CN1861800A - 用于化学扩增反应的大孔载体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于将核酸在平面地构成的大孔载体材料的孔内进行扩增的方法，其中，在载体材料的孔内提供对于核酸扩增所需的反应混合物的预先规定部分。此外，本发明还涉及包括具有大量孔的平面地构成的大孔载体材料的装置，其中，在孔内提供用于进行核酸扩增的反应混合物的预先规定部分。

Description

用于化学扩增反应的大孔载体
技术领域
本发明涉及一种用于将核酸在平面地构成的大孔载体材料的孔内进行扩增的方法，其中，在载体材料的两个或者多个孔内提供核酸扩增所需的反应混合物的预先规定部分。此外，本发明还涉及包括具有大量孔的、平面地构成的大孔的载体材料的装置，其中，在孔内提供用于进行核酸扩增的反应混合物的预先规定部分。
背景技术
包括核酸研究在内的方法在分子生物学研究方面、但也在大量疾病的诊断方面得到越来越多的应用。为此目的，一般情况下将相应的核酸进行扩增。聚合酶链式反应(PCR)是一种控制扩增DNA片断的体外方法。短寡核苷酸(引物)与所要求的DNA片断的两端特异性结合，并这样通过DNA聚合酶引发指数倍增。理论上在100％反应效率的情况下，片断复制原始量可以达到2n复制的扩增，其中，n为扩增周期的数量。
对于核酸扩增在基础研究、诊断和治疗监测方面的应用来说，在同时提高特异性的情况下，自动化、并行化和微型化具有越来越重要的意义。除了与自动化相关的节省时间和成本外，一个主要优点在于，滴定误差或者由于扩增时微小的温度或者时间波动或者在光度测量扩增产物时仪器条件所限的读数误差造成的各反应批料的反应条件的差别降到最低限度。这一点意味着，当越多的反应混合物成分可用作反应批料在共同主盘模型中进行比较时、且当越多的反应可被同时执行和分析时，则结果越就可相互比较。因为PCR是核酸的一种幂扩增，所以反应条件中微小的差别乘方，并因此对结果产生明显影响。设立PCR条件的特异性，可以通过缩短扩增期间反应混合物的加热和冷却时间间隔得到实质性提高，因为由此可以使引物的非特异性结合最小化。用于提高核酸扩增效果的另一个因素在于减少反应体积。反应体积越小，整个体积均匀的温度上升或下降也就越快。此外可以利用试样材料进行更多的反应、并因此进行更多的分析。特别是在可供使用的患者材料-例如活组织检查有限时、或者试样材料例如cDNA的获取需要很高费用的情况下，这构成一个主要优点。
现有技术中公知的用于核酸扩增微型化和并行化的构思，优选使用平面的“芯片实验室”系统(Kopp等的《科学》(Science)(1998)280，1046-1048)。这种芯片系统采用流动构思进行工作，其中，PCR连续地使反应溶液流经不同的温度区域。这种方案的缺点除了温度周期的数量通过芯片几何形状来确定和不可变化外，还在于由于PCR流动构思的实验复杂性造成并行化程度十分有限，而且由于PCR流动反应器的平面设置使得每个芯片需要很大空间，从而导致很高的制造成本。在专利申请US 2001/0055765 A1中公开了一种装置和方法，用于在平面基底的敞开的反应室内进行化学和生化反应，其中，将大量液态试样添加到单个反应室内，这样就造成操作非常复杂，而且耗费时间、成本很高。同目前所有存在的用于微型和纳米滴定片的构思一样，上述的美国申请也以“一个反应体积上的反应批料”构思为基础。然而随着微型化的不断增加，对分配技术的要求日益提高：
(i)必须以高精度和高度可重复性分配越来越小的体积。对此产生的困难是，特别是在生命科学和分子诊断中，通常必须用吸管移取具有极其不同浸湿特性(例如含有去污剂)和粘度(例如高浓度蛋白质溶液或者血液)的反应溶液，由此有损于精度和可重复性。
(ii)为活化单个离散的反应容器，对将要沉积的溶液的定位精度和可重复性的要求有所提高。这种精确分配系统维护复杂且制造昂贵。特别是对于服务和常规实验室的周围环境来说，精确分配系统并不适用。
因此，在使用具有相应反应容器的微型化载体的情况下，希望的方法能够对分配装置的定位精度要求不高，并同时可以非常精确地并可重复地供应最少的液体量。
发明内容
本发明的目的因此在于，提供用于改进地执行核酸扩增的新型方法和装置。
该目的通过在权利要求中具有特征实施方式得以实现。
尤其提供一种用于在平面地构成的大孔载体材料的孔内扩增核酸的方法，该载体材料对置地具有第一和第二表面，其中，在整个表面区域上分布地设置大量离散的孔，其直径处于500nm至100μm的范围内，孔深度与孔径的纵横比至少为10∶1而孔密度为104至108/cm2，该方法包括下列步骤：
(a)在载体材料的包括至少两个孔的至少一个区域内提供能够用于扩增反应的反应混合物的预先规定部分，这样使该部分反应混合物非共价地与载体材料的孔壁相结合，从而由此在载体材料表面上同时确定一个反应区域，
(b)在整个载体材料上添加一种试样，该试样含有用于完成扩增反应所需的反应混合物部分，
(c)进行扩增反应，以及
(d)检测至少一种扩增产物。
采用一种有序的多孔基材可以满足上述两个要求，条件是放弃“以一种反应体积的一个反应批料”概念，并将反应批料分布在多个彼此相邻的毛细管或孔上：
-反应区域不是通过载体基材的几何形状限定，而是仅通过供给反应溶液或其部分来限定(例如像为产生微型阵列所使用的那样，通过使用斑点技术)。在依据本发明提供的带孔载体上，由一组连续的毛细管或孔组成反应区域，其中，不需要得到校正的斑点。反应区域不必彼此无缝隙，而是也可以通过包括多个孔的空隙分开。
-通过溶液与带孔载体接触时产生的毛细力的抽吸作用，对于一组离散的反应毛细管进行填充。如果毛细管或孔已注满，它们不会再吸收其它溶液。依据本发明设置的带孔载体因此是一种自限制的系统。毛细管的填注既可以采用盲孔也可以采用贯通孔。
超过目前所使用形式的进一步微型化具有许多优点。通过依据本发明所使用的载体材料的小尺寸，可以避免试样上的温度梯度。此外，降低用于填注反应载体所需的试剂量，并因此同时降低每次实验/试验的成本。特别是在要求快速加热率和冷却率的化学扩增情况下，这种微型化反应载体的小尺寸具有优点，因为所要输送的热量很小，并因此可以迅速泵入到该系统内，或从那里排出。
在本发明的构思内，孔既指通过载体材料从第一表面向第二表面延伸的孔、也就是贯通孔，也指一端处封闭的孔、也就是盲孔。在本发明的构思内，最好设置通过载体材料从第一表面向第二表面延伸的孔。
本发明的大孔载体材料在材料选择方面不受限制，只要其包括具有孔直径为500nm至100μm、最好为2至20μm的孔以及104至108孔/cm2的孔密度。特别是依据本发明所使用的大孔载体材料可以以塑料、玻璃、Al2O3或者硅为基础。最好大孔硅、以及更优选地局部氧化的大孔硅作为大孔载体材料在本发明的构思内使用。
优选使用的大孔硅在这种情况下可以进行掺杂，优选进行n型掺杂，或者不掺杂。这样一种大孔硅例如可以按照在EP-A1-0 296 348中所介绍的方法进行制造。洞开口或孔的制造优选按照电化学的途径进行，其中，在含有氢氟酸电解液中的电化学蚀刻在施加恒定或者时间上变化的电势时进行，其中，由硅制成的层或者所述基材作为电解槽的正极电极连接。这种孔的制造例如可以按V.Lehmann.J.Electrochem.Soc.140，1993，2836页以后所介绍的方法进行。但在本发明的构思内，作为大孔基材例如也可以设置例如像GaAs基材这种半导体基材、或者设置利用Si3N4涂层的玻璃基材。
作为本发明的构思内的大孔载体材料可以特别优选的方式使用局部氧化的大孔硅，正如WO 03/089925中所介绍的那样，这里引用其全部内容。这种局部氧化的大孔硅是指硅基上平面地构成的大孔载体材料，它在整个表面上分布地设置大量的孔，其直径处于500nm至100μm的范围内，孔深度与孔径的纵横比至少为10∶1而孔密度为104至108/cm2，其中，所述载体具有至少一个区域，该区域包括具有由SiO2制成的孔壁的多个或大量孔，并且其中该区域由一个与孔的纵轴线基本平行设置的、由具有硅芯的壁组成的、向表面敞开的框架所环绕，其中所述硅芯在横截面上向构成框架的壁的外侧过渡到SiO2内。这种局部氧化的大孔硅因此具有局部透明的由SiO2制成的区域，其中，这些透明区域也由具有硅芯壁制成的框架所环绕。换句话说，存在局部完全透明的由SiO2制成的区域，它们通过基本形成二级结构的、具有硅芯的非透明壁彼此相分离。
在此方面，在本发明的构思内作为大孔载体材料所使用的、局部氧化的大孔硅也可以这样构成，正如DE 10 2004 018846.7中所介绍的那样，这里引用其全部内容，即在由具有硅芯的壁所组成的所有框架之内，每个单个框架完全与环绕它的框架、或相邻的框架在空间上完全隔绝。单个区域或间隔段的硅壁不再相联、或者说不接触，而是通过具有由SiO2制成孔壁的区域彼此完全分离。由于这种结构上的设置，在这种局部已氧化的大孔硅的制造过程中通过因为从硅向氧化硅过渡时的体积加倍而局部出现的应力达到空间上的分离。在全部氧化的区域内，孔之间的壁完全由SiO2构成。
扩增反应器依据本发明具有的三维设置利用基材的深度，并可以使扩增反应区域具有高的整体性，并因此可以低成本地制造反应载体。这达到反应体积的完全分离，从而不会出现交叉污染。依据本发明的大孔载体材料具有500nm至100μm、最好2至10μm的孔直径。通过将反应体积最小化到约10pl至500nl，最好1.5至20nl，就降低了每次扩增反应的成本。孔内的毛细力使孔的填注变得容易。很小的热容量和对孔内反应混合物良好的热传导可以使系统内产生非常迅速的温度变化，并因此可以在非常短的时间内以大约3至10℃/s的加热率或冷却率进行选择性的和敏感的扩增。载体材料的加热和冷却可以或者通过外部的加热块/冷却块(例如加热线圈/压缩空气冷却装置或者帕尔贴元件)、优选具有一种温度传感器(例如Pt100)进行，或者通过一个在载体材料上集成的加热元件(例如加热线圈)、优选具有一种温度传感器(例如Pt100)进行。
术语“核酸扩增”包括核酸的任何酶扩增、优选通过具有聚合酶活性的酶。这种酶例如是Taq聚合酶或者Pfu聚合酶。所述扩增可以通过聚合酶链反应(PCR)进行。
例如依据本发明的核酸扩增为实时PCR、嵌套式PCR、非对称性PCR、梯度PCR、RT-PCR和甲基化特异PCR。
实时聚合酶链反应(实时PCR)在PCR中倍增DNA片断，并为此可以通过测量荧光信号连续观察DNA的扩增。这一点既可以通过使用与双股核酸非特异地结合的颜料，也可以通过使用与荧光颜料结合的序列特异性探针。
在嵌套式PCR中，首先将核酸片断借助于PCR进行扩增。这种PCR产物在一个第二PCR中作为目标核酸使用。利用在第一PCR片断内部杂交的第二引物配对，在随后的PCR中扩增更小的片断。
所要扩增的核酸可以是任何天然存在的、或者人工制成的核酸。这既包括双股和单股DNA或者RNA分子，也包括具有修饰碱基的核酸。此外，这还包括扩增前经修饰的核酸，例如为检测在甲基化特异PCR中的甲基化DNA，用亚硫酸氢钠进行处理，从而将甲基化胞嘧啶向尿嘧啶转换。此外，同时还包括事先从RNA逆转录的DNA分子的扩增。
反应混合物的预先规定部分可以是为扩增核酸必需的反应混合物的一种或者多种化合物，包括酶、核苷酸(例如像dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP这样的脱氧核苷酸、或者像ddATP或者ddCTP这样的二脱氧核苷酸)、盐(例如MgCl2)、引物(包括扩增期间可扩展的和不可扩展的引物)、核酸(例如DNA、RNA)、PNA(肽核酸)、颜料和探针。
如上所述，能够用于扩增反应的反应混合物的预先规定部分或其化合物一般通过干燥含有该部分的水溶液而与载体材料的孔壁相结合。
在本发明的一种优选实施方式中，步骤(a)中在孔内提供的预先规定部分包括核苷酸、至少一种探针和/或者至少一种颜料、盐和引物，在一种优选的实施方式中附加PNA，从而为在步骤(c)中进行酶反应添加所要检验的试样材料和酶。按照这种方式，在一种尤其优选的实施方式中，可制造对某一检测具有特异性的标准大孔载体并销售给潜在的使用者。使用者提供所要进行检测的试样，且优选为酶，并进行核酸扩增。
概念“盐”包括浓度上不妨碍核酸进行酶扩增的所有公知的盐。
概念“引物”包括通过碱基配对与互补的核酸序列杂交并作为添加核苷酸起点所使用的所有寡核苷酸。依据本发明的引物可以携带能够检测核酸扩增反应产物的检测性标记。
PNA是寡核苷酸，其碱基不是通过糖-磷酸盐桥相互连接，而是通过一种类似氨基的桥相互连接。这种结构通过具有非常高结合能量的碱基配对与互补的单股DNA序列特异性地杂交。通过结合的PNA，聚合酶不能扩增核酸。只要在PNA和核酸之间出现错误配对，那么结合能量就会剧烈下降，而且PNA在扩增反应期间不与核酸相结合。
概念“颜料”表示可以用于检测已扩增的核酸的所有公知颜料，包括与双股核酸特异结合的(例如插入的)、如Sybr Green或者溴化乙锭这样的荧光颜料。
概念“探针”包括可以用于通过特异杂交来检测已扩增的核酸的任何核苷酸序列，包括与一种可检测的标记相结合的探针。这样一种可检测的标记例如可以是荧光颜料或者对可检测的标记具有很高亲和性的化合物。本发明中所使用的探针系统可以是可用于检测PCR产物的任何公知的探针系统，例如像TaqMan探针、分子标识、Scorpion探针、Light Cycler探针或者其它荧光共振能量转换(FRET)探针。TaqMan探针包括一端上的“报道基因”和另一端上阻止报道基因发射可检测的荧光信号的“猝灭基因”。在探针与互补的核苷酸序列杂交后，聚合酶的5′→3′外切核酸酶活性使探针断裂，从而猝灭基因不再处于报道基因的附近，并发射可检测的荧光信号。分子标识也在一端上具有一个“报道基因”，而在另一端上具有阻止通过报道基因发射可检测的荧光信号的“猝灭基因”。该探针两端上的自互补序列造成一种发夹结构的探针，只要探针与一种互补的核苷酸序列杂交，该结构就被释放。发夹结构的这种释放导致报道基因和猝灭基因之间空间上的分离，这足可以使报道基因发射可检测的荧光信号。荧光共振能量转换(FRET)原理(例如Light Cycler探针以其为基础)涉及两个探针，它们与目标核酸的相邻顺序互补，并利用不同的荧光颜料做标记。在所述两个探针与目标核酸杂交后，其中一个探针的颜料受到激励，而且这种激励诱导通过与第二探针结合的颜料来发射可检测的荧光信号。
概念“试样”或“试样材料”包括含有可扩增核酸的任何成分。这一点同时包括人工合成的核酸和从病毒—例如HIV、原核生物—例如大肠杆菌、或者真核生物—例如哺乳动物中分离的核酸。在本发明的一种优选实施方式中，试样材料包括从例如血液、唾液或者尿液这些人的生物液体中分离出来的DNA和/或者RNA。在本发明的另一种优选实施方式中，试样材料包括从人的组织或者肿瘤试样中分离出来的DNA和/或者RNA。
在本发明的一种实施方式中，试样材料包括为依据本发明的扩增所提供的核酸。例如可以嵌套式PCR的方式进行所要求核酸片断的预扩增，或者例如可以RT-PCR的方式通过RNA的逆转录产生试样材料中存在的DNA。为此，可以在试样材料中存在的核酸中通过利用亚硫酸氢钠的事先处理将甲基化的胞嘧啶转换成尿嘧啶，例如用于甲基化的特异PCR。在另一种实施例中，试样材料内存在的核酸事先例如通过使用探针或者通过色谱、电泳或者离心拆开进行选择性地富集。
上述方法例如可以用于定量检测核酸。在一种优选的实施方式中，在步骤(a)中提供核苷酸、盐、至少一种探针和/或者至少一种颜料、引物和必要时的PNA，用于选择性地扩增某种核酸片断。在步骤(b)中可以输送试样材料，将其这样稀释，使该待扩增的核酸片断的一个拷贝统计学地进入到载体材料的孔内。如果例如所述反应混合物含有PNA，它们抑制核酸片断某个变种、例如野生型的扩增，那么可以检测例如已突变的核酸的已改变的变种的频率。在另一种实施例中，试样材料可以这样稀释，使在统计学上一个基因组当量进入载体材料的孔内。按照这种方式，可以检测染色体畸变(例如缺失或者重复)。上述实施例可以用于诊断基因缺陷、肿瘤新疾病和肿瘤的分类。在上面介绍的实施例中，通过所使用的载体材料的大量孔无附加操作步骤进行的大量反应可以产生统计学上有说服力的计值分析。例如，在一个面积为1mm2的载体材料上，根据孔的彼此距离存在102至106个孔。依据本发明的方法的另一种优点在于，通过在相同的扩增和检测条件下使用同一反应混合物和同一试样材料，为所有并列进行的反应提供基本上相同的条件，从而将各反应添加物之间个体的波动降到最低限度。
在该方法的一种特别优选的实施方式中，在步骤(a)中除了用于扩增或检测所要求的核酸片断的引物和至少一种探针和/或者至少一种颜料外，还提供另一种引物对和至少一种用于处于这些引物之间的核酸序列的特异探针。利用特异的探针检测第二引物对的扩增产物，这可以起到控制扩增反应效率的目的。扩增反应的效率也可以通过使用结合双股扩增产物的非特定颜料进行确证。
在一种实施方式中，依据本发明的方法还包括提供至少另一部分能够用于扩增反应的反应混合物，其成分与步骤(a)中的反应混合物部分的成分的区别是：在载体材料的包括至少两个孔并不同于步骤(a)中区域的至少第二区域内的至少一种化合物、或者至少一种化合物的浓度。最好所述能够用于扩增反应的反应混合物的至少另一部分的成分与步骤(a)中反应混合物的部分的成分的区别在于至少一种化合物。
这种实施方式因此涉及一种用于在平面地构成的大孔载体材料的孔内进行核酸扩增的方法，该材料具有彼此对置的第一表面和第二表面，其中，在整个表面上分布地设置大量离散的孔，其直径处于500nm至100μm的范围内，孔深度与孔径的纵横比至少为10∶1，而孔密度为104至108/m2，包括一下步骤：
(a)在载体材料包括至少两个孔的至少一个区域内提供能够用于扩增反应的反应混合物的预先规定部分，这样使该部分反应混合物非共价地与载体材料的孔壁相结合，从而在载体材料表面上同时限定反应区域或反应带，
(b)提供至少一部分反应混合物，其成分与步骤(a)中的反应混合物成分的区别是：在载体材料的包括至少两个孔并不同于步骤(a)中区域的至少第二区域内的至少一种化合物、或者至少一种化合物的浓度，这样使该部分反应混合物非共价地与载体材料的孔壁相结合，
(c)在整个载体上材料添加试样，该试样含有用于使扩增反应完备所要求的、步骤(a)和(b)的反应混合物部分，
(d)进行扩增反应，以及
(e)检测至少一种扩增产物。
可以在带孔载体材料上任意限定所述单独的区域。
上述依据本发明方法的实施方式是一种检验试样材料内存在具体核酸的检测方法。由于通过在步骤(a)和(b)中提供不同的引物恰当划分大孔载体的区域，仅通过引物的变化就可以在载体材料上进行大量检测，可以在一个操作步骤中检验试样材料上大量公知的重要生物标记，例如所有公知的肿瘤标记或者由于基因缺陷引起的疾病标记，或者肿瘤疾病和/或者新陈代谢疾病的大量公知的基因表达标记。
这种检测的一个实施例是出于例如诊断目的扩增DNA，在依据本发明所使用的多孔材料载体上提供核苷酸、盐、至少一种探针和/或者至少一种颜料和引物，它们与例如不同HIV亚型或者不同HPV型具体病原体的DNA特异结合，并添加从血液成分和酶中分离的DNA。这种检测的另一个实施例是出于诊断目的将mRNA逆转录成DNA和随后扩增DNA，在依据本发明所使用的多孔材料载体上提供核苷酸、盐、至少一种探针和/或者至少一种颜料和引物，它们与存在某种疾病情况下其表达增加或者降低的特定基因的mRNA特定结合，并添加从组织或者血液成分和酶中分离的RNA。这种检测的另一个实施例是例如为诊断肿瘤疾病检测修饰的DNA，如果利用依据本发明的方法所检测的DNA修饰，对肿瘤疾病是具有代表性的。在这种情况下，除了核苷酸、盐、探针和/或者颜料和引物外，在依据本发明所使用的带孔载体上还可以提供抑制未修饰DNA扩增的PNA。在添加试样材料和相应的酶时，如果试样内存在经修饰的DNA的话，使用者得到正荧光信号。
在依据本发明方法的另一种优选实施方式中，在载体材料的不同区域内提供核苷酸、盐、至少一种探针和/或者至少一种颜料和不同区域特异性的核酸。随后对包括为所有区域添加的相同引物在内的其余部分反应混合物进行扩增反应并检测扩增产物。这种实施方式可以在下述情况下使用，例如在载体材料上提供不同组织或者肿瘤的cDNAs并利用添加的引物辨别，利用该引物扩增的核酸在其中进行表达的组织或肿瘤。按照这种方式可以检查例如不同疾病阶段或者发展程度上的组织样品在不同组织内或者例如不同肿瘤类型或者不同肿瘤阶段的肿瘤内已知和未知基因的表现。
通常载体材料在步骤(a)前单面封闭。此外，在进行扩增反应前一般情况下在仍敞开的面上继续进行封闭，也就是双面封闭。由此例如可以避免扩增反应期间加热时反应混合物蒸发。封闭可以按照对扩增反应无实质影响的任何公知方式进行。例如，带孔载体材料的上面或底面或者两面可以利用聚合物薄膜或者弹性体基(例如硅树脂)上的垫作为盖或者密封件封闭或者这些孔可以利用矿物油覆盖。封闭载体材料的另一个实施例是利用蜡、微晶蜡、聚乙烯蜡或者不含溶剂或者不会产生危害扩增反应的其他化学成分的快速硬化树脂封闭孔。
在依据本发明方法的一种实施方式中，大孔载体材料至少一面上的孔也可以保持不封闭。在这种情况下，扩增反应在可利用水蒸汽饱和并可加热将其覆盖的反应室内进行。
扩增反应在通过提供反应混合物内含有的酶进行核酸扩增的条件下进行，优选通过周期性加热载体材料进行。
扩增产物的检测优选测量光度进行。扩增产物例如可以通过使用与双股核酸特异结合的颜料或者通过使用标记的序列特异性探针进行检测。
在本发明的一种优选实施方式中，将引入孔内的反应混合物的预先规定部分或其化合物在液体中溶解，加入孔内(例如在利用孔的毛细力情况下)并随后蒸发液体。
在依据本发明的一种特别优选的实施方式中，能够用于扩增反应的反应混合物所提供部分通过干燥或脱水涂覆在载体材料的孔壁上。
能够用于扩增反应的反应混合体所提供部分可以在载体材料的各自所要求的区域内通过现有技术中公知的斑点法涂覆。
在本发明的一种优选实施方式中，在一个操作步骤中在整个载体上材料添加试样。载体材料各孔的填注优选毛细管驱动进行。孔的毛细力可以使孔确定均匀填注，从而获得一种自加料系统。
此外提供一种包括平面地构成的大孔载体材料的装置，该材料对置地具有第一和第二表面，其中，在整个表面上分布地设置大量的离散孔，其直径处于500nm至100μm的范围内，孔深度与孔径的纵横比至少为10∶1，而孔密度为104至108/m2，其中，该装置具有至少一个区域，在该区域内用于进行核酸扩增的反应混合物的预先规定部分在至少两个孔内非共价地结合。
此外提供一种包括平面地构成的大孔载体材料的装置，该材料对置地具有第一和第二表面，其中，在整个表面上分布地设置大量的离散孔，其直径处于500nm至100μm的范围内，孔深度与孔径的纵横比至少为10∶1，而孔密度为104至108/cm2，其中，该装置具有至少一个第一区域，在该区域内用于进行核酸扩增的反应混合物的预先规定部分在至少两个孔内非共价地结合，还具有一个第二区域，在该区域内用于进行核酸扩增的反应混合物的预先规定部分非共价地结合地处于至少两个孔内，该预先规定部分与第一部分的区别是至少一种化合物。
“非共价地结合”在本发明的构思内是指将形成如上所述能够用于扩增反应的反应混合物的预先规定部分的化合物涂覆或设置在大孔载体材料的各自孔壁内或孔壁上，从而化合物固定附着在这些孔壁上，而不是与这些孔壁通过化学共价结合连接。这种固定附着或物理吸附可以通过相应地干燥含有该预先规定部分或与此相关化合物的水溶液进行。这些化合物以可逆、无破坏和可定量分开的方式附着在大孔载体材料的孔壁上。
在依据本发明的方法或依据本发明的装置中，通过平面地构成的大孔载体材料的整个表面分布设置大量通常周期性设置的孔，它们从载体材料的一个表面向相对的表面延伸。在本发明的构思内，平面地构成的大孔载体材料上可局部提供盲孔，也就是仅在一个表面侧敞开的孔。
在依据本发明的方法或依据本发明的装置中所使用的大孔载体材料具有500nm至100μm，优选2至20μm的孔直径。由此形成孔深度与孔径的纵横比大于10∶1，优选大于40∶1。大孔载体材料的厚度一般为100至5000μm，优选为300至600μm。孔中心到孔中心的间隔(Pitch)、也就是两个彼此相邻或者邻接孔的距离一般为1至100μm，优选3至50μm。孔密度一般处于104至108/cm2的范围内。
本发明的大孔载体材料在材料选择方面不受限制，只要具有孔直径500nm至100μm，优选2至10μm的孔。特别是依据本发明所使用的载体材料可以以塑料、玻璃、Al2O3或者硅为基础。优选大孔硅并更多地优选局部氧化的大孔硅作为大孔载体材料在本发明的构思内使用。
优选所使用的大孔硅可以掺杂，优选进行n型掺杂，或者不掺杂。这种大孔硅例如可以按照EP-A1-0 296 348中所介绍的方法制造。洞开口或孔的制造优选按照电化学的途径进行，其中，在含有氢氟酸电解液中的电化学蚀刻在施加恒定或者随时间变化的电位下进行，其中，由硅组成的层或者基材作为电解槽的正极电极连接。这种孔的制造例如可以按V.Lehmann.J.Electrochem.Soc.140，1993，2836页以后所介绍的方法进行。但在本发明的构思内，作为大孔基材例如也可以使用例如像GaAs基材这种半导体基材或者具有Si3N4涂层的玻璃基材。
作为本发明构思内的大孔载体材料可以特别优选的方式使用一种局部氧化的大孔硅，正如在WO 03/089925中所介绍的那样，这里引用其全部内容。这种局部氧化的大孔硅是指基于硅的平面地构成的大孔载体材料，它该载体材料整个表面上分布地设置大量的孔，其直径处于500nm至100μm的范围内，该孔具有至少一个包括具有SiO2孔壁的大量孔的区域，并且其中该区域由一个与孔的纵轴线基本平行设置，由具有硅芯的壁组成向表面敞开的框架环绕，硅芯通过横截面向构成框架的壁外侧过渡到SiO2内。这种局部氧化的大孔硅因此具有局部透明的SiO2区域，其中，这些透明区域也由具有硅芯壁构成的框架环绕。换句话说，存在局部完全透明的SiO2区域，它们通过在基本上形成二级结构具有硅芯的非透明壁彼此分离。
在本发明的构思内作为大孔载体材料使用的局部氧化大孔硅也可以这样构成，正如DE 10 2004 018846.7中所介绍的那样，这里引用其全部内容，即具有硅芯的壁构成的所有框架中的每个单个框架完全与环绕它的框架即相邻的框架空间上完全隔绝。单个区域或隔断段的硅壁然后不再连续即不接触，而是通过具有SiO2孔壁的区域彼此完全分离。根据这种结构上的设置，在这种局部氧化大孔硅的制造过程中，通过因为从硅向氧化硅过渡时的体积加倍而局部出现的应力达到空间上的分离。在全部氧化的区域内，孔之间的壁完全由SiO2构成。
依据本发明方法或依据本发明装置中的孔例如可以基本上圆形或者椭圆形构成。如果作为本发明的构思内的大孔载体材料特别是使用局部氧化的大孔硅，那么具有SiO2孔壁的孔也可以基本上正方形构成。由具有硅芯的壁组成的框架然后可以基本上正方形或者矩形的方式存在。
此外，提供如上述平面地构成的大孔载体材料，用于核酸的扩增。
附图说明
下面借助附图对本发明进行举例说明。其中：
图1示出依据本发明装置的不同实施方式的横截面图(A)-(D)；
图2示出依据本发明装置的一种实施方式的示意俯视图；
图3示出进行扩增反应不同实施方式的横截面图(A)、(B)和(C)；以及
图4示出在整个载体材料上添加试样不同阶段的横截面图(A)、(B)和(C)；
图5示出在载体材料上提供能够用于扩增反应的反应混合物实施方式不同阶段的横截面图(A)、(B)、(C)、(D)和(E)；
图6示出在载体材料上提供能够用于扩增反应的反应混合物的另一优选实施方式的不同阶段的横截面图(A)、(B)、(C)、(D)和(E)。
具体实施方式
图1示出依据本发明的装置的一种实施方式的横截面图(A)，该装置以例如像玻璃、Al2O3或者硅这种大孔载体材料为基础，其中，(1)为孔壁，(2)为孔，而(3)形成能够用于扩增反应的反应混合物的预先规定部分的已干燥化合物；(B)示出依据本发明的装置的一种实施方式的横截面图，该装置以局部已氧化的大孔硅为基础，其中，(3)为形成能够用于扩增反应的反应混合物的预先规定部分的已干燥化合物，(4)为孔壁的硅芯，(5)为SiO2而(6)为由SiO2制成的孔壁；图(A)中所示实施方式的横截面图具有一个设置在下表面侧的盖(7)，它以例如弹性体为基础，也起到密封件的作用，而图(D)则为图(B)所示实施方式的横截面图，具有设置在下表面侧的盖(7)。
图2示出依据本发明的装置的一种实施方式的示意俯视图，该装置以局部氧化的大孔硅为基础，其中，(2)为孔，(4)为具有硅芯的孔壁，(6)为由SiO2制成的孔壁，(8)为载体材料的一个第一区域，其中提供能够用于扩增反应的反应混合物的预先规定部分，而(9)则为载体材料的一个第二区域，其中提供一种反应混合物的预先规定部分，该部分与第一区域内设置的能够用于扩增反应的反应混合物部分在至少一种化合物上有区别。
图3示出进行扩增反应的一种实施方式的横截面图(A)，其中，(10)为低热容的支架(例如由塑料制成)，(11)为透明窗(例如由玻璃制成)，(12)为1至200μm的化学惰性密封件(例如由聚二甲基硅氧烷制成的氧化硅弹性体)，(13)为依据本发明的装置，(14)为1至200μm的化学惰性密封件(例如由聚二甲基硅氧烷制成的氧化硅弹性体)，(15)为具有高导热性的、反射性的、不散射的化学惰性基底(例如硅)，其中，支架将窗口和基底压合起来，以达到密封目的；图(B)示出图(A)中所示实施方式的横截面图，具有加热块和/或者冷却块(16)，而图(C)示出图(A)中所示实施方式的横截面图，具有处于依据本发明装置上方的反应室(17)。
图4示出在整个载体材料上添加试样的不同阶段的横截面图，其中，(A)示出依据本发明的装置的一种实施方式的横截面图，其中，(1)为孔壁，(2)为孔而(3)为形成能够用于扩增反应的反应混合物的预先规定部分的已干燥化合物；图(B)示出依据本发明的装置的一种实施方式的横截面图、以及盖(7)连同涂覆在表面上的试样材料(18)，而图(C)示出依据本发明的装置在添加试样后一种实施方式的横截面图，其中，(19)为一种孔，该孔注入一种用于扩增的反应混合物、并处于在载体材料表面上被确定的反应区域内；而(20)则为一种孔，该孔仅含有用于完成扩增反应所要求的反应混合物部分，从而在这种孔内不进行扩增，并处于所述在载体材料表面上确定的反应区域之间。
图5示出一种实施方式的横截面图，该实施方式在载体材料上提供能够用于扩增反应的反应混合物，其中，图(A)示出依据本发明的装置的一种实施方式的横截面图，其中，(1)为孔壁，(2)为孔；图(B)示出依据本发明的装置的一种实施方式的横截面图，这是在载体材料的至少一个区域内提供能够用于扩增反应的反应混合物的预先规定部分之后，这样使该部分反应混合物非共价地与载体材料的孔壁相结合，从而由此同时在载体材料表面上限定一个反应区域，其中，(3)为已干燥的化合物；图(C)示出依据本发明的装置的一种实施方式的横截面图以及盖(7)连同涂覆在表面上的试样材料(18)，而图(D)示出依据本发明的装置在添加试样后一种实施方式的横截面图，其中，(19)为一种孔，该孔注入一种能够用于扩增的反应混合物，并处于在载体材料表面上所确定的反应区域内，而(20)则是一种孔，该孔仅含有用于完成扩增反应所要求的反应混合物部分，从而在这种孔内不发生扩增，并且该孔处于在载体材料表面上所确定的反应区域之间；图(E)示出进行扩增反应的一种实施方式的横截面图，其中，(11)为透明窗口(例如由玻璃制成)，(12)为1至200μm的化学惰性密封件(例如由聚二甲基硅氧烷制成的氧化硅弹性体)，(14)为1至200μm的化学惰性密封件(例如由聚二甲基硅氧烷制成的氧化硅弹性体)，而(15)为具有高导热性的、反射性的、不散射的化学惰性基底(例如硅)。
图6示出另一种优选实施方式的横截面图，该实施方式在载体材料上提供能够用于扩增反应的反应混合物，其中，图(A)示出依据本发明装置的一种优选实施方式的横截面图，其中，(1)为孔壁，(2)为孔，(14)为1至200μm的化学惰性密封件(例如由聚二甲基硅氧烷制成的氧化硅弹性体)，而(15)为具有高导热性的、反射性的、不散射的化学惰性基底(例如硅)；图(B)示出依据本发明的装置的一种实施方式的横截面图，这是在载体材料的至少一个区域内提供能够用于扩增反应的反应混合物的预先规定部分之后，这样使该部分反应混合物非共价地与载体材料的孔壁相结合，从而由此同时在载体材料表面上确定反应区域，(3)为已干燥的化合物；图(C)示出依据本发明的装置的一种实施方式的横截面图和盖(7)连同涂覆在表面上的试样材料(18)，而图(D)示出依据本发明的装置在添加试样后一种实施方式的横截面图，其中(19)为孔，该孔注入能够用于扩增的反应混合物并处于在载体材料表面上确定的反应区域内，而(20)则为仅含有用于完成扩增反应所要求的反应混合物部分的孔，从而在这种孔内不发生扩增，并且该孔处于在载体材料表面上确定的反应区域之间；图(E)示出进行扩增反应的一种实施方式的横截面图，其中，(11)为透明窗口(例如由玻璃制成)，(12)为1至200μm的化学惰性的密封件(例如由聚二甲基硅氧烷制成的氧化硅弹性体)。
附图标记列表
(1)孔壁
(2)孔
(3)已干燥的化合物，它形成能够用于扩增反应的反应混合物的预先规定部分
(4)孔壁的硅芯
(5)SiO2
(6)SiO2制成的孔壁
(7)例如为弹性体的基础上的盖
(8)载体材料的第一区域，其中提供能够用于扩增反应的反应混合物的预先规定部分
(9)载体材料的第二区域，其中提供反应混合物的预先规定部分，该部分在至少一种化合物上或者通过至少一种化合物的浓度与第一区域内提供的能够用于扩增反应的反应混合物的预先规定部分有区别
(10)支架
(11)窗口
(12)密封件
(13)依据本发明的装置
(14)密封件
(15)基底
(16)加热块和/或者冷却块
(17)反应室
(18)试样材料
(19)处于在载体材料表面上确定的反应区域内的孔，注入能够用于扩增反应的反应混合物
(20)处于在载体材料表面上确定的反应区域之间的孔，其中，该孔仅含有用于使扩增反应完备所要求的部分反应混合物

Claims (11)

1.用于在平面地构成的大孔载体材料的孔内扩增核酸的方法，该载体材料对置地具有第一和第二表面，其中，在整个表面区域上分布地设置大量离散的孔，其直径处于500nm至100μm的范围内，孔深度与孔径的纵横比至少为10∶1而孔密度为104至108/cm2，该方法包括下列步骤：
(a)在载体材料的包括至少两个孔的至少一个区域内提供能够用于扩增反应的反应混合物的预先规定部分，这样使该部分反应混合物非共价地与载体材料的孔壁相结合，从而由此在载体材料表面上同时确定一个反应区域，
(b)在整个载体材料上添加一种试样，该试样含有用于完成扩增反应所需的反应混合物部分，
(c)进行扩增反应，以及
(d)检测至少一种扩增产物。
2.按权利要求1所述的方法，还包括提供另一部分能够用于扩增反应的反应混合物，其成分与步骤(a)中的反应混合物部分的成分的区别是：在载体材料的包括至少两个孔并不同于步骤(a)中区域的至少第二区域内的至少一种化合物、或者至少一种化合物的浓度。
3.按权利要求1或2所述的方法，其中，将能够用于扩增反应的反应混合物的预先规定部分通过干燥含有该部分的水溶液而与载体材料的孔壁相结合。
4.按权利要求1至3之一所述的方法，其中，大孔载体材料为大孔硅或者局部氧化的大孔硅。
5.包括平面地构成的大孔载体材料的装置，该载体材料对置地具有第一和第二表面，其中，在整个表面上分布地设置大量的离散孔，其直径处于500nm至100μm的范围内，孔深度与孔径的纵横比至少为10∶1而孔密度为104至108/cm2，其中，该装置具有至少一个区域，在该区域内用于进行核酸扩增的反应混合物的预先规定部分在至少两个孔内非共价地结合。
6.按权利要求5所述的装置，其中，该装置具有至少另一个区域，在该区域内用于进行核酸扩增的反应混合物的预先规定部分在至少两个孔内非共价地结合，其成分与第一区域内的反应混合物部分的成分的区别在于至少一种化合物。
7.按权利要求5或6所述的装置，其中，载体材料的一个表面利用盖进行封闭。
8.按权利要求5至7之一所述的装置，其中，所述大孔载体材料为大孔硅或者局部氧化的大孔硅。
9.按权利要求5至8之一所述的装置，其中，孔具有2至20μm范围内的直径。
10.按权利要求5至9之一所述的装置，其中，载体材料具有100至5000μm之间的厚度。
11.平面地构成的大孔载体材料用于扩增核酸的应用，该材料对置地具有第一和第二表面，其中，在整个表面区域上分布地设置大量的离散孔，其直径处于500nm至100μm的范围内，孔深度与孔径的纵横比至少为10∶1，而孔密度为104至108/cm2。
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