JP2009505126A - 全反射顕微鏡検査用の顕微鏡および方法 - Google Patents

Abstract

エバネッセント照明用の少なくとも１つの光源（１）を備え、必要によっては照明光（５）用の調整ユニット（４）を備え、そして対物レンズ（６）を備える全反射顕微鏡検査用の顕微鏡であって、前記照明光（５）および検出光（１３）は、照明ビーム経路（１２）を介して前記対物レンズ（６）を通して導かれ、そして標本（８）または標本カバーの界面における好ましくは全反射された照明光（反射光）（９）が前記照明ビーム経路（１２）に戻る顕微鏡において、前記照明ビーム経路（１２）には、前記戻ってきた反射光（９）を前記照明ビーム経路から少なくとも部分的に分離するための手段（２）と、前記分離された反射光（９）を検出するための手段とが設けられること、および前記分離された反射光（９）の前記ビーム経路（１２）から、前記標本（８）に発生されている前記エバネッセント照明のおよび／またはエバネッセント場の定量化可能なおよび／または条件付け可能なパラメータを導出できることを特徴とする顕微鏡。

Description

本発明は、エバネッセント（一過性）照明用の少なくとも１つの光源を備え、必要によっては照明光用の調整ユニットを備え、そして対物レンズを備える全反射（全内反射）顕微鏡検査用の顕微鏡であって、照明光および検出光の両方が照明ビーム経路を介して対物レンズを通して導かれ、そして標本または標本カバーの界面における好ましくは全反射された照明光（反射光）が照明ビーム経路に戻る顕微鏡に関する。

さらに本発明は、エバネッセント照明が少なくとも１つの光源を介してもたらされ、照明光が、調整ユニットを介して対物レンズを通して標本に選択的に導かれ、照明光および検出光の両方が照明ビーム経路を介して対物レンズを通して導かれ、そして標本または標本カバーの界面における好ましくは全反射された照明光（反射光）が照明ビーム経路に戻る、全反射顕微鏡検査のための方法、特に本発明による顕微鏡に使用するための方法に関する。

全反射顕微鏡検査では、光が、光学的により高密度の媒体から、光学的により低密度の媒体に移行するときの光の屈折動作が利用される。このようにして、例えば、カバーガラス（ｎ１＝１．５１８）から水（ｎ２＝１．３３）への移行により、６１°の臨界角、すなわち全反射角が生じる。全反射状態（角度≧６１°）において、定在エバネッセント波が、より低い屈折率を有する媒体に形成される。この波の強度は、界面からの距離に対して指数関数的に低下する。このために、界面から離間して配置された蛍光体は励起されない。バックグラウンド蛍光は著しく低減される。この過程において、画像コントラストが改善され、それと同時に、分解能が著しく向上する。上記現象を利用するための要件は、カバーガラスの屈折率と媒体の屈折率との差が十分に大きいことである。

特許文献１は、標本のエバネッセント照明を有する顕微鏡を開示している。この顕微鏡は白色光源を備え、この白色光源の光は、エバネッセント照明目的のために、スリット開口部を介して顕微鏡対物レンズを通して標本スライドに結合される。照明光は、全反射により標本スライドに伝搬し、ここで、標本スライドから延びるエバネッセント場の領域の標本のみが照射される。この種の顕微鏡は、頭文字ＴＩＲＦＭ（全反射蛍光顕微鏡Total Internal Reflection Fluorescent Microscope）によって知られている。ＴＩＲＦ顕微鏡のＺ分解能は、エバネッセント場が、約１００ｎｍだけ標本に延びるという事実によって極めて優れている。

特許文献２は、特にＴＩＲＦ用途のための高開口数の対物レンズを開示している。この対物レンズは、正屈折力を有する第１のレンズと、負屈折力を有する第２のレンズとからなり、この場合、２つのレンズの焦点距離の比は−０．４〜−０．１の範囲内にあり、また全屈折力はゼロよりも大きい。さらに、対物レンズは２つの正レンズを備え、この２つの正レンズの直径と焦点距離との比は０．３よりも大きく、０．６よりも小さい。その上、対物レンズは負レンズとコレクタレンズとを備え、この場合、負レンズは前群に対面し、また負レンズとコレクタレンズとの焦点距離の比は−０．５〜−２である。

特許文献３は、ＴＩＲＦ顕微鏡検査用の入射照明アレイを開示している。この入射照明アレイは、作動中に、光軸に対してある角度で伝搬する偏光照明ビーム束を放射する照明源を含み、さらに、前記アレイは、照明ビーム束を偏向しかつ光軸に対して平行な対物レンズに前記照明ビーム束を結合する偏向装置を備える。この入射照明アレイについて、照明源により放射された照明ビーム束が、位相差を有するｓ偏光方向およびｐ偏光方向を有し、また偏向装置が、ｘ回（ここでｘ＝（ｎ×１８０−ｄ）／６０°）だけ、照明ビーム束を反射することが意図される。

特許文献４は、ＴＩＲＭ（全反射顕微鏡検査Total Internal Reflection Microscopy）用の顕微鏡を開示している。この顕微鏡はハウジングと対物レンズとを有する。顕微鏡ハウジングに摺動できるアダプタを使用して、照明装置により放射された照明光を結合できる。

特許文献５は、エバネッセント照明と反射照明との簡単な切り換えを可能にする光学照明システムを有する顕微鏡を開示している。この照明システムはレーザ光源を備え、このレーザ光源の光は光ファイバに結合される。さらに、顕微鏡対物レンズの後側焦点のファイバから来る光を集束する分離光学系が設けられる。顕微鏡対物レンズの光軸に対して垂直な面に、光ファイバを摺動できる。

特許文献６は、光を顕微鏡に結合するための装置を開示している。ここで、光フィールド開口面のスライダとして構成された光伝送ファイバにより、レーザ光が標本に導かれる。この発明はＴＩＲＦ法に特に適している。

走査顕微鏡検査では、標本に光ビームが照射されるので、標本により放射された検出光を反射光または蛍光として観察できる。照明光ビーム束の焦点は、制御可能なビーム偏向装置によって、通常、２つの鏡を傾斜させることによって標本面で移動され、ここで、偏向軸は通常互いに垂直であるので、一方の鏡はｘ方向に偏向するが、他方の鏡はｙ方向に偏向する。例えばガルバノメータ設定素子によって、鏡が傾斜される。物体から来る検出光の出力は、走査ビームの位置の関数として測定される。通常、設定素子には、鏡の現在位置を決定するためのセンサが設けられる。特に共焦点走査顕微鏡検査の場合、光ビームを集束して、物体が３次元走査される。

共焦点走査型顕微鏡は、一般に、光源、光源からの光をピンホール（いわゆる励振開口部）に集束する集光光学系、ビームスプリッタ、ビーム制御用のビーム偏向装置、顕微鏡光学系、検出開口部、および検出光または蛍光を検出するための検出器を備える。照明光は、ビームスプリッタによって結合される。物体から来る蛍光または反射光は、ビーム偏向装置を介してビームスプリッタに戻り、それに続いて、検出開口部の下流に検出器が配置される検出開口部に集束されるようにビームスプリッタを通過する。この検出構成はデスキャン構成と呼ばれる。集光領域から直接生じない検出光は、異なる光路を取り、また検出開口部を通過しないので、照明光ビーム束を集束して物体を順次走査することによって、３次元画像を発生させる位置情報が得られる。大部分の３次元画像は、重畳画像データを取得することによって得られる。

従来技術から公知の顕微鏡について、エバネッセント照明は、このような場合に使用される調整ユニットが常に１次元的に構成されているとしても、２次元の解決方法の範囲内において規則的に結合される。このようにして、例えば、いわゆる中間スプリッタによって、すなわち、光をある程度反射する、さもなければ光を伝達する鏡によって、結合が行われる。二色性スプリッタによる結合も知られている。この場合、前記二色性スプリッタは、１つの特定波長を除いて、他の全ての波長を反射する特殊な鏡である。他の公知の方法は、偏光スプリッタによる結合である。この場合、エバネッセント照明（ＴＩＲＦ照明）用のレーザ、および従来のエピ蛍光照明用のレーザは、互いに直交して偏光され、その次に組み合わされる。さらに、必要な放射源を結合するための１次元の方法としては、追加の小型鏡をエピ蛍光照明用の照明ビーム経路に使用することが既知である。

エバネッセント照明（ＴＩＲＦ照明）を実現するために、従来技術により、基本的に、照明光が対物レンズ側にまたはコンデンサ側に結合される。次に、エバネッセント照明によって発生された後方反射は、散乱光または寄生反射を回避するために、分離され、通常、光トラップに反射される。これまで、戻ってきた反射光は、実際に有害なものであり、したがって、「廃棄」されていた。

特許文献７は、レーザ保護のために照明光を利用する方法を既に開示している。このために、照明光が結合されたときに、光出力部は分離され、それに続いて、検出器に反射される。同様に、光出力部は、分離領域内に反射され、その次に、検出器に集束される。強度比が一定の値未満に低下した場合、結合された照明光、通常、結合されたレーザの照明光の光源は、特にこのために設けられた保護装置によって遮断される。

従来技術から公知の全反射顕微鏡検査用の顕微鏡および方法は、ビームが回転対称的に導かれたときに、標本に発生されているエバネッセント場について実現すべき侵入深さを定量的に決定できない限りにおいては不利である。このことは、試験すべき標本の通常認識されていない屈折率に起因する。標本の屈折率が認識されている場合、標本に対するエバネッセント照明光ビームの認識されている屈折率および入射角から、侵入深さを周知の方法で算出できる。種々の標本が試験されている場合、種々の屈折率に遭遇するので、全反射角を算出できない。したがって、エバネッセント照明の自動設定が不可能になるであろう。ビームが非回転対称的に導かれたときに、ＴＩＲＦ照明の均一に回転対称的な放射がほとんど不可能である。

ＵＳ ２００２／００９７４８９ Ａ１ ＤＥ １０１０８７９６ Ａ１ ＤＥ １０２１７０９８ Ａ１ ＤＥ １０１４３４８１ Ａ１ ＵＳ ２００４／０００１２５３ Ａ１ ＤＥ １０２２９９３５ Ａ１ ＤＥ １０３０９２６９ Ａ１

本発明は、全反射顕微鏡検査用の顕微鏡と、ビームが回転対称的に導かれたときにエバネッセント照明を自動的に設定することが可能である対応する方法とを提供することを目的とする。

上記目的は、本発明による顕微鏡によれば、請求項１に記載の特徴によって達成される。この請求項によれば、一般的な顕微鏡は、戻ってきた反射光を照明ビーム経路から少なくとも部分的に分離するための手段と、分離された反射光を検出するための手段とが照明ビーム経路に設けられることと、分離された反射光のビーム経路から、標本に発生されているエバネッセント照明のおよび／またはエバネッセント場の定量化可能なおよび／または条件付け可能なパラメータを導出できることを特徴とする。

上記目的は、本発明による方法によれば、請求項１６に記載の特徴によって達成される。この請求項によれば、一般的な方法は、照明ビーム経路において、戻ってきた反射光が照明ビーム経路から少なくとも部分的に分離され、その次に検出されることと、分離された反射光のビーム経路から、標本に発生されているエバネッセント照明のおよび／またはエバネッセント場の定量化可能なおよび／または条件付け可能なパラメータを導出できることを特徴とする。

本発明によれば、エバネッセント照明を自動的に設定するために、標本の、標本ガラスのおよび／または標本カバーの、すなわち、試験すべき物体の屈折率を認識することが絶対必要であることが理解される。これに関連して、エバネッセント照明の自動設定が、標本のエバネッセント場の定量化可能な侵入深さに合わせられることに留意されたい。特に、標本におけるまたは栄養液における変化について、再現可能な設定を可能にすべきであり、このために、屈折率を認識する必要がある。

本発明によれば、顕微鏡は集積装置を備え、この集積装置によって、従来のＴＩＲＦ構成で標本の屈折率を解明でき、またこの屈折率から、必要な特性に関する情報を導出でき、この後に、操作または設定を自動化できる。

さらに、本発明によれば、自動操作のために、エバネッセント場の侵入深さを定量的に測定でき、したがって設定できるようにする必要があることが理解される。標本の屈折率が認識されると、その屈折率からまた照明光ビームの入射角から、侵入深さを算出できる。

具体的には、本発明による顕微鏡において、実際に有害な反射光は、照明ビーム経路から、すなわち完全に、さもなければ少なくとも部分的に分離される。分離された反射光は検出手段に送られ、この後に、分離された反射光のビーム経路から、標本に発生されているエバネッセント照明のおよび／またはエバネッセント場の定量化可能なおよび／または条件付け可能なパラメータを導出できる。

この場合、検討中のパラメータは、対物レンズの入射瞳における照明光ビームの位置に関する情報を含む。さらに、パラメータにより、標本の界面への照明光ビームの入射角に関する結論を引き出すことが可能になる。既述のように、パラメータを用いて、標本の屈折率を算出し、次に、この屈折率から、付加情報を導出できる。

さらに、分離された反射光が検出手段に有利に集束されることに留意されたい。

極めて有利な方法では、反射光を分離するための手段は反射光の形態に合わせられ、この場合、具体的には、その手段を反射光の２次元形態に合わせることができる。構造について、反射光を照明光から空間的に分離するための手段が、既存の構成要素、すなわち、例えばＸＹスキャナを備えることが可能である。次に、このＸＹスキャナは、その実際の走査機能に加えて、光軸に反射された反射光を反射ビーム経路に偏向するように機能し、この結果、反射光は入射照明光から分離される。ここで、分離された反射光が検出手段に送られる。

簡単な構造において、反射光を分離するための手段は鏡であり得る。

分離された反射光を検出するための上記手段には、位置分解能を有する検出器が有利に設けられるので、対物レンズの入射瞳における照明光ビームの位置に関する情報を得ることが可能である。検出器をＣＣＤ（電荷結合素子）として構成できる。同様に、検出器を位置分割フォトダイオード（ＰＳＤ、位置感受素子）として構成することが可能である。その代わりに、分離された反射光を検出するための手段が、光源を位置決めするための調整ユニットの照明ビーム経路に配置された従来の検出器およびセンサの組み合わせを含むことが可能であり、この結果、定量的情報および位置特定情報をさらに得ることができる。この場合、検出器をフォトダイオードとして構成できる。

基本的に、反射光を分離および検出するための手段の配置を非対称的に構成することが可能である。光軸を中心とする回転対称的な形態が有利であるが、この理由は、特に、結合された照明光または結合された照明光ビームが対応して方向転換するからである。

エバネッセント照明光に関して、この光は、コンデンサ結合またはプリズム結合によって結合することもできることに留意されたい。エバネッセント照明光を結合するための任意の所望の方法が可能である。

本発明による方法に関して、本発明による顕微鏡に関する方法を有利に用いることができることが不可欠である。このために、照明ビーム経路の戻ってきた反射光は、上記説明によれば、照明ビーム経路から少なくとも部分的に分離され、またこのように発生された追加のビーム経路で検出される。標本に発生されているエバネッセント照明のおよび／またはエバネッセント場の定量化可能なおよび／または条件付け可能なパラメータは、分離された反射光のビーム経路から導出される。ここで、再説を回避するために、上記説明を参照されたい。

さらに、パラメータが解明される前に、調整ユニットを較正することが不可欠である。調整ユニットを較正するために、既知の屈折率を有する標本が使用されて、適切に照射される。

調整ユニットにより、照明ビームが高開口数から低開口数の方向に移動され、この結果、反射光の強度および位置を検出できる。全反射角に達する直前に、検出器で測定される強度は１００％である。全反射角を超えた直後に、強度は０％に低下する。これに基づいて、すなわち上記移行によって、全反射位置を決定できる。

既述のように、標本の既知の屈折率から、全反射角を算出できる。調整ユニットが較正されると、入射角は、全反射位置に基づいて算出される。

既知の屈折率を有する標本について、エバネッセント場の侵入深さを定量的に決定できる。したがって、既知の屈折率を有する標本について、好ましくはエバネッセント場の所望の侵入深さに対する見解によって、エバネッセント照明を意図するように、さらに好ましくは自動操作で設定できる。

認識されていない屈折率を有する標本について、上記説明の範囲内において、屈折率を解明または測定できる。このために、上記説明に従って、標本が照射され、また全反射位置が解明される。調整ユニットが較正されると、その位置から、全反射角を算出でき、またその角度から、標本の屈折率を算出できる。屈折率が決定されると、特にエバネッセント場の所望の侵入深さに対する見解によって、照明をさらに特に自動的に設定できる。

本発明の原理を有利に形成しまた発展させるための種々の方法が存在する。このために、本明細書において、一方では、請求項１と請求項１９とに従属する請求項を参照されたい。他方、図面を参照して、本発明の好ましい実施形態について以下に説明する。概して、図面を参照しつつ、本発明の好ましい実施形態の説明により、本原理の好ましい実施形態および改良形態について説明する。図面は以下のようなものを示している。

したがって、図は、全反射顕微鏡検査用の本質的な構成要素を備える本発明による顕微鏡の概略構成を示している。顕微鏡はエバネッセント照明用の光源１を備える。この光源はレーザ光源であることが好ましい。

さらに、孔と調整ユニット４とを有する鏡２が設けられ、この場合、調整ユニット４、例えばＸＹスキャナは、例えば照明光ビームを偏向するように機能するステッピングモータを備えることができる。鏡の孔は、鏡２の当該位置の照明光ビーム５の直径とほぼ同一の大きさである。鏡２は、対物レンズ瞳１１の面に対して共役な面３にまたはその近傍に配置される。照明光は照明ビーム経路１２を介して調整ユニット４を介して対物レンズ６に達する。照明光ビームは、全反射角において、対物レンズとは反対側で透明標本スライド７によって保持される物体８に当たるように対物レンズ６を通して導かれる。全反射状態において、定在エバネッセント波が標本に発生され、前記波の強度は、界面までの距離の関数として指数関数的に低下する。標本は検出光１３を放射する。反射光９は標本スライドから反射する。

本図において、照明光５および検出光１３が照明ビーム経路１２を介して対物レンズ６を通して導かれ、この場合、物体８のあるいは標本または標本カバーの界面において、全反射照明光、すなわち反射光９が、照明ビーム経路１２に戻り、調整ユニット４を介して導かれることも理解できる。

本発明によれば、戻ってきた反射光９を照明ビーム経路１２から分離するための孔１４を有する鏡２が、照明ビーム経路１２に設けられる。全反射中に反射光９をオフセットすることによって、反射光は光源１と調整ユニット４との間の照明光の同一のビーム経路にはもはや当たらない。結果として、反射光は鏡の孔には当たらず、戻りビーム経路に面する鏡２の表面に当たり、その次に、検出器１０に導かれるので、標本に発生されているエバネッセント照明のおよび／またはエバネッセント場の定量化可能なおよび／または条件付け可能なパラメータを反射光９から導出できる。このために、位置分解能を有する検出器が機能することが必要であるか、さもなければ、他の検出装置を調整ユニット４に関連付ける必要がある。

本図によれば、エバネッセント照明、言い換えれば、ＴＩＲＦ照明を発生させるために、通常の照明光源、すなわち、エバネッセント照明目的のために示されている単一の光源１に加えて、追加の光源をビーム経路に結合する必要があることに留意されたい。次に、エバネッセント場を標本８に発生させるために、エバネッセント照明が、対物レンズ６によって発生される。標本８の界面の全反射状態において、照明光５は、入口とは正反対の側の位置に再び現れ、その次に、光軸に対して対称的に僅かにオフセットされるようにビーム経路を逆方向に移動する。反射光９として示されている、戻ってきた光ビームは、部分的または完全に反射または分離されて、検出器１０に集束される。物体５の入射瞳における照明光ビームの位置に関する情報が得られ、またこの情報に基づいて、界面への入射角を導出できるように、全ビーム経路が構成される。このために必要な構成は、上記に総合的に詳述されているように、遮断されたビーム経路に、位置分解能を有する検出器を備えることができる。同様に、照明光ビームを位置決めするために、調整ユニット４において、検出器、例えばフォトダイオードと他のセンサとの組み合わせを実行することが可能である。

本図に示されている構成は、光軸を中心に回転対称的に構成されることができるが、非回転対称的な構成も考慮できかつ実行できる。

さらに、エバネッセント照明を結合するための任意の所望の方法のために、屈折率を測定するための方法を用いることができることが不可欠である。コンデンサ結合またはプリズム結合ついては既に上述してある。

関連するパラメータの決定に関して、本図によれば、調整ユニット４が第１のステップで較正されることに留意されたい。このために、既知の屈折率を有する標本８は顕微鏡の下方に配置され照射される。引き続き、好ましくは自動の調整ユニット４を使用して、照明光５が高開口数から低開口数の方向に移動される。個々の強度および位置は、特に適切な検出器を使用して上記構成に基づき解明される。全反射角に達する直前に、検出器の測定強度は依然として１００％である。全反射角を超えた直後に、強度は０％である。移行に基づいて、全反射位置を決定できる。屈折率が認識されている場合に、全反射角を算出できる。それに応じて、調整ユニット４を較正でき、またその位置から、入射角に関する結論を引き出すことができる。

したがって、既知の屈折率を有する標本の場合、エバネッセント照明を自動的に設定することが可能であり、その次に、これにより、エバネッセント場の関連する侵入深さが得られる。

認識されていない屈折率を有する標本の場合、この屈折率の値を最初に解明または測定する必要がある。このために、標本８が照射され、ここで、上記方法によって、全反射中の位置を解明できる。較正された調整ユニット４が使用された場合、その位置から、角度を直接算出でき、またその角度から、屈折率を算出できる。ここで認識された屈折率に基づいて、同種の次の標本について、エバネッセント照明を自動的に設定でき、その次に、エバネッセント場の侵入深さを定量的に決定できる。

ここで、本図から確認できない特徴に関しては、再説を回避するために、一般的な説明と特許請求の範囲とを参照されたい。

最後に、本実施形態の原理を限定することなく、主張される原理を説明するために、上記に詳述されている実施形態が用いられているに過ぎないことに留意されたい。

本発明に関連する特徴のみを示す、本発明に係る方法を説明するための本発明に係る顕微鏡の基本構成の概略図である。

符号の説明

１ 光源
２ 鏡
３ 共役な対物レンズ瞳面
４ 調整ユニット（例えばＸＹスキャナ）
５ 照明光
６ 対物レンズ
７ 標本スライド
８ 標本
９ 反射光
１０ 検出器
１１ 対物レンズ瞳面
１２ 照明ビーム経路
１３ 検出光
１４ 鏡の孔

Claims (31)

1. エバネッセント照明用の少なくとも１つの光源（１）を備え、必要によっては照明光（５）用の調整ユニット（４）を備え、そして対物レンズ（６）を備える全反射顕微鏡検査用の顕微鏡であって、前記照明光（５）および検出光（１３）の両方が、照明ビーム経路（１２）を介して前記対物レンズ（６）を通して導かれ、そして標本（８）または標本カバーの界面における好ましくは全反射された照明光（反射光）（９）が前記照明ビーム経路（１２）に戻る顕微鏡において、
   前記照明ビーム経路（１２）には、前記戻ってきた反射光（９）を前記照明ビーム経路から少なくとも部分的に分離するための手段（２）と、前記分離された反射光（９）を検出するための手段とが設けられること、および
   前記分離された反射光（９）の前記ビーム経路（１２）から、前記標本（８）に発生されている前記エバネッセント照明のおよび／またはエバネッセント場の定量化可能なおよび／または条件付け可能なパラメータを導出できること
   を特徴とする顕微鏡。
2. 前記分離手段（２）が２つの領域を有し、第１の領域（１４）により、前記照明光が通過時に結合され、第２の領域により、前記反射光（９）が前記照明ビーム経路（１２）から少なくとも部分的に分離されることを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡。
3. 前記分離手段（２）が２つの領域を有し、第１の領域（１４）により、前記照明光が通過時に結合され、第２の領域により、前記反射光（９）が少なくとも部分的に検出されるかまたは検出器に送られることを特徴とする請求項１または２に記載の顕微鏡。
4. 前記分離手段（２）が、対物レンズ瞳（１１）の面に対して共役な面（３）にまたは該共役な面の近傍に配置されることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の顕微鏡。
5. 前記パラメータが、前記対物レンズ（６）の入射瞳における照明ビームの位置に関する情報を含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の顕微鏡。
6. 前記パラメータにより、前記界面への前記照明ビームの入射角に関する結論を引き出すことが可能になることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の顕微鏡。
7. 前記パラメータが、前記標本（８）の屈折率を算出するために用いられることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の顕微鏡。
8. 前記分離された反射光（９）が前記検出手段に集束されることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の顕微鏡。
9. 前記反射光（９）の分離手段が前記反射光（９）の形態に合わせられることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の顕微鏡。
10. 前記反射光（９）の分離手段が前記反射光（９）の２次元形態に合わせられることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の顕微鏡。
11. 前記反射光（９）の分離手段が鏡を備えることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の顕微鏡。
12. 前記分離された反射光（９）の検出手段が、位置分解能を有する検出器（１０）を備えることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項に記載の顕微鏡。
13. 前記検出器（１０）がＣＣＤ（電荷結合素子）として構成されることを特徴とする請求項１２に記載の顕微鏡。
14. 前記検出器（１０）が位置分割フォトダイオード（ＰＳＤ、位置感受素子）として構成されることを特徴とする請求項９に記載の顕微鏡。
15. 前記分離された反射光（９）の検出手段が、前記光源（１）を位置決めするための前記調整ユニット（４）での前記照明ビーム経路（１２）に配置されたセンサと検出器の組み合わせを含むことを特徴とする請求項１〜１４のいずれか１項に記載の顕微鏡。
16. 前記検出器がフォトダイオードとして構成されることを特徴とする請求項１〜１５のいずれか１項に記載の顕微鏡。
17. 前記反射光（９）の分離手段および前記反射光（９）の検出手段の構成が、光軸を中心とする回転対称に形成されることを特徴とする請求項１〜１６のいずれか１項に記載の顕微鏡。
18. コンデンサ結合またはプリズム結合によって、前記エバネッセント照明光（５）を前記照明ビーム経路（１２）に結合できることを特徴とする請求項１〜１７のいずれか１項に記載の顕微鏡。
19. エバネッセント照明が少なくとも１つの光源（１）を介してもたらされ、照明光（５）が、調整ユニット（４）を介して対物レンズ（６）を通して標本に必要に応じて導かれ、前記照明光（５）および検出光（１３）の両方が照明ビーム経路（１２）を介して前記対物レンズ（６）を通して導かれ、そして標本（８）または標本カバーの界面において好ましくは全反射された照明光（反射光）（９）が前記照明ビーム経路（１２）に戻る、全反射顕微鏡検査のための方法、特に請求項１〜１５のいずれか１項に記載の顕微鏡に使用するための方法であって、
    前記照明ビーム経路（１２）にて、前記戻ってきた反射光（９）が、前記照明ビーム経路（１２）から少なくとも部分的に分離され、検出されること、および
    前記標本（８）に発生されている前記エバネッセント照明のおよび／またはエバネッセント場の定量化可能なおよび／または条件付け可能なパラメータが、前記分離された反射光（９）の前記ビーム経路（１２）から導出されることを特徴とする方法。
20. 前記パラメータが確認される前に、前記調整ユニット（４）が較正されることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
21. 前記調整ユニット（４）を較正するために、既知の屈折率を有する標本（８）が照射されることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
22. 前記調整ユニット（４）により、照明ビームが高開口数から低開口数の方向に移動させられ、その結果、前記反射光（９）の強度および位置が検出されることを特徴とする請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の方法。
23. 全反射角に達する直前に、前記検出器（１０）で測定される強度が１００％であり、前記全反射角を超えた直後に、前記強度が０％に低下する請求項２１に記載の方法であって、全反射位置が、これに基づいて決定されることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
24. 前記全反射角が、前記標本（８）の前記既知の屈折率から算出されることを特徴とする請求項１７〜２３のいずれか１項に記載の方法。
25. 前記調整ユニット（４）が較正されると、入射角が、前記全反射の位置に基づいて算出されることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
26. 既知の屈折率を有する標本（８）について、前記エバネッセント場の侵入深さが定量的に決定されることを特徴とする請求項１９〜２５のいずれか１項に記載の方法。
27. 既知の屈折率を有する標本（８）について、好ましくは前記エバネッセント場の所望の侵入深さを考慮して、前記エバネッセント照明が好ましくは自動的に設定されることを特徴とする請求項１９〜２６のいずれか１項に記載の方法。
28. 認識されていない屈折率を有する標本（８）について、前記認識されていない屈折率が確認または測定されることを特徴とする請求項１７〜２３のいずれか１項に記載の方法。
29. 前記標本（８）が照射され、前記全反射位置が確認されることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
30. 前記調整ユニット（４）が較正されると、前記全反射角が前記位置から算出され、前記標本（８）の前記屈折率が前記角度から算出されることを特徴とする請求項２６に記載の方法。
31. 前記屈折率が確認されると、好ましくは前記エバネッセント場の所望の侵入深さを考慮して、前記エバネッセント照明が好ましくは自動的に設定されることを特徴とする請求項２７に記載の方法。

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