NL1030102C2 - Fluorescentiemicroscoop. - Google Patents

Description

Korte aanduiding: Fluorescentiemicroscoop.

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een fluorescentiemicroscoop.

In het bijzonder heeft de onderhavige uitvinding betrekking op een fluorescentiemicroscoop, omvattende een behuizing met een 5 excitatielichtbron die is ingericht voor het uitzenden van excitatielicht, een filtermiddel dat excitatielicht scheidt van door een fluorescerende stof opgewekt fluorescentielicht, een objectlens, een substraathouder, een plaatsgevoelige lichtdetector, en een afbeeldingslens voor de plaatsgevoelige lichtdetector.

10 Dergelijke fluorescentiemicroscopen worden veel gebruikt bij fluorescentieonderzoek. Daarbij wordt een fluorescerend monster of preparaat onderzocht. Desgewenst kan een op zichzelf niet fluorescerend monster zijn voorzien van een fluorescerende stof.

Indien een dergelijk monster of preparaat wordt bestraald met 15 geschikt licht, meestal maar niet uitsluitend zichtbaar licht of ultraviolet licht, zal de fluorescerende stof in het monster oplichten met fluorescentielicht, dat een langere golflengte heeft dan het excitatielicht. Vaak is de intensiteit van de fluorescentie gering, zodat vrijwel altijd het excitatielicht wordt weggefilterd 20 met behulp van een filter. De zwakke fluorescentie is dan in beginsel het enige zichtbare beeld.

In de praktijk wordt fluorescentieonderzoek vaak gedaan op micro-organismen. Daarbij wordt meestal een grotere vergroting gebruikt, bij voorkeur meer dan 50 keer tot 100 keer bij het 25 objectief, en rond 1000 x in totaal, om een inspectie met het menselijk oog mogelijk te maken. Daarenboven is een typische afmeting van een gebruikt substraat bijvoorbeeld 25 mm doorsnede. Een dergelijke afmeting is bijvoorbeeld veelal nodig in het geval van microbiologische monsters, waarbij een hoeveelheid monstervloeistof 30 door het substraat dient te lopen om de microbiologische deeltjes, die later dienen te worden onderzocht, te concentreren op het substraat. De monstervloeistof loopt daarbij door dunne gaatjes door het substraat, en de deeltjes blijven achter op het oppervlak van het substraat.

35 Een nadeel van de bekende fluorescentiemicroscoop is dat de meettijd zeer lang kan worden. Bijvoorbeeld in het geval van 10 3 0 1 0 2 __ - 2 - microbiologisch onderzoek met een gewenst oplossend vermogen kleiner dan 1 micrometer en een substraat van 25 mm doorsnede, met per beeld een meettijd van enkele seconden, is een totale meettijd van vele uren tot zelfs een dag geen uitzondering.

5 Het is een doel van de onderhavige uitvinding om een fluorescentiemicroscoop te verschaffen die een veel kortere meettijd toestaat, bij het behoud van oplossend vermogen. Dit doel wordt bereikt met een fluorescentiemicroscoop volgens de uitvinding, omvattende een substraat dat een wafer-gebaseerd filtermembraan uit 10 in hoofdzaak silicium omvat, waarbij het filtermembraan een patroon van doorgaande gaatjes omvat. In het bijzonder is het filtermembraan vervaardigd met behulp van een siliciumwafel. Dergelijke siliciumwafels kunnen namelijk bijzonder vlak worden gemaakt, zodat de filtermembranen, die de oppervlaktevorm van de wafel overnemen, 15 eveneens buitengewoon vlak kunnen worden gemaakt, met name zodanig vlak dat in hoofdzaak het hele substraatoppervlak scherp kan worden afgebeeld bij een instelling van een fluorescentiemicroscoop waarbij een oplossend vermogen van 1 micrometer of kleiner wordt verschaft. Dergelijke silicium filtermembranen worden bijvoorbeeld verschaft 20 door fluXXion. De silicium filtermembranen van fluXXion hebben een bijkomend voordeel dat deze zeer dun zijn en vanwege het grote aantal gaatjes, die bovendien zeer goed zijn gedefinieerd, een zeer hoge doorlaatbaarheid hebben. Hierdoor is het mogelijk om substraten te verschaffen die beduidend kleinere afmetingen hebben dan de tot nog 25 toe gebruikelijke substraten, en toch een zelfde totale doorlaatbaarheid hebben. Bijvoorbeeld is het mogelijk om een substraat uit de stand van de techniek met een doorsnede van 25 mm te vervangen door een silicium filtermembraan met een doorsnede van in het bijzonder kleiner dan 10 mm, en bijvoorbeeld 3 mm. Dit betekent 30 dat de te onderzoeken materialen die zich bevinden in een monstervloeistof, na door het filtermembraan te zijn geleid, veel sterker zijn geconcentreerd dan bij substraten uit de stand van de techniek. In de praktijk houdt dit ook in dat een veel kleiner gebied hoeft worden onderzocht. Bijvoorbeeld betekent een verkleining van 35 het te onderzoeken gebied van 25 mm doorsnede naar 3 mm in het kwadraat een tijdswinst van ongeveer een factor 50.

Een ander probleem dat bij de fluorescentiemicroscopie volgens de stand van de techniek vaak optreedt is dat het substraat kan fluoresceren. Dit betekent dat bij de fluorescentiemetingen een 40 achtergrondsignaal oftewel ruis aanwezig is. Dit achtergrondsignaal 1030102 - 3 - kan de echte metingen, dat wil zeggen van de te onderzoeken materialen, verstoren. Derhalve is het gewenst om een substraat te verschaffen dat niet, althans zeer weinig fluoresceert. Dit doel wordt bereikt doordat het substraat in hoofdzaak silicium omvat.

5 Een verder belangrijk punt betreft het scherpstellen op het substraat. Immers, ook indien een perfect vlak substraat wordt gebruikt kan het nog nodig zijn om bij elk nieuw onderzocht deel van het substraat opnieuw scherp te stellen, aangezien het substraat niet in het scherpstelvlak van de microscoop hoeft te liggen. In feite 10 dient voor elke positie de hoogte ten opzichte van het scherpstelveld te worden bepaald. Echter, bij een perfect, of althans voldoende, vlak substraat is het voldoende om een driepuntsmeting van het scherpstelpunt te bepalen. Hierdoor wordt de positie van het substraat ten opzichte van het scherpstelvlak van de microscoop 15 bepaald. Vervolgens kan dan het substraat zodanig worden gekanteld dat het wel in het scherpstelvlak van de microscoop komt te liggen. Alternatief is het mogelijk om nu eenvoudig voor elke positie de vereiste scherpstelcorrectie te bereken, die dan desgewenst automatisch kan worden uitgevoerd. Bij verschuiven van het substraat 20 kan de scherpstelling dan automatisch worden bijgeregeld. Ook in deze uitvoeringsvorm bespaart het vlakke substraat zeer veel insteltijd.

In een aantrekkelijke uitvoeringsvorm omvat de fluorescentiemicroscoop een instelverlichtingssysteem met een instellichtbron die is ingericht voor uitzenden van instellicht, 25 waarbij een optisch pad van het instellicht en een optisch pad van het fluorescentielicht coaxiaal via de objectlens in de richting van het substraat verlopen. Hierbij wordt dus bij gebruik van de fluorescentiemicroscoop tijdens instellen licht op het substraat geschenen. Het gedeelte van het optische pad voor het instellicht 30 vanaf het substraat naar de detector is hetzelfde als dat voor het fluorescentielicht. Met andere woorden is het mogelijk om van het substraat zowel een beeld bij instellicht als een beeld bij fluorescentielicht te maken. Dit verschaft de mogelijkheid tot correleren van het fluorescentiebeeld met een gewoon optisch beeld 35 van het substraat met monster of preparaat. Dit kan gunstig zijn om de fluorescentiebeelden te interpreteren en bijvoorbeeld te ontdoen van artefacten.

Het instellicht kan hierbij in beginsel gewoon zichtbaar licht omvatten. Desgewenst omvat het instellicht slechts een deel van het 40 zichtbare spectrum. Met voordeel omvat het instellicht in hoofdzaak 1030102 - 4 - licht in een golflengtegebied buiten het excitatielicht, dat immers zal worden weggereflecteerd door de spiegel of dergelijke die het excitatielicht op het substraat richt. Bijvoorbeeld omvat het instellicht hoofdzakelijk licht met een golflengte rond of gelijk aan 5 die van fluorescentielicht, of zelfs hoofdzakelijk fluorescentielicht.

De fluorescentiemicroscoop omvat voorts bij voorkeur een voor instellicht gedeeltelijk doorlatende spiegel, die zodanig in een optisch pad van het instellicht is geplaatst, dat van het substraat 10 komend licht naar de lichtdetector wordt gericht. Dit biedt de mogelijkheid om het instellicht via de objectlens te verschaffen. Met andere woorden wordt het instellicht op het substraat gestraald via dezelfde optiek als via welke het weerkaatste instellicht wordt opgevangen, dat wordt gebruikt om een instelbeeld ermee te vormen. .

15 Van belang is hierbij dat het substraat geheel vlak is, en bij voorkeur spiegelend, zoals bijvoorbeeld het silicium waferfiltermembraan gebruikt in deze uitvinding. Dit biedt onder andere het voordeel dat tijdens bekijken van het preparaat of monster slechts het gedeelte dat op dat moment bekeken wordt, wordt bestraald 20 met instellicht. Dat is gunstig vanwege het onder invloed van licht veelal snelle ontkleuren van het preparaat of monster, of dito verval van de fluorescerende stof. Het is een verder voordeel dat het instellicht van dezelfde zijde wordt aangeboden als de zijde vanwaar het fluorescentielicht wordt uitgestraald. Overigens is het ook wel 25 mogelijk om een doorzichtig substraat te nemen. Echter werkt dit bij het wafer-filtermembraan niet goed, omdat dat via de doorgaande gaten in feite een optisch element met een zeer geringe NA en dus zeer grote scherptediepte vormt. Dat betekent wederom dat van onderaf scherpstellen op het instellicht moeilijk wordt, waarbij scherp 30 betrekking heeft op de instelling van het preparaat of monster ten opzichte van de afbeeldingsoptiek en de camera. Immers heeft die : optiek een veel kleinere NA dan de effectieve NA van de doorgaande j gaten in het filtermembraan.

Opgemerkt wordt dat het echter ook mogelijk is om instellicht 35 via een ander optisch pad aan te bieden, bijvoorbeeld schuin invallend op het substraat, zoals met een rond de objectieflens instellicht aanbiedende instellichtbron. Ook bij deze uitvoeringsvorm biedt de onderhavige uitvinding overigens voordelen aangezien de werkafstand met de gekozen optische instellingen over het algemeen 40 groter is dan bij fluorescentiemicroscopen volgens de stand van de 1030102 - 5 - techniek, en zeker die met immersieoptiek. Een en ander zal hieronder nader worden toegelicht.

Bij gebruik van een camera met pixels, als plaatsgevoelige detector, is bij voorkeur de zogenaamde pixelresolutie minstens zo 5 goed als de optische resolutie van de fluorescentiemicroscoop, om zo veel mogelijk de informatie uit het optische beeld dat met de camera wordt gedetecteerd te behouden. De pixelresolutie is eenvoudig de pixelafmeting gedeeld door de vergrotingsmaatstaf, en ligt bij voorkeur tussen 1/3 en 1 x de optische resolutie, d.w.z. dat de 10 pixelresolutie bij voorkeur minstens zo goed is als de optische resolutie (behoud van informatie) maar bij voorkeur hooguit 3x beter is, d.w.z. l/3x zo groot als de optische resolutie. Immers zou een nog "betere" pixelresolutie slechts de schijn van een hogere effectieve resolutie geven, aangezien die informatie toch al niet in 15 het optische aangeboden beeld besloten lag.

Door nu de optische resolutie bescheiden te kiezen, d.w.z. niet meer dan nodig is, en vooral op basis van de eigenschappen van de ί camera, en niet van het menselijke oog, kan worden volstaan met een kleinere vergroting. Een groot voordeel hiervan is dat het benodigde 20 aantal pixels beperkt kan blijven, althans de verhouding tussen gemeten beeldveld en aantal pixels gunstig is. Dat aantal pixels bepaalt niet alleen de prijs en complexiteit van de camera, maar bovenal ook de uitleessnelheid. Alternatief is het mogelijk om van een aanwezige CCD slechts een beperkt aantal pixels te gebruiken voor 25 de opname, niet meer dan nodig om de gewenste resolutie te halen. In beide gevallen betekent een klein pixelaantal een hoge uitleessnelheid, en dus een snellere meting.

Bijvoorbeeld is een gewenste resolutie 0,5 pm. en wordt er groen licht gebruikt met een golflengte van 530 nm. De bijbehorende NA is 30 dan minstens 0,40. Bij pixelafmetingen van 5 pm en een gewenste pixelresolutie van 0,5 x de optische resolutie, dus 0,25 pm, resulteert een vereiste vergroting voor de camera van in totaal 20x. Het is dan praktisch goed mogelijk om bijvoorbeeld een objectieflens van f = 10 mm en een afbeeldingslens van f = 200 mm te kiezen. Dit 35 zijn brandpuntsafstanden die een compacte bouwwijze van de microscoop toelaten, terwijl toch een werkafstand van rond 2 cm mogelijk wordt. Uiteraard zijn andere gewenste resoluties mogelijk, evenals andere fluorescentiegolflengten, pixelafmetingen, verhoudingen tussen pixelresolutie en optische resolutie, bij voorkeur tussen 1:1 en 1:3, 103 0 1 02_ - 6 - en brandpuntsafstanden van objectlens en afbeeldingslens, welke laatste uiteraard ook samengestelde lenssystemen mogen zijn.

Op bovengenoemde wijze kan er voor worden gezorgd dat de sterkte of vergrotingsfactor van de objectlens beperkt kan blijven, 5 terwijl de totale vergroting toch voldoende is om in combinatie met de kleine pixelafmetingen het gewenste oplossende vermogen te halen.

Een bijkomend voordeel is dat de numerieke apertuur (NA) van de objectlens niet bijzonder groot hoeft te worden gehouden, zodat bij grote vergrotingen immersie niet nodig is.

10 In feite wordt voor de microscoop een afschatting gemaakt van de benodigde NA op basis van de gewenste resolutie, bij gebruik van een camera i.p.v. het menselijke oog, gevolgd door bepaling van de benodigde vergrotingsfactor op basis van pixelafmeting en gewenste pixelresolutie.

15 Een groot voordeel van lenzen met een betrekkelijk kleine NA, met voordeel 0,45 en kleiner, is dat de scherptediepte relatief groot is. Dat betekent wederom dat opnieuw scherpstellen van het substraat niet of althans minder vaak nodig is, en dat ook een relatief dikker substraat nog in zijn geheel door te meten is zonder verstellen van 20 de microscoop.

Vooral in combinatie met het zeer vlakke wafer-filtermembraan biedt dit voordelen, aangezien nu een volledige meting van het substraat bij één scherpstelactie mogelijk wordt. In feite vormt het wafer-filtermembraan een tweedimensionaal substraat, waarbij op de 25 openingen in het membraan aan de oppervlakte ervan kan worden scherpgesteld, terwijl bovendien het preparaat of monster direct op dat oppervlak ligt.

Immersie, oftewel onderdompelen, in bijvoorbeeld water of olie gaat altijd gepaard met verdampen van de betreffende 30 immersievloeistof, hetgeen vaak ongewenst is. Bovendien is het mogelijk, en is het een belangrijker nadeel, dat contaminatie kan optreden door kruisbesmetting bij verschillende preparaten. Dit kan niet alleen optreden juist vanwege verdampen van de immersievloeistof, waarbij bijvoorbeeld micro-organismen of ander | 35 materiaal wordt meegenomen, doch ook doordat via de immersievloeistof dergelijk materiaal wordt overgebracht van het ene preparaat naar het andere. Door de kleine vergroting van de objectlens is het namelijk eenvoudig mogelijk om een grote werkafstand in te stellen.

Met voordeel omvat de gedeeltelijk doorlatende spiegel een 40 spiegel of zogenaamde polkadot-beamsplitter, waarbij de verhouding 1030102 - 7 - tussen reflectiecoëfficiënt en transmissiecoëfficiënt voor het instellicht ten minste 10 bedraagt, en met voordeel tenminste 100.

Bij voorkeur bedraagt de verhouding tussen reflectiecoëfficiënt en transmissiecoëfficiënt voor fluorescentielicht tenminste 100. Bij 5 coaxiaal inkoppelen van het instellicht is een optisch element aanwezig dat het instellicht eerst deels doorlaat, en vervolgens deels reflecteert in de richting van de detector, of omgekeerd indien de positie van detector en instellichtbron worden verwisseld.

De uitvinding heeft voorts betrekking op een werkwijze voor het 10 detecteren van fluorescentie van een preparaat op een substraat, onder gebruikmaking van een fluorescentiecamera volgens een der voorgaande conclusies, omvattende het bestralen van het preparaat op het substraat met excitatielicht, en het detecteren van fluorescentielicht van het preparaat. Door gebruik te maken van de 15 fluorescentiemicroscoop volgens de uitvinding, in het bijzonder van het silicium wafersubstraat, kan een opmerkelijke tijdwinst worden geboekt bij de fluorescentiemetingen. Bovendien is er geen of nauwelijks invloed van fluorescentie door het substraat.

In het bijzonder zendt de instellichtbron in hoofdzaak slechts 20 instellicht uit bij in focus brengen van het preparaat. Hierdoor wordt het uitbleken van het preparaat of monster op het substraat beperkt. Door de bij voorkeur met de excitatiestraling coaxiale belichting met instellicht kan er worden afgewisseld tussen beelden met instellicht, die desgewenst een zichtbaar-lichtbeeld opleveren, j 25 en fluorescentiebeelden, waarbij een correlatie eenvoudig mogelijk is. Bij verplaatsen van het substraat en desgewenst eventueel opnieuw scherpstellen kan eenvoudig gedurende een korte (instel)tijd de instellichtbron worden ingeschakeld.

De instellichtbron zendt bovendien slechts zeer weinig licht 30 uit, althans bereikt zeer weinig licht het preparaat of monster. Het instellicht wordt in beginsel beperkt tot een hoeveelheid die nodig is om te kunnen scherpstellen, zodat bleek- en andere nadelige effecten op het preparaat of monster tot een minimum beperkt kunnen blijven. Uiteraard mag die hoeveelheid licht groter zijn indien het 35 preparaat daarvan geen last heeft, zodat het scherpstellen eventueel sneller enof nauwkeuriger kan geschieden.

In een bijzondere uitvoeringsvorm wordt van een aantal deelgebieden van het preparaat op het substraat telkens de fluorescentie gedetecteerd, vervolgens wordt uit de in een deelgebied 40 gedetecteerde fluorescentie relevante beeldinformatie bepaald, 1 0 3 0 1 02 - 8 - waarbij de deelgebieden willekeurig worden gekozen uit het preparaat, en wordt er gestopt met bepalen van de fluorescentie indien de relevante beeldinformatie uit alle tot dan toe bepaalde deelgebieden samen een voorafbepaalde betrouwbaarheidsdrempel overschrijdt. Op 5 deze wijze kan de meettijd nog verder worden teruggebracht. Vooraf dient dan een drempel te worden die aangeeft wanneer met voldoende betrouwbaarheid een bepaald preparaat of monster is doorgemeten. Een eenvoudig voorbeeld is wanneer de aanwezigheid van een bepaald micro-organisme dient te worden vastgesteld. Immers volstaat daar de 10 detectie van een of enkele exemplaren van dat micro-organisme.

Uiteraard is het ook mogelijk om als drempelwaarde een (wettelijke) normwaarde te kiezen, waarbij het volstaat om het overschrijden van j die norm vast te stellen, enzovoort. Inbouwen van detectie dergelijke drempeloverschrijdingen kan bijvoorbeeld, en bij voorkeur, geschieden 15 met geautomatiseerde beeldherkenningsapparatuur.

De fluorescentiemicroscoop en de werkwijze volgens de uitvinding verschaffen onder andere een snelheidswinst bij fluorescentiemetingen. Deze snelheidswinst komt onder andere voort uit het gebruik van het wafer-filtermembraan, dat snelheidswinst 20 oplevert doordat het een in vergelijking met bekende substraten even doelmatig filter verschat op een veel kleinere oppervlakte, die dus sneller kan worden doorgemeten. Bovendien is het een vlak filter, dat niet steeds opnieuw scherpstelling behoeft. Een driepuntsmeting volstaat, waarna eventueel bijregelen automatisch kan geschieden.

25 Bovendien wordt gebruikgemaakt van een camera, die een beter oplossend vermogen verschaft dam het menselijk oog, zodat een kleinere numerieke apertuur van de gebruikte lenzen mogelijk wordt.

Dit maakt de lenzen goedkoper, en vaak is geen immersie meer nodig.

Bovendien kan worden volstaan met een kleinere vergroting, althans 30 indien de pixels van de camera niet te groot zijn ten opzichte van het gewenste optische oplossende vermogen, zodat ook het gebruik van langere brandpuntsafstanden mogelijk wordt, en daarmee een grotere werkafstand. Dit heeft weer voordelen bij voorkomen van besmetting via immersie. Voorts is het voordelig om met meten te stoppen wanneer 35 de gevonden statistiek daartoe aanleiding geeft. Al met al kan met de fluorescentiemicroscoop en de werkwijze volgens de uitvinding zeer snel, betrouwbaar en contactloos fluorescentie worden gemeten.

De uitvinding zal hierna worden toegelicht aan de hand van de tekening, waarin de enige figuur een schematische weergave is van een 40 dwarsdoorsnede van een fluorescentiemicroscoop volgens de uitvinding.

1030102_ - 9 -

Fig. 1 toont een fluorescentiemicroscoop volgens de uitvinding, : in dwarsdoorsnede.

De fluorescentiemicroscoop is algemeen aangeduid met het 1 verwijzingscijfer 1, en omvat een behuizing 10 met daarop gemonteerd 5 een camera 12. In de behuizing 10 is een excitatielichtbron 14 verschaft, alsmede een eerste lens 16, een excitatiefilter 18 en een j dichroïtische spiegel 20.

In figuur 1 onder aan de behuizing 10 is objectlens 22 verschaft via welke een substraat 24 kan worden beschenen. Het 10 substraat 24 is opgenomen in een substraathouder 26, terwijl 28 een substraatverstelinrichting in x, y en z aanduidt.

Met 30 is een gedeeltelijk doorlatende spiegel of beamsplitter aangeduid, met 32 een emissiefilter, en met 34 een afbeeldingslens.

Boven op de behuizing 10 zijn een instellichtbron 36 en een 15 instellens 38 aangeduid.

De behuizing 10 van de fluorescentiemicroscoop 1 volgens de uitvinder is een in hoofdzaak lichtdichte behuizing. Behuizing 10 kan gemaakt zijn van in beginsel elk willekeurig materiaal, zoals metaal en/of kunststof. In de behuizing 10 zijn een aantal optische en 20 andere componenten aangebracht.

i

In de behuizing 10 is een excitatielichtbron 14 aangebracht, voor het verschaffen van excitatielicht. De excitatielichtbron kan in beginsel elke daartoe geschikte lichtbron omvatten, zoals een of meer LED's, een (hogedruk-)kwiklamp, een laser enz. De golflengte van het 25 excitatielicht van de excitatielichtbron 14 is gekozen afhankelijk van de te onderzoeken fluorescerende materialen, doch is in het algemeen betrekkelijk kortgolvig licht. Veelgebruikte golflengten liggen in het groene tot en met het nabije ultraviolette bereik, doch andere golflengten zijn niet uitgesloten. In dit geval is de 30 excitatielichtbron 14 bijvoorbeeld een blauwe LED-bron.

Het door de excitatielichtbron 14 uitgezonden licht gaat door een eerste lens 16 voor het vormen van een geschikte excitatielichtbundel, bijvoorbeeld met een voldoende hoge homogeniteit. De lichtbundel gaat tevens door een excitatiefilter 18 35 dat bedoeld is om ongewenste lichtaandelen weg te filteren. Met name valt hierbij te denken aan lichtaandelen uit het excitatielicht die overeenkomen met het fluorescentielicht. Immers zou een dergelijk aandeel in het excitatielicht de latere fluorescentiemeting kunnen verstoren. Desgewenst kan het excitatiefilter 18 ook zodanig zijn 40 ingesteld dat een meer of minder groot gedeelte van het licht, niet 10.7 o 1 o 2_ - 10 - zijnde excitatielicht of fluorescentielicht, wordt weggenomen. Aldus wordt eventuele ruis ten gevolge van voor de fluorescentiemeting niet-relevant licht zoveel mogelijk voorkomen. Geschikte filters kunnen door de vakman eenvoudig worden geselecteerd op basis van de 5 soorten toegepast excitatielicht en/of fluorescentielicht. Desgewenst kan het excitatiefilter 2 of meer subfilters omvatten.

Hoewel in dit geval de excitatielichtbron in de behuizing 10 is weergegeven, is het ook mogelijk om de excitatielichtbron buiten de behuizing 10 aan te brengen, waarbij er desgewenst een lichtdichte 10 koppeling tussen de excitatielichtbron 14 en de behuizing 10 wordt verschaft, vergelijk de koppeling met de camera 12, wat later zal worden besproken).

Het aldus gebundelde en gefilterde excitatielicht wordt via een dichroïtische spiegel 20 via objectlens 22 uitgestraald in de j 15 richting van het substraat 24. De dichroïtische spiegel 20 is bijvoorbeeld ingericht voor het zoveel mogelijk weerkaatsen van het excitatielicht, terwijl fluorescentielicht, dat afkomstig is van het substraat 24, met een hoge transmissie wordt doorgelaten. Een en ander kan, zoals de vakman weet, eenvoudig worden bereikt met 20 geschikte stapelingen van diëlektrische lagen.

De objectlens 22 kan bijvoorbeeld een standaard microscoop-objectief zijn, met een vergrotingsfactor van bijvoorbeeld tussen 10 keer en 45 keer. De numerieke apertuur kan bijvoorbeeld tussen 0,2 en 0,5 bedragen. De werkafstand kan bijvoorbeeld enkele millimeters tot 25 zelfs enkele centimeters bedragen. Belangrijk om op te merken is dat deze werkafstand voldoende is om contactloos te kunnen meten ten opzichte van het substraat 24.

Het substraat 24 kan in beginsel elk daartoe geschikt substraat zijn, bijvoorbeeld een glazen plaatje of dergelijke. Met name voor 30 microbiologische metingen worden vaak substraten gebruikt die zijn voorzien van vele, kleine gaatjes. Voorafgaand aan de meting laat men bijvoorbeeld een monster met te onderzoeken micro-organismen of dergelijke door het substraat lopen, waarbij het te onderzoeken materiaal achterblijft, terwijl de vloeistof door de gaatjes in het 35 substraat kan weglopen. Typische substraten die voor deze proefnemingen worden gebruikt omvatten bijvoorbeeld polymeersubstraten. Met voordeel omvat het substraat 24 echter een silicium membraanfilter. Dergelijke silicium membraanfliters, zoals bijvoorbeeld op de markt gebracht door de firma fluXXion zijn 40 vervaardigd uit silicium dat niet, althans zeer weinig fluoresceert, 1030102 - 11 - waardoor het eventuele fluorescentiemetingen niet kan verstoren. Bovendien zijn dergelijke silicium filtermembranen vervaardigd op basis van een siliciumwafel zoals gebruikt in de hoofdleidertechnologie. De silicium filtermembranen zijn dan ook 5 zeer vlak, zodat bij een opstelling loodrecht op de optische as van de fluorescentiemicroscoop overal zonder bijregelen een scherp beeld kan worden verkregen, zelfs bij sterke vergrotingen. Een ander voordeel van dergelijke silicium filtermembranen is dat. de doorlaatbaarheid zeer hoog is vanwege de zeer vele en bovendien 10 binnen zeer nauwe grenzen gedefinieerde gaatjes. Dit betekent dat het filtermembraan zeer selectief kan zijn tijdens filteren, en bovendien dat de afmetingen van het substraat 24 zeer beperkt kunnen worden gehouden, terwijl toch een zelfde hoeveelheid monstervloeistof binnen een in de praktijk gebruikelijke hoeveelheid tijd kan worden 15 gefilterd. Een silicium filtermembraan van bijvoorbeeld 3 millimeter doorsnede kan daarbij volstaan. Uiteraard zijn andere afmetingen ook mogelijk.

Het substraat 24 is opgenomen in een substraathouder 26, die een substraatverstelinrichting 28 (slechts schematisch aangeduid) 20 omvat. De substraatverstelinrichting 28 dient voor het verplaatsen van het substraat 24 in richtingen die liggen in het beeldveld van de fluorescentiemicroscoop 1, hier ook wel x en y-richting genoemd, alsmede ten behoeve van de scherpstelling ook in de loodrichting daarop, hier ook wel z-richting genoemd. Bovendien kan de 25 substraatverstelinrichting zijn ingesteld voor het zodanig kantelen, rond de x- en/of y-as, van het substraat 24 dat het oppervlak daarvan ligt in het scherpstelvlak van de fluorescentiemicroscoop 1. Dit laatste is een voordeel aangezien het zeer vlakke silicium filtermembraansubstraat het mogelijk maakt om met een driepuntsmeting 30 volkomen uitgelijnd te worden in het scherpstelvlak. Bovendien is het substraat zo vlak en is de scherptediepte zo groot bij de fluorescentiemicroscoop volgens de uitvinding dat het hele substraat over de volledige x,y-verplaatsing binnen de scherptediepte blijft.

De z-waarde kan dan eenvoudig als een functie van x en y worden 35 ingesteld, bijvoorbeeld een lineaire combinatie van x en y.

Het excitatielicht van de excitatielichtbron 14 dat is ingevallen op het substraat 24 met daarop de te onderzoeken materialen, zal aldaar fluorescentie kunnen veroorzaken. Het daardoor opgewekte fluorescentielicht zal wederom via de objectlens 22 het 40 huis 10 binnengaan, alwaar het in hoofdzaak de dichroïtische spiegel 1030102 - 12 - 20 zal passeren. Vervolgens zal het fluorescentielicht op de gedeeltelijk doorlatende spiegel 30 vallen en daardoor worden weerkaatst, in de richting van de camera 12. Eerst passeert het echter een emissiefilter 32, dat is ingericht om in hoofdzaak alleen 5 fluorescentielicht door te laten. Algemener gezegd dient het emissiefilter 32 om de verhouding tussen fluorescentielicht en ander licht, met name excitatielicht, te verbeteren. In beginsel zou het reeds voldoende kunnen zijn dat ook emissiefilter 32 slechts de excitatiestraling in hoge mate tegenhoudt, doch het emissiefilter 32 10 kan voorts dienen om een bepaald type fluorescentie te selecteren.

Immers kunnen ook andere dan de te onderzoeken materialen fluoresceren, met name het substraat. Bij een gebruik van een silicium filterrnembraan als substraat 24 is dit type fluorescentie echter meestal te verwaarlozen.

15 Het fluorescentielicht gaat vervolgens door afbeeldinglens 34, en heeft bijvoorbeeld een golflengte van 530 nm. Voorts kan als camera 12 een CCD camera of dergelijke worden gebruikt, met een pixelafmeting van 10 micrometer of kleiner. In een concreet geval is de pixelafmeting bijvoorbeeld 4,65 pm, en is een gewenste verhouding 20 tussen pixelresolutie en optische resolutie minimaal een factor 2.

Bij een gewenst optisch oplossend vermogen van bijvoorbeeld ongeveer 0,5 pm is de pixelresolutie dan bijvoorbeeld 0,23 pm, en is de | benodigde vergrotingsfactor ongeveer 20. Bijvoorbeeld heeft de objectieflens 22 een brandpuntafstand heeft van 10 mm en een NA van 25 0,42 en de afbeeldinglens 34 een brandpuntsafstand van 200 mm. Bij een dergelijke combinatie wordt tevens een gunstige, i.e. voldoende grote werkafstand bij de objectieflens 22 bereikt.

Als alternatief voor de CCD camera 12 zal bijvoorbeeld ook een CMOS camera kunnen worden gebruikt, of bijvoorbeeld een fotografische 30 plaat. Een CCD camera of CMOS camera heeft als voordeel dat de beelden elektronisch kunnen worden verwerkt, en zoals gezegd hebben zij een betere effectieve optische resolutie dan het menselijke oog.

Daartoe kan bijvoorbeeld de camera 12 zijn aangesloten op een computer met beeldverwerkings- en/of beeldherkenningsapparatuur en/of 35 software (niet weergegeven).

Opgemerkt wordt dat de in de figuur 1 getekende stralengang van de fluorescentiestraling, dat wil zeggen via de gedeeltelijk doorlatende spiegel 30 naar de camera 12, is gekozen vanwege de instellichtbron 36. Bij afwezigheid van de instellichtbron 36 zou de 40 camera ook op de plaats van deze instellichtbron 36 kunnen zijn 1 03 0 1 02 ._ - 13 - geplaatst, waardoor de gedeeltelijk doorlatende spiegel 30 in feite overbodig wordt. In de figuur 1 weergegeven fluorescentiemicroscoop 1 is echter een instellichtbron 36 opgenomen. Deze dient om met een voldoende hoeveelheid licht eenvoudig het substraat 24 in het 5 scherpstelvlak van fluorescentiemicroscoop 1 te kunnen plaatsen. De instellichtbron 36 zendt daartoe bijvoorbeeld wit licht of groen licht uit, met name licht dat door het emissiefilter 32, en uiteraard de dichroïtische spiegel 20 wordt doorgelaten. Derhalve hangt de kleur van het door de instellichtbron 36 uit te zenden licht af van 10 de kleur van het licht van de excitatielichtbron 14 alsmede die van het fluorescentielicht. Een en ander kan door de vakman eenvoudig worden gekozen. De instellichtbron 12 kan bijvoorbeeld wederom een LED-bron zijn, of ook een (halogeen) gloeilamp of (hoge druk) kwikdamplamp. Andere lichtbronnen zijn eveneens mogelijk. Met 15 voordeel wordt een LED-bron gebruikt, met als voordelen de mogelijkheid om snel om te kunnen schakelen, zodat een mechanische sluiter, draaibare spiegel of dergelijke niet nodig is, en tevens een lange levensduur, en een doelmatige belichting door hoge intrinsieke efficiëntie en een betrekkelijk smalle bandbreedte, zodat filters en 20 substraat relatief weinig vermogen hoeven te verwerken. Deze voordelen gelden overigens in principe evenzeer in het geval dat de excitatiebron een LED-bron omvat.

De instellens 38 dient voor het verkrijgen van een voldoende homogene lichtbundel, hetgeen gunstig is bij het scherpstellen.

25 Bovendien is het gunstig dat tijdens instellen, of ook wel uitlijnen genoemd, van het substraat 24 de eventueel aanwezige te onderzoeken materialen, met name gemarkeerde bacteriën niet worden gebleekt. Dit zou ongunstig zijn voor de daarna te verrichten fluorescentiemetingen. Om bleken te voorkomen wordt de 30 instellichtbron 36 slechts gebruikt bij instellen. Bovendien is het gunstig om een hoge verhouding te kiezen tussen lichtintensiteiten van excitatielicht en het licht van de instellichtbron 36 zoals dit op het substraat 24 komt. Bijvoorbeeld is met de hierboven beschreven LED-bronnen voor de excitatielichtbron 14 en de instellichtbron 36 35 eenvoudig een verhouding mogelijk tussen excitatielicht en uitlijnlicht van 2000:1. Optioneel kan tussen de gedeeltelijk doorlatende spiegel 30 en de instellens 38 nog een tweede emissiefilter geplaatst worden, dat in hoofdzaak kan overeenkomen met het emissiefilter 32. In een dergelijk geval kan eenvoudig een 40 verhouding van 10.000: 1 worden verkregen. Bij dergelijke 103 0 1 02 ! - 14 - verhoudingen kan betrouwbaar worden vermeden dat de te onderzoeken materialen worden gebleekt door het instellicht. Bovendien biedt het gebruik van vlakke, kleine substraten het voordeel dat slechts een gering aantal malen hoeft te worden scherp gesteld.

5 Een algemene opmerking ten aanzien van het gebruik van het woord "lens" is dat in alle gevallen deze lens ook een samengestelde lens kan zijn, dat wil zeggen met meerdere optische elementen. Bovendien kunnen in beginsel de posities van het emissiefilter 32 alsmede het excitatiefilter 18 ten opzicht van bijbehorende lenzen, 10 respectievelijk de afbeeldinglens 34 en de verlichtingslens 16, worden opgekeerd.

De beschreven uitvoeringsvormen dienen als niet - beperkende voorbeelden te worden beschouwd. De beschermingsomvang van de uitvinding wordt bepaald door de aangehechte conclusies.

1030102_

Claims (8)

1. Fluorescentiemicroscoop, omvattende een behuizing met een excitatielichtbron die is ingericht voor het uitzenden van excitatielicht, een filtermiddel dat excitatielicht scheidt van door een fluorescerende stof opgewekt fluorescentielicht, een objectlens, 5 een substraathouder, een plaatsgevoelige lichtdetector, en een afbeeldingslens voor de plaatsgevoelige lichtdetector, alsmede een substraat dat een wafer-gebaseerd filtermembraan uit in hoofdzaak silicium omvat, waarbij het filtermembraan een patroon van doorgaande gaatjes omvat. 10

2. Fluorescentiemicroscoop volgens conclusie 1, omvattende een scherpstelbijregelsysteem, dat is ingericht voor invoer van de instelafstand van het substraat op drie niet op een lijn liggende punten, waarbij het scherpstelbijregelsysteem daaruit een 15 scherpstelvlak bepaalt.

3. Fluorescentiemicroscoop volgens een der voorgaande conclusies, voorts omvattende een instelverlichtingssysteem met een instellichtbron die is ingericht voor uitzenden van instellicht, 20 waarbij een optisch pad van het instellicht en een optisch pad van het fluorescentielicht coaxiaal via de objectlens in de richting van het substraat verlopen.

4. Fluorescentiemicroscoop volgens conclusie 3, voorts omvattende 25 een voor instellicht gedeeltelijk doorlatende spiegel, die zodanig in een optisch pad van het instellicht is geplaatst, dat van het substraat komend licht naar de lichtdetector wordt gericht.

5. Fluorescentiemicroscoop volgens conclusie 3 of 4, voorts 30 omvattende een tussen de gedeeltelijk doorlatende spiegel en de instellichtbron geplaatst filter dat voor excitatielicht een lagere doorlaatbaarheid heeft dan voor fluorescentiestraling.

6. Werkwijze voor het detecteren van fluorescentie van een 35 preparaat op een substraat, onder gebruikmaking van een fluorescentiecamera volgens een der voorgaande conclusies, omvattende - het bestralen van het preparaat op het substraat met excitatielicht, 10 3 η λ o o - 16 - - het detecteren van fluorescentielicht van het preparaat.

7. Werkwijze volgens conclusie 6, waarbij de instellichtbron in hoofdzaak slechts instellicht uitzendt bij in focus brengen van het 5 preparaat.

8. Werkwijze volgens een van de conclusies 6-7, waarbij van een aantal deelgebieden van het preparaat op het substraat telkens de fluorescentie wordt gedetecteerd, vervolgens uit de in een deelgebied 10 gedetecteerde fluorescentie relevante beeldinformatie wordt bepaald, waarbij de deelgebieden willekeurig worden gekozen uit het preparaat, en waarbij wordt gestopt met bepalen van de fluorescentie indien de relevante beeldinformatie uit alle tot dan toe bepaalde deelgebieden samen een voorafbepaalde betrouwbaarheidsdrempel overschrijdt. 15 _1 @3 010 2_