sample solution reaching the reservoir and determining the amount of change in fluorescence intensity before and after continuous flow PCR with a fluorescence plate reader (Thermochemical Fluoroscan Ascent) set for FAM dye. did.
  • the increase in fluorescence intensity indicating amplification of the target DNA fragment was dependent on the time required for each cycle, as shown in FIG. This is because the heat conduction and reaction time necessary for each reaction of denaturation, annealing, and extension of PCR are sufficiently secured when the flow rate is decreased and the required time for each cycle is lengthened.
  • the flow path length of the straight portion of the meandering flow path is 30 mm, and the volume corresponds to about 5.5 ⁇ L.
  • the amount of the reagent solution is 10 ⁇ L or more
  • the size of the sample plug exceeds the length of one cycle, so the influence of the vapor pressure difference before and after the sample plug is eliminated and the sample solution flows at a constant speed.
  • the sample plug is sized to fit within the straight portion of the meandering channel. Therefore, in the heating or cooling for the thermal cycle, the vapor pressure changes individually at the gas-liquid interface upstream and downstream of the sample plug and changes every moment depending on the position of the meandering channel. Thereby, in the process of the extension reaction from 55 ° C. to 95 ° C., the vapor pressure at the upstream gas-liquid interface increases from the downstream side, so that a force against the flow direction is generated, as shown in FIG.
  • the sample plug moved at a low speed.
  • the vapor pressure on the downstream gas-liquid interface increases and works to accelerate the flow, so the sample plug moves at a speed of 2 to 3 times. .
  • the efficiency is about 2 to 6 times higher even at the same average flow rate. Met.
  • the extension reaction time of 72 ° C. following 55 ° C. is long, which is advantageous for PCR reaction.
  • the shape of the meandering channel of the microfluidic device for continuous flow PCR also affects the temperature control of the sample plug. Therefore, in the implementation of the present invention, the distance between the parallel straight flow paths is changed when the aspect ratio of the cross section (the ratio of the flow path depth to the flow path width) is changed by changing the depth of the micro flow path. The effect on the amplification of the target DNA was evaluated.
  • the aspect ratio should be set to a value greater than 1/8 and less than 1. Is desirable.
  • the channel depth corresponding to 1/8 was 100 ⁇ m
  • the increase in the amount of fluorescence by real-time PCR was decreased, but this was because the channel was too shallow, and this was a heater block for DNA denaturation reaction. This is because the heat is excessively propagated at the position, and the sample plug evaporates.
  • the channel depth corresponding to an aspect ratio of 1 was 800 ⁇ m
  • the increase in the fluorescence amount by real-time PCR was reduced. This is because, when heating or cooling from the bottom surface of the continuous flow PCR microchannel device, temperature unevenness occurred in the cross-sectional direction of the meandering channel, and it was not possible to uniformly control the accurate temperature.
  • the interval between the parallel linear channels of the meandering channel for maintaining a sufficient heat capacity is desirably 200 ⁇ m or more, preferably 400 ⁇ m or more, and most preferably 600 ⁇ m or more. From the above, when using COP-made micro-channels, it is considered effective for accurate temperature control to secure the distance between the channels at intervals similar to the channel width. In order to maintain a sufficient heat capacity, the interval between parallel flow paths of the meandering flow path is ensured, and the aspect ratio of the flow path cross section is set to be larger than 1/8 and less than 1 for the generation of bubbles and stable liquid feeding. It has become clear that this is necessary for more efficient DNA amplification, and a technique for accurate and high-speed temperature control to these sample plugs is one of the features of the present invention.
  • amplification of DNA fragments by continuous flow PCR was examined for Bacillus subtilis genes.
  • the PCR reagent was prepared according to the kit using the Cycle PCR PCR Screening Kit manufactured by Takara. Each PCR reagent was individually subjected to continuous flow PCR. The adjusted PCR reagent was simultaneously injected into a microfluidic device for continuous flow PCR as a 3 ⁇ L sample plug, and fed by a syringe pump (Model 11 manufactured by Harvard) at a flow rate of 100 to 680 ⁇ L / min.
  • a SELFOC fiber fluorescence detector was installed at the position of the meandering channel near the outlet of the microfluidic device for continuous flow PCR, and the fluorescence intensity increased by continuous flow PCR was measured in real time.
  • the fluorescence intensity obtained was changed in proportion to the amount of Bacillus subtilis mixed with.
  • FIG. 10 shows the change in fluorescence intensity as a numerical value and graphed as a calibration curve.
  • the obtained fluorescence intensity was confirmed to have an excellent correlation with the amount of Bacillus subtilis contained in the reagent plug originally prepared as a PCR sample, and it was confirmed that the target gene could be detected.
  • FIG. 9 it was confirmed that by using a microfluidic device for continuous flow PCR, the process from gene amplification to detection can be realized very rapidly, about 6 minutes.
  • a real-time PCR method for confirming amplification of DNA fragments by fluorescence change is used.
  • the technique used in this specification is not limited to real-time PCR, and RT-PCR. It can be used for a nucleic acid amplification technique using a PCR method including

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Abstract

流路内の核酸を超高速に増幅するための方法を提供する。 少なくとも１回のＰＣＲサイクルを行うことができる蛇行流路を備えた核酸増幅装置にＰＣＲ試料液を供給してＰＣＲ反応を行う核酸増幅方法において、前記核酸増幅装置は、片側のループ部に対応する１つのＤＮＡ変性用温度帯と反対側のループ部に対応するアニーリング用温度帯、アニーリング用温度帯とＤＮＡ変性用温度帯の間の伸長用温度帯を有し、かつ、ＰＣＲ試料液は気体に挟まれた試料プラグの形状でポンプにより蛇行流路内に送液され、気体によりＰＣＲの１サイクル分或いはそれ以上隔てられた状態で前記蛇行流路内に供給されることを特徴とする、核酸増幅方法。

Description

核酸増幅方法
　本発明は、蛇行流路内の核酸を超高速に増幅するための方法に関する。より具体的には、本発明は、連続流マイクロ流体システムを用いて、温度を正確にコントロールするための送液条件と流路デザインを提供し、超高速なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実行する方法に関する。
　遺伝子検査は、医薬品開発、法医学、臨床検査、農作物や病原性微生物の同定など、様々な分野における中核をなし、疾患および発症リスク診断、マーカーの探索、食品や環境中の安全性評価、犯罪の立証などにおける普遍的技術となっている。昨年問題となった口蹄疫や、新型インフルエンザなど、感染症の確定検査にも利用されているのは周知の事実である。また、2007年、厚労省保険局が癌遺伝子検査に対する保険収載を認めたことを皮切りに、臨床検査各社が遺伝子検査用機器やキットの市販化を発表し、いよいよ遺伝子検査が医療においても本格化し始めている。
　遺伝子である少量の核酸を高感度に検出する最も強力な基礎技術の１つは、核酸配列の一部または全部を指数関数的に複製し増幅した産物を分析する手法である。
　ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）は、ＤＮＡのある特定領域を選択的に増幅する強力な技術である。ＰＣＲを用いると、テンプレートＤＮＡの中の標的とするＤＮＡ配列について、単一のテンプレートＤＮＡから数百万コピーのＤＮＡ断片を生成することができる。ＰＣＲは、サーマルサイクルと呼ばれる三相の温度条件を繰り返すことにより、単一鎖へのＤＮＡの変性、変性されたＤＮＡ一本鎖とプライマーのアニーリング、および熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素によるプライマーの伸長という個々の反応が順次繰り返される。このサイクルは、分析に必要な十分なコピー数が得られるまで繰り返し行われる。原理上、ＰＣＲの1回のサイクルで、コピー数を倍にすることが可能である。実際には、サーマルサイクルが続くと、反応が進行するために必要な反応試薬の濃度が減少するので、増幅されたＤＮＡ産物の集積が、最終的に止まる。ＰＣＲの一般的詳細については、「Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ＰＣＲ」、Ｄｅｎｎｉｓ　Ｌｏ（編集）、Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ（ニュージャージー州トトワ所在）（１９９８年）、および「ＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　Ａ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓら（編集）、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｉｎｃ．社（カリフォルニア州サンディエゴ所在）（１９９０年）を参照のこと。
　ＰＣＲ法は、サーマルサイクルにより遺伝子を指数関数的に増幅する強力な手法であるが、ＰＣＲに使用される汎用のサーマルサイクラー装置は、ヒーターであるアルミブロック部の巨大な熱容量のため温度制御が遅く、３０～４０サイクルのＰＣＲ操作に従来１～２時間を要する。そのため、最新の遺伝子検査装置を用いても、分析にトータルで数時間を要しており、ＰＣＲ操作の高速化は、技術登場以来の大きな課題であった。
　このような課題解決のため、ＰＣＲによるＤＮＡ増幅に関するマイクロ流体デバイスも開発されている。試料のサーマルサイクリングは、通常、３つの方法のいずれかでなされている。
　第１の方法は、試料液がデバイス内に導入され、溶液が同じ部分に保持されたまま時間の経過とともに温度サイクリングが行われる方法である。これは従来のＰＣＲ計測器と非常によく似ている(非特許文献１、２および特許文献１)。しかし、この方法は、試料量の低減により熱容量を小さくし、サーマルサイクルの高速化を目指しているものの、チャンバーやヒーター自身の熱容量の低減に限界があるため、十分な増幅反応を行うには、少なくとも１サイクル当たり３０秒程度必要であり、ＰＣＲ反応の終了までに最も早い装置であっても１５分以上費やさなければならない。
　第２の方法は、空間的に離れた複数の温度帯が微小流路で結ばれており、試料液がこれらの温度帯上を所定の時間ずつ停止するように、同一流路上を反復しながら交互に移動し加熱される方法である。この方法では各温度時間を自由に設定してサーマルサイクル可能な点で優れているものの、試料を導入し、ポンプを使って回転する形でそれらの温度帯に送り込むために、多数の一体化された弁およびポンプが必要なため装置の小型化が困難である(特許文献３)。
　また、第３の方法は第２の方法と同様に、微小流路を通じて試料液が空間的に離れた複数の温度帯を移動し、試料液は止まることなく連続的に送り込まれる連続流ＰＣＲと呼ぶ方法である。この連続流ＰＣＲ法の中でも、一定温度に制御された３本のヒーター上で蛇行流路を介して流すことで、試料温度を高速に制御する方式が注目されていた(非特許文献３)。この方式は、容器やヒーター等外部装置の温度変化が不要なため、理論上最も高速な温度制御を期待でき、製品化を目指して開発が行われたが、加熱領域で偶発的に気泡が発生し流れが頻繁に停止するなどの問題から、現在も実用化には至っていない。具体的には、連続流ＰＣＲでは２～３ヶ所の個別の温度領域を通して、ＰＣＲ試料が微小流路全体を満たす様に連続的に送液される。しかし、そのような連続流では、ＰＣＲ試料が大量に必要となり、かつ複雑な制御が求められる。さらに、９５℃の変性温度領域における気泡発生が生じやすく、流れの乱れや停止を招くことが頻繁に起こる。また、各温度帯上を３０回～４０回程度繰り返し通過できるように、数メートルの微細管や微小流路を通液するため、流体抵抗が大きく送液速度も遅くなるため、効率的で高速な温度制御を妨げ、結局、連続流ＰＣＲが終了するまでに１時間程度、例え高速なシステムであっても１５分以上を要していた。
　ＰＣＲ／リアルタイムＰＣＲ装置を利用した遺伝子検査の市場は順調に成長しており、特にウイルス性肝炎や性感染症、インフルエンザ等の感染症の遺伝子検査は国内でも急速に普及し始めている。また、癌治療における遺伝子検査は、ＥＧＦＲ遺伝子変異が抗がん剤イレッサの適用目安になる等、その有用性が明らかになったことから、肺癌や膵臓癌などにおけるＥＧＦＲ遺伝子、Ｋ－ＲＡＳ遺伝子、ＥＷＳ－Ｆｌｉｌ遺伝子、ＴＬＳ－ＣＨＯＰ遺伝子、ＳＶＴ－ＳＳＸ遺伝子、ｃ－ｋｉｔ遺伝子に関する遺伝子検査が最近保険適用となった。
　現状では、遺伝子検査をラボや分析センターに持ち帰り行っているが、現場で迅速に実施可能な高速な遺伝子検査システムがあれば、その場で治療や対策の方針を決定できるため、現状の遺伝子検査機器に置き換わる画期的な技術になるものと考えられる。特に、口蹄疫や高病原性インフルエンザなど、パンデミックの水際対策では、現場での迅速かつ的確な判断と、移動に伴う二次感染拡大の防止が重要であり、そのニーズは極めて大きい。特に、臨床や感染症発生の現場で、ただちに遺伝子検査ができるサービスの実現には、低価格で実施可能で、高速かつ簡便な遺伝子検査手法が必要である。
　しかしこれまでの技術では、現場で処理可能な、迅速かつ簡便なＰＣＲを行うことが不可能であり、超高速に増幅を行える方法が望まれていた。
特許第３０４１４２３号 米国特許第６，９６０，４３７号 ＷＯ２００６／１２４４５８号
Ｌａｇａｌｌｙら（Ａｎａｌ　Ｃｈｅｍ　７３：５６５－５７０（２００１年） 永井らＡｎａｌ　Ｃｈｅｍ　７３：１０１５－１０１９（２００１年）） Ｋｏｐｐら（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８０：１０４６－１０４８（１９９８年）
　本発明は、流路内の核酸を超高速に増幅するための方法を提供することを目的とする。
　そこで上記課題を解決するために、本発明者は、従来の微細管や微小流路全体を満たす連続流ＰＣＲのように試料溶液を流し続けるのではなく、数マイクロリットルサイズで送液し空気で押し続けるセグメントフローとすることで気泡発生の影響を無くし、さらに、試料液内部の高速な対流によるアニーリングの高速化と、低い圧力損失による高速送液に成功した。
　本発明は、送液途中、順次加熱される際に生じる蒸気圧変化により、試料溶液が昇温方向では遅く、降温方向では速く移動することで、長い伸長反応時間を確保しつつも、遷移温度における副生成物の伸長を抑えることが可能な高速かつ高効率なＰＣＲ技術である。
　特に、このような流路を用いたサーマルサイクルでは、試料溶液に対して短時間で温度を正確に変化させるための制御が不可欠である。そこで本発明は、微小流路を用いて、セグメントフローで流れるＰＣＲ試料に対して、正確に温度を制御するための流路デザインと、送液条件を適切に設定し、流路内の核酸を超高速に増幅するための方法を提供することを目的とする。
　本発明は、以下の核酸増幅方法を提供するものである。
項１．　少なくとも１回のＰＣＲサイクルを行うことができる蛇行流路を備えた核酸増幅装置にＰＣＲ試料液を供給してＰＣＲ反応を行う核酸増幅方法において、前記核酸増幅装置は、片側のループ部に対応する１つの変性用温度帯と反対側のループ部に対応するアニーリング用温度帯、アニーリング用温度帯とＤＮＡ変性用温度帯との間の伸長用温度帯を有し、かつ、ＰＣＲ試料液は気体に挟まれた試料プラグの形状でポンプにより蛇行流路内に送液され、気体によりＰＣＲの１サイクル分或いはそれ以上隔てられた状態で前記蛇行流路内に供給されることを特徴とする、核酸増幅方法。
項２．　前記試料プラグの前後の気体との界面に生じる蒸気圧差を利用することにより、アニーリング用温度帯からＤＮＡ変性用温度帯へ向かう加熱過程における送液速度を遅延させて伸長用温度帯での酵素的伸長反応時間を確保し、逆にＤＮＡ変性用温度帯からアニーリング用温度帯へ向かう冷却過程において送液速度を促進させて、前記加熱過程よりも高速に通過させる温度制御方法を利用することを特徴とする項１に記載の核酸増幅方法。
項３．　前記ＰＣＲ試料液が、前記蛇行流路の直線部分の容積以下の容量で供給されることを特徴とする請求項１または２に記載の核酸増幅方法。
項４．　チップ内流路内溶液の温度を観察するための薄膜フィルムを使用することを特徴とする、項１～３のいずれか１項に記載の核酸増幅方法。
項５．　前記試料プラグに対する温度制御方法が、(i)温度下降のためのアニーリング用ヒーター温度を40℃以下に冷却、(ii)熱容量を保持するため蛇行流路の平行する流路同士の間隔を200μｍ以上に確保、(iii)気泡発生や安定した送液のため流路断面のアスペクト比を1/8より大きく1未満に設定、の少なくとも1つの温度制御方法を包含することを特徴とする項１～４のいずれか１項に記載の核酸増幅方法。
　遺伝子検査のように、医療現場において微量に採取した生体試料から、高感度に遺伝子の有無を検査可能なシステムの実現が求められる。そこで、マイクロ流体デバイスの分析容量の微量化、ならびに体積に対する表面積増大に伴う伝熱効率の最大化の特性という長所を利用して、出来るだけ微量で高速な遺伝子の増幅技術を確立する必要がある。本発明では、遺伝子増幅技術であるＰＣＲの既存法ではなかった空気に挟まれた試料プラグの形態（形状）を利用し、これまでの平板型マイクロ流体デバイスを用いた連続流ＰＣＲにおいて課題であった高速と高効率の両立を、試料プラグの前後の空気との界面に生じた試料液自身の蒸気圧を活用することで実現することができる。これにより、新たに特別な外部装置を必要とせず、マイクロ流体デバイスの長所を最大限に生かした連続流ＰＣＲシステムの微量化ならびに高速化に資する特徴を備える。
連続流ＰＣＲ用微小流体デバイス４を示す図である。 図１に示す連続流ＰＣＲ用微小流体デバイスにおいて、サーマルサイクルのため、蛇行流路の領域毎に温度を制御する方法を示す図である。図２中、温調１（約９５℃）はＤＮＡ変性用ヒーターブロック７であり、温調２（約７２℃）は伸長反応用ヒーターブロック６であり、温調３（約５５℃）はアニーリング用ヒーターブロック５であり、試料液１～３は試料プラグ(sample)８である。 試料プラグ前後の蒸気圧差の影響により、連続流ＰＣＲ用微小流体デバイスの各ヒーターブロック上を通過する試料プラグの通過時間と速度の変動を示すグラフである。 連続流ＰＣＲ用微小流体デバイスの内を通過する試料プラグの温度を計測するため、蛇行流路上の測定ポイントを示す模式図である。 図４の各ポイントにおける温度の測定結果を示す図である。 連続流ＰＣＲ用微小流体デバイス上の1サイクル当たりの時間を１～１０秒とした場合の、図４の各ポイントにおける測定結果を示す図である。 連続流ＰＣＲ用微小流体デバイスを用いて、試薬プラグの液量と送液速度を変化させ、試料プラグ形状にて連続流ＰＣＲを行った結果、リアルタイムＰＣＲキットのＤＮＡ断片の増幅に伴って得られた蛍光強度を示す図である。 連続流ＰＣＲ用微小流体デバイスを用いて、蛇行流路の流路の深さと、平行する直線流路の間隔を変化させ、試料プラグ形状にて連続流ＰＣＲを行った結果、リアルタイムＰＣＲキットのＤＮＡ断片の増幅に伴って得られた蛍光強度を示す図である。 試料プラグに混合する枯草菌の量を変化させて、枯草菌の遺伝子に対する連続流ＰＣＲを行った結果、連続流ＰＣＲ用微小流体デバイスの蛇行流路出口にて検出された蛍光強度を示す図である。 図９の計測された蛍光量と、試料プラグにあらかじめ混合した枯草菌の量との関係を示す図である。
　本発明は、複数の温度帯を蛇行しながら繰り返し通過する微小流路内において極めて高速にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により核酸を増幅するための方法に関する。より具体的には、本発明は、連続流ＰＣＲのための平板型マイクロ流体システムにおいて、微小流路を用いて、気体に挟まれ試料プラグとして流れるＰＣＲ試料に対して、正確に温度を制御するための流路デザインと、送液条件を適切に設定し、流路内の核酸を超高速に増幅するための方法を提供することを目的とする。
　本明細書において、複数の温度帯とは、ＤＮＡ変性用温度帯、アニーリング用温度帯、伸長用温度帯が挙げられる。これらの３つの温度帯は加熱装置（ヒーター）或いは冷却装置などにより明確に区別されていてもよく、隣接する温度帯（ＤＮＡ変性用温度帯と伸長用温度帯、或いは、伸長用温度帯とアニーリング用温度帯）の境界は明確でなくてもよい。特に伸長用温度帯とアニーリング用温度帯は、見かけ上一体的になった１つの温度帯に見える場合もあるが、本明細書ではこのような場合であっても、より温度の高い部分を伸長用温度帯と表現し、より温度の低い部分をアニーリング用温度帯と表現する。
　断りのない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、本発明が関係している技術分野の当業者に通常理解される意味と同じ意味を有する。次に実施の形態を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施の形態のみに限定されるものではなく、本明細書で説明されているものと類似のまたは同等の多数の方法および材料についてどれも本発明を実施する際に使用することができる。好ましい材料および方法について以下に説明する。
　本発明を実施するための連続流ＰＣＲ用微小流体デバイス４の模式図を図１に示す。このデバイスは、ＰＣＲ試薬の注入口１、蛇行流路２、ＰＣＲ反応後の液を貯蔵するリザーバー３を備える。ＰＣＲの１サイクルは、両側の１対のループ部分（高温の変性領域（ＤＮＡ変性用温度域に対応））と低温のアニーリング領域に対応）、ループ部分を結ぶ２つの直線部分からなる１つのユニットにより行うことができる。高温の変性領域は、「ＤＮＡ変性用温度域」に対応し、低温のアニーリング領域は、「アニーリング用温度域」に対応し、ループ部分を結ぶ２つの直線部分は、「アニーリング温度域」に対応する。本発明で使用する微小流体デバイスは、このユニットが１つの蛇行流路３により形成されてもよく、前記ユニットが多数連結された蛇行流路３により形成されてもよい。１つのＰＣＲ試料液が蛇行流路を進んでいくと、蛇行流路のユニット数に応じて１サイクルのＰＣＲ反応或いは多数のサイクルのＰＣＲ反応が行われ、必要な数のＰＣＲ産物が形成されてリザーバーに放出される。
　図１の連続流ＰＣＲ用微小流体デバイス４は、例えば長さ７６ｍｍ、幅５２ｍｍ、厚さ２ｍｍのシクロオレフィン樹脂（ＣＯＰ）の平板に、ＣＡＤ上でデザインした流路形状を、ＮＣ加工機を用いて切削加工して作製した。このマイクロ流体デバイスの材質は、ＣＯＰ等のポリオレフィン系樹脂以外にも、アクリル系樹脂やポリカーボネイト系樹脂、ポリスチレン樹脂、フッ素系樹脂などであっても良い。また、この流路形状の形成には、ＮＣ加工機のような機械加工以外にも、射出成形、あるいはナノインプリンティング、あるいはソフトリソグラフィーなど樹脂の微細加工に利用可能な方法でも良い。切削加工の場合には、微小流路の切削は、直径２００μｍの樹脂用エンドミルを使用し、流路断面の形状は、幅１０～１０００μｍ、深さ１０～１０００μｍ、望ましくは幅４００μｍ、深さ５００μｍの半円形状、あるいは直方形状とした。なお、本発明の実施においては、微小流路の注入側の末端からＣＯＰ板の端まで幅および深さが０．６５ｍｍの直線上の溝を切削し、出口側の末端には、直径２ｍｍの円筒状のリザーバーが接続する形状とした。注入側の溝部分に外径０．６５ｍｍの金属チューブを自然に外れない長さ以上挿入し、液漏れを防ぐために接着剤を金属チューブの外周部のみに塗布後、圧力感受性の粘着剤がコートされたマイクロプレートシール（３Ｍ製９７９５）を、金属チューブ部分を含めた蛇行流路全面を接合することにより、ＰＣＲ試料注入用チューブを内蔵した連続流ＰＣＲ用微小流体デバイスを作製した。このＰＣＲ試料注入用チューブについては金属製ではなくてもシリコンチューブなど樹脂製であっても良く、あるいはゴム材、あるいはガラス材を用いたチューブなどであっても良い。この蛇行流路部のカバーについては、異なるシール剤、あるいはテープ剤、あるいは樹脂材による熱融着であっても良い。なお、微小流路出口側のリザーバーを覆う部分のシールについては、カットした。
　図２の通り、ヒーターを内蔵した３本の長さ１５０ｍｍ、幅１５ｍｍ、高さ１０ｍｍのヒーターブロック５，６，７(各々温調３，２，１)を平行に、０．５ｍｍから１ｍｍ程度の間隔をおいて図２のように配置し、その上に作製した連続流ＰＣＲ用微小流体デバイスと接触させることで、３ヶ所の接触領域について個別かつ局所的に温度を制御した。各ヒーターブロックは、ヒーターブロック表面を均一に、１２０℃以上まで加熱可能な性能を有しており、また、底面側にペルチェ素子を接合させることで、５℃以下まで冷却する機能を持たせた。各アルミブロック５，６，７の温度は、内部に設けた温度センサーに基づきＰＩＤ制御することで、ヒーターもしくはペルチェ素子により均一かつ一定に保持される。図２に示す個々のアルミブロック５，６，７の設定温度は、試料液の温度がＰＣＲの変性、伸長、アニーリングに必要な９５℃、７２℃、５５℃となるように設定した。なお、一度設定したアルミブロックの温度については、同じ条件で連続流ＰＣＲを実施する限り変更する必要はない。
　連続流ＰＣＲ用微小流体デバイスの蛇行流路のデザインについては、３０ｍｍの長さ毎に１０～１０００μｍ、望ましくは４００μｍの間隔をおきながら連続的に折り返す蛇行流路とし、３つのヒーターブロックと蛇行流路が直交し、かつ蛇行流路の折り返すループ部分が、両端のヒーターブロックと７ｍｍずつ接触するように設計した。なお、両端のヒーターブロックと接触する蛇行流路の位置は、目的とする温度や制御時間に合わせて、適宜変更可能とする。本発明の実施においては、連続流ＰＣＲのためのヒーターブロックは、温度センサーを内蔵した長さ１５０ｍｍ、幅１５ｍｍ、１０ｍｍ厚のステンレス製の構造体を利用し、１～２ｍｍの間隔を空けて並べ、そのうち端側の１本については、ペルチェを接触させ室温以下まで温度制御が可能とした。また、３本のヒーターブロックのうち、両端のヒーターブロック上で、各４０回ずつ折り返すデザインとすることで、ＰＣＲに要するサーマルサイクルを４０回実行できる設計とした。図１,２は、サーマルサイクルを４０回実行できる蛇行流路と３つの温度帯を用いた例を示しているが、サーマルサイクルを１回実行できるように蛇行流路を設計してもよく、温度帯を２つになるように設計してもよい。
　蛇行流路の本数については、２本以上に設計することも可能であるが、迅速な分析を可能にするためには、１本（単独）の流路であることが好ましい。
　アニーリング、伸長及び変性の好ましい各温度と時間の推奨比率を以下の表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　連続流ＰＣＲ用微小流体デバイスが、片側のループ部に対応する１つのＤＮＡ変性用ヒーターブロックと他方のループ部に対応するアニーリング用ヒーターブロックと両側のループ部をつなぐ直線部に対応する伸長反応用ヒーターブロックの３つの温度帯を有する場合には、上記表１の推奨比率になるように設定すればよく、片側のループ部に対応する１つのＤＮＡ変性用ヒーターブロックと、他方のループ部/直線部に対応する伸長過程が実施できるヒーターブロック（伸長過程はアニール温度から変性温度の途中の温度で実施する）の２つの温度設定のサーマルサイクルでＰＣＲを行う場合には、表１の推奨比率に対応するように実施すればよい。
　各ヒーターブロックの温度をＰＩＤ制御により、目的の温度に一定制御した。ヒーターブロック表面あるいは、連続流ＰＣＲ用微小流体デバイスの表面温度については、必要に応じて、接触式あるいは非接触式の温度センサーにより確認し、表１に示すようなＰＣＲの各反応に必要な温度となるように、ヒーターブロックの温度の調整を可能とする。本発明の実施においては、連続流ＰＣＲ用微小流体デバイスの表面あるいは流れている流体、あるいはその周辺部の連続流ＰＣＲ用微小流体デバイスの表面の温度は、赤外線カメラにて測温し、目的の温度となるように調整を行った。
　ＰＣＲの試料液としては、リアルタイムＰＣＲの標準的なキット（Ｔａｋａｒａ製ＣｙｃｌｅａｖｅＰＣＲ　Ｃｏｒｅ　Ｋｉｔ）を利用した。キット付属の１３４ｂｐのＤＮＡ試料（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ）を、ＰＣＲにおける増幅対象とし、キット通りにＰＣＲ試薬を調整した。なお、検出対象の遺伝子の種類に合わせ、ＰＣＲ用プライマーやプローブなど、試薬の組成及び濃度は変更可能である。
　あらかじめ連続流ＰＣＲ用微小流体デバイスおよび中間に接続された試料注入用チューブの体積以上の気体を充填しておいたシリンジポンプを用いてＰＣＲ試料の送液を行った。空気を満たした容量１ｍＬシリンジポンプを用いて、シリコンチューブを介して、０．１～１０μＬ、望ましくは１～５μＬのＰＣＲ試料を吸引した後、チップのＰＣＲ試料注入用チューブと接続することで、ＰＣＲ試料を送液した。もしくは、一定量のＰＣＲ試料をピペットマンにて吸引後、ＰＣＲ試料をピペットマン用の交換チップ内部に留めたままはずし、ＰＣＲ試料注入用チューブに先端を差し込み、さらに他端をシリンジポンプと接続することでも、ＰＣＲ試料の注入を可能とした。本発明の実施においては、３００μＬ以上のＰＣＲ試薬の１μＬから３０μＬを、シリンジポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ製Ｍｏｄｅｌ１１）に接続した内径０．５ｍｍのシリコンチューブを通して、連続流ＰＣＲ用マイクロ流体デバイスのＰＣＲ試料注入用チューブから注入した。その際、試料液が連続流ＰＣＲ用マイクロ流体デバイスのＰＣＲ試料注入用チューブから微小流路出口のリザーバーまで流れきるように、シリンジポンプには３００μＬの空気をあらかじめ満たしておく。シリンジポンプの流速は、６５～２２５μＬ／ｍｉｎに設定し、微小流路の出口末端のリザーバーに排出されるまで連続的に送液した。これは、連続流ＰＣＲにおける１サイクル分の流路長さを流れる所要時間として、１ｓｅｃ／ｃｙｃｌｅから１０ｓｅｃ／ｃｙｃｌｅに相当する。また、ＰＣＲ試料を送液するポンプとしては、シリンジポンプ以外にも、微量の溶液を送液可能であればいかなるポンプであっても良い。これにより、図２に示すように、微少量のＰＣＲ試料を試料プラグの形状で送液する連続流ＰＣＲを行う方法を確立した。本発明では、数マイクロリットルサイズで送液し、空気で押し続けるセグメントフローとすることにより、試料液の内部で高速な対流や拡散律速のアニーリング反応の高速化が達成できた。また、ＰＣＲ溶液は気泡発生によって流れが不安定になる前に、高温領域を迅速に通過可能な点が、本発明の特徴の１つである。
　また、前述のＴａｋａｒａ製ＣｙｃｌｅａｖｅＰＣＲ　Ｃｏｒｅ　ＫｉｔのようなリアルタイムＰＣＲにおいては、目的とするＤＮＡ配列が増幅される場合に、同時に蛍光を増大させることによって、目的のＤＮＡの増幅を確認し検知する手法である。そのため、本発明の実施においては、目的とするＤＮＡの増幅を確認するため、ＰＣＲ後におけるＰＣＲ試料の蛍光強度を、蛇行流路上あるいはリザーバー位置に設置したＳＥＬＦＯＣ蛍光ファイバー検出器にて直接計測するか、あるいはＰＣＲ試料をマイクロプレートに移し替えた後、蛍光マイクロリーダーを用いて計測した。
　試料プラグを用いた連続流ＰＣＲ用微小流体デバイスの使用は、迅速な流れと簡便なＰＣＲ制御を可能にすると考えられるが、過剰に迅速な送液は各温度帯の上をＰＣＲに必要な温度に至る前に通り過ぎる可能性がある。そのため、本発明においては、ＤＮＡ変性、アニーリング、伸長の各反応に十分な反応時間を確保することを目的として、微小流路内の試料プラグの前後において、気体との界面に生ずる蒸気圧を効果的に利用し、ＰＣＲの各反応に必要な時間をかけて試料プラグが各ヒーターブロックを通過するように送液速度を変動させる点が特徴の１つである。
　ビデオカメラを用いて、試料プラグが各反応用のヒーターブロック上を通過する時間と速度を計測した結果を図３に示す。図３のグラフから明らかなとおり、蛇行流路上の平行する直線流路部分の内、伸長反応に関わる加熱の過程で通過時間は長くなった。これは、ＤＮＡ変性反応用ヒーターブロックにおいて生じる高い蒸気圧が、試料プラグの進行と対向する方向に働くため減速されたためである。それに対し、ＤＮＡ変性からアニーリングに向かう冷却過程では、同様の蒸気圧差の影響により試料プラグが加速されるため、通過時間は最も短かった。ＰＣＲの変性とアニーリングは極めて迅速に進行するため、この各反応時間の比率は、表１と同等なため、ＰＣＲにおいて最適であり、比較的ゆっくり進行する酵素的な伸長反応の時間を有為に確保する上で適している。
　これに対し、試料プラグ形状でなく、従来の、蛇行流路全体をＰＣＲ試料で充填するように送液する連続流ＰＣＲでは、送液速度は一定であり、ＤＮＡの変性温度帯からアニーリング温度帯へ向かう冷却過程においても、その他の温度帯間と同様、低速に移動する。アニーリング過程において、プライマーが標的のＤＮＡ配列に結合する転移温度まで冷却する過渡的な温度では、標的配列以外の部位にプライマーが結合する可能性があり、これが目的遺伝子配列以外の副生成物の生成する原因となる。そのため、本発明によって実現される高速な冷却は、副生成物の生成を抑制し、正確なＤＮＡ増幅に有利な点が一つの特徴である。
　試料プラグの前後に生じる蒸気圧差により、図３の通り、ヒーターブロックごとの通過速度が変動するため、設定した反応時間および温度に到達するための、流路設計および設定温度の最適化が必要となる。これらの条件が整うことによってはじめて、正確なＤＮＡの増幅が実現される。そのためには、チップ上でのヒーター間の温度勾配を含めた各温度領域の正確な温度の計測が必要となる。そのために、本発明の実施においては、シール材であるポリオレフィンの薄膜を介して、赤外線カメラにより微小流路内部を流れるＰＣＲ試料の温度の計測を検討した。本発明の実施において使用したポリオレフィンのシール材の膜厚は、５０μｍであり、シール材を介して試料プラグの温度を計測可能である。ただし、シール材の膜厚は、０．５ｍｍ以下であり、もしくは５０μｍ以下であることが望ましい、また、シール材として用いる薄膜の材質はＣＯＰ等のポリオレフィン系樹脂以外にも、アクリル系樹脂やポリカーボネイト系樹脂、ポリスチレン樹脂、フッ素系樹脂であっても良い。本発明では、薄膜のシール材もしくはカバー材もしくはフィルム材を使用することにより、蛇行流路内部の試料プラグの温度を正確に計測する手法を有することがその特徴の１つである。
　本発明の実施において、実際に連続流ＰＣＲ用微小流体デバイスの内を通過する試料プラグの温度を計測するため、図４に蛇行流路上の測定ポイントを示す。また、図４の各ポイントにおける温度の測定結果を、図５に示す。試料プラグを用いた送液による迅速な温度制御において重要な点は、アニーリングのための冷却過程の時間がかなり短いため、通常のアニーリング温度である５５～６５℃にアニーリング用ヒーターブロックの温度を設定した場合でも、図５の通り、設定温度まで冷却されず、冷却効果が不十分であった。これは、試料プラグの主成分である水の熱伝導度に比べ、連続流ＰＣＲ用微小流体デバイスの部材であるＣＯＰの熱伝導度は数倍低く、迅速な熱伝導のためにはより高い温度差が必要となるためである。そのため、アニーリング用ヒーターブロックの温度を下げて観察したところ、試料プラグの温度は図５のとおり、アニーリング用ヒーターブロックの温度に依存して減少した。さらに、ＰＣＲ後の蛍光強度についても比較したところ、表２のとおり、アニーリング用ヒーターブロックの温度が４０℃以下のとき蛍光強度の増加し、ＤＮＡが増幅されていることが確認された。特に、本発明の実施においては、アニーリング用ヒーターブロックの温度が２０℃のとき、最も蛍光強度は増幅しており、図５から明らかな通り、アニーリング反応に必要な温度まで試料プラグが十分に冷却できたためと考えられる。本発明においては、試料プラグに対する高速な温度制御のために、各ヒーター温度を通常のアニーリング温度より過剰に加熱あるいは冷却することが、特徴の１つである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　このように各温度領域における試料プラグの到達温度は、流速によって影響を受けるため、シリンジポンプの流速を変化させて、図４の各ポイントにおいて計測し、1サイクル当たりの時間を１～１０ sとした場合の温度の測定結果を図６に示す。1サイクル当たり１～２ｓといった極めて早い送液では、全ての温度領域でＰＣＲに必要な温度に到達しなかった。一方、アニーリング用ヒーターブロックの温度が２０℃の場合、1サイクル当たりの時間が７ｓ以上では過剰に冷却され、ミスアニーリングを生じやすい４０℃以下まで到達してしまうことが判明した。
　以上のことから、各ヒートブロックの設定温度と流速の最適化が試料プラグを用いた連続流ＰＣＲの温度制御に重要であり、本発明の実施において、アニーリング用ヒーターブロックの温度が２０℃のとき、流速は1サイクル５～６ｓが最適であった。
　ＰＣＲによるＤＮＡの増幅は、リザーバーに到達した試料液を回収し、ＦＡＭ色素用に設定した蛍光プレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製Ｆｌｕｏｒｏｓｃａｎ　Ａｓｃｅｎｔ）にて、連続流ＰＣＲ前後における蛍光強度の変化量を求めることで確認した。連続流ＰＣＲの結果、目的のＤＮＡ断片の増幅を示す蛍光強度の増加は、図７に示す通り、１サイクル毎の所要時間に依存した。これは、流速を遅くして１サイクル毎の所要時間を長くすると、ＰＣＲの変性、アニーリング、伸長の各反応に必要な熱伝導と反応時間が十分確保されたためである。
　図７にて明らかな通り、本発明の特徴の１つである試料プラグとして、連続流ＰＣＲを送液した場合、試料液の体積が少なくなると、ＰＣＲの効率が予想以上に向上することが明らかとなった。本発明の実施例では、蛇行流路の直線部分の流路長さは３０ｍｍであり容積は約５．５μＬに相当する。実施例に示すように、試薬溶液量が１０μＬ以上のときは、試料プラグのサイズが１サイクル分の長さを超えるため、試料プラグ前後の蒸気圧差の影響が無くなり一定の速度で流れるために、伸長反応に寄与する５５℃から９５℃へ向かう間の７２℃の領域と、折り返して、９５℃から５５℃へ冷却する間に挟まれた７２℃の領域の移動時間は等しくなる。しかし、試料液の体積が５．５μＬより小さくなると、試料プラグは蛇行流路の直線部分の中に収まるサイズとなる。そのため、サーマルサイクルのための加熱もしくは冷却において、試料プラグの上流および下流の気液界面においては、個々に蒸気圧の変化が生じ、蛇行流路の位置に依存して刻一刻と変化する。これにより、５５℃から９５℃へ向かう伸長反応の過程では、上流側の気液界面での蒸気圧は、下流側より高まるために流れ方向に逆らう力が発生し、図３に示すように、試料プラグは低速で移動した。それに対し、９５℃から５５℃へ向かう微小流路内では、下流側の気液界面側の蒸気圧が高くなり流れを加速するように働くため、試料プラグは２～３倍の速度で移動した。
　図７から明らかなように、試料液の体積が、５μＬ以下の場合のＰＣＲによる蛍光増幅量と、１０μＬ以上の場合を比較すると、同じ平均流速であっても、２倍から６倍ほど高効率であった。このように、試料プラグ両端の蒸気圧の差を利用することで、５５℃に続く７２℃の伸長反応の時間は長くＰＣＲ反応に有利となり、一方、蛇行流路のデザイン上の制約による変性領域（９５℃）からアニーリング領域（５５℃）に戻る間のＰＣＲに不要な伸長領域（７２℃）を高速に通過することで、副生成物のない理想的なサーマルサイクルが実現でき、連続流ＰＣＲの高速化と高効率化の両立が初めて実現された。従って、試料プラグは、蛇行流路の直線部分の容積以下の容量で供給されることが、本発明の好ましい特徴の一つである。
　一方、連続流ＰＣＲ用微小流体デバイスの蛇行流路の形状も、試料プラグの温度制御に影響を及ぼす。そのため、本発明の実施において、微小流路の深さを変えて断面のアスペクト比（流路幅に対する流路深さの比）を変えた場合と、平行する直線流路間の間隔を変えた場合の、目的ＤＮＡの増幅への影響を評価した。
　流路幅を８００μｍと固定し、流路深さの違いによる蛍光量の変化を検討したが、図８に示す通り、そのアスペクト比は、１／８より大きく、1未満の値に設定することが望ましい。１／８に相当する流路深さが１００μｍの場合には、リアルタイムＰＣＲによる蛍光量の増加量が減少していたが、これは、流路が浅くなり過ぎるために、ＤＮＡ変性反応用ヒーターブロック位置に置いて、過剰に熱が伝搬し試料プラグの蒸散などの影響が生じたためである。一方、アスペクト比が１に相当する流路深さが８００μｍの場合には、リアルタイムＰＣＲによる蛍光量の増加量が減少していた。これは連続流ＰＣＲ用微小流路デバイスの底面から加熱あるいは冷却する際に、蛇行流路の断面方向にて温度ムラが発生し、正確な温度まで均一に制御出来なかったためである。
　また、蛇行流路の平行する直線流路の間隔が狭くなると、単位面積当たりの流路面積の比率が増大するため空気の占める割合が増大し、ヒートブロックからチップ表面まで十分に温度が伝達されていないことが確認された。直線流路間の距離が短いと流路周辺の熱容量が少ないため十分には加熱されず、逆に冷却の場合においても同様で、流路同士の間隔が広いほど効率よく温度が変化した。
　図８に示すように、十分な熱容量を保持するための蛇行流路の平行する直線流路間の間隔は、２００μｍ以上、好ましくは４００μｍ以上、最も好ましくは６００μｍ以上であることが望ましい。以上のことから、ＣＯＰ製の微小流路を利用する場合、流路幅と同程度の間隔で流路同士の距離を確保することが、正確な温度制御に有効であると考えられる。十分な熱容量を保持するため蛇行流路の平行する流路同士の間隔の確保すること、また気泡発生や安定した送液のため流路断面のアスペクト比が１／８より大きく、１未満に設定されていることが、より効率的なＤＮＡ増幅に必要であることが明らかとなり、これらの試料プラグへの正確かつ高速な温度制御のための手法が、本発明の特徴の１つである。
　他の遺伝子検出の実施例として、枯草菌の遺伝子を対象に連続流ＰＣＲによるＤＮＡ断片の増幅を検討した。Ｔａｋａｒａ製ＣｙｃｌｅａｖｅＰＣＲＢａｃｔｅｒｉａＳｃｒｅｅｎｉｎｇ　Ｋｉｔを使用し、ＰＣＲ試薬をキット通りに調整した。各ＰＣＲ試薬については個別に連続流ＰＣＲを行った。調整したＰＣＲ試薬を、３μＬの試料プラグとして、同時に連続流ＰＣＲ用微小流体デバイス内に注入し、シリンジポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ製Ｍｏｄｅｌ１１）により、１００から６８０μＬ／ｍｉｎの流速で送液した。
　複数の試料プラグを同時に導入して連続流ＰＣＲを行った際、微小流路上の１サイクル分の長さに２個以上の試料プラグが同時に入ると、理想的なサーマルサイクルに必要な蒸気圧を利用した送液のリズムが乱れてしまう。そのため、各試料プラグについては、１サイクル分以上の十分な間隔をおいて注入した。これにより、個々の試料プラグにおいて、伸長過程が減速し、冷却過程が加速化される送液のリズムが確認され、１回の連続流ＰＣＲにおいて、試料プラグの数は１個に限定されず、大量の試料液量にも対応できる。
　連続流ＰＣＲ用微小流体デバイスの出口付近の蛇行流路の位置に、ＳＥＬＦＯＣファイバー蛍光検出器を設置し、連続流ＰＣＲによって増大した蛍光強度をリアルタイムに測定した結果、図９の通り、あらかじめ試料プラグに混合した枯草菌の量に比例して、得られる蛍光強度が変化した。この蛍光強度の変化を数値化し、検量線としてグラフ化したものを図１０に示す。その結果、得られる蛍光強度は、もともとＰＣＲ試料として調製した試薬プラグ中に含まれる枯草菌の量に優れた相関性が確認され、目的とする遺伝子の検出が可能であることが確認された。また、図９に示す通り、連続流ＰＣＲ用微小流体デバイスを使用することにより、遺伝子増幅から検出までを６分程度と、極めて迅速に実現できることが確認された。
　なお、これらの検討においては、蛍光変化によってＤＮＡ断片の増幅を確認するリアルタイムＰＣＲ法を用いているが、本明細書で使用される技術は、リアルタイムＰＣＲに限定されるものではなく、ＲＴ-ＰＣＲを含むＰＣＲ法を利用した核酸増幅技術に利用可能である。
　上記の結果から、本発明が非常に高速にＰＣＲ反応を行えることが明らかになった。
１　ＰＣＲ試料注入用チューブ
２　蛇行流路
３　リザーバー
４　連続流ＰＣＲ用微小流体デバイス
５　アニーリング用ヒーターブロック
６　伸長反応用ヒーターブロック
７　ＤＮＡ変性用ヒーターブロック
８　試料プラグ(sample)

Claims (5)

  1. 　少なくとも１回のＰＣＲサイクルを行うことができる蛇行流路を備えた核酸増幅装置にＰＣＲ試料液を供給してＰＣＲ反応を行う核酸増幅方法において、前記核酸増幅装置は、片側のループ部に対応する１つのＤＮＡ変性用温度帯と反対側のループ部に対応するアニーリング用温度帯、アニーリング用温度帯とＤＮＡ変性用温度帯との間の伸長用温度帯を有し、かつ、ＰＣＲ試料液は気体に挟まれた試料プラグの形状でポンプにより蛇行流路内に送液され、気体によりＰＣＲの１サイクル分或いはそれ以上隔てられた状態で前記蛇行流路内に供給されることを特徴とする、核酸増幅方法。
  2. 　前記試料プラグの前後の気体との界面に生じる蒸気圧差を利用することにより、アニーリング用温度帯からＤＮＡ変性用温度帯へ向かう加熱過程における送液速度を遅延させて伸長用温度帯での酵素的伸長反応時間を確保し、逆にＤＮＡ変性用温度帯からアニーリング用温度帯へ向かう冷却過程において送液速度を促進させて、前記加熱過程よりも高速に通過させる温度制御方法を利用することを特徴とする請求項１に記載の核酸増幅方法。
  3. 　前記ＰＣＲ試料液が、前記蛇行流路の直線部分の容積以下の容量で供給されることを特徴とする請求項１または２に記載の核酸増幅方法
  4. 　チップ内流路内溶液の温度を観察するための薄膜フィルムを使用することを特徴とする、請求項１～３のいずれか１項に記載の核酸増幅方法。
  5. 　前記試料プラグに対する温度制御方法が、(i)温度下降のためのアニーリング用ヒーター温度を４０℃以下に冷却、(ii)蛇行流路の平行する流路同士の間隔を２００μｍ以上に確保、(iii)気泡発生や安定した送液のため流路断面のアスペクト比を１／８より大きく1未満に設定、の少なくとも１つの温度制御方法を包含することを特徴とする請求項１～４のいずれか１項に記載の核酸増幅方法。
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