CN104302402A - 用于评估生物样品的系统和方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于确定样品中靶核苷酸分子的数目的系统，其包括样品架、激发光学系统、光学传感器和发射光学系统。所述样品架被配置成容纳包括至少20,000个单独的反应位点的制品。所述激发光学系统包括被配置成同时照射所述至少20,000个单独的反应位点的光源。所述光学传感器包括预定的像素数目，所述预定的像素数目为所述单个反应位点数目的至少20倍。所述发射光学系统包括距所述样品架的系统工作距离，其中所述工作距离小于或等于60毫米。

Description

用于评估生物样品的系统和方法

背景技术

技术领域

本发明整体涉及用于评估生物样品的装置、系统和方法，更具体地涉及用于同时评估多个生物样品的装置、系统和方法。

相关领域的说明

用于生物反应和生物化学反应的光学系统已被用来监控、测量和/或分析此类反应。此类系统通常用于测序、基因分型、聚合酶链式反应(PCR)以及其他生物化学反应，以监控进程并提供定量数据。例如，在实时PCR(qPCR)方法中可使用光激发光束照射荧光DNA结合染料或荧光探针，以产生指示靶基因或其他核苷酸序列的量的荧光信号。对在每个测试或实验中提供更大数目的反应的需求日益增长，催生了能够同时执行更巨大数目的反应的仪器。

单个测试或实验中样品位点数量的增加催生了微量滴定板和其他提供更小样品体积的样品格式。此外，诸如数字PCR(dPCR)的技术增加了对更小样品体积的需求，在大多数大量测试样品中所述更小样品体积包含零个或一个靶核苷酸序列。需要这样的系统和样品格式：其将在甚至高密度的样品格式中提供可靠的数据，其中样品位点具有大约纳升级或皮升级体积。

附图说明

当结合附图阅读以下具体实施方式时可更好地理解本发明的实施例。仅出于说明性目的此类实施例示出了本发明的新颖性方面和非显而易见性方面。附图包括以下各图：

图1是根据本发明的一个实施例的基材的俯视图。

图2是图1中示出的基材的侧视图。

图3是图1中示出的基材的一部分的截面图。

图4是本发明的一个实施例的模型的示意图。

图5是使用图4所示模型的示意图结果。

图6是根据本发明的一个实施例的反应位点分布模式的示意图。

图7是示出圆形反应位点和六边形反应位点之间的比较的几何布局示意图。

图8是根据本发明的一个实施例的基材的截面图。

图9是根据本发明的一个实施例的基材的一部分的透视图。

图10是根据本发明的一个实施例的基材的顶视图。

图11是根据本发明的一个实施例的方法的流程图。

图12是根据本发明的一个实施例的载体和相关基材的截面图。

图13是图12所示的载体和基材的顶视图。

图14是根据本发明的一个实施例的载体的透视图。

图15是根据本发明的一个实施例的载体的透视图。

图16是根据本发明的一个实施例的方法的流程图。

图17是根据本发明的一个实施例的制品的正视图。

图18至19是图17所示制品的放大的正视图。

图20是图17所示制品的正视图，示出该制品的多个尺寸。

图21是根据本发明的一个实施例的制品的正视图。

图22是图21所示制品的正视图，示出该制品的多个尺寸。

图23是根据本发明的一个实施例的系统的示意图。

图24是根据本发明的另一个实施例的系统的示意图。

具体实施方式

本发明的实施例整体涉及用于监测或测量位于多个反应区或反应位点的大量小样品或溶液的生物反应的装置、仪器、系统和方法。实施例包括聚合酶链式反应(PCR)方法、测定和方案的使用。虽然一般适用于处理大量样品的dPCR(数字PCR)或qPCR(实时或定量PCR)，但是应当理解，任何合适的PCR方法都可根据本文所述的各种实施例使用。合适的PCR方法包括但不限于等位基因特异性PCR、不对称PCR、连接介导的PCR、多重PCR、巢式PCR、定量或实时PCR(qPCR)、竞争性等位基因特异性TaqMan PCR(cast PCR)、基因组步移、桥式PCR、数字PCR(dPCR)等。

虽然根据本发明的实施例的装置、仪器、系统和方法一般涉及dPCR和qPCR，但本发明可适用于处理、观察和/或测量大量样品或溶液测试体积的任何PCR过程、实验、测定或方案，本发明的实施例尤其适用于dPCR。在根据本发明的实施例的dPCR测定或实验中，将包含相对少量的至少一种靶多核苷酸或核苷酸序列的稀释溶液细分成许多非常小的测试样品或体积，使得这些样品或体积中的至少一些大多数包含靶核苷酸序列的一个分子或不包含靶核苷酸序列。当样品随后在PCR方案、程序、测定、过程或实验中进行热循环时，包含靶核苷酸序列的一个或多个分子的各单个样品被大量扩增，并产生可检测的阳性检测信号，而不包含该靶标的那些样品不被扩增并且不产生检测信号，或者产生低于预定阈值或噪声水平的信号。通过采用泊松统计，可将初始溶液中靶核苷酸序列的数量与产生阳性检测信号的样品数量相关。在一些实施例中，所检测到的信号可用于确定单个样品或体积中所含靶分子的数量或数量范围。例如，检测系统可被配置成对包含一个靶分子的样品和包含两个或至少两个靶分子的样品进行区分。除此之外或作为另一种选择，检测系统可被配置成对包含等于或低于预定量的靶分子数量的样品和包含高于该预定量的样品进行区分。在某些实施例中，qPCR和dPCR过程、测定或方案均使用单个相同的装置、仪器或系统和方法来执行。

在各种实施例中，本文所述的装置、仪器、系统和方法可用于检测含有目的生物组分的初始样品或溶液中所包含的一种或多种类型的目的生物组分或靶标。这些目的生物组分或靶标可为任意合适的生物靶，包括但不限于DNA序列(包括无细胞DNA)、RNA序列、基因、寡核苷酸、分子、蛋白质、生物标记、细胞(例如循环肿瘤细胞)，或任何其他合适的靶生物分子。在多个实施例中，此类生物组分可与各种一种或多种PCR方法和系统组合用于诸如胎儿诊断、多重dPCR、病毒检测、及定量标准、基因分型、测序测定、实验或方案、测序验证、突变检测、遗传修饰的生物体的检测、稀有等位基因检测和/或拷贝数变异的应用。

根据本发明的实施例，一个或多个包含至少一个目的生物靶标的样品或溶液可包含在多个小样品体积或反应体积位点中或分布在或分配在其之间。用于本文所公开的本发明样品体积或反应位点的实施例的样品或溶液通常描述为包含在位于基材材料中的通孔中；然而，在适用情况下，可使用根据本发明实施例的样品体积或反应位点的其他形式，包括位于在基材中形成的孔或凹陷内的反应体积、分布在基材表面或其他类型的反应室或格式的溶液斑，诸如位于微流体系统的测试位点或体积内的样品或溶液，或者位于小珠或球体内或位于其上的样品或溶液。

在某些实施例中，执行dPCR方案、测定、程序、过程或实验的命令包括根据本发明的实施例分布或分配，初始样品或溶液可以以简单且高性价比的方式分配成至少一万个反应位点、至少十万个反应位点、至少一百万个反应位点，或至少一千万个反应位点，数万、数十万或甚至数百万个反应位点。具有反应位点的每一个可具有数纳升、约一纳升或小于或等于一纳升(例如，小于或等于100皮升、小于或等于10皮升和/或小于或等于一皮升，数十或数百皮升或更小)的体积。当因为初始样品或溶液中所包含的靶核苷酸序列的数量可为非常少(例如，少于1000个靶分子、少于100个靶分子、少于10个靶分子或仅有一个或两个靶分子)时，在一些情况下在这种情况下可能也重要的是，初始溶液的全部含量或几乎全部含量占并包含于进行处理的样品体积或反应位点之一者中或者被进行处理的样品体积或反应位点之一者容纳。例如，在仅少量靶核苷酸存在于初始溶液中的情况下，这些靶核苷酸的许多一些或全部可能潜在地包含在不被成功装载到反应位点之一不位于任何反应位点的小的残余流体体积中，从而不会被检测、测量或计数。因此，初始溶液的有效转移可有助于降低在稀有等位基因或靶核苷酸计数中误算的机会或可能性，或者降低如果没有成功地使任何一个稀有等位基因或靶核苷酸装载到指定的反应位点之一者中的话根本检测不到靶分子的存在的机会或可能性。因此，本发明的实施例可用于有效地提供高的装载效率，其中装载效率被定义为容纳在反应位点内的初始样品或溶液的体积或质量除以初始样品或溶液的总体积或质量，并且以使得全部或基本上全部样品或溶液包含在预定的反应位点之一者中的方式将初始样品溶液装载到大量的反应位点或通孔中。

参见图1至图3，在本发明的某些实施例中，制品、装置、基材、玻片或板100包括基材102，所述基材102包括位于基材102中的多个分区、通孔、反应区或反应位点104。在某些实施例中，制品100可包括芯片。除此之外或作为另一种选择，制品100可包括微流体装置，其例如还可包括多个用于向反应位点104转移试剂和/或测试溶液的通道或路径。在其他实施例中，反应位点104包括多个小滴或小珠，并且制品100可包括一个或多个包含一些或全部小滴或小珠104的室和/或通道。在此类实施例中，小滴或小珠104可形成乳液，其中一些或全部小滴或小珠104包含至少一种多核苷酸或核苷酸序列的一个或多个靶标。在反应位点104为小珠的情况下，所述小珠可任选包含连接的光学标记或标签。可例如使用根据本发明的实施例的成像系统，一次一个或者以包含一个或多个小滴或小珠104的组来检查、监测或测量小滴或小珠104。

在图示实施例中，制品100包括第一表面110和相对的第二表面112。在图示实施例中，每个反应位点104从第一表面110中的开口114延伸至第二表面112中的开口116。虽然图3所示的示例性实施例示出了包括通孔104的基材，但是基材102可除此之外或作为另一种选择包括其他类型的反应位点。例如，反应位点104可包括位于在基材102中形成的孔或凹陷内的反应体积，分布在表面110或112上或者其他类型的反应室或格式上的溶液斑，例如位于微流体系统的测试位点或体积内或者位于小珠或球内或位于小珠或球上的样品或溶液。

反应位点104可被配置成通过毛细作用提供足够的表面张力，以吸取分别的量的包含目的生物组分的液体或样品。制品100可具有如在以下美国专利号的任一者中所公开的一般形式或构造：6,306,578、7,332,271、7,604,983、7,6825,65、6,387,331、或6,893,877，所述专利全文以引用方式并入本文，如同在本文中完整阐述一样。

基材102可为平板，或包括任何适用于特定应用、测定或实验的形式。基材102可包含制造领域中已知的各种材料中的任一者，包括但不限于金属、玻璃、陶瓷、硅等。除此之外或作为另一种选择，基材102可包含聚合物材料，诸如丙烯酸材料、苯乙烯材料、聚乙烯材料、聚碳酸酯材料和聚丙烯材料。基材102和反应位点104可通过机械加工、注射模制、热模压、激光钻孔、光刻等中的一种或多种技术来形成。

在某些实施例中，表面110、112可包含疏水材料，例如如美国专利申请公布号2006/0057209或2006/0105453中所描述的，所述专利以引用方式全文并入本文，就如在本文中完整阐述了一样。在此类实施例中，反应位点104可包含吸引水或其他液体溶液的亲水材料。此类亲水区域阵列可包括在疏水表面上的亲水岛，并且可使用各种微制造技术中的任一者来在基材102上或在该基材内形成，所述微制造技术包括但不限于沉积法、等离子法、掩蔽法、转移印刷、丝网印刷、定点(spotting)等。

已发现，可配置高反应位点密度以减少在装载过程期间留在表面110、112上的溶液的量，从而导致初始溶液的更高装载效率或转移。例如，通过降低相邻孔之间的间隔值与孔直径值的比率，可显著降低留在板表面上的溶液的量，使得所有或几乎所有包含目的生物组分的初始溶液或样品位于反应位点104内部。通过该方式，降低了错失稀有等位基因或其他靶分子的可能性，因为一个或多个靶分子会保持在基材表面上而不被指定的反应位点104之一容纳的可能性较低。

参见图4，用包含多个亲水反应位点的疏水表面的计算机模型示出了装载效率的增加。该模型用于分析样品在多个反应位点中的分布与直径为75微米的通孔的反应位点间距(或密度)之间的函数关系。图5示出随着反应位点之间的间隔减小(密度增加)，更大百分比的初始液体样品被反应位点捕获，并且在装载过程后更少量的残余液体被留在疏水表面上。因此，更高密度的指定横截面尺寸的反应位点104既使给定大小的基材102的测试样品数目增加，又使留在表面110、112上的残余流体减少或消除(所述残余液体可包含稀有等位基因或其他目的靶分子)。

在某些实施例中，例如由于当用光学系统对反应位点104进行成像时的光学极限，相邻反应位点之间的间隔可能存在下限。例如，因为光学系统对相邻反应位点进行清楚成像的能力的局限，相邻反应位点之间的间隔可能存在下限。为了提高反应位点104在基材102中的密度，可使用例如紧密堆积的六边形矩阵图案，如图6和图7所示。

已发现，具有非圆形横截面的反应位点可有利地减小相邻反应位点104之间的平均距离或间隔，从而导致在装载测试溶液或样品之后留在表面110、112上的残余液体或溶液的量减少。参见图6和图7，具有顶点到顶点直径D的六边形反应位点104的阵列被布置成六边形图案，其中相邻反应位点之间的间隔或间距为P。在某些实施例中，在用于测量来自反应位点104的荧光信号的光学系统中相邻反应位点之间的串扰是相邻反应位点之间的最小边距S的函数。因此，图7所示的几何形状体现了可使用的反应位点间最小间距P，该最小间距仍保持相邻反应位点之间的串扰在预定值或预定值以下。图7中还示出了在每个六边形内的虚线圈。这表示具有与六边形反应位点相同的间距P值和相同的边缘间隔S的直径为D'的圆形反应位点。图7中的灰色部分示出针对圆形反应位点和六边形反应位点二者的跨越一定宽度W的相邻反应位点之间的面积。如图7中清楚所见，当间距P和边缘间隔S相同时，圆形反应位点的跨越宽度W的相邻反应位点之间的面积大于六边形反应位点之间的面积。针对图4和图5所讨论的建模结果显示，相邻反应位点之间的面积越小导致越高的装载效率。因此，基于图7所示的结果，在相同的间隔条件(P和S)下，为六边形反应位点提供的装载效率比为圆形反应位点提供的装载效率更高。

该结果还为被构造来检查反应位点的光学系统提供意料不到的优点。因为图7中圆形反应位点和六边形反应位点的最小边缘间隔S相同，所以对于任一种类型的反应位点来说相邻反应位点之间的串扰将相同或相似。然而，对于相同的间距P和边缘间隔S，六边形反应位点的横截面积大于圆形反应位点的横截面积。因此，由光学系统产生的六边形反应位点的图像将比圆形反应位点的图像具有更大的面积。因此，由六边形反应位点产生的更大的图像可潜在地跨越更多数量的像素。每个反应位点的更大数量的像素有助于对反应位点所产生的信号进行更精确的计算。因此，除了提供更高的装载效率之外，如图6和图7所示，使用六边形反应位点还可得到对每个反应位点104所产生的光学信号或输出的更精确的测量或计算(例如，对与靶分子或染料分子的量成比例产生的荧光信号的测量或计算)。

在图1所示的实施例中，制品100具有正方形形状，并且总尺寸为15毫米乘15毫米。制品100还具有尺寸为13毫米乘13毫米的活性面积、区域或区120。如本文所用，术语“活性面积”、“活性区域”或“活性区”是指制品(如制品100)的表面面积、区域或区，在其上包含着或分布着反应位点或溶液体积。在某些实施例中，制品100的活性面积可增大至14毫米乘14毫米或更大，例如在15毫米乘15毫米的基材尺寸上，以增加基材102上包含的反应位点的总数。制品100可具有其他形状和尺寸。例如，表面110、112可为矩形、三角形、圆形或一些其他几何形状。制品100和活性面积120的总尺寸可比图1所示实施例更小或更大，这取决于针对给定系统、测定或实验的特定设计参数。

在图1所示的实施例中，反应位点104可具有75微米的特征直径，并且以相邻反应位点之间125微米的间距分布在活性面积120上。在其他实施例中，反应位点104具有小于或等于75微米的特征直径，例如小于或等于60微米，或者小于或等于50微米的特征直径。在其他实施例中，反应位点104具有小于或等于20微米、小于或等于10微米、小于或等于1微米，或者小于或等于100纳米的特征直径。反应位点之间的间距可小于125微米，例如，小于或等于100微米、小于或等于30微米、小于或等于10微米，或者小于或等于1微米。

在某些实施例中，基材102在表面110和表面112之间的厚度为或约为300微米，使得每个反应位点104的体积为约1.3纳升。作为另一种选择，可例如通过减小反应位点104的直径和/或基材102的厚度从而使每个反应位点104的体积小于1.3纳升。例如，每个反应位点104的体积可为小于或等于1纳升、小于或等于100皮升、小于或等于30皮升，或者小于或等于10皮升。在其他实施例中，一些或全部反应位点104的体积在1纳升至20纳升的范围内。

在某些实施例中，表面110、112上的反应位点104的密度为至少100个反应位点每平方毫米。还可预期更高的密度。例如，表面110、112上的反应位点104的密度可大于或等于150个反应位点每平方毫米、大于或等于200个反应位点每平方毫米、大于或等于500个反应位点每平方毫米、大于或等于1,000个反应位点每平方毫米、或者大于或等于10,000个反应位点每平方毫米，或者大于或等于1,000,000个反应位点每平方毫米。

有利的是，可通过光学系统对活性面积120中的所有反应位点104进行同时成像和分析。在某些实施例中，通过光学系统成像并分析的活性面积120包括至少12,000个反应位点104。在某些实施例中，通过光学系统成像并分析的活性面积120包括至少15,000个、至少20,000个、至少30,000个、至少100,000个、至少1,000,000个反应位点，或者至少10,000,000个反应位点。

在某些实施例中，反应位点104包括以第一特征直径、厚度和/或体积表征的第一多个反应位点，以及以与相应的第一特征直径、厚度或体积不同的第二特征直径、厚度和/或体积表征的第二多个反应位点。反应位点大小或尺寸的这种变化可用于例如同时分析可能具有不同浓度的两种或更多种不同核苷酸序列。除此之外或作为另一种选择，单个基材102上反应位点104大小的变化可用于提高dPCR过程、测定或实验的动态范围。例如，制品100可包含反应位点104的两个或多个子阵列，其中每个组以与其他组或其余组的反应位点104的直径或厚度不同的直径或厚度表征。每组的大小可设定为提供不同的靶多核苷酸计数动态范围。子阵列可位于基材102的不同部分上，或者可以是散布的，使得两个或更多个子阵列在制品100的整个活性面积上或在制品100的活性面积的通用部分上延伸。

在某些实施例中，反应位点104中的至少一些在其壁的全部或一部分上是锥形的。例如，参见图8，反应位点104中的至少一些可在表面110上包括斜面130。除此之外或作为另一种选择，反应位点104中的至少一些可在表面112上包括斜面130(未示出)。已发现，倒角的和/或锥形的反应位点的使用可减小相邻反应位点104之间的平均距离或总面积，而又不会超出溶液位点或测试样品之间的最小间隔的光学极限。如上文针对图5所讨论，相邻反应位点104之间的面积的减小可导致在装载过程期间留在表面110、112上的液体溶液的量减少。因此，可得到更高的样品装载效率，同时在光学系统的相邻溶液位点或测试样品之间仍保持较大的有效间隔。

在图9所示的实施例中，制品、装置、阵列、玻片或板100a包括不包含任何反应位点104a的非活性面积、区域或区132a。非活性面积可为围绕包含反应位点104a的活性区的周围区。作为另一种选择，非活性面积可包括在一个、两个或更多个侧或区上毗接活性区的面积。在图9所示的图示实施例中，制品100a的厚度等于或约等于0.3毫米，并且从非活性面积的边缘到活性面积的距离等于或约等于1毫米；然而，可使用其他尺寸。在图9所示的图示实施例中，反应位点104a的直径等于或约等于0.075毫米，并且间距间隔等于或约等于0.100毫米；然而，可使用其他尺寸。在适当的情况下，上文针对制品100所讨论的特征和/或尺寸可并入制品100a中，或者反之亦然。

参见图10，在某些实施例中，制品、装置、阵列、玻片或板100b包括具有多个反应位点的活性面积、区域或区120b，以及非活性面积132b，其中非活性面积132b包括位于相邻活性面积120b之间的分隔区、间隔区或隔离区134b。如图10所示，非活性区132b还可包括围绕活性区120b的周围区。图10所示的制品100b的各种特征的尺寸是具体实施例的例子，并且尺寸可根据特定设计的要求而有所不同。例如，分隔区134b可具有在活性面积120b之间的厚度，其小于或等于500微米、小于或等于1毫米，或者小于或等于2毫米或3毫米。

分隔区134b可被构造为有助于使一个活性面积、区域或区中的反应位点与另一独立的活性面积、区域或区中的反应位点隔开。此类构造可用于例如有利于在第一活性面积中装载第一样品，以及在第二活性面积中装载不同的第二样品，其中这两个面积被分隔区134b分开。在某些实施例中，活性面积120b和分隔区134b的表面在制品100b的一面或两面上彼此齐平。除此之外或作为另一种选择，在制品100b的一面或两面上，分隔区134b的至少一部分可从活性面积120b升高或偏移。在其他实施例中，分隔区134b的至少一部分相对于制品100b的一面或两面的活性面积120b形成槽。在适当的情况下，上文针对制品100、100a所讨论的特征和/或尺寸可并入制品100b中，或者反之亦然。

在某些实施例中，基材102包含可光结构化的材料(photostructurablematerial)，如某些玻璃材料或陶瓷材料。在此类实施例中，可使用图11所示的方法140来制造基材102。有利的是，可使用图11所示的方法140的最后任选单元以提供不透明或几乎不透明的基材102，使得从一个反应位点104发射的光不进入相邻的反应位点104。

方法140可用于提供具有足以防止在一个反应位点104中发射的任何或几乎任何光射入相邻反应位点104中的不透明度的基材102。方法140还可包括以足以减小表面110、112之间的厚度的量从基材102移除材料，例如，以足以使表面110、112之间的厚度相对于初始厚度减小至少20％、或者相对于初始厚度减小至少30％或至少40％的量从基材104移除材料。方法140还可包括在制造期间将基材102加热到至少500摄氏度的温度。在某些实施例中，方法140中使用的图案化掩膜包括具有铬图案的石英板。掩模可在将基材的至少一部分暴露于腐蚀剂之前被移除。方法140中使用的腐蚀性材料可为氢氟酸。

参见图12和图13，在某些实施例中，制品100装在载体150内，所述载体150包括具有底部表面154的第一盖152和具有顶部表面158的第二盖156。载体150还可包括一个或多个侧壁159，其被构造为在盖152、盖154之间保持预定的间隔。盖152、154以及壁159一起形成尺寸被设定成容纳制品100的腔体160。在使用期间，将制品100设置在形成于表面154和表面158之间的腔体160内。腔体160的厚度可大于制品100的厚度，使得制品100与底部表面154之间和/或制品100与顶部表面158之间存在间隙。如图12的图示实施例所示，一个或多个侧壁159之间也可存在间隙。除此之外或作为另一种选择，制品100的一部分可附接到一个或多个盖152、盖156以及一个或多个侧壁159。

载体150可由金属材料(诸如不锈钢、铝、铜、银或金)或半金属(诸如石墨)制成或形成。除此之外或作为另一种选择，载体150的全部或一部分可由非金属材料制成，所述非金属材料包括但不限于玻璃、丙烯酸树脂、苯乙烯、聚乙烯、聚碳酸酯和聚丙烯。在某些实施例中，盖152、盖156中的至少一个包括适当透明的材料，以用于提供被构造为允许光出入反应位点104的窗口。除此之外或作为另一种选择，整个载体150可由一种或多种透明的或几乎透明的材料制成。

参见图14，在某些实施例中，载体150a包括孔、端口或开口162，其通常可被设置成与盖或光学出入窗口152a垂直，并且尺寸被设定为允许制品100进入到载体150a中。载体150a还可包括沿开口162的至少一条长边缘设置的刮片或叶片164。叶片164可被构造为当将制品100装载到载体150a中时与制品100的表面110和表面112中的至少一个接触或接合。载体150a还可包括设置在整个开口162或其一部分上的膜或隔膜(未示出)，其帮助密封腔体160a，并且在制品100被装载到载体150a中时被刺破。在某些实施例中，隔膜和叶片164形成单一构件。

在某些实施例中，叶片164被构造为在制品100通过开口162插入到载体150中时有助于样品流体分布到一些或所有反应位点104中。例如，叶片164可被构造为在装载制品100的过程中与表面110和表面112中的一个或两个接触，使得随着表面110和表面112移动经过叶片164，液体不移过叶片164，而是通过毛细管力被推动和/或牵拉进入反应位点104。除此之外或作为另一种选择，叶片164可被构造为用液体、凝胶等盖住制品100的表面110和表面112中的一个或两个，从而例如降低或消除包含在反应位点104内的样品流体的污染和/或蒸发。

在适当的情况下，载体150a可并入上文针对载体150所讨论的结构或特征，或者反之亦然。

参见图15，在某些实施例中，载体150b包括主体170，其可包括载体150和/或载体150a的一些或所有结构和特征。载体150b还包括用于保持制品100的装载器或插入工具172，以用于帮助将制品100装载到主体170中，和/或用于将测试溶液装载到反应位点104中。工具172可具有U形主体，其中制品100在装载到主体170之前被保持在该“U”内部。工具172可包括在相对臂175上的突出部174，其被构造为结合或者压入主体170的相应突出部或类似结构176。

腔体160在制品100与表面154、158之间的部分可用不与反应位点104中包含的测试溶液混合的不混溶流体170(例如液体材料或凝胶材料)填充，并且被构造为防止或减少反应位点104中包含的测试溶液的蒸发。用于一些应用的一种合适的流体170是由3M公司(3M Company)市售的Fluorinert。然而，在某些实施例中，Fluorinert可能由于其倾向于容易吸收空气而对于某些PCR应用有问题，空气以后可能在PCR循环期间释放，导致形成不想要的空气泡。

作为另一种选择，在某些实施例中，已发现，如果聚二甲基硅氧烷(PDMS)不完全交联的话，则可在腔体160中使用PDMS。在此类实施例中，已发现PDMS具有使其适于与PCR一起使用的若干特征，包括低自体荧光、在PCR温度下的热稳定性以及不会抑制聚合过程。此外，PDMS可包含含水样品，但是对水蒸汽是可透气的。典型的硅氧烷与用于本发明的实施例之外的一般应用中的交联剂的比率按重量计为10:1(10％的交联剂)。

已发现，通过使PDMS材料不完全交联，所得到的材料可充当用于减少蒸发的合适的密封剂，同时还保留上文所讨论的并且与完全交联的材料相关联的有利属性。更具体地讲，不完全交联的PDMS材料可通过使用按重量计小于10％的交联剂来形成。例如，已证实小于或等于1重量％的交联水平满足某些PCR应用(如某些dPCR应用)的设计要求。使用利用小于或等于0.8重量％的交联剂的量来包封的平板100已经示出了多个dPCR响应。此外，由于不完全交联的PDMS材料的粘度与Fluorinert相比更高，所以PDMS密封剂还可适合于包装要求和客户工作流程解决方案。

参见图16，制备多个生物样品的方法200包括提供制品(如制品100、100a或100b)的基材。方法200还包括提供载体(如载体150、150a或150b)，以及提供插入工具(如插入工具172)，所述插入工具包含U形主体，该主体包括被构造为可滑动地接合载体的一对臂。方法200还包括将基材安装或附接到插入工具，并且将插入工具安装或附接到载体。在某些实施例中，将基材安装或附接到插入工具，然后将插入工具和基材一起安装到载体。在某些实施例中，将插入工具安装到没有基材的载体，随后将基材安装到插入工具和/或载体。

一旦基材被安装或附接，方法200包括例如通过将基材插入穿过载体的开口和/或隔膜来使插入工具沿着载体以足以将基材定位在载体内部的量滑动。使用方法200，溶液或样品可以以如下方式被施加于基材的面上：随着基材插入载体中，溶液被沉积或吸入于基材中的反应位点或通孔中。此外，基材的两个表面中的一个可用液体或凝胶覆盖，例如以保护溶液免于污染和/或蒸发。

在某些实施例中，至少99％的液体样品被至少一些反应位点容纳。在其他实施例中，至少99.5％或99.9％的液体样品被至少一些反应位点容纳。在某些实施例中，反应位点104的总体积被选择为大于要装载到反应位点104中的液体样品的体积。已发现这可增加装载效率，如上文所述，这在某些情况中可能是至关重要的。在某些实施例中，液体样品体积与所有反应位点104总体积的比率小于或等于95％。在某些实施例中，液体样品体积与所有反应位点104总体积的比率小于或等于90％、小于或等于80％，或者小于或等于70％。在某些实施例中，该比率的值取决于在装载后填充有液体的每个反应位点的总体积的百分比。例如，如果在装载后每个反应位点104的仅90％包含液体样品，则液体样品体积与所有反应位点104的总体积的比率可小于或等于90％、小于或等于80％、小于或等于70％，或者小于或等于60％。

参见图17-图20，在某些实施例中，制品、装置、阵列、玻片、或板200包括基材202，该基材202包括位于基材102中的多个通孔或反应位点204。基材202包括第一表面和相对的第二表面。在图示实施例中，每个反应位点204从第一表面中的开口延伸至第二表面中的开口。如图18和图19所示，反应位点204可具有六边形形状和/或被布置为紧密堆积的六边形矩阵图案。作为另一种选择，反应位点204中的一些或全部可具有上文针对反应位点104所讨论的形状、直径、密度、厚度、间距间隔等。制品200还包括一个或多个带突出部的区域、切口区域、或空白区域206，其中不存在反应位点204。如下文所讨论的，空白区域206可位于在制品200的支撑区域中。在图示实施例中，空白区域限定4个半圆形形状；然而，设想到其他的形状和尺寸。此外，制品200可包括没有反应位点位于其中的空白周边208。

在某些实施例中，基材202包含硅，其可被构造成在使用期间于整个制品200上提供均匀温度分布。作为另一种选择，基材202包含玻璃材料，如光结构化玻璃陶瓷，或金属，如铝、铜或不锈钢。

参见图18，反应位点204可被布置成限定位于反应位点204的阵列内的一个或多个缺失区域(dropout region)209。在一些实施例中，缺失区域209具有适合用肉眼观察的尺寸(例如，在未使用放大装置的情况下对肉眼是可见的)。在图示实施例中，制品200包括位于制品200的第一象限中的一个缺失区域204；然而，单个制品200上可包含多个缺失区域。一个或多个缺失区域209可限定出有一条轴线比正交轴线长的总体形状，如图19所示。因此，使用图18中所示的偏离制品200的中心定位的单个细长的缺失区域209，可让使用者确定制品200的取向(例如，确定哪一面为正面和背面，以及确定环绕垂直于图17-图19的页面的轴线的正确取向)。缺失区域209还可被构造成提供基准信号，例如，在对反应位点204进行光学检测期间使用的基准光学信号。

在某些实施例中，多个缺失区域209可被构造成基于例如缺失区域209的缺失形状、数目、和/或一个缺失区域209与另一个缺失区域209的相对位置来提供关于制品200的信息。例如，特定制品200上的缺失区域的数目可用于确定反应位点204的直径和/或各缺失区域209之间的距离，或各缺失区域209彼此的几何形状，可用于确定反应位点204的数目或各反应位点204之间的间距。设想到缺失区域的尺寸、形状和分布的许多其他组合。

参见图20，制品200可具有约10mm乘10mm的总体尺寸。图20还示出了与图20中示出的具体实施例相关的其他尺寸值。

参见图21和图22，制品可被构造成与200'图17中的制品200类似，例外的是制品还包括一个或多个其尺寸可被200'设计为提供更有利的加载特性的着陆区域230。因此，制品的一个或多个边缘200'具有比制品200'的其他边缘更宽的不具有反应位点204的区。

在合适的情况下，制品200可包含针对制品100所讨论的各种元件和特征，或者反之亦然。此外，根据本发明的实施例，制品200可用于载体150中或其他载体中。制品200可与系统400或方法140一起使用，使用方式与制品100在本文中已公开的使用方式类似，以及在本文针对制品100所公开的其他系统或方法中使用或与所述其他系统或方法一起使用。

可使用多种方法和装置来提供对反应位点104中包含的一种或多种目的生物组分的检测。例如，可将各种荧光染料或标记掺入到包含一种或多种目的生物组分的溶液中，然后可使用光学系统检测该溶液以确定该一种或多种生物组分的存在或量。在其他实施例中，可检测到离子(阳性或阴性)的存在和/或可使用pH、电压、或电流的变化来确定一种或多种目的生物组分的存在或量。

参见图23，系统300可用于以光学法观察、检查、或测量一种或多种样品或溶液，所述样品或溶液包含位于制品100的反应位点104中的目的生物组分。系统300包括光学头或系统400，其被配置成读取或监控制品100、制品200等的反应位点104中的一些或所有。在某些实施例中，系统100还包括热控制系统500、一体式控制器、计算机、计算系统或处理器530(位于光学头或系统400和/或控制系统500上或内)，和/或外部控制器，计算机，或处理器560(位于光学头或系统400和热控制系统500的外部)中的一者或多者。

计算机530,560的任一者或两者可包括电子记忆存储，其包含指令、程序、算法、测试和/或配置参数、测试或实验数据等。计算机530,560的任一者或两者可被配置成例如操作光学系统400的各种部件或获取和/或处理由系统300所提供的数据。例如，可使用计算机530,560的任一者或两者来获取和/或处理由光学系统400的一个或多个光电探测器所提供的光学数据。在某些实施例中，一体式计算机530可例如使用固线连接、局域网、互联网连接、云计算系统等与外部计算机560通信和/或将数据传输至外部计算机560以用于进一步处理。外部计算机560可为物理计算机，诸如台式计算机、膝上式计算机、笔记本计算机、平板计算机等。除此之外或作为另外一种选择，计算机530,560的任一者或两者可包括虚拟装置或系统诸如云计算或存储系统。数据可通过局域网、云存储或计算系统等内的无线连接在计算机530,560之间传送或共享。除此之外或作为另外一种选择，来自系统300(例如，来自光学系统400和/或热控制器500)的数据可被传送至外部记忆存储装置，例如，外部硬盘、USB存储模块、云存储系统等。系统300可包括计算机530,560两者。作为另外一种选择，系统300可仅包括计算机530或计算机560中的一者。在此类实施例中，可通过固线连接、局域网、互联网连接、云计算系统等来存储、传送或处理来自计算机530或计算机560的数据。

在某些实施例中，系统300在通用壳体或仪器内并不包括热控制系统500。例如，光学系统400可被配置成接收芯片或板如制品100或200，所述制品在单独的热控制系统如PCR热循环仪中处理。然后，光学系统400可用于执行端点PCR或dPCR实验或测定。在某些实施例中，外部热控制器被配置成处理多个芯片或板，例如，以制品100,200等的形式。在此类实施例中，光学系统400被配置成接收多个芯片或板中的一个或多个以执行dPCR实验或测定。计算机系统如计算机530和/或计算机560可用于基于来自多个芯片或板的数据执行dPCR分析。在此类实施例中，计算机系统可被配置成汇集来自芯片或板的数据，例如以增加dPCR实验或测定的有效样品大小，从而创建“虚拟芯片”。例如，可在单独的PCR热循环仪中(一起、分组或单独地)处理多个包括用于容纳样品的至少15,000个或至少20,000个通孔或分隔区的制品100,200，然后使用光学系统400检查，每次检查一个芯片或板或以小组进行检查，以提供汇集的dPCR数据或虚拟芯片，该芯片包括至少100,000个样品、至少1,000,000个样品、或至少10,000,000个样品。

在某些实施例中，光学系统400包括光源410和相关联的激发光学系统412，该光源和激发光学系统被配置成照明包含在制品100或200的反应位点中的至少一些样品。激发光学系统412可包括一个或多个透镜414和/或用于调节导向样品的光的一个或多个滤光器416。光学系统400还可包括光电探测器或光学传感器420和相关联的发射光学系统或成像系统422，其被配置成接收反应位点104，204中的至少一些所发射的辐射，并将这种辐射引导到光学传感器420上，例如通过在或接近于光学传感器420处形成制品100或200或反应位点104或204的图像。由发射光学系统接收的辐射可包括响应于光源410所产生的一个或多个激发光束在反应位点104,204内产生的荧光发射。除此之外或作为另外一种选择，由发射光学系统接收的辐射可为反应位点104,204内产生的其他类型的发光，例如，生物发光、化学发光、磷光等。例如，当系统300被配置成执行qPCR和/或dPCR程序、测定或过程时，反应位点104,204可包含一个或多个荧光染料或标记，其提供根据制品100,200的多个或全部反应位点中包含的靶核苷酸序列或分子的量变化的荧光信号。

发射光学系统422可包括透镜或透镜系统424和/或用于调节导向样品的光的一个或多个滤光器426。在图23示出的图示实施例中，激发光学系统412/发射光学系统422均包括一个或多个常见的光学元件。例如，激发光学系统412/发射光学系统422均可包括分束器430，该分束器可反射激发光并将发射光从样品透射至光学传感器420。在某些实施例中，激发光学系统412/发射光学系统422均包括设置在分束器430和制品100,200之间的物镜(未示出)，可使用该物镜改善光学性能，例如通过使光线更均匀地照射到反应位点104,204和/或从所述反应位点发射而改善光学性能。在某些实施例中，例如在均匀照明或发射(例如由远心光学系统提供)不太重要(例如，一些dCPR应用)的情况下，可省去常用的物镜，如图23的图示实施例中所示。省去物镜可有助于减小光学系统400的大小和复杂性。激发光学系统和发射光学系统的示例性实施例在以下美国专利申请号中进行讨论：6,818,437、7,498,164、7,387,891、7,635,588、或7,410,793，这些出版物以引用的方式全文并入本文。

透镜424可包括单个透镜或简单透镜，例如平凸透镜、平凹透镜、双凸透镜、双凹透镜、弯月形透镜等。除此之外或作为另外一种选择，透镜424可包括复合透镜和/或透镜系统，例如，消色差透镜、多元件透镜、相机透镜、微透镜阵列等。在某些实施例中，透镜424可包括一种或多种反射光学元件或衍射光学元件，诸如衍射透镜、衍射光栅、全息光学元件等。

光学传感器420可包括一个或多个光电二极管、光电倍增管(PMT)等。此类光电探测器可在例如光学系统400被构造成扫描各个反应位点104,204或反应位点104,204的子集的情况下使用。在其他实施例中，光学传感器420可包括一个检测器阵列或片段检测器阵列(segmented detector array)，例如，一个或多个CCD(电荷耦合装置)或CMOS(互补金属氧化物半导体)阵列。片段检测器阵列可有利地在全部的或大部分的反应位点104,204被同时成像或检查的情况下使用。为了提供每个反应位点多个像素，光学传感器420可包括至少4,000,000像素或超过10,000,000像素。在光学传感器420包括分段检测器和/或包括一个或多个共同光学元件的实施例中，光学系统400可被配置成使得多个反应位点(例如，反应位点104,204等)各自在光学传感器420的单个像素或光元件或在一组像素或光元件上成像。对于光学传感器420包括分段检测器的实施例，成像光学系统422可被配置成形成制品100,200等的单个反应区域的图像。除此之外或作为另外一种选择，发射光学系统422可被配置成形成包括制品100,200等的多个反应区域的图像。

可将光学系统400的任何或全部组件或元件安装到一个或多个共同框架(未示出)。在某些实施例中，光学系统400的任何或全部组件或元件可被封闭在外壳或壳体450内，例如，以防止或减少外部光或杂光的引入，保护光学系统400免受外部灰尘和碎片的影响，和/或遮挡电噪音或磁噪音。在图23的图示实施例中，光源410和光学传感器420包含在外壳450内。作为另外一种选择，光源410和/或光学传感器420可安装在外壳450的外部表面上和/或可部分地位于外壳450内。

在某些实施例中，光学系统400被配置成提供制品100,200的大量的反应位点104，204(例如足够大量的反应位点104，204)的同时成像，以提供对一个或多个靶分子、序列、基因、生物学微生物体等进行dPCR分析。例如，系统400可被配置成同时使至少20,000个反应位点104,204成像，其中反应位点104,204的密度可为至少100个反应位点每平方毫米和/或每个反应位点104,204的特征直径可小于或等于100微米。例如，本发明的示例性实施例(本文称为实例A)，使29,760个反应位点104,204(每个反应位点具有小于70微米的特征直径)的二维阵列同时成像并处理以提供对靶核苷酸序列或分子进行dPCR分析。在实例A实施例中，反应位点104,204被布置在160×186的六边形排列图案(与图6或图13中所示类似)中，该图案在制品100,200的小于14毫米乘约14毫米(约13毫米乘约13毫米)的活性面积上。每个反应位点的反应体积可小于一纳升。在其他实施例中，制品100,200的活性面积包括至少15,000个、至少20,000个反应位点104,204，至少30,000个反应位点104,204，至少100,000个反应位点104,204或至少1,000,000个反应位点104,204。

参见图24，可将外部光电探测器、相机、或便携式电子装置600安装到光学系统400上以用于获取制品100,200的图像和/或相关联的来自制品100,200的反应位点104,204的光学信号或数据。可将装置600用来取代光学传感器420(例如图24)或与该光学传感器一起使用(未示出)。装置600可以可拆卸地安装到光学系统400。例如，装置600可暂时附接到光学系统400以在处理前、处理期间或处理后获得制品100,200和/或反应位点104,204的图像。在获得一个或多个此类图像后，可将装置600从光学系统400中分离或移除，以例如观察图像、转移图像、和/或处理图像(例如，以改善图像和/或获取或计算与反应位点104,204中的一者或多者中的生物化学反应相关的信息)。

装置600可包括光电探测器或光学传感器(例如，CCD或CMOS传感器)，其被配置成当将其安装至光学系统400时接收制品100,200和/或反应位点104,204的一个或多个图像。装置600还可包括一个或多个透镜、滤镜、或其他光学元件以用于提供制品100,200和/或反应位点104,204的图像。透镜424可被配置成在装置600的光电探测器上提供图像。在某些实施例中，装置600可包括透镜或透镜系统(例如，包括透镜元件的系统的相机透镜)。在此类实施例中，装置600的透镜或透镜系统可被配置成与光学系统400的透镜424一起工作以提供预定质量或特性的图像。作为另外一种选择，装置600包括一个或多个透镜等以用于形成制品100,200和/或反应位点104,204的图像，而光学系统400不包含透镜如在制品100,200和装置600的光电探测器之间的光学路径中的透镜424。

在某些实施例中，装置600被设计成或被配置成专门与光学系统400一起使用，以获得制品100,200和/或反应位点104,204的图像。作为另外一种选择，装置600可被配置成用于除了获得制品100,200和/或反应位点104,204的图像之外的其他用途。例如，装置600可包括可被配置成用于个人摄影、商业摄影、和/或科学摄影的相机。在某些实施例中，装置600为商业装置或消费装置，其可包括除摄影应用之外的用途。例如，装置600可为消费者或专业相机或录像机、相机手机、智能手机(例如，基于移动操作系统的移动电话，移动操作系统包括但不限于谷歌的安卓操作系统(Google's Android OS)、苹果的iPhone操作系统(Apple's iOS)、诺基亚的塞班(Nokia's Symbian)、黑莓公司的黑莓操作系统(RIM's BlackBerry OS)、三星的Bada(Samsung's Bada)、微软的视窗操作系统(Microsoft's WindowsPhone)、惠普的网络操作系统(Hewlett-Packard's webOS)或嵌入式Linux发行版(Linux distributions)如Maemo和MeeGo，或其他构建在移动计算平台上的移动电话)、苹果触控式iPod(Apple iPod Touch)或类似装置、个人数字助理(PDA)、便携式媒体播放器、个人计算机或具有图片输入的电子表等。

在某些实施例中，光学系统400(例如，图23和图24的图示实施例)被配置成相对较小，但仍提供制品100,200的全部反应位点104,204或制品100,200的几乎全部的(例如，制品100,200的至少90％、至少95％、或至少99％的)反应位点104,204的成像质量。例如，光学系统400的大小可被配置成足够小以便提供比现有系统更易于携带的紧凑型系统以用于进行qPCR和/或dPCR测试、实验或分析。除此之外或作为另外一种选择，光学系统400的大小可被配置成足够小以便将光学元件的成本保持在预定的预算内或目标成本内。例如，选择成像透镜或相机透镜如图23和图24中示出的透镜424的焦距或有效焦距以提供相对短的工作距离。在此类实施例中，相对短的焦距或有效焦距还可使得能够使用相对小的透镜、分束器、激发滤光片、发射滤光片和/或其他系统组件，因此降低了产品的总材料和/或系统成本。

重要的是，已发现，减小光学系统400的大小(例如，图23和图24的图示实施例)和/或减小特征成像系统焦距或有效焦距(例如与用于类似目的的现有技术PCR系统相比)可被使反应位点104,204图像质量保持处于或高于预定的量的设计或系统约束所限制。例如，已发现光学像差如散光、失真和场弯曲会降低图像质量，具体地讲降低在反应位点104,204的二维阵列中的周边反应位点的图像质量，所降低的量可妨碍在用于确定一个或多个靶核苷酸序列或分子的计数的dPCR计算中获得期望的准确性。出乎意料的是，已发现使用某种设计方法学和/或光学品质因子，可得到能产生反应位点104,204的阵列的足够图像质量的系统和仪器，从而允许例如通过使用扩增处理如qPCR和/或dPCR来检测和/或定量样品中的靶核苷酸序列或分子。

在某些实施例中，发射光学系统或成像系统422根据设计方法进行配置，以提供小型化光学系统用来检测和/或定量包含在至少一些反应位点104,204中的靶核苷酸序列或分子。多种以非线性方式相互作用的组件的存在可使发射光学系统422的设计复杂化。当受限于仅有限定数量的的组件可商购获得时，例如在成本约束妨碍或减少了使用定制光学的情况下，发射光学系统422的设计也可能复杂化。可商购自某些消费者市场驱动应用(诸如移动电话、智能手机相机)的小型化光学元件可被用在当前设计方法中以提供很低的组件价格。例如，为这些市场生产的可商购获得的硬件和光学元件的规格和特性是有限的，并且可能与用在鉴定和/或定量靶核苷酸序列或分子的小型化仪器的开发中的期望的或优选的值不匹配。

在某些实施例中，当前设计方法可使用扫描显微镜方法以提供根据本发明的实施例的系统和仪器。作为另外一种选择，设计方法可使用相机设计方法以提供根据本发明的实施例的系统和仪器。所述相机设计方法可由对象、摄像透镜或物镜和像素化的传感器如CCD或CMOS传感器组成。就相机设计方法而言，整个能视域(FOR)可在本文称为“曝光时间”的时间间隔里立刻被感知。

该设计方法可包括结合光学“对象”。在不限制本发明的实施例的范围情况下，对象可包括孔阵列板，该板可由多达96或384个单独的孔以80×120mm的网格格式组成。所述孔可以以9毫米或4.5毫米的间距隔开。作为另外一种选择，还可使用以这些间距隔开的较小数量的孔。在某些实施例，对象可为具有通孔阵列的基材，所述通孔的直径为350微米并且相隔500微米。所述通孔可分入8×8的子网格中，子网格被布置成4×12的图案。除此之外或作为另外一种选择，用于当前设计方法的对象可包括如上文所讨论的制品100,200的构型中的一种或多种。

该设计方法可包括使用可商购获得的摄影物镜透镜，因为此类透镜就是设计为成像出具有低像差的宽能视域。这些透镜可为多元件的(至少3个透镜元件，最多为11个或更多个透镜元件)。限制孔(孔径光阑)可在透镜组件内部并且控制该透镜的“速度”或f/#(聚光力)，其中f/#可被定义为透镜或系统焦距除以该限制孔的直径所得的比率。这种透镜设计类型是非常成熟的，并且大量的选择已具体地设计了各种类型的可商购获得的传感器(例如，CCD和CMOS传感器)。这些传感器将光能转化为电能，并且通常由数百万个单独的感测元件组成，每个元件接收通过摄影物镜透镜从FOR的一小部分成像的能量。通过软件组装来自这些感测元件中的每一个的电信号(称为图片元件或“像素”)，该软件允许对由物镜成像的对象进行2维呈现。

现在将更详细地描述该设计方法的实施例，其中光学对象包括如上实例A实施例所述的制品100,200。CMOS传感器可用于当前设计方法的实施例中，因为相比于提供类似性能(例如，就像素分辨率、帧频和/或动态范围而言)的CCD传感器，这些传感器具有相对较低的成本。应当理解，在该设计方法的其他实施例中，可使用CCD或其他类型的光电探测器。

在某些实施例中，洞或斑发现算法和定量算法可提供每个反应位点104,204的图像在整个洞直径上包括至少5像素或总共约20像素。对于本实施例而言，选择在整个孔或洞直径上约8像素的值。对制品100,200的实例A实施例而言，洞通过60微米的直径来表征，并且被布置为六边形图案，其中相邻反应位点104,204以82微米的间距隔开。因为8像素跨越60微米并且它们以82微米的间距隔开，所以洞间距为11像素，在相邻反应位点104,204之间留下大约3暗像素。沿CMOS检测器的一条轴线，一侧有约160个反应位点图像，其在一侧提供约1760像素的CMOS像素设计参数，或为制品100,200的正方形活性面积提供总数至少约3.1百万的探测器像素。在某些实施例中，可选择甚至更大数量的传感器像素以适应定位考虑和/或在FOR的边缘增加的透镜像差。

当前设计方法中的下一个考虑可为像素大小。当前可用的传感器具有例如1.1、1.4、2.2、3、5、8、11微米和更大的正方形像素大小。存在三个可能影响像素大小的选择的因素：动态范围(DR)、信噪比和衍射。DR可通过每个像素能存储的光电子的最大数量来确定。2.2微米直径的像素的绝对数为约3200光电子，而5.5微米的像素为约20,000光电子。作为通用设计参数，更大的像素(更大的光电子数量)提供更好的DR，以及更好的信噪比(SNR)特性，该信噪比特性等于信号的平方根。20K DR具有140的SNR；3.2K DR具有57的SNR，前者为后者的2.5倍。

一般来讲衍射为电磁波的基本特性，具体来讲衍射为光波的基本特性。其由物理孔如透镜或系统孔径光阑对波的程度的截断引起。在光学系统中的效果为无限远离的完美点源(如恒星)的图像其自身并非无限小，而是一斑点，其精确形状由孔的大小和形状来决定。大多数透镜的圆形孔形成具有明亮的大中心环(所谓的“艾里斑”)的牛眼型图案以及无限个较小和较暗的环绕圈。对于可见波长而言，艾里斑的大小大约等于微米级的系统物镜透镜的f/#。因此，衍射考虑因素使光学设计导向于更大的透镜直径和系统孔。然而，存在对透镜直径或孔的实际限制，因为由透镜元件的表面形状引起的透镜像差(诸如但不限于散光、失真和场弯曲)随着f/#减少或透镜直径增加而增加。f/#的实际值为约f/2.5。这意味着点源的图像将形成直径约2.5微米的圆形图像。如果像素为2.5微米的正方形，则艾里斑将刚好填入其中。如果像素为1.4微米，则艾里斑将占据2×2的像素网格。计算透镜或系统分辨率的一种评估标准称为瑞利判据，该判据称当一个艾里斑的最大图像出现在另一个艾里斑的最小图像处时，两个点物体可由光学系统分辨。这暗示在当前实例中的两个相邻像素应被一个艾里斑半径或约1.25微米分开。另一种分辨率评估标准为将相邻的信号分开达至少一个艾里斑直径。后一种标准提供了限制像素大小至2.5微米的正方形或更大。具有这种像素大小和像素计数的传感器的总体大小变为1760×2.5＝4400微米或4.4mm。

两种可商购获得的满足上述用于当前设计方法的标准的传感器为Aptina MT9P031单色CMOS传感器(4.28毫米×5.7毫米和1944×2592像素，直径为2.2微米乘2.2微米)以及尼康D7000相机(Nikon D7000camera)的DX大小的16Mp传感器(DX sized 16Mp sensor)(23.6×15.6毫米和5微米乘5微米像素)。在当前的实例中，可基于成本考虑选择AptinaMT9P031。

基于4.28毫米的Aptina CMOS传感器的较小直径和在实例A实施例中制品100,200的13毫米乘13毫米的活性面积，系统放大率为0.33(4.28/13)。这提供了60微米×0.33＝19.8微米的反应位点104,204图像大小。因此，每个反应位点104,204图像覆盖19.8/2.5＝7.92像素，这满足上文中大于5像素和约8像素的两个标准。

当前设计方法还包括当使用发射光学系统422使制品100,200在光电探测器420上成像时，基于接收自反应位点104,204的信号确定强度计算的准确度。在当前的实例中，强度计算基于直径为约5传感器像素的每个反应位点的图像大小。光学检测系统如发射光学系统422的效果取决于信噪比(SNR)。对于荧光感测仪器而言，一条经验法则是SNR为至少3。SNR的测量位置是在传感器换能器处。该换能器将光能(光子)转换成电能(电子)。这些电子通常称为“光电子”，字面意思为由光子产生的电子。SNR可包括两部分：信号能量和噪声能量。信号能量(信号光电子)由光子通量(光子抵达率，光子/秒)引起。噪声能量可由若干机制产生，诸如信号本身、光学背景能量(来自不同于信号源的源)以及与换能器相关的能量诸如读取噪声或暗(热)噪声。可在7,233,393和7,045,756中找到读取噪声和暗噪声的更详细的讨论，二者均以全文引用的方式并入本文。

当确定了或提供了噪声能量的准确估计时，可使用SNR计算来确定给定的信号能量是否足够大以克服噪声能量。换能器(光学检测器)可针对读取噪声或针对热噪声进行表征。可由检测器量子效率(QE)、光通过量(optical throughput)(例如，测得的光子的比率与在样品处产生的光子的比率之比)以及在光源(激光、LED、电灯、电弧等…)处产生的光通量(optical flux)估计在检测器处的信号通量。光通过量可由以下组成：源光谱通量、光学过滤器光谱传输特性、荧光转换效率(在波长1处的入射通量被转换为在波长2处的荧光发射通量的比例)、发射光通量的角范围、相机透镜的光学采集效率和窗口、流体以及光路中任何其他材料的其他特性。知道了光学组件的通过量特性和正常封闭的波长处的光学过滤器的残余传输、光路中材料的(自动)荧光以及在包含光学系统的结构的界限内产生的散射光，可计算光学背景。背景可可能难以模拟，但可从系统中的测量获取。

基于当前设计方法，成像系统包括Aptina CMOS传感器和0.33的系统放大率。使用系统为小的通用设计标准，按照成像系统为全部或几乎全部的反应位点104,204提供预定的强度计算准确度的设计标准，评估了各种可商购获得的设计用于监测系统和移动电话的物镜透镜。这些透镜的额外优势为相对廉价。从这种评估确定出Sunex透镜型号DSL901产生了低得足以满足预定的强度计算准确度标准的总像差。DSL901为f/3透镜并且具有15毫米的焦距，其使用以下关系产生60毫米的工作距离：

p＝f[(m+1)/m]，

式中f＝焦距

p＝工作距离。

作为另外的选择，鉴定了满足预定的强度计算准确度标准的其他摄影物镜。这些摄影物镜的焦距小于或等于DSL901的15毫米的焦距。在某些实施例中，放大率可略低于0.33。由于工作距离的增加，这将导致系统略微变大；然而，较低的放大率有利地减少了像差如散光，像差在FOR内的周边定位的反应位点104,204处较大。

概括地说，已发现，可提供包括具有小于或等于60毫米工作距离的光学成像系统的系统，所述系统能够接收包含至少20,000个单独的反应位点104,204的制品100,200，同时照明该至少20,000个单独的反应位点104,204并且计算包含在该至少20,000个单独的反应位点中的一些或全部中的多个靶核苷酸粒子。在某些实施例中，通过提供光电探测器如光电探测器420(包括预定的像素数量，该数量是单独的反应位点的数量的至少20倍)来获得靶核苷酸粒子数量的精确计算。在其他实施例中，预定的像素数量为单独的反应位点数量的至少60倍，或为单独的反应位点数量的至少100倍。

在某些实施例中，根据上文讨论的设计方法的实施例的成像系统可通过一个或多个品质因子(FOM)来表征。一些FOM包括：

·传感器像素正方形大小>＝相机透镜f#(例如，用于具有光谱可见部分中的波长的系统)。

·传感器像素的数量>＝(n*n*l*w)/(p*p)，其中n＝图像中所需的像素/特征，l＝对象能视域长度，w＝对象能视域宽度，p＝特征间距。

·选择放大率，使其为传感器长度/宽度与对象长度/宽度的四个比率中最小的一个。

·选择透镜焦距和对象至图像距离对(由放大率确定)以在透镜像差和整体光学封装长度之间提供最佳折中方案。

在某些实施例中，系统300还包括热控制系统500，该热控制系统包括例如热循环仪，该热循环仪被配置成在包含在制品100,200中的一些或全部样品上执行PCR程序或方案。系统400,500可组合或联接在一起成为单个单元，例如以便在包含在制品100,200中的至少一些样品上执行qPCR和/或dPCR程序、测定、实验或方案。在此类实施例中，可使用计算机530,560来控制系统400,500和/或收集或处理由系统400,500的任一者或两者提供或获得的数据。作为另外一种选择，热控制系统500可与光学系统400和/或与计算机530,560完全分开。在此类实施例中，使用热控制系统500或一些其他热控制器或热循环仪在样品上执行热循环之后，可使用光学系统400在包含在反应位点104,204中的样品上执行dPCR或端点PCR程序。在某些实施例中，热控制系统500包括热循环仪，在热循环仪中使用传统的热循环仪、等温扩增、热对流、红外介导的热循环或解旋酶依赖性扩增来完成PCR。在某些实施例中，可将热控制系统500的至少一部分与制品100,200结合为一体或结合到所述制品中。例如，制品100,200可包括沿表面110,112的一者或两者分布的一个或多个加热元件。除此之外或作为另一种选择，基材102的至少一部分可为加热元件，例如由具有电阻的材料制成，该材料被配置为在对基材102施加电势时提供电阻性加热。

根据各种实施例，发射光学系统422和/或透镜424可包括小于或等于15mm的焦距和/或小于或等于60mm的工作距离，其中工作距离具有从制品100,200至透镜424或透镜424的主平面的距离。此外，在各种实施例中，发射光学系统422和/或透镜424包括小于或等于3的光圈数。在一些实施例中，发射光学系统422和/或透镜424可包括小于或等于15mm的焦距和小于或等于3的光圈数二者。

在某些实施例中，制品100,200包括具有集成电路和半导体的电子芯片。在此类实施例中，还可将检测系统整合到芯片中以确定目的生物组分的存在和/或数量。

上文以完整、清楚、简明且准确的术语呈现了对设想的实施本发明的最佳模式以及对制备和使用本发明的方式和过程的描述，使得其所属领域的技术人员能够制备和使用本发明。然而，本发明可作出与上文所述完全等效的修改形式和替代构造。因此，并非意图将本发明限制于所公开的具体实施例。相反，其目的在于涵盖属于如以下权利要求书大体表达的本发明的精神和范围内的修改形式和替代构造，以下权利要求书特别指出并明确要求本发明的主题。

用于与本文件所描述的各个实施例有关的方法的示例性系统包括在以下美国临时专利申请中所描述的系统：

提交于2012年3月16日的美国临时申请号61/612,087；以及

提交于2012年11月7日的美国临时申请号61/723,759；以及

提交于2012年3月16日的美国临时申请号61/612,005；以及

提交于2012年3月16日的美国临时申请号61/612,008；以及

提交于2012年11月7日的美国临时申请号61/723,658；以及

提交于2012年11月7日的美国临时申请号61/723,738；以及

提交于2012年6月13日的美国临时申请号61/659,029；以及

提交于2012年11月7日的美国临时申请号61/723,710；以及

提交于2013年3月7日的美国临时申请号61/774,499；以及

提交于2013年3月15日的生命科技公司(Life Technologies)案卷号LT00655PCT，以及

提交于2013年3月15日的生命科技公司(Life Technologies)案卷号LT00656PCT，以及

提交于2013年3月15日的生命科技公司(Life Technologies)案卷号LT00657PCT，以及

提交于2013年3月15日的生命科技公司(Life Technologies)案卷号LT00658PCT，以及

提交于2013年3月15日的生命科技公司(Life Technologies)案卷号LT00668PCT。

所有这些申请也以全文引用的方式并入本文中。

Claims (14)

1.一种用于确定样品中靶核苷酸分子的数目的系统，所述系统包括：

样品架，其被配置成容纳包括至少20,000个单独的反应位点的制品；

激发光学系统，其包括被配置成同时照射所述至少20,000个单独的反应位点的光源；

光学传感器，其包括预定的像素数目，所述预定的像素数目为所述反应位点数目的至少20倍；以及

发射光学系统，其包括距所述样品架的系统工作距离，其中所述系统工作距离小于或等于60毫米。

2.根据权利要求1所述的系统，还包括计算机，所述计算机包括处理器和与所述处理器通信的电子存储器，其中：

所述计算机接收来自所述光学传感器的所述至少20,000个单独的反应位点的图像；

所述存储器包括用于执行数字PCR计算的指令；并且

所述计算机被配置成基于所述指令和所接收到的图像计算包含在所述至少20,000个单独的反应位点中的至少一些单独的反应位点中的多个靶核苷酸粒子。

3.根据权利要求1所述的系统，还包括：

外壳，其包含激发光学系统和所述发射光学系统；以及

图像记录系统，其包括所述光学传感器；

其中所述图像记录系统可拆卸地安装至所述外壳。

4.根据权利要求3所述的系统，其中所述图像记录系统为相机手机或智能手机。

5.根据权利要求3所述的系统，其中所述图像记录系统为iPhone。

6.根据权利要求3所述的系统，其中所述图像记录系统包括处理器，所述处理器被配置成从所述光学传感器获取图像并处理所述图像以提供所述样品的生物化学信息。

7.一种用于确定样品中靶核苷酸分子的数目的系统，包括：

样品架，其被配置成容纳包括多个单独的反应位点的制品；

图像记录系统，其包括所述光学传感器；以及

外壳，其包括：

激发光学系统，其包括被配置成同时照射所述单独的反应位点的光源；

发射光学系统，其被配置成将来自所述制品的辐射转移至所述图像记录系统；

其中所述图像记录系统可拆卸地安装至所述外壳。

8.根据权利要求7所述的系统，其中所述图像记录系统为相机手机或智能手机。

9.根据权利要求7所述的系统，其中所述图像记录系统为iPhone。

10.根据权利要求7所述的系统，其中图像记录系统包括处理器，所述处理器被配置成从所述光学传感器获取图像并处理所述图像以提供所述样品的生物化学信息。

11.一种测量一种或多种样品中的靶核苷酸的量的方法，所述方法包括：

提供系统，所述系统包括：

样品架，其被配置成容纳包括至少20,000个单独的反应位点的制品；

激发光学系统，其包括被配置成同时照射所述至少20,000个单独的反应位点的光源；

光学传感器，其包括预定的像素数目，所述预定的像素数目为所述反应位点数目的至少20倍；以及

发射光学系统，其包括距所述样品架的系统工作距离，其中所述系统工作距离小于或等于60毫米；

提供所述制品；

在所述至少20,000个反应位点中的至少一些反应位点上执行扩增测定；

将所述制品放入所述样品架中；

使用所述激发光学系统照射所述制品；

测量来自所述至少20,000个单独的反应位点中的至少一些单独的反应位点的发射辐射；以及

确定所述靶核苷酸的量。

12.根据权利要求11所述的方法，还包括：

将含有所述靶核苷酸的样品溶液的至少一部分分配在所述至少20,000个反应位点中的至少一些反应位点之间；

通过测量来自所述至少20,000个反应位点中的至少一些反应位点的发射辐射来确定所述溶液中的所述靶核苷酸的量。

13.根据权利要求12所述的方法，还包括：

将含有所述靶核苷酸的样品溶液的至少一部分分配在多个制品的所述反应位点之间，每个制品包括所述至少20,000个反应位点；

通过测量来自所述多个制品每一者的反应位点中的至少一些反应位点的发射辐射来确定所述溶液中的所述靶核苷酸的量。

14.根据权利要求12所述的方法，还包括：

将含有所述靶核苷酸的样品溶液的至少一部分分配在多个制品的所述反应位点之间，每个制品包括所述至少20,000个反应位点；

依次将所述多个制品中的每个制品放入所述样品架中，并测量来自每个制品的所述至少20,000个单独的反应位点中的至少一些单独的反应位点的发射辐射；

基于所测得的全部所述多个制品的发射辐射来确定所述溶液中的所述靶核苷酸的量。