DE102018126011A1

DE102018126011A1 - Verfahren zur Bestimmung des Brechungsindex eines optischen Mediums in einem Mikroskop und Mikroskop

Info

Publication number: DE102018126011A1
Application number: DE102018126011.3A
Authority: DE
Inventors: Christian Schumann
Original assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Current assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date: 2018-10-19
Filing date: 2018-10-19
Publication date: 2020-04-23
Also published as: WO2020079216A1

Abstract

Ein Verfahren zur Bestimmung des Brechungsindex eines optischen Mediums (26) in einem Mikroskop (10, 74), das ein einem Probenraum (14) zugewandtes Objektiv (12) aufweist, wobei das optische Medium (26) eine teilreflektierende Grenzfläche bildet, und wobei zeitlich aufeinanderfolgend wenigstens ein erstes Messlichtbündel (35a) und ein zweites Messlichtbündel (35b) erzeugt werden, wobei das erste Messlichtbündel (35a) und das zweite Messlichtbündel (35b) voneinander verschiedene Polarisationszustände aufweisen, das erste Messlichtbündel (35a) und das zweite Messlichtbündel (35b) jeweils durch das Objektiv (12) unter schrägem Einfall auf das Deckglas (24) gelenkt werden, zwei Reflexionslichtbündel (54a, 54b) erzeugt werden, indem das erste Messlichtbündel (35a) und das zweite Messlichtbündel (35b) jeweils zum Teil an der Grenzfläche reflektiert werden, das erste Reflexionslichtbündel und das zweite Reflexionslichtbündel (54a, 54b) jeweils durch das Objektiv (12) empfangen und auf einen Detektor (60) gelenkt werden, die Intensitäten des ersten Reflexionslichtbündels (54a) und des zweiten Reflexionslichtbündels (54b) mittels des Detektors (60) erfasst werden, und auf Grundlage der erfassten Intensitäten des ersten Reflexionslichtbündels (54a) und des zweiten Reflexionslichtbündels (54b) der Brechungsindex des optischen Mediums ermittelt wird.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des Brechungsindex eines optischen Mediums in einem Mikroskop, das ein einem Probenraum zugewandtes Objektiv aufweist, wobei das optische Medium mit dem zu bestimmenden Brechungsindex in dem Probenraum an eine von zwei entgegengesetzte Oberflächen eines Deckglases grenzt und dadurch eine teilreflektierende Grenzfläche bildet. Der Erfindung betrifft ferner ein Mikroskop mit einer Einrichtung zur Bestimmung des Brechungsindex des optischen Mediums.
Die lichtmikroskopische Abbildung einer Probe wird durch die verschiedenen optischen Medien beeinflusst, die in einem Probenraum eines Mikroskops aneinandergrenzen. Diese optischen Medien bilden infolge ihrer unterschiedlichen Brechungsindizes Grenzflächen, an denen sich der Brechungsindex sprunghaft ändert. Jede dieser Grenzflächen wirkt sich abhängig davon, wie groß der Sprung des Brechungsindex dort ist, unterschiedlich auf die optische Abbildung aus. Insbesondere die sphärische Aberration wird durch die sprunghafte Variation des Brechungsindex signifikant beeinflusst. Zu den die Abbildung beeinflussenden optischen Medien zählen üblicherweise ein Deckglas sowie die beiden optischen Medien, die von entgegengesetzten Seiten her an das Deckglas grenzen. Letztere sind beispielsweise durch ein Immersionsmedium, das sich zwischen dem Deckglas und dem Objektiv befindet, und ein die Probe umgebendes Einbettmedium gebildet.
Um eine wirksame Korrektion der Abbildungsfehler, die durch eine sprunghafte Variation des Brechungsindex beeinflusst werden, zu ermöglichen, ist es wichtig, die Brechungsindizes der verwendeten optischen Medien zu kennen. Dabei sind häufig die Brechungsindizes des Deckglases und des Immersionsmediums von Vorneherein mit hoher Genauigkeit bekannt. Dies gilt jedoch nicht für den Brechungsindex des die Probe umgebenden Einbettmediums. Dieser Brechungsindex sollte deshalb in einer eigens hierfür vorgesehenen Messung außerhalb oder innerhalb des Mikroskops ermittelt werden.
Eine Messung des Brechungsindex außerhalb des Mikroskops ist mit der Unwägbarkeit einer nach der Messung erfolgenden Probenpräparation verbunden. Eine Korrelation des außerhalb des Mikroskops gewonnenen Messwertes mit dem in der lichtmikroskopischen Abbildung tatsächlich wirksamen Brechungsindex kann nicht sichergestellt werden. So wird in manchen Anwendungen, z. B. in der Lebendzellmikroskopie, der Brechungsindex des Einbettmediums signifikant von der Probe beeinflusst und ist somit außerhalb der mikroskopischen Präparation gar nicht mit hinreichender Genauigkeit messbar.
DE 10 2006 021 996 A1 offenbart ein Mikroskop zur internen Totalreflexionsmikroskopie, kurz TIRF, das eine Bestimmung des Brechungsindex innerhalb des Mikroskops ermöglicht. Dieses TIRF-Mikroskop umfasst ein Objektiv, durch das die Probe mit einer evaneszenten Beleuchtung beaufschlagt wird. Das an der Probe totalreflektierte Beleuchtungslicht wird mittels eines Detektors erfasst. Anhand des Übergangs, an dem die Intensität des an der Probe reflektierten Beleuchtungslichts von einem maximalen Wert auf null abfällt, wird der Einfallswinkel der Totalreflexion bestimmt. Auf Basis des Einfallswinkels wird dann der Brechungsindex ermittelt. Eine derartige Bestimmung des Brechungsindex erfordert jedoch ein Immersionsobjektiv mit hoher numerischer Apertur, um die Probe unter Totalreflexion beleuchten zu können. Ein solches Objektiv ist aufwändig zu fertigen und somit teuer.
Zum Stand der Technik wird ferner auf DE 10 2010 030 430 A1 verwiesen, worin eine triangulierende Autofokuseinrichtung für ein Mikroskop offenbart ist. Diese Autofokuseinrichtung erzeugt ein Spaltbild auf der Probe, das auf einen positionssensitiven Detektor abgebildet wird. Über die durch den Detektor erfasste Einfallsposition wird der Autofokus gesteuert.
Es ist Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Bestimmung des Brechungsindex eines optischen Mediums in einem Mikroskop und ein Mikroskop anzugeben, die eine einfache und präzise Bestimmung des Brechungsindex eines optischen Mediums ermöglichen.
Diese Aufgabe wird durch das Verfahren nach Anspruch 1 und das Mikroskop nach Anspruch 7 gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen sind in den abhängigen Ansprüchen angegeben.
Das erfindungsgemäße Verfahren dient zur Bestimmung des Brechungsindex eines optischen Mediums in einem Mikroskop, das ein einem Probenraum zugewandtes Objektiv aufweist, wobei das optische Medium mit dem zu bestimmenden Brechungsindex in dem Probenraum an eine von zwei entgegengesetzte Oberflächen eines Deckglases grenzt und dadurch eine teilreflektierende Grenzfläche bildet. Bei dem Verfahren wird zeitlich aufeinanderfolgend wenigstens ein erstes Messlichtbündel und ein zweites Messlichtbündel erzeugt, wobei das erste Messlichtbündel und das zweite Messlichtbündel voneinander verschiedene Polarisationszustände aufweisen. Das erste Messlichtbündel und das zweite Messlichtbündel werden jeweils durch das Objektiv unter schrägem Einfall auf das Deckglas gelenkt. Es werden zwei Reflexionslichtbündel erzeugt, indem das erste Messlichtbündel und das zweite Messlichtbündel jeweils zum Teil an der Grenzfläche reflektiert werden. Das erste Reflexionslichtbündel und das zweite Reflexionslichtbündel werden jeweils durch das Objektiv empfangen und auf einen Detektor gelenkt. Die Intensitäten des ersten Reflexionslichtbündels und des zweiten Reflexionslichtbündels werden mittels des Detektors erfasst. Auf Grundlage der erfassten Intensitäten des ersten Reflexionslichtbündels und des zweiten Reflexionslichtbündels wird der Brechungsindex des optischen Mediums ermittelt.
Die Intensitäten des ersten Reflexionslichtbündels und des zweiten Reflexionslichtbündels hängen von der Reflexion und der Transmission des ersten Messlichtbündels bzw. des zweiten Messlichtbündels an der Grenzfläche ab, die durch das Deckglas und das optische Medium definiert sind. Die Reflexions- und Transmissionsvorgänge, auf denen letztlich die Intensitäten der beiden zeitlich aufeinanderfolgenden Reflexionslichtbündel beruhen, werden wesentlich durch die Brechungsindizes des Deckglases sowie des an das Deckglas grenzenden optischen Mediums und den jeweiligen Polarisationszustand des ersten Messlichtbündels bzw. des zweiten Messlichtbündels bestimmt. Ist der Brechungsindex des Deckglases sowie der Polarisationszustand des ersten bzw. zweiten Messlichtbündels bekannt, lässt sich der Brechungsindex des optischen Mediums zuverlässig aus den durch den Detektor erfassten Intensitäten bestimmen.
Insbesondere erfordert das erfindungsgemäße Verfahren nur eine einzige teilreflektierende Grenzfläche. Dies ist besonders dann von Vorteil, wenn durch die Oberflächen des Deckglases nur eine Grenzfläche gebildet wird, weil beispielsweise der Brechzahlsprung zwischen dem Deckglas und einem zwischen dem Deckglas und dem Objektiv eingebrachten Immersionsöl zu gering ist. Ist der Brechzahlsprung zu gering, werden Reflexionen gegenüber Transmissionen unterdrückt, so dass es nicht möglich ist, an dieser Grenzfläche das erste Messlichtbündel bzw. das zweite Messlichtbündel zu erzeugen. Geringe Brechzahlsprünge, die nicht zu messbaren Reflektionen führen, sind andererseits aber auch keine Quelle für sphärische Aberration und daher irrelevant für die Abbildungsqualität.
Die Erfindung ermöglicht eine einfache und präzise Bestimmung des Brechungsindex eines optischen Mediums innerhalb des Mikroskops. Dies kann gewinnbringend zur Einstellung weiterer Mikroskop-Parameter genutzt werden. Insbesondere ermöglicht die Erfindung eine Automatisierung einer am Mikroskopobjektiv vorgesehenen Korrektionseinsteinstellung für unterschiedliche Einbettmedien, indem beispielsweise eine in dem Mikroskopobjektiv enthaltende Korrekturlinse in Abhängigkeit des ermittelten Brechungsindex automatisch angesteuert wird. Auch ist es möglich, eine Modellierung einer Punktspreizfunktion im Rahmen einer Dekonvolution in Abhängigkeit des ermittelten Brechungsindex vorzunehmen.
In einer vorteilhaften Weiterbildung wird der Brechungsindex des optischen Mediums in Abhängigkeit des Brechungsindex des Deckglases und der numerischen Apertur des ersten Messlichtbündels und des zweiten Messlichtbündels ermittelt. Dabei können die numerische Apertur des ersten Messlichtbündels und des zweiten Messlichtbündels über die Brennweite des Objektivs und die Position des Messlichtbündels in der Objektivpupille bestimmt werden.
Die Reflexions- und Transmissionsgrade, die Brechungsindizes des Deckglases und des optischen Mediums, die numerische Apertur des ersten Messlichtbündels bzw. des zweiten Messlichtbündels und der Polarisationszustand des ersten Messlichtbündels bzw. des zweiten Messlichtbündels sind über die fresnelschen Formeln miteinander verknüpft. Die Reflexions- und Transmissionsgrade lassen sich auf Basis der Intensitäten der beiden zeitlich aufeinanderfolgenden Reflexionslichtbündel bestimmen. Sind der Brechungsindex des Deckglases, die numerische Apertur des ersten Messlichtbündels bzw. des zweiten Messlichtbündels und der Polarisationszustand des ersten Messlichtbündels bzw. des zweiten Messlichtbündels bekannt, so kann der Brechungsindex des optischen Mediums über die fresnelschen Formeln einfach berechnet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Brechungsindex des optischen Mediums auf Grundlage des Verhältnisses der Intensitäten des ersten Reflexionslichtbündels und des zweiten Reflexionslichtbündels ermittelt. Dadurch ist die erfindungsgemäße Messung des Brechungsindex gleichsam selbstreferentiell. Dies bedeutet, dass der Brechungsindex unabhängig von der Intensität des ersten Messlichtbündels bzw. zweiten Messlichtbündels bestimmt werden kann, d.h. keine Kenntnis dieser Intensität erforderlich ist.
In einer vorteilhaften Weiterbildung wird zeitlich auf das erste Messlichtbündel oder das zweite Messlichtbündel ein drittes Messlichtbündel erzeugt, das einen von dem ersten Messlichtbündel und zweiten Messlichtbündel verschiedenen Polarisationszustand aufweist. Das dritte Messlichtbündel wird durch das Objektiv unter schrägem Einfall auf das Deckglas gelenkt. Es wird ein drittes Reflexionslichtbündel erzeugt, indem das dritte Messlichtbündel zum Teil an der Grenzfläche reflektiert wird. Das dritte Reflexionslichtbündel wird durch das Objektiv empfangen und auf den Detektor gelenkt. Die Intensität des dritten Reflexionslichtbündels wird mittels des positionssensitiven Detektors erfasst. Auf Grundlage der erfassten Intensitäten des ersten bis dritten Reflexionslichtbündels wird der Brechungsindex des optischen Mediums als komplexe Zahl ermittelt. Dabei ist der komplexe Anteil des als komplexe Zahl geschriebenen Brechungsindex des optischen Mediums ein Maß für die Absorption von Licht durch das optische Medium ist. Für den Fall, dass die Intensitäten des ersten bis dritten Reflexionslichtbündels erfasst werden, kann aus daraus der Brechungsindex des optischen Mediums als komplexe Zahl bestimmt werden, während für den Fall, dass nur die Intensitäten von zwei der drei Reflexionslichtbündel erfasst werden, nur der Betrag des Brechungsindex bestimmt werden kann.
Vorzugsweise werden das erste Messlichtbündel, zweite Messlichtbündel und/oder dritte Messlichtbündel in einen Teilbereich einer Eintrittspupille des Objektivs geleitet, der gegenüber der Mitte der Eintrittspupille versetzt ist. Auf diese Weise wird die Eintrittspupille des Objektivs durch das erste Messlichtbündel, zweite Messlichtbündel und/oder dritte Messlichtbündel dezentral unterleuchtet, wodurch das erste Messlichtbündel, zweite Messlichtbündel bzw. dritte Messlichtbündel beim Austritt aus dem Objektiv schräg zu dessen optischer Achse gestellt werden. Hierdurch wird ferner jeweils eine Einfallsebene des ersten Messlichtbündels, zweiten Messlichtbündels bzw. dritten Messlichtbündels definiert, relativ zu welcher der Polarisationszustand des jeweiligen Messlichtbündels definiert wird. Das erste Reflexionslichtbündel, zweite Reflexionslichtbündel und/oder dritte Reflexionslichtbündel werden dann vorzugsweise so zurück in das Objektiv geleitet, dass sie in der der Ausbreitungsrichtung des ersten Messlichtbündels, zweiten Messlichtbündels und/oder dritten Messlichtbündels entgegengesetzten Richtung einen anderen Teilbereich der Eintrittspupille durchsetzen, der gegenüber dem vorgenannten Teilbereich der Eintrittspupille versetzt ist.
Vorzugsweise ist das optische Medium, dessen Brechungsindex erfindungsgemäß zu bestimmen ist, ein Einbettmedium für eine Probe, das an eine der beiden Oberflächen des Deckglases grenzt.
Das erfindungsgemäße Mikroskop hat einen Probenraum mit einem Deckglas und ein optisches Medium, ein dem Probenraum zugewandtes Objektiv, eine teilreflektierende Grenzfläche, die in dem Probenraum angeordnet und dadurch gebildet ist, dass das optische Medium in dem Probenraum an eine von zwei entgegengesetzten Oberflächen des Deckglases grenzt, und eine Einrichtung zur Bestimmung des Brechungsindex des optischen Mediums. Die Einrichtung ist ausgebildet, zeitlich aufeinanderfolgend wenigstens ein erstes Messlichtbündel und ein zweites Messlichtbündel zu erzeugen, wobei das erste Messlichtbündel und das zweite Messlichtbündel voneinander verschiedene Polarisationszustände aufweisen. Die Einrichtung ist ausgebildet, das erste Messlichtbündel und das zweite Messlichtbündel jeweils durch das Objektiv unter schrägem Einfall auf das Deckglas zu lenken. Die Einrichtung ist ausgebildet, zwei Reflexionslichtbündel zu erzeugen, indem das erste Messlichtbündel und das zweite Messlichtbündel jeweils zum Teil an der Grenzfläche reflektiert werden. Die Einrichtung weist einen Detektor auf und ist ausgebildet ist, das erste Reflexionslichtbündel und das zweite Reflexionslichtbündel jeweils durch das Objektiv zu empfangen und auf den Detektor zu lenken. Der Detektor ist ausgebildet, die Intensitäten des ersten Reflexionslichtbündels und des zweiten Reflexionslichtbündels zu erfassen. Die Einrichtung umfasst ferner eine Ermittlungseinheit, die ausgebildet ist, auf Grundlage der erfassten Intensitäten des ersten Reflexionslichtbündels und des zweiten Reflexionslichtbündels den Brechungsindex des optischen Mediums zu ermitteln.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform weist die Einrichtung ein mehrteiliges Polarisationselement zum Präparieren der Polarisationszustände des ersten Messlichtbündels und des zweiten Messlichtbündels auf. Insbesondere weist das mehrteilige Polarisationselement wenigstens zwei, bevorzugt drei Bereiche auf, die jeweils nur für Licht mit jeweils verschiedenen Polarisationszuständen transparent sind. Das mehrteilige Polarisationselement ist beispielsweise in oder nahe einer Pupillenebene des Objektivs einbringbar. Beispielsweise kann das mehrteilige Polarisationselement in einer Aufnahmevorrichtung für ein objektivseitiges Nomarski-Prisma für differentielle Interferenzkontrast-Mikroskopie angeordnet werden. Derartige Aufnahmevorrichtungen sind in vielen kommerziellen Mikroskopen in unterschiedlichen Ausführungsformen verfügbar.
Vorzugsweise weist die Einrichtung eine Aperturblende mit einer Blendenöffnung auf, die dezentriert mit Abstand zur optischen Achse des Objektivs angeordnet ist. Die Aperturblende begrenzt den Querschnitt des ersten Messlichtbündels und des zweiten Messlichtbündels derart, dass letztere die Eintrittspupille des Objektivs dezentral unterleuchten und dadurch schräg zur optischen Achse aus dem Objektiv austreten. Die dezentrale Unterleuchtung der Eintrittspupille des Objektivs hat den Vorteil, dass achsnahe Strahlanteile vermieden werden, die sogenannte Reflexe erster Ordnung verursachen, die am stärksten an den Flächenscheiteln der das Objektiv bildenden Linsen entstehen und das Signal-Rausch-Verhältnis verschlechtern. Ferner wird durch die dezentrale Unterleuchtung die Einfallsebene des jeweiligen Messlichtbündels als Referenz für die Polarisationsrichtung des jeweiligen Messlichtbündels definiert.
In einer vorteilhaften Ausgestaltung hat die Ermittlungseinheit einen Speicher, in dem Parameter zur Ermittlung des Brechungsindex des optischen Mediums speicherbar sind. Dadurch ist es beispielsweise möglich, die für die Ermittlung des Brechungsindex relevanten Parameter für eine Vielzahl von Mikroskopkomponenten vorzuhalten, die je nach Anwendung wahlweise in dem Mikroskop zum Einsatz kommen. So können etwa die Brechungsindizes verschiedener Immersionsmedien und verschiedener Deckgläser sowie die optischen Daten verschiedener Objektive gespeichert und nach Bedarf zur Bestimmung des gesuchten Brechungsindex ausgelesen werden.
Vorzugsweise sind die entgegengesetzten Oberflächen des Deckglases planparallel zueinander ausgebildet.
Die erfindungsgemäße Einrichtung ist aufgrund ihrer vorliegend beschriebenen strukturellen und funktionellen Eigenschaften auch dazu geeignet, in dem Mikroskop als Autofokuseinrichtung genutzt zu werden. Zudem bietet die Einrichtung aufgrund ihrer Eigenschaften die Möglichkeit, neben dem Brechungsindex eines optischen Mediums andere, die lichtmikroskopische Abbildung beeinflussende Größen zu bestimmen, wie etwa die Dicke und/oder die Verkippung des Deckglases.
Die Erfindung ist auf eine Vielzahl von Mikroskoptypen anwendbar, z.B. inverse oder aufrechte Durchlichtmikroskope.
Die Erfindung wird im Folgenden anhand der Figuren näher erläutert. Darin zeigen:

1 eine schematische Darstellung eines inversen Durchlichtmikroskops als erstes Ausführungsbeispiel;
2 eine zur Bestimmung des Brechungsindex eines optischen Mediums bestimmte Einrichtung, die Teil des Mikroskops nach 1 ist;
3 eine schematische Darstellung eines mehrteiligen Polarisationselements, das Teil der Einrichtung nach 2 ist, als erstes Ausführungsbeispiel;
4a eine schematische Darstellung des mehrteiligen Polarisationselements nach 3 in einer beispielhaften ersten Einstellung;
4b eine schematische Darstellung des mehrteiligen Polarisationselements nach 3 in einer beispielhaften zweiten Einstellung;
4c eine schematische Darstellung des mehrteiligen Polarisationselements nach 3 in einer beispielhaften dritten Einstellung;
5 eine schematische Darstellung des weiteren mehrteiligen Polarisationselements, das Teil der Einrichtung nach 2 ist, als zweites Ausführungsbeispiel;
6a eine schematische Darstellung des mehrteiligen Polarisationselements nach 5 in einer beispielhaften ersten Einstellung;
6b eine schematische Darstellung des mehrteiligen Polarisationselements nach 5 in einer beispielhaften zweiten Einstellung;
6c eine schematische Darstellung des mehrteiligen Polarisationselements nach 5 in einer beispielhaften dritten Einstellung;
7 ein Flussdiagramm, das eine spezielle Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung des Brechungsindex zeigt; und
8 eine schematische Darstellung eines aufrechten Durchlichtmikroskop, das ein zweites Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Mikroskops bildet.

1 zeigt ein Mikroskop 10 als erstes Ausführungsbeispiel, auf das die erfindungsgemäße Brechungsindexbestimmung anwendbar ist.
Das Mikroskop 10 ist als inverses Durchlichtmikroskop ausgeführt. Es umfasst demnach ein Objektiv 12, das von unten einem in 1 mit dem Bezugszeichen 14 versehenen Probenraum zugewandt ist, sowie eine Lichtquelle 16, die von oben auf den Probenraum 14 gerichtet ist. Das Mikroskop 10 weist ferner einen Tubus 18 mit einem Okular 20 auf, durch das eine Bedienperson ein durch das Objektiv 12 eingefangenes Probenbild betrachten kann. Zudem ist eine Steuereinheit 22 vorgesehen, welche die verschiedenen Mikroskopkomponenten ansteuert.
In dem Probenraum 14 des Mikroskops 10 befindet sich ein Deckglas 24 zum Bedecken einer in 1 nicht explizit dargestellten Probe. Auf dem Deckglas 24 befindet sich ein optisches Medium 26, in das die Probe eingebettet ist und das im Weiteren als Einbettmedium 26 bezeichnet wird. In dem Probenraum 14 ist ferner ein Immersionsmedium 28 angeordnet, das in 1 von oben an das Objektiv 12 und von unten an das Deckglas 24 grenzt.
Das Mikroskop 10 weist ferner eine in 1 allgemein mit dem Bezugszeichen 30 bezeichnete Einrichtung auf, die dazu dient, den Brechungsindex des die Probe aufnehmenden Einbettmediums 26 zu ermitteln. Die Einrichtung ist in 2 genauer dargestellt.
Wie in 2 gezeigt, weist die Einrichtung 30 eine Lichtquelle 32 auf, die ein unpolarisiertes Lichtbündel 34 emittiert. Die Lichtquelle 32 ist beispielweise eine LED, die eine Spaltblende 33 aufweist, durch die das unpolarisierte Lichtbündel 34 auf eine Beleuchtungsoptik 36 gerichtet wird. Nach Durchtritt durch die Beleuchtungsoptik 36 fällt das unpolarisierte Lichtbündel 34 auf eine Aperturblende 38, die mittig auf der optischen Achse O1 der Beleuchtungsoptik 36 positioniert ist und eine Blendenöffnung 39 aufweist, die dezentriert mit Abstand zur optischen Achse O1 der Beleuchtungsoptik 36 angeordnet ist. Die Blendenöffnung der Aperturblende 38 begrenzt den Strahlquerschnitt des unpolarisierten Lichtbündels 34 derart, dass nur der in 2 unterhalb der optischen Achse O1 der Beleuchtungsoptik 36 liegende Teil des unpolarisierten Lichtbündels 34 die Aperturblende in Richtung eines Umlenkprismas 40 passiert.
Das in seinem Strahlquerschnitt begrenzte unpolarisierte Lichtbündel 34 wird an dem Umlenkprisma 40 in eine Transportoptik 42 reflektiert, die aus einer längs ihrer optischen Achse O2 verschiebbaren Fokussierlinse 44, einer Leuchtfeldblende 46 und einer weiteren Linse 48 gebildet ist. Nach Durchtritt durch die Transportoptik 42 fällt das unpolarisierte Lichtbündel 34 auf einen dichroitischen Strahlteiler 50, der Licht im Infrarot-Wellenlängenbereich reflektiert, während er Licht im sichtbaren Bereich transmittiert. Durch den dichroitischen Spiegel 50 wird das unpolarisierte Lichtbündel 34 in Richtung des Objektivs 12 reflektiert. Das an dem dichroitischen Spiegel 50 reflektierte unpolarisierte Lichtbündel 34 verläuft dabei mit einem Parallelversatz zur optischen Achse O3 des Objektivs 12. Auf diese Weise wird das unpolarisierte Lichtbündel 34 in eine Polarisationseinrichtung 52 gelenkt, die bildseitig einer Pupillenebene 53 des Objektivs 12 angeordnet ist. Die Polarisationseinrichtung 52 umfasst ein verstellbares mehrteiliges Polarisationselement 64, das anhand der 3, 4a, 4b, 4c, 5, 6a, 6b und 6c näher beschrieben ist. Mittels der Polarisationseinrichtung 52 wird aus dem unpolarisierten Lichtbündel 34 ein erstes Messlichtbündel 35a erzeugt, das einen ersten Polarisationszustand aufweist. Durch verstellen des mehrteiligen Polarisationselementes 64 lassen sich zeitlich auf das erste Messlichtbündel 35a folgend ein zweites Messlichtbündel 35b, mit einem von dem ersten Polarisationszustand verschiedenen zweiten Polarisationszustand, und ein drittes Messlichtbündel 35c, mit einem von dem ersten Polarisationszustand und dem zweiten Polarisationszustand verschiedenen dritten Polarisationszustand erzeugen. Der Einfachheit halber sind alle drei Messlichtbündel 35a bis 35c in 2 als ein einzelnes mit 35 bezeichnetes Lichtbündel dargestellt.
Die drei Messlichtbündel 35a bis 35c werden zeitlich aufeinanderfolgend jeweils in einen Teilbereich einer Eintrittspupille 52 des Objektivs 12 geleitet, der gegenüber der optischen Achse O3 des Objektivs 12 und damit gegenüber der Mitte der Eintrittspupille 53 seitlich versetzt ist. Die Eintrittspupille 53 des Objektivs 12 wird somit dezentral unterleuchtet, was dazu führt, dass die drei Messlichtbündel 35a bis 35c jeweils schräg zur optischen Achse O3 in den Probenraum 14 gelenkt werden.
Der Einfachheit halber sind in der Darstellung nach 2 das Einbettmedium 26 und das Immersionsmedium 28, die in dem Probenraum 14 von entgegengesetzten Seiten her an das Deckglas 24 grenzen, weggelassen. Die drei unter schrägem Einfall in den Probenraum 14 geleiteten drei Messlichtbündel 35a bis 35c werden an dem Deckglas 24 reflektiert, wodurch zeitlich aufeinanderfolgend drei jeweils in das Objektiv 12 zurückgeleitete Reflexionslichtbündel 54a bis 54c entstehen, die in der schematischen Ansicht nach 2 in Form eines einzigen, mit 54 bezeichneten Lichtbündels dargestellt sind. Die drei Reflexionslichtbündel 54a bis 54c treten durch die Polarisationseinrichtung 52, die für die drei Reflexionslichtbündel 54a bis 54c als Analysator dient.
Nach Durchtritt durch das Objektiv 12 fallen die drei Reflexionslichtbündel 54a bis 54c auf den dichroitischen Spiegel 50, der die drei Reflexionslichtbündel 54a bis 54c in die Transportoptik 42 lenkt. Nach Passieren der Transportoptik 42 fallen die drei Reflexionslichtbündel 54a bis 54c auf das Umlenkprisma 40, das die drei Reflexionslichtbündel 54a bis 54c auf eine Detektoroptik 56 reflektiert. Die Detektoroptik 56 richtet die drei Reflexionslichtbündel 54a bis 54c auf ein Spektralfilter 58, das nur für Licht in dem von der Lichtquelle 32 emittiertem Wellenlängenbereich durchlässig ist und Streulicht außerhalb dieses Wellenlängenbereichs blockiert. Die durch das Spektralfilter 58 transmittierten Reflexionslichtbündel 54a bis 54c fallen schließlich auf einen Detektor 60, der im Stande ist, die Intensitäten der drei Reflexionslichtbündel 54a bis 54c nacheinander zu erfassen.
In der 2 ist der Vollständigkeit halber auch die über den dichroitischen Spiegel 50 realisierte Ankopplung des Tubus 18 an die Einrichtung 30 veranschaulicht. Demnach dient der dichroitische Spiegel 50 im vorliegenden Ausführungsbeispiel auch dazu, das für die eigentliche mikroskopische Bildgebung genutzte Detektionslicht 62, welches das Objektiv 12 aus dem Probenraum 14 in Richtung des dichroitischen Spiegels 50 leitet, durch Transmission dem Tubus 18 zuzuführen.
3 zeigt eine schematische Darstellung des mehrteiligen Polarisationselements, das Teil der Einrichtung nach 2, als erstes Ausführungsbeispiel. Das in 3 gezeigte mehrteilige Polarisationselement wird im Folgenden mit dem Bezugszeichen 64a bezeichnet.
Das mehrteilige Polarisationselement 64a ist kreisförmig und weist drei Bereiche 66a, 68a, 70a auf. Die drei Bereiche 66a, 68a, 70a sind jeweils nur für Licht mit einem bestimmten Polarisationszustand durchlässig. Ein erster Bereich 66a der drei Bereiche 66a, 68a, 70a ist in 3 ganz links angeordnet und erstreckt sich über 2/3 der Gesamtfläche des mehrteiligen Polarisationselements 64a. Der erste Bereich 66a ist für Licht mit einer Polarisationsrichtung von 45° zu einer Einfallebene der drei Messlichtbündel 35a bis 35ca, 35b, 35c auf das Deckglas 24 durchlässig, wie es in 3 durch einen Pfeil P1a angedeutet ist. Ein zweiter Bereich 68a der drei Bereiche 66a, 68a, 70a ist in 3 rechts des ersten Bereichs 66a angeordnet und erstreckt sich über 1/6 der Gesamtfläche des mehrteiligen Polarisationselements 64a. Der zweite Bereich 68a ist für Licht mit einer Polarisationsrichtung von 90° zu der Einfallebene durchlässig. Dies ist in 3 durch einen Pfeil P2a angedeutet. Ein dritter Bereich 70a der drei Bereiche 66a, 68a, 70a ist in 3 rechts des zweiten Bereichs 68a angeordnet und erstreckt sich über 1/6 der Gesamtfläche des mehrteiligen Polarisationselements 64a. Der dritte Bereich 70a ist für Licht mit einer Polarisationsrichtung von 0° zu der Einfallebene durchlässig, wie es in 3 durch einen Pfeil P3a angedeutet ist.
4a zeigt eine schematische Darstellung des mehrteiligen Polarisationselements 64a nach 3 in einer beispielhaften ersten Einstellung. In der ersten Einstellung ist das mehrteilige Polarisationselement 64a in der Polarisationseinrichtung 52 angeordnet, dass sowohl das erste Messlichtbündel 35a als auch das durch Reflexion des ersten Messlichtbündels 35a an dem Deckglas 24 erzeugte erste Reflexionslichtbündel 54a auf den ersten Bereich 66a des mehrteiligen Polarisationselements 66a auftreffen. Da sich die Polarisationsrichtung von Licht bei Reflexion an einer Grenzfläche ändert und damit das erste Messlichtbündel 35a und das erste Reflexionslichtbündel 54a verschiedene Polarisationszustände aufweisen, ist die in 4a gezeigte erste Einstellung eine Dunkelstellung, d.h. das erste Reflexionslichtbündel 54a kann das mehrteilige Polarisationselement 64a nicht passieren. Der Bereich 66a des Polarisationselements 64a wirkt also sowohl als Polarisator für das erste Messlichtbündel 35a, als auch als Analysator für das erste Reflexionslichtbündel 54a.
4b zeigt eine schematische Darstellung des mehrteiligen Polarisationselements 64a nach 3 in einer beispielhaften zweiten Einstellung. In der zweiten Einstellung ist das mehrteilige Polarisationselement 64a derart in der Polarisationseinrichtung 52 angeordnet, dass das zweite Messlichtbündel 35b auf den zweiten Bereich 68a und das durch Reflexion des zweiten Messlichtbündels 35b an dem Deckglas 24 erzeugte zweite Reflexionslichtbündel 54b auf den ersten Bereich 66a des mehrteiligen Polarisationselements 64a auftreffen. Der Bereich 68a des Polarisationselements 64a wirkt also als Polarisator für das zweite Messlichtbündel 35b, und der Bereich 66a wirkt als Analysator für das zweite Reflexionslichtbündel 54b.
4c zeigt eine schematische Darstellung des mehrteiligen Polarisationselements 64a nach 3 in einer beispielhaften dritten Einstellung. In der dritten Einstellung ist das mehrteilige Polarisationselement 64a derart in der Polarisationseinrichtung 52 angeordnet, dass das dritte Messlichtbündel 35c auf den dritten Bereich 70a und das durch Reflexion des dritten Messlichtbündels 35c an dem Deckglas 24 erzeugte dritte Reflexionslichtbündel 54c auf den ersten Bereich 66a des mehrteiligen Polarisationselements 64a auftreffen. Der Bereich 70a des Polarisationselements 64a wirkt also als Polarisator für das dritte Messlichtbündel 35c, und der Bereich 66a wirkt als Analysator für das dritte Reflexionslichtbündel 54c.
Durch die drei in den 4a, bis 4c gezeigten Einstellungen des mehrteiligen Polarisationselements 64a nach 3 lassen sich das zweite Messlichtbündel 35b und das dritte Messlichtbündel 35c mit jeweils verschiedenem Polarisationszustand - insbesondere realisiert in Form von verschiedenen Polarisationsrichtungen zu der Einfallebene des jeweiligen Messlichtbündels 35b, 35c auf das Deckglas 24 - erzeugen. Ferner lässt sich eine Dunkelstellung realisieren, bei der das durch Reflexion des ersten Messlichtbündels 35a an dem Deckglas 24 erzeugte erste Reflexionslichtbündel 54a das mehrteilige Polarisationselement 64a nicht passieren kann.
5 zeigt eine schematische Darstellung des mehrteiligen Polarisationselements, das Teil der Einrichtung nach 2 und dort mit dem Bezugszeichen 64 versehen ist, als zweiten Ausführungsbeispiel. Das in 5 gezeigte mehrteilige Polarisationselement wird im Folgenden mit dem Bezugszeichen 64b versehen. Das mehrteilige Polarisationselement 64b nach 5 weist im Gegensatz zu dem mehrteiligen Polarisationselement 64a nach 3 keine Dunkelstellung auf.
Das mehrteilige Polarisationselement 64b ist kreisförmig und hat vier Bereiche 66b, 68b, 70b, 72b, die jeweils nur für Licht mit einem bestimmten Polarisationszustand durchlässig sind. Ein erster Bereich 66b der vier Bereiche 66b, 68b, 70b, 72b ist in 5 ganz links angeordnet und erstreckt sich über 1/6 der Gesamtfläche des mehrteiligen Polarisationselements 64b. Der erste Bereich 66b ist für Licht mit einer Polarisationsrichtung von -45° zu der Einfallebene der drei Messlichtbündel 35a bis 35ca, 35b, 35c auf das Deckglas 24 durchlässig, wie es in 5 durch einen Pfeil P1b angedeutet ist. Ein zweiter Bereich 68b der vier Bereiche 66b, 68b, 70b, 72b ist in 5 rechts des ersten Bereichs 66b angeordnet und erstreckt sich über die Hälfte der Gesamtfläche des mehrteiligen Polarisationselements 64b. Der zweite Bereich 68b ist für Licht mit einer Polarisationsrichtung von 45° zu der Einfallebene durchlässig. Dies ist in 3 durch einen Pfeil P2b angedeutet. Ein dritter Bereich 70b der vier Bereiche 66b, 68b, 70b, 72b ist in 5 rechts des zweiten Bereichs 68b angeordnet und erstreckt sich über 1/6 der Gesamtfläche des mehrteiligen Polarisationselements 64b. Der dritte Bereich 70b ist für Licht mit einer Polarisationsrichtung von 0° zu der Einfallebene durchlässig, wie es in 5 durch einen Pfeil P3b angedeutet ist. Ein vierter Bereich 72b der vier Bereiche 66b, 68b, 70b, 72b ist in 5 rechts des dritten Bereichs 70b angeordnet und erstreckt sich über 1/6 der Gesamtfläche des mehrteiligen Polarisationselements 64b. Der vierte Bereich 72b ist für Licht mit einer Polarisationsrichtung von 90° zu der Einfallebene durchlässig, wie es in 5 durch einen Pfeil P4b angedeutet ist.
6a zeigt eine schematische Darstellung des mehrteiligen Polarisationselements 64b nach 5 in einer beispielhaften ersten Einstellung. In der ersten Einstellung ist das mehrteilige Polarisationselement 64b derart in der Polarisationseinrichtung 52 angeordnet, dass das erste Messlichtbündel 35a auf den zweiten Bereich 68b und das durch Reflexion des ersten Messlichtbündels 35a an dem Deckglas 24 erzeugte erste Reflexionslichtbündel 54a auf den ersten Bereich 66b des mehrteiligen Polarisationselements 64b auftreffen. Der Bereich 68b wirkt als Polarisator für das erste Messlichtbündel 35a, und der Bereich 66b wirkt als Analysator für das erste Reflexionslichtbündel 54a.
6b zeigt eine schematische Darstellung des mehrteiligen Polarisationselements 64b nach 5 in einer beispielhaften zweiten Einstellung. In der zweiten Einstellung ist das mehrteilige Polarisationselement 64b derart in der Polarisationseinrichtung 52 angeordnet, dass das zweite Messlichtbündel 35b auf den dritten Bereich 70b und das durch Reflexion des zweiten Messlichtbündels 35b an dem Deckglas 24 erzeugte zweiten Reflexionslichtbündel 54b auf den zweiten Bereich 68b des mehrteiligen Polarisationselements 64b auftreffen. Der Bereich 70b wirkt als Polarisator für das zweite Messlichtbündel 35b, und der Bereich 68b wirkt als Analysator für das zweite Reflexionslichtbündel 54b.
6c zeigt eine schematische Darstellung des mehrteiligen Polarisationselements 64b nach 5 in einer beispielhaften dritten Einstellung. In der dritten Einstellung ist das mehrteilige Polarisationselement 64b derart in der Polarisationseinrichtung 52 angeordnet, dass das dritte Messlichtbündel 35c auf den vierten Bereich 72b und das durch Reflexion des dritten Messlichtbündels 35c an dem Deckglas 24 erzeugte dritte Reflexionslichtbündel 54c auf den dritten Bereich 70b des mehrteiligen Polarisationselements 64b auftreffen. Der Bereich 68b wirkt als Polarisator für das dritte Messlichtbündel 35c, und der Bereich 72b wirkt als Analysator für das dritte Reflexionslichtbündel 54c.
Durch die drei in den 6a, bis 6c gezeigten Einstellungen des mehrteiligen Polarisationselements 64b nach 3 lassen sich das ersten Messlichtbündel 35a, das zweite Messlichtbündel 35b und das dritte Messlichtbündel 35c mit jeweils verschiedenem Polarisationszustand - insbesondere realisiert in Form von verschiedenen Polarisationsrichtungen zu der Einfallebene des jeweiligen Messlichtbündels 35a, 35b, 35c auf das Deckglas 24-erzeugen.
7 zeigt ein Flussdiagramm, das rein beispielhaft veranschaulicht, wie der Brechungsindex des Einbettmediums 26 erfindungsgemäß ermittelt werden kann.
In einem ersten Schritt S1 werden zeitlich aufeinanderfolgend die drei Messlichtbündel 35a bis 35ca, 35b, 35c durch das Objektiv 12 in den Probenraum 14 geleitet. Nach Durchtritt durch die Immersionsflüssigkeit 28 treffen die drei Messlichtbündel 35a bis 35c unter einem Winkel α schräg auf das Deckglas 24. Der Winkel α kann aus dem Abstand zwischen dem Objektiv 12 dem Deckglases 24 sowie der numerischen Apertur des jeweiligen Messlichtbündels 35a, 35b, 35c bestimmt werden. Dabei ergibt sich die numerische Apertur 34 des jeweiligen Messlichtbündels 35a, 35b, 35c anhand der Brennweite des Objektivs 12 und der Position des jeweiligen Messlichtbündels 35a, 35b, 35c in der Eintrittspupille 53 des Objektivs 12 bzw. anhand der Positionierung der Blendenöffnung 39 der Aperturblende 38 und des Vergrößerungsmaßstabs, mit dem die Aperturblende 38 in die Eintrittspupille 53 des Objektivs 12 abgebildet wird.
In einem zweiten Schritt S2 werden zeitlich aufeinanderfolgend drei Reflexionslichtbündel 54a, 54b, 54c durch die Teilreflexionen an einer dem Einbettmedium 26 zugewandten Oberfläche des Deckglases 24 generiert.
In einem dritten Schritt S3 werden die drei Reflexionslichtbündel 54a, 54b, 54c auf den Detektor 60 geleitet. Die drei zeitlich aufeinanderfolgenden Reflexionslichtbündel 54a, 54b, 54c treffen zu unterschiedlichen Zeitpunkten auf den Detektor 60.
In einem vierten Schritt S4 werden die im Weiteren als I_a , I_b bzw. I_c bezeichneten Intensitäten der drei Reflexionslichtbündel 54a, 54b, 54c durch den Detektor 60 erfasst.
In einem fünften Schritt S5 wird schließlich der Brechungsindex des Einbettmediums 26 auf Grundlage der Intensitäten der drei Reflexionslichtbündel 54a, 54b, 54c ermittelt. Dies ist im Folgenden näher erläutert.
Die jeweils durch den Detektor 60 erfasste Intensität I des ersten, zweiten bzw. dritten Reflexionslichtbündels 54a, 54b, 54c ergibt sich als $\begin{array}{l} I = {cos}^{2} α_{a} {cos}^{2} α_{p} ({| r_{s} |}^{2} {| t_{s} |}^{4} + {| r_{p} |}^{2} {| t_{p} |}^{4}) + cos α_{a} cos α_{p} sin α_{a} sin α_{p} (r_{p} t_{p}^{2} \bar{r_{s}} \bar{t_{s}^{2}}) - \\ {| r_{s} |}^{2} {| t_{s} |}^{4} ({cos}^{2} α_{a} + {cos}^{2} α_{p} - 1) \end{array}$
In die obige Gleichung (2) gehen die jeweilige Polarisationsrichtung α_a des ersten, zweiten bzw. dritten Reflexionslichtbündels 54a, 54b, 54c und die jeweilige Polarisationsrichtung α_p des ersten, zweiten bzw. dritten Messlichtbündels 35a, 35b, 35c und die komplexen Fresnel-Amplitudenkoeffizienten für Reflexion r_s und Transmission t_s für die zwischen dem Deckglas 24 und dem Einbettmedium 26 gebildete optische Grenzfläche sowie den komplexen Fresnel-Amplitudenkoeffizienten für Reflexion r_p und Transmission t_p für die zwischen dem Deckglas 24 und dem Immersionsmedium 28 gebildete weitere optische Grenzfläche ein. Die Fresnel-Amplitudenkoeffizienten lauten explizit $t_{s} = \frac{2 n_{I m m} \sqrt{1 - \frac{N A^{2}}{n_{I m m}^{2}}}}{n_{I m m} \sqrt{1 - \frac{N A^{2}}{n_{I m m}^{2}}} + n_{D g l} \sqrt{1 - \frac{N A^{2}}{n_{D g l}^{2}}}}$
$t_{p} = \frac{2 n_{I m m} \sqrt{1 - \frac{N A^{2}}{n_{I m m}^{2}}}}{n_{D g l} \sqrt{1 - \frac{N A^{2}}{n_{I m m}^{2}}} + n_{I m m} \sqrt{1 - \frac{N A^{2}}{n_{D g l}^{2}}}}$
$r_{s} = \frac{n_{D g l} \sqrt{1 - \frac{N A^{2}}{n_{D g l}^{2}}} - n_{S p c} \sqrt{1 - \frac{N A^{2}}{n_{S p c}^{2}}} +}{n_{D g l} \sqrt{1 - \frac{N A^{2}}{n_{D g l}^{2}}} + n_{S p c} \sqrt{1 - \frac{N A^{2}}{n_{S p c}^{2}}}}$
und $r_{p} = \frac{n_{S p c} \sqrt{1 - \frac{N A^{2}}{n_{D g l}^{2}}} - n_{D g l} \sqrt{1 - \frac{N A^{2}}{n_{S p c}^{2}}}}{n_{S p c} \sqrt{1 - \frac{N A^{2}}{n_{D g l}^{2}}} + n_{D g l} \sqrt{1 - \frac{N A^{2}}{n_{S p c}^{2}}}}$
Dabei sind n_Imm, n_Dgl und n_Spc jeweils der Brechungsindex des Immersionsmediums 28, des Deckglases 24 und des Einbettmediums 26, und NA ist die numerische Apertur des ersten, zweiten bzw. dritten Reflexionslichtbündels 54a, 54b, 54c.
Anhand der Polarisationsrichtung α_a des ersten und zweiten Reflexionslichtbündels 54a, 54b, der Polarisationsrichtung α_p des ersten und zweiten Messlichtbündels 35a, 35b, des Brechungsindex des Immersionsmediums n_Imm und der jeweiligen numerischen Apertur NA des ersten und zweiten Messlichtbündels 35a, 35b lässt sich das durch die obigen Gleichungen (3) bis (6) gebildete Gleichungssystem nach dem Betrag des Brechungsindex n_Spc des Einbettmediums 26 auflösen. Sind zusätzlich die Polarisationsrichtung α_a des dritten Reflexionslichtbündels 54c und die Polarisationsrichtung α_p des dritten Messlichtbündels 35c sowie die numerische Apertur NA des dritten Messlichtbündels 35c bekannt, kann aus dem durch die Gleichungen (3) bis (6) gebildeten Gleichungssystem der komplexe Brechungsindex n_Spc des Einbettmediums 26 bestimmt werden. Dies kann beispielsweise durch eine Minimierung von quadratischen Abweichungen der durch den Detektor gemessenen Intensitäten der drei Reflexionslichtbündel 54a, 54b, 54c in Bezug auf eine numerische Simulation in Abhängigkeit des Brechungsindex n_Spc des Einbettmediums 26 erfolgen.
8 zeigt ein Mikroskop 74, das im Unterschied zu dem in 1 dargestellten Mikroskop 10 als aufrechtes Durchlichtmikroskop ausgeführt ist. Dabei sind in 8 diejenigen Mikroskopkomponenten, die den Komponenten des Mikroskops 10 nach 1 entsprechen, mit den schon in 1 verwendeten Bezugszeichen versehen.
Im Unterschied zur Ausführungsform nach 1 ist bei dem in 8 dargestellten Mikroskop das Objektiv 12 oberhalb des Probenraums 18 angeordnet, während sich die Lichtquelle 16 unterhalb des Probenraums 18 befindet. Dementsprechend befindet sich das Immersionsmedium 28, das zum einen an das Objektiv 12 und zum anderen an das Deckglas 24 grenzt, oberhalb des Deckglases 24, während sich das Einbettmedium 26, dessen Brechungsindex erfindungsgemäß zu bestimmen ist, unterhalb des Deckglases 24 angeordnet ist.
Bezugszeichenliste

10: Mikroskop
12: Objektiv
14: Probenraum
16: Lichtquelle
18: Tubus
20: Okular
22: Steuereinheit
24: Deckglas
26, 28: optisches Medium
30: Einrichtung
32: Lichtquelle
33: Spaltblende
34: Messlichtbündel
36: Beleuchtungsoptik
38: Aperturblende
39: Blendenöffnung
40: Umlenkprisma
42: Transportoptik
44: Fokussierlinse
46: Leuchtfeldblende
48: Linse
50: Strahlteiler
52: Polarisationseinrichtung
53: Eintrittspupille
54: Reflexionslichtbündel
56: Detektoroptik
58: Spektralfilter
60: Detektor
62: Abbildungsstrahlengang
64: Polarisationselement
66, 68, 70, 72: Bereich
74: Mikroskop

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

DE 102006021996 A1 [0005]
DE 102010030430 A1 [0006]

Claims

Verfahren zur Bestimmung des Brechungsindex eines optischen Mediums (26) in einem Mikroskop (10, 74), das ein einem Probenraum (14) zugewandtes Objektiv (12) aufweist, wobei das optische Medium (26) mit dem zu bestimmenden Brechungsindex in dem Probenraum (14) an eine von zwei entgegengesetzte Oberflächen eines Deckglases (24) grenzt und dadurch eine teilreflektierende Grenzfläche bildet, dadurch gekennzeichnet, dass zeitlich aufeinanderfolgend wenigstens ein erstes Messlichtbündel (35a) und ein zweites Messlichtbündel (35b) erzeugt werden, wobei das erste Messlichtbündel (35a) und das zweite Messlichtbündel (35b) voneinander verschiedene Polarisationszustände aufweisen, das erste Messlichtbündel (35a) und das zweite Messlichtbündel (35b) jeweils durch das Objektiv (12) unter schrägem Einfall auf das Deckglas (24) gelenkt werden, zwei Reflexionslichtbündel (54a, 54b) erzeugt werden, indem das erste Messlichtbündel (35a) und das zweite Messlichtbündel (35b) jeweils zum Teil an der Grenzfläche reflektiert werden, das erste Reflexionslichtbündel und das zweite Reflexionslichtbündel (54a, 54b) jeweils durch das Objektiv (12) empfangen und auf einen Detektor (60) gelenkt werden, die Intensitäten des ersten Reflexionslichtbündels (54a) und des zweiten Reflexionslichtbündels (54b) mittels des Detektors (60) erfasst werden, und auf Grundlage der erfassten Intensitäten des ersten Reflexionslichtbündels (54a) und des zweiten Reflexionslichtbündels (54b) der Brechungsindex des optischen Mediums ermittelt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Brechungsindex des optischen Mediums in Abhängigkeit des Brechungsindex des Deckglases (24) und der numerischen Apertur des ersten Messlichtbündels (35a) und des zweiten Messlichtbündels (35b) ermittelt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Brechungsindex des optischen Mediums (26) auf Grundlage des Verhältnisses der Intensitäten des ersten Reflexionslichtbündels (54a) und des zweiten Reflexionslichtbündels (54b) ermittelt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass zeitlich auf das erste Messlichtbündel (35a) oder das zweite Messlichtbündel (35a) ein drittes Messlichtbündel (35b) erzeugt wird, das einen von dem ersten Messlichtbündel (35a) und zweiten Messlichtbündel (35a) verschiedenen Polarisationszustand aufweist, das dritte Messlichtbündel (35c) durch das Objektiv (12) unter schrägem Einfall auf das Deckglas (24) gelenkt wird, ein drittes Reflexionslichtbündel (54c) erzeugt wird, indem das dritte Messlichtbündel (35c) zum Teil an der Grenzfläche reflektiert wird, das dritte Reflexionslichtbündel (54c) durch das Objektiv (12) empfangen und auf den Detektor (60) gelenkt wird, die Intensität des dritten Reflexionslichtbündels (54c) mittels des positionssensitiven Detektors (60) erfasst wird, und auf Grundlage der erfassten Intensitäten der drei Reflexionslichtbündel (54a, 54b, 54c) der Brechungsindex des optischen Mediums (26) als komplexe Zahl ermittelt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Messlichtbündel (54a), zweite Messlichtbündel (54b) und/oder dritte Messlichtbündel (54c) in einen Teilbereich einer Eintrittspupille (53) des Objektivs (12) geleitet wird, der gegenüber der Mitte der Eintrittspupille (53) versetzt ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das optische Medium (26) ein Einbettmedium für eine Probe ist, das an eine der beiden Flächen des Deckglases (24) grenzt.
Mikroskop, umfassend: einen Probenraum (14) mit einem Deckglas (24) und ein optisches Medium, ein dem Probenraum (14) zugewandtes Objektiv (12), eine teilreflektierende Grenzfläche, die in dem Probenraum (14) angeordnet und dadurch gebildet ist, dass das optische Medium (26) in dem Probenraum (14) an eine von zwei entgegengesetzten Oberflächen des Deckglases (24) grenzt, und eine Einrichtung (30) zur Bestimmung des Brechungsindex des optischen Mediums (26), dadurch gekennzeichnet, dass die Einrichtung (30) ausgebildet ist, zeitlich aufeinanderfolgend wenigstens ein erstes Messlichtbündel (54a) und ein zweites Messlichtbündel (54b) zu erzeugen, wobei das erste Messlichtbündel (54a) und das zweite Messlichtbündel (54b) voneinander verschiedene Polarisationszustände aufweisen, die Einrichtung (30) ausgebildet ist, das erste Messlichtbündel (54a) und das zweite Messlichtbündel (54b) jeweils durch das Objektiv (12) unter schrägem Einfall auf das Deckglas (24) zu lenken, die Einrichtung (30) ausgebildet ist, zwei Reflexionslichtbündel (54a, 54b) zu erzeugen, indem das erste Messlichtbündel (54a) und das zweite Messlichtbündel (54b) jeweils zum Teil an der Grenzfläche reflektiert werden, die Einrichtung einen Detektor (60) aufweist und ausgebildet ist, das erste Reflexionslichtbündel und das zweite Reflexionslichtbündel (54a, 54b) jeweils durch das Objektiv (12) zu empfangen und auf den Detektor (60) zu lenken, der Detektor (60) ausgebildet ist, die Intensitäten des ersten Reflexionslichtbündels und des zweiten Reflexionslichtbündels (54a, 54b) zu erfassen, und die Einrichtung (30) eine Ermittlungseinheit umfasst, die ausgebildet ist, auf Grundlage der erfassten Intensitäten des ersten Reflexionslichtbündels und des zweiten Reflexionslichtbündels (54a, 54b) der Brechungsindex des optischen Mediums zu ermitteln.
Mikroskop nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Einrichtung (30) ein mehrteiliges Polarisationselement (64) zum Präparieren der Polarisationszustände des ersten Messlichtbündels (35a) und des zweiten Messlichtbündels (35b) aufweist.
Mikroskop nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das mehrteilige Polarisationselement wenigstens zwei, bevorzugt drei Bereiche (66, 68, 70) aufweist, die jeweils nur für Licht mit jeweils verschiedenen Polarisationszuständen transparent sind.
Mikroskop nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Einrichtung (30) eine Aperturblende (38) mit einer Blendenöffnung (39) aufweist, die dezentriert mit Abstand zur optischen Achse (O3) des Objektivs (12) angeordnet ist.
Mikroskop nach einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Ermittlungseinheit einen Speicher hat, in dem Parameter zur Ermittlung des Brechungsindex des optischen Mediums (26) speicherbar sind.
Mikroskop nach einem der Ansprüche 7 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die entgegengesetzten Oberflächen des Deckglases (24) planparallel zueinander ausgebildet sind.
Mikroskop nach einem der Ansprüche 7 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass es ein inverses Mikroskop oder ein aufrechtes Mikroskop ist.
Mikroskop nach einem der Ansprüche 8 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Polarisationszustände des ersten Messlichtbündels (35a) und des zweiten Messlichtbündels (35b) durch eine Rotationsbewegung des mehrteiligen Polarisationselements (64) eingestellt werden.