JP3041423B1 - 集積化されたマイクロウェルを用いたポリメラ―ゼ連鎖反応装置 - Google Patents
集積化されたマイクロウェルを用いたポリメラ―ゼ連鎖反応装置Info
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- JP3041423B1 JP3041423B1 JP11040811A JP4081199A JP3041423B1 JP 3041423 B1 JP3041423 B1 JP 3041423B1 JP 11040811 A JP11040811 A JP 11040811A JP 4081199 A JP4081199 A JP 4081199A JP 3041423 B1 JP3041423 B1 JP 3041423B1
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Abstract
【要約】
【課題】 微量のサンプルにより、多数のＤＮＡ試料を
一度に増幅して解析を行う事を可能とする、ポリメラー
ゼ連鎖反応の装置を開発する。 【解決手段】 半導体基板上において集積化されたマイ
クロウェルを作製して、当該ウェルの中でポリメラーゼ
連鎖反応を行う。
一度に増幅して解析を行う事を可能とする、ポリメラー
ゼ連鎖反応の装置を開発する。 【解決手段】 半導体基板上において集積化されたマイ
クロウェルを作製して、当該ウェルの中でポリメラーゼ
連鎖反応を行う。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、半導体基板上にお
いてマイクロウェル集積体を作成して、当該ウェル内で
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことにより、微
量のサンプルで一度に多数のＤＮＡ試料の増幅を行って
解析する事を可能とする装置に関する。
いてマイクロウェル集積体を作成して、当該ウェル内で
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことにより、微
量のサンプルで一度に多数のＤＮＡ試料の増幅を行って
解析する事を可能とする装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】ＰＣＲ法は分子生物学において最も重要
な手法の一つである。また、ＰＣＲ法は医療微生物学、
遺伝疾患の臨床診断、抗体をコード化する遺伝子のスク
リーニング及び法医学等、広範な分野における分析に利
用されている。臨床の場においては、より多くの検体を
より迅速に分析できる事が、多種にわたる遺伝子疾患の
診断上望まれる。また遺伝疾患の研究において、遺伝子
系統図を作成するためには多数の人の遺伝情報を解析す
る事が必要であるが、ヒトゲノムに含まれる情報は膨大
であり、効率的な分析方法が必要である。
な手法の一つである。また、ＰＣＲ法は医療微生物学、
遺伝疾患の臨床診断、抗体をコード化する遺伝子のスク
リーニング及び法医学等、広範な分野における分析に利
用されている。臨床の場においては、より多くの検体を
より迅速に分析できる事が、多種にわたる遺伝子疾患の
診断上望まれる。また遺伝疾患の研究において、遺伝子
系統図を作成するためには多数の人の遺伝情報を解析す
る事が必要であるが、ヒトゲノムに含まれる情報は膨大
であり、効率的な分析方法が必要である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかし、従来のＰＣＲ
を行う装置では、１０〜１００μｌのサンプル量が必要
であり、より少量のサンプルで精度良くＰＣＲを行える
装置が必要とされる。また、同時に多数のＤＮＡサンプ
ルの増幅を行って解析する事は困難であるため、多数の
サンプルを一度に処理できる、高密度でかつ小型化され
た装置が必要とされている。
を行う装置では、１０〜１００μｌのサンプル量が必要
であり、より少量のサンプルで精度良くＰＣＲを行える
装置が必要とされる。また、同時に多数のＤＮＡサンプ
ルの増幅を行って解析する事は困難であるため、多数の
サンプルを一度に処理できる、高密度でかつ小型化され
た装置が必要とされている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】そこで、セミコンダクタ
ーマイクロファブリケーションの技術を用いることによ
り、シリコンチップの高密度マイクロウェル集積体を作
成した。そのように集積化したマイクロウェルは、当該
ウェル中においてＰＣＲを行うために適した性質を有
し、多数の検体を同時に測定する事が可能となった。Ｐ
ＣＲの確認は、蛍光指示薬を用いる事により行った。更
に、水蒸気は通過させるが液体は通過させない膜でマイ
クロウェルを覆う事により，ＰＣＲ後の生成物が互いに
混合する事がなく、反応後のサンプルの利用を可能とし
た。
ーマイクロファブリケーションの技術を用いることによ
り、シリコンチップの高密度マイクロウェル集積体を作
成した。そのように集積化したマイクロウェルは、当該
ウェル中においてＰＣＲを行うために適した性質を有
し、多数の検体を同時に測定する事が可能となった。Ｐ
ＣＲの確認は、蛍光指示薬を用いる事により行った。更
に、水蒸気は通過させるが液体は通過させない膜でマイ
クロウェルを覆う事により，ＰＣＲ後の生成物が互いに
混合する事がなく、反応後のサンプルの利用を可能とし
た。
【０００５】
【実施例】（マイクロウェル集積体の作製方法）３０ｍ
ｍｘ３０ｍｍに切り取った、厚さ５００μｍのシリコン
ウエハーの表面に、１０００℃、８時間のウェット熱酸
化によりＳｉＯ2 膜を形成した。この片面にネガ型のフ
ォトレジストをスピンコート（４０００ｒｐｍ、２０
秒）により塗布し、フォトマスクを通じて露光した（８
秒）。現像後、余分なレジストを除去し、表面に現れた
酸化膜を１：６のＨＦ／ＮＨ4 Ｆ溶液中に５分間浸潰し
て除去した。残ったレジストについても除去後、ＴＭＡ
Ｈ（tetramethoxyammmoniumhydroxyrate ）溶液中にお
いて８０℃、１時間の条件下で、異方性エッチングを行
った。再度１０００℃、４時間のウェット熱酸化を行っ
た後、ポジ型のフォトレジストを用いて、先程と同様の
フォトリソグラフを行い、１：６のＨＦ／ＮＨ 4 Ｆ溶液
で処理することにより、チャンバー内壁以外の酸化膜を
除去した。そのように作製したマイクロウェル集積体の
断面図を図１に示す。マイクロウェル集積体（１）上
に、縦５０μｍ、横５０μｍ、高さ２７μｍの四角錐の
形状のマイクロウェル（３）を５０μｍの間隔で作製
し、２ｃｍ四方内にシリコンチップ一枚の内にマイクロ
ウェルを４万個配列させた。各ウェルの容積は２３ｐｌ
であり、通常のＰＣＲの１／２０万の容量のウェルが作
製された。マイクロウェル集積体（１）の基盤（２）上
に作製したウェル（３）の内壁（４）は酸化膜（６）で
覆われているために親水性であり、かつ基板表面（５）
は疎水性であるために、当該ウェル（３）はその中にお
いてＰＣＲを行うために適した性質を有している。
ｍｘ３０ｍｍに切り取った、厚さ５００μｍのシリコン
ウエハーの表面に、１０００℃、８時間のウェット熱酸
化によりＳｉＯ2 膜を形成した。この片面にネガ型のフ
ォトレジストをスピンコート（４０００ｒｐｍ、２０
秒）により塗布し、フォトマスクを通じて露光した（８
秒）。現像後、余分なレジストを除去し、表面に現れた
酸化膜を１：６のＨＦ／ＮＨ4 Ｆ溶液中に５分間浸潰し
て除去した。残ったレジストについても除去後、ＴＭＡ
Ｈ（tetramethoxyammmoniumhydroxyrate ）溶液中にお
いて８０℃、１時間の条件下で、異方性エッチングを行
った。再度１０００℃、４時間のウェット熱酸化を行っ
た後、ポジ型のフォトレジストを用いて、先程と同様の
フォトリソグラフを行い、１：６のＨＦ／ＮＨ 4 Ｆ溶液
で処理することにより、チャンバー内壁以外の酸化膜を
除去した。そのように作製したマイクロウェル集積体の
断面図を図１に示す。マイクロウェル集積体（１）上
に、縦５０μｍ、横５０μｍ、高さ２７μｍの四角錐の
形状のマイクロウェル（３）を５０μｍの間隔で作製
し、２ｃｍ四方内にシリコンチップ一枚の内にマイクロ
ウェルを４万個配列させた。各ウェルの容積は２３ｐｌ
であり、通常のＰＣＲの１／２０万の容量のウェルが作
製された。マイクロウェル集積体（１）の基盤（２）上
に作製したウェル（３）の内壁（４）は酸化膜（６）で
覆われているために親水性であり、かつ基板表面（５）
は疎水性であるために、当該ウェル（３）はその中にお
いてＰＣＲを行うために適した性質を有している。
【０００６】（ＰＣＲの条件）Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒ
ｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）遺伝子を導入
したプラスミドをテンプレートとして使用し、ＧＦＰ遺
伝子の増幅を行った。表１に示す組成の溶液を調製して
マイクロウェル内へ注入した後、ガラスプレートにより
すべてのウェルを覆って密封して、サーマルサイクラー
を使用してＰＣＲを行った。熱サイクルの条件は、９５
℃、２分のプレヒートの後、９４℃、６５℃をそれぞれ
１分、４０サイクル行うこととした。プライマー及びプ
ローブとして、以下の２種類を使用した。 順方向プライマー：ＧＴＧＣＴＧＣＣＡＴＡＡＣＣＡＴ
ＧＡＧＴＧ 逆方向プライマー：ＡＴＣＣＣＣＣＡＴＧＴＴＧＴＧＣ
ＡＡＡＡ プローブ：Ｆａｍ−ＣＧＧＣＣＡＡＣＴＴＡＣＴＴＣＴ
ＧＡＣＡＡＣＧＡＴＣＧ−Ｔａｍｒａ
ｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）遺伝子を導入
したプラスミドをテンプレートとして使用し、ＧＦＰ遺
伝子の増幅を行った。表１に示す組成の溶液を調製して
マイクロウェル内へ注入した後、ガラスプレートにより
すべてのウェルを覆って密封して、サーマルサイクラー
を使用してＰＣＲを行った。熱サイクルの条件は、９５
℃、２分のプレヒートの後、９４℃、６５℃をそれぞれ
１分、４０サイクル行うこととした。プライマー及びプ
ローブとして、以下の２種類を使用した。 順方向プライマー：ＧＴＧＣＴＧＣＣＡＴＡＡＣＣＡＴ
ＧＡＧＴＧ 逆方向プライマー：ＡＴＣＣＣＣＣＡＴＧＴＴＧＴＧＣ
ＡＡＡＡ プローブ：Ｆａｍ−ＣＧＧＣＣＡＡＣＴＴＡＣＴＴＣＴ
ＧＡＣＡＡＣＧＡＴＣＧ−Ｔａｍｒａ
【０００７】
【表１】 ＰＣＲにおける溶液の組成 試薬 濃度 ＧＦＰ １．３５ｎｇ／ｍｌ 各プライマー ０．５μＭ ＴａｑＭａｎプローブ ０．６３μＭ ウシ血清アルブミン ０．２％ｗ／ｖ ｄＮＴＰ ２００μＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３） １０ｍＭ ＫＣｌ ５０ｍＭ ＭｇＣｌ2 ５．５ｍＭ ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ０．０２５Ｕ／μｌ 滅菌水 −
【０００８】（ＰＣＲの確認）目的とするＤＮＡの増幅
を、蛍光により指示する方法であるＴａｑＭａｎケミス
トリーにより確認した。蛍光強度は、顕微鏡を通じてＣ
ＣＤカメラにより観察した。その結果、ＰＣＲを行う前
のマイクロウェルの蛍光顕微鏡像（図２）と比較して、
ＰＣＲを行った後の蛍光顕微鏡像（図３）において蛍光
強度は増加しており、ＧＦＰ遺伝子の増幅が確認され
た。ＰＣＲを行う前後の蛍光強度の３次元グラフを図４
に示す。
を、蛍光により指示する方法であるＴａｑＭａｎケミス
トリーにより確認した。蛍光強度は、顕微鏡を通じてＣ
ＣＤカメラにより観察した。その結果、ＰＣＲを行う前
のマイクロウェルの蛍光顕微鏡像（図２）と比較して、
ＰＣＲを行った後の蛍光顕微鏡像（図３）において蛍光
強度は増加しており、ＧＦＰ遺伝子の増幅が確認され
た。ＰＣＲを行う前後の蛍光強度の３次元グラフを図４
に示す。
【０００９】カバーガラスを除去した時に、キャピラリ
ー効果のためにサンプルが混合されてしまう事を防ぐた
めに、ＨＩＰＯＲＡ膜を用いた。ＨＩＰＯＲＡ膜及びカ
バーガラスを含む、マイクロウェル集積体全体の構造を
図５に示す。ＨＩＰＯＲＡ膜（８）は多くの微小孔を有
しているため、液体の水は通過できないが水蒸気は膜を
通過する。ＰＣＲの後にカバーガラス（７）のみ除去す
ると、マイクロウェル集積体（１）はＨＩＰＯＲＡ膜
（８）のみに覆われて、加熱してＰＣＲサンプルの水分
を蒸発させる事が可能となる。乾燥させるため、キャピ
ラリー効果によりサンプルどうしが混じることなく、Ｐ
ＣＲ後にＨＩＰＯＲＡ膜（８）を除去して、サンプルを
利用する事が可能となる。
ー効果のためにサンプルが混合されてしまう事を防ぐた
めに、ＨＩＰＯＲＡ膜を用いた。ＨＩＰＯＲＡ膜及びカ
バーガラスを含む、マイクロウェル集積体全体の構造を
図５に示す。ＨＩＰＯＲＡ膜（８）は多くの微小孔を有
しているため、液体の水は通過できないが水蒸気は膜を
通過する。ＰＣＲの後にカバーガラス（７）のみ除去す
ると、マイクロウェル集積体（１）はＨＩＰＯＲＡ膜
（８）のみに覆われて、加熱してＰＣＲサンプルの水分
を蒸発させる事が可能となる。乾燥させるため、キャピ
ラリー効果によりサンプルどうしが混じることなく、Ｐ
ＣＲ後にＨＩＰＯＲＡ膜（８）を除去して、サンプルを
利用する事が可能となる。
【００１０】
【発明の効果】本発明によるシリコンチップ上に集積化
されたマイクロウェルを用いる事により、微量のサンプ
ルで同時に多数のＤＮＡ試料のＰＣＲ反応を行う事が可
能となった。
されたマイクロウェルを用いる事により、微量のサンプ
ルで同時に多数のＤＮＡ試料のＰＣＲ反応を行う事が可
能となった。
【図１】 マイクロウェル集積体の断面図。
【図２】 ＰＣＲ前のマイクロウェルの蛍光顕微鏡像。
【図３】 ＰＣＲ後のマイクロウェルの蛍光顕微鏡像。
【図４】 ＰＣＲ前後の蛍光強度の三次元グラフ。
【図５】 ＨＩＰＯＲＡ膜及びカバーガラスを含む、マ
イクロウェル集積体全体の構造。
イクロウェル集積体全体の構造。
１ マイクロウェル集積体、２ マイクロウェル基盤、
３ マイクロウェル、４ マイクロウェル内壁、５ 基
板表面、６ 酸化膜、７．カバーガラス、８ＨＩＰＯＲ
Ａ膜
３ マイクロウェル、４ マイクロウェル内壁、５ 基
板表面、６ 酸化膜、７．カバーガラス、８ＨＩＰＯＲ
Ａ膜
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 阪口 利文 石川県能美郡辰口町旭台１−50 職員宿 舎Ｄ−13号室 (72)発明者 森田 資隆 石川県能美郡辰口町宮竹力−67 (72)発明者 永井 秀典 石川県能美郡辰口町旭台１−８ 学生宿 舎３−514号室 (72)発明者 井手上 公太郎 石川県能美郡辰口町旭台１−50 学生宿 舎３−405号室 (56)参考文献 特開 平５−317030（ＪＰ，Ａ) Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏ ｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ 72 （1998）ｐ．125−135 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12M 1/00 C12Q 1/68 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (5)
- 【請求項１】 ポリメラーゼ連鎖反応法を実施するため
の装置であって、 半導体基板上に、集積化された複数のマイクロウェルか
らなるマイクロウェル集積体が形成されており、 当該集積体を構成する各マイクロウェル中においてそれ
ぞれポリメラーゼ連鎖反応を行うように構成されてお
り、 当該マイクロウェルの内部は酸化膜が設けられて親水性
になっていて、 前記半導体基板の表面の酸化膜が除去されて疎水性にな
っている、 事を特徴とする、ポリメラーゼ連鎖反応装置。 - 【請求項２】 前記半導体基板のマイクロウェル集積体
側を覆う膜であって、水蒸気は透過させるが液体は不透
過性の膜を備えており、この膜によって各マイクロウェ
ル中の各ポリメラーゼ連鎖反応の生成物の混合を防いで
いる事を特徴とする、請求項１記載のポリメラーゼ連鎖
反応装置。 - 【請求項３】 請求項１又は請求項２記載の装置を用い
た、ポリメラーゼ連鎖反応方法。 - 【請求項４】 水蒸気は透過させるが液体は不透過性の
膜によって、前記半導体基板の前記マイクロウェル集積
体側を覆い、各マイクロウェル中の各ポリメラーゼ連鎖
反応の生成物を乾燥させて、前記膜を取り除く事を特徴
とする、請求項３記載のポリメラーゼ連鎖反応方法。 - 【請求項５】 前記各マイクロウェル中の前記生成物を
乾燥させて、次いで蛍光指示薬を滴下し、各マイクロウ
ェルからの蛍光を検出する事を特徴とする、請求項４記
載のポリメラーゼ連鎖反応方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11040811A JP3041423B1 (ja) | 1999-02-19 | 1999-02-19 | 集積化されたマイクロウェルを用いたポリメラ―ゼ連鎖反応装置 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11040811A JP3041423B1 (ja) | 1999-02-19 | 1999-02-19 | 集積化されたマイクロウェルを用いたポリメラ―ゼ連鎖反応装置 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP3041423B1 true JP3041423B1 (ja) | 2000-05-15 |
| JP2000236876A JP2000236876A (ja) | 2000-09-05 |
Family
ID=12591044
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11040811A Expired - Lifetime JP3041423B1 (ja) | 1999-02-19 | 1999-02-19 | 集積化されたマイクロウェルを用いたポリメラ―ゼ連鎖反応装置 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3041423B1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10273532B2 (en) | 2012-03-09 | 2019-04-30 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | Nucleic acid amplification method |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100855996B1 (ko) * | 2002-07-02 | 2008-09-02 | 유재천 | Pcr 디스크 장치, pcr 디스크 드라이버 장치 및 그를 이용한 분석 방법 |
| KR101181097B1 (ko) * | 2005-02-10 | 2012-09-07 | 파나소닉 주식회사 | 미세구조체를 유지하기 위한 구조체, 반도체장치, 티에프티구동회로, 패널, 디스플레이, 센서 및 이들의 제조방법 |
| JP2008232899A (ja) * | 2007-03-22 | 2008-10-02 | Sumitomo Bakelite Co Ltd | 基板およびその使用方法 |
| JP4453090B2 (ja) | 2007-11-08 | 2010-04-21 | セイコーエプソン株式会社 | 生体試料反応用チップおよび生体試料反応方法 |
| JP4665960B2 (ja) | 2007-12-06 | 2011-04-06 | セイコーエプソン株式会社 | 生体試料反応用チップ、生体試料反応装置、および生体試料反応方法 |
| JP4556194B2 (ja) | 2008-02-01 | 2010-10-06 | セイコーエプソン株式会社 | 生体試料反応方法 |
| JP5131538B2 (ja) * | 2008-05-07 | 2013-01-30 | セイコーエプソン株式会社 | 反応液充填方法 |
| WO2010107497A2 (en) * | 2009-03-18 | 2010-09-23 | The Regents Of The University Of California | Honeycomb shrink wells for stem cell culture |
| KR101188011B1 (ko) | 2011-06-03 | 2012-10-08 | 삼성전기주식회사 | 바이오 칩 |
| KR101218986B1 (ko) | 2011-10-25 | 2013-01-09 | 삼성전기주식회사 | 바이오 칩 |
| JP2017026516A (ja) * | 2015-07-24 | 2017-02-02 | 株式会社古河電工アドバンストエンジニアリング | マイクロウェルプレート、ウェルへの検体導入方法 |
| KR101816520B1 (ko) | 2015-12-29 | 2018-01-10 | 광주과학기술원 | 다중 분자진단을 위한 칩 구조 |
| WO2023070567A1 (zh) * | 2021-10-29 | 2023-05-04 | 京东方科技集团股份有限公司 | 检测芯片及其制备方法 |
-
1999
- 1999-02-19 JP JP11040811A patent/JP3041423B1/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ７２（１９９８）ｐ．１２５−１３５ |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10273532B2 (en) | 2012-03-09 | 2019-04-30 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | Nucleic acid amplification method |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2000236876A (ja) | 2000-09-05 |
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