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Die
Anmeldung betrifft eine Autofokuseinrichtung mit einem optischen
System zum Fokussieren von Licht in einem Messlichtfokus in einer
Probe und zum Führen von von dort zurückgeworfenem Licht
auf zumindest zwei Detektorelemente.
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Stand der Technik
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Zur
automatischen Fokussierung von Mikroskopen auf eine Probe sind zwei
Methoden bekannt:
- – Es wird die Position
einer Probe oder die Entfernung der Probe zu einem Bezugspunkt gemessen,
indem von der Probe reflektiertes Licht auf Schemen, Intensität
oder dergleichen oder interferometrisch untersucht wird.
- – Es wird das Bilder der Probe auf Kontrast, Auflösung,
Autokorrelation oder Phasenkontrast hin untersucht.
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In
der Mikroskopie besteht eine Probe üblicherweise aus einem
zu untersuchenden Probenmaterial, das auf einen lichtdurchlässigen
Probenträger aufgebracht und mit einem dünnen
lichtdurchlässigen Abdeckglas abgedeckt ist. Eine Positionsmessung
des Probenmaterials führt häufig zur Messung der
Position einer der Reflexionsebenen an den Schichtgrenzen der Probe.
Da ein Reflex an der Luft-Abdeckglas-Grenzschicht weit stärker
ist als ein Reflex an einer Grenzschicht am Probenmaterial, überstrahlt
der Luft-Abdeckglas-Reflex typischerweise den für einen
Autofokus geeigneteren Reflex an einer Grenzschicht am Probenmaterial.
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Aus
der
US 6,130,745 ist
es bekannt, die Position einer starken Reflexschicht oberhalb oder
unterhalb der Probe zu messen und aus der Dicke der Probe auf die
Position des Probenmaterials zu schließen, das in einer
bekannten Entfernung von der Reflexschicht angeordnet ist. Typischerweise
sind jedoch bei der beschrieben Probe bei Verwendung hochauflö senden
Systemen die Toleranzen in den Schichtdicken (z. B. des Deckglases
oder des Objektträgers) größer als die
Tiefenschärfe des Abbildungssystems und eine Fokussierung
kann mit einer solchen Methode nicht immer gewährleistet
werden.
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Es
ist eine Aufgabe der Erfindung, eine Autofokusvorrichtung anzugeben,
mit dem ein optisches System, z. B. ein Mikroskop, schnell und genau
auf eine reflektierende Schicht einer Probe fokussierend eingestellt
werden kann.
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Lösung der Aufgabe
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Diese
Aufgabe wird durch eine Autofokuseinrichtung der eingangs genannten
Art gelöst, die erfindungsgemäß einen
Aktuator und ein Steuermittel aufweist zum Bewegen eines Elements
des optischen Systems relativ zur Probe durch den Aktuator derart,
dass der Messlichtfokus in unterschiedlich stark Licht zurückwerfenden
Schichten der Probe bewegt wird, wobei die Detektorelemente so angeordnet
sind, dass hierbei Verläufe einer von den Detektorelementen
registrierten Strahlungseigenschaft unterschiedlich sind und das
Steuermittel zum Auswerten der Verläufe an mehreren Positionen
des Messlichtfokus vorgesehen ist. Durch die unterschiedlichen Verläufe
der registrierten Strahlungsverläufe kann die Position
einer besonders ausgezeichneten Schicht in der Probe, z. B. einer
reflektierenden Grenzfläche, gefunden und darauf oder auf
eine in einem bekannten Abstand dazu angeordnete Fokuszielebene
fokussiert werden.
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Auch
Flächen, z. B. Grenzflächen, sind im Folgen als
Schichten zu verstehen. Eine der Schichten ist vorteilhafterweise
eine Grenzfläche. Die Lichtpfade sind zweckmäßigerweise
zumindest teilweise voneinander getrennt, insbesondere sind sie
im optischen System voneinander getrennt. Der Verlauf kann durch
punktuelle Messungen an mehreren Positionen des Messlichtfokus erfasst
werden, zweckmäßigerweise nach Lichtpfaden getrennt.
Die Strahlungseigenschaft des zurückgeworfenen Lichts kann die
Strahlungsintensität sein. Die einge stellte Fokusposition
ist eine gewünschte Fokusposition, in der das optische
System zweckmäßigerweise so zur Probe angeordnet
ist, dass eine Bildaufnahme der Probe zu gewünschten Bildern
führt.
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Außerdem
kann durch die Erfindung die optische Weglänge der Lichtpfade
bestimmt werden. Zweckmäßigerweise werden die
optischen Weglängen der Lichtpfade unterschiedlich gewählt.
Hierdurch kann durch die getrennte Auswertung der optischen Weglängen
der Lichtpfade ein Abweichungssignal zu einer gewählten
reflektierenden/streuenden Probenstruktur generiert und darauf oder
auf eine in einem bekannten Abstand dazu angeordnete Fokuszielebene
fokussiert werden. Eine Licht zurückwerfende Schicht kann
eine reflektierende und/oder streuende Probenstruktur sein und kann
insbesondere eine Grenzschicht sein, insbesondere eine an das Probenmaterial
angrenzende Grenzschicht bzw. Grenzfläche.
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Das
mit der Autofokuseinrichtung durchführbare Autofokusverfahren
ist ein Verfahren zum automatisierten Fokussieren des optischen
Systems auf eine gewünschte Fokusposition bzw. Fokuszielebene,
z. B. innerhalb der Probe. Ist auf die Fokuszielebene fokussiert,
kann das optische System ein dort angeordnetes Objekt in eine Bildebene
scharf abbilden, in der zweckmäßigerweise ein
Detektor bzw. eine Kamera angeordnet ist. Nach der Autofokussierung
kann die Probe mit Hilfe einer Kamera abgebildet werden.
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Die
Probe kann zur Untersuchung vorbereitetes Probenmaterial, einen
Träger, auf den es aufgebracht ist, und ein Abdeckglas,
das es abdeckt, umfassen. Ebenso eignen sich eine für das
Autofokuslicht lichtdurchlässige Schichtstruktur, an deren Schichtgrenzen
Reflexion oder Streuung des verwendeten Autofokuslichts auftritt.
Die Probe muss keine Lichtdurchlässigkeit für
das Autofokuslicht nach der zur Fokussierung bestimmten Schicht
aufweisen. Die Reflexion/Streuung an einer Grenzschicht, die hier
beschrieben wird, kann auch durch reflektierende/streuende Partikelschicht
bzw. Fehlstellen schicht im Material hervorgerufen werden. Die Schichtgrenzen
können vorbehandelt (z. B. verspiegelt) werden um die Signale
für das Autofokussystem zu erhöhen.
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Die
Fokuszielebene ist diejenige Ebene innerhalb der Probe, auf die
das optische System fokussiert werden soll oder von der die Position
des gewünschten Fokus in einem vorbestimmten Abstand entfernt
sein soll. Die Fokuszielebene ist zweckmäßigerweise
eine Reflexionsebene, an der einfallendes Licht reflektiert wird.
Sie kann eine Grenzschicht innerhalb der Probe sein, z. B. die Ebene
einer Glas-Probenmaterial-Grenzfläche. Ebenso könnte die
Streuung an der Probe selbst ausgenutzt werden.
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Das
auf die Lichtpfade geleitete Licht stammt zweckmäßigerweise
aus einer gemeinsamen Lichtquelle, wobei als Lichtquelle nicht nur
originär strahlendes Material sondern auch eine reflektierende Schicht,
eine Blendenöffnung oder dergleichen bezeichnet wird. Typischerweise
wird eine ein- bzw. zweidimensionale Lichtquelle verwendet. Die
beiden Lichtpfade sind zweckmäßigerweise symmetrisch zueinander
gebildet und insbesondere symmetrisch zur optischen Achse des optischen
Systems angeordnet.
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Die
Lichtquelle, die insbesondere punktförmig ist oder mehrere
Lichtpunkte umfasst, wird im Messlichtfokus in der Probe durch die
Optik fokussiert. Der Messlichtfokus ist üblicherweise
punktförmig, kann aber je nach Form der Lichtquelle alternativ
ein- oder mehrdimensional sein und z. B. mehrere Punkte umfassen.
Der Messlichtfokus liegt vorteilhafterweise im Fokus oder nahe des
Fokus des zu fokusierenden optischen Systems. Der Fokus des optischen
Systems kann eine Fokusebene sein. Ein im Fokus des optischen Systems
liegendes Objekt wird vom optischen System in einer Bildebene scharf
abgebildet. Es ist auch möglich, dass der Messlichtfokus
in einer voreingestellten Entfernung vom Fokus des optischen Systems
liegt. Hierdurch kann der Messlichtfokus auf eine Reflexionsebene
eingestellt werden, z. B. eine Grenz schicht Deckglas-Probenmaterial,
wobei der Fokus des optischen Systems z. B. 20 μm entfernt
von der Grenzschicht im Probenmaterial liegt.
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Von
dem auf die Probe auftreffenden Licht wird ein Teil zurückgeworfen.
Unter Zurückwerfen kann im Folgenden eine Reflexion und/oder
eine Streuung verstanden werden. Die das Licht zurückwerfende
Schicht kann eine reflektierende und/oder streuende Schicht sein.
Wenn im Folgenden von Reflexion gesprochen wird, soll eine Streuung
mit umfasst sein können.
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Die
Lichtpfade treffen vorteilhafterweise aus unterschiedlichen Richtungen
auf die Probe auf, so dass ihre Reflexe in unterschiedliche Richtungen
abgestrahlt und so leicht getrennt voneinander ausgewertet werden
können. Es erleichtert die Detektion der einzelnen Schichten
in einer Schichtstruktur, wenn der Winkel der auftreffenden Lichtpfade
so gewählt wird, dass Reflexe von benachbarten Schichten
sich nicht überdecken. Wird eine streuende Schicht zur
Bestimmung der Fokusposition verwendet, so sollte die Aufteilung
der Lichtpfade erst im Detektionspfad erfolgen.
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Vorteilhafterweise
hat das Licht des Autofokussystems eine andere Frequenz als Licht,
das zur Untersuchung bzw. Abbildung der Probe verwendet werden kann.
Die Lichteigenschaft ist zweckmäßigerweise die
Lichtintensität.
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Das
optische System kann dasjenige eines Mikroskops sein. Es weist eine
optische Achse auf, die üblicherweise senkrecht zu einer
Probenebene gerichtet ist, in der sich die Probe erstreckt.
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Die
Lichtpfade zwischen Lichtquelle und Releflexionsschicht bzw. zwischen
Reflexionsschicht und Detektor können als Beleuchtungspfade
bzw. Detektionspfade bezeichnet werden. Ein Autofokuslichtpfad besteht
somit aus einem Beleuchtungspfad und einem Detektionspfad. Der Unterschied
in der optischen Weglänge kann nun sowohl im Beleuchtungspfad,
im Detektionspfad sowie in beiden beiden Pfaden erzeugt werden.
Im Folgenden wird eine Realisierung im Detektionspfad beschrieben.
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Die
Messung der optischen Weglänge der Pfade erfolgt durch
mindestens eine, insbesondere jeweils eine Blende vor den Detektoren.
Durch eine weglängenabhängige Position der Lichtpfade
an der Blende, kann somit auf die optische Weglänge des Systems
geschlossen werden. Eine mögliche Realisation wird im Folgenden
beschrieben:
Die Detektorelemente sind z. B. relativ zu einem
Element des optischen Systems so angeordnet, z. B. zu einer Blende,
dass Verläufe einer von den Detektorelementen registrierten
Strahlungseigenschaft zueinander unterschiedlich sind. Das Element
des optischen Systems kann eine Blende, z. B. unmittelbar vor den
Detektorelementen, ein Strahlteiler, ein Spiegel oder ein anderes
geeignetes Element sein.
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Die
Blende bzw. deren Blendenöffnung ist vorteilhafterweise
in einer Bildebene des optischen Systems angeordnet, also in einer
Ebene, in der ein vom optischen System fokussierter Gegenstand abgebildet
wird. Die Blendenöffnung kann ein Abbild der Lichtquelle
sein.
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Die
Blendenöffnung ist zweckmäßigerweise nicht
wie üblich symmetrisch um die optische Achse des optischen
Systems angeordnet sondern unsymmetrisch zur optischen Achse, insbesondere
unsymmetrisch zur optischen Achse der beiden Lichtpfade am Ort der
Blendenöffnung. Insbesondere ist sie vollständig
außerhalb der optischen Achse angeordnet. Hierdurch kann
auf einfache Weise eine Selektion des einen oder anderen Lichtpfads
für eine getrennte Auswertung an verschiedenen Positionen
des Messlichtfokus erreicht werden.
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Eine
besonders genaue Fokussierung kann erreicht werden, wenn die Verläufe
kontinuierliche erfasst werden.
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Zur
genaueren Erläuterung der Erfindung wird ein Autofokusverfahren
beschrieben, zu dessen Ausführung die erfindungsgemäße
Autofokusvorrichtung insbesondere in der Lage ist.
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Bei
diesem Verfahren wird ein Fokus vorteilhaften des optischen Systems
vorteilhafterweise so eingestellt, dass die Signale der Detektorelemente
in einem festen Verhältnis zueinander stehen. Bei einem
Lichteinfall auf die Detektorelemente in einem festen Verhältnis
kann in einfacher Weise eine Symmetrieposition zwischen den Lichtpfaden
und damit die Fokuszielebene erfasst werden. Noch einfacher kann
dies geschehen, wenn die Signale gleich stark sind. Der Weglängenunterschied
der Pfade wird so gewählt, dass bei Überlagerung
der Signale die Signale an einer Flanke überlappen und
somit einen Schnittpunkt aufweisen. In diesem Schnittpunkt sind die
Signale gleich stark. Mithilfe eines Nulldurchgangs des Differenzsignals
kann die gleiche Stärke der Signale einfach erfasst werden.
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Eine
weitere Ausführungsform des Verfahrens sieht vor, dass
eine Zielposition eines Fokus des optischen Systems mit Hilfe der
Signale der Detektorelemente erfasst wird und der Fokus mit Hilfe
der erfassen Zielposition durch einen Aktuator eingestellt wird.
Die Zielposition kann eine vom Aktuator ausgegebene Position sein,
z. B. diejenige Position, an der die Signale der Detektorelemente
gleich sind. Es ist auch möglich, diese Einstellung nur
als Voreinstellung zu verwenden. Alternativ oder z. B. als Feineinstellung
zusätzlich ist es denkbar, die Zielposition durch ein Regeln
zu erreichen, wobei die Detektorsignale als Regeleingangssignale
und ein Signal zum Steuern des Aktuators als Regelausgangssignal
verwendet wird.
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Eine
einfache und zuverlässige automatische Fokussierung kann
erreicht werden, wenn die Detektorelemente so kalibriert sind, dass
die Stärke ihres Signals, das von einer Grenzschicht zurückgeworfenem
Licht hervorgerufen wird, gleich ist. Hierbei liegt die Fokusposition
zweckmäßigerweise in der reflektierenden bzw.
das Licht zurückwerfenden Schicht. Alternativ können
die Detektorelemente so eingestellt sein, dass ihre Signalstärke
gezielt unterschiedlich ist, z. B. um einen gezielten Fokusoffset
zu erreichen.
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Eine
gute Orientierung bei der Suche nach der Zielposition des Fokus
bzw. der Fokuszielebene kann erreicht werden, wenn der Messlichtfokus
durch die Fokuszielebene auf eine Probe-Luft-Grenzfläche zu
bewegt wird und der Reflex der Probe-Luft-Grenzfläche zur
groben Orientierung verwendet wird.
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Zur
Untersuchung einer Probe kann es notwendig sein, dass sie an verschiedenen
Orten untersucht wird, z. B. wenn sie größer als
ein Blickfeld des Mikroskops ist. Hierzu wird sie nach einer ersten
Untersuchung senkrecht zur optischen Achse des optischen Systems
bewegt und anschließend erneut untersucht. Eine schnelle
automatische Fokussierung nach einer solchen Bewegung kann erreicht
werden, die Signale der Detektorelemente nach einer Bewegung der
Probe senkrecht zur optischen Achse des optischen Systems auf Plausibilität
hinsichtlich einer nach wie vor vorhandenen Grobeinstellung auf
die Fokuszielebene überprüft werden. Liegt Plausibilität vor,
kann auf eine zeitaufwendige vollständige neue Fokussierung
verzichtet werden. Die Plausibilität kann ein Grenzwert
im Unterschied der Signale sein, der nicht überschritten
werden darf. Die Plausibilitätsprüfung kann außerdem
zur Grobeinstellung verwendet werden, so dass bei vorliegender Plausibilität nur
noch eine Feineinstellung vorgenommen wird.
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Eine
weitere vorteilhafte Ausführungsform des Verfahrens sieht
vor, dass die Lichtquelle ein Lichtmuster aufweist, das in der Probe
abgebildet wird. Das Lichtmuster kann ein-, zwei oder dreidimensional
sein und ist zweckmäßigerweise in einer Ebene
senkrecht zur optischen Achse des optischen Systems in der Probe
abgebildet. Hierbei wird reflektiertes Licht aus mehreren Musterpunkten
des Lichtmusters jeweils nach Lichtpfaden getrennt erfasst. Hierdurch
kann aus mehreren Zielpositionen zu den mehreren Musterpunkten eine
Verkippung der Fokuszielebene, z. B. zur optischen Achse, erkannt werden.
Die so erzeugten Signale können zur Regelung der Autofokussierung
genutzt werden.
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Bei
der Bewegung des Elements des optischen Systems relativ zur Probe
kann der Aktuator das Element oder die Probe relativ zu einem festen Bezugspunkt,
z. B. einem Erdboden, bewegen.
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Vorteilhafterweise
ist das Steuermittel dazu ausgebildet, einen, mehrere oder alle
der oben angeführten Verfahrensschritte zu steuern.
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Vorteilhafterweise
umfasst die Autofokuseinrichtung ein Messsystem, das dazu vorgesehen
ist, den Abstand des Elements des optischen Systems zur Probe oder
einen davon abhängigen Abstand zu erfassen, insbesondere
auf nicht-optischem Wege. Sobald die Fokusposition optische gefunden
wurde, kann der Abstand mit dem weiteren Messsystem gemessen und
während der Beleuchtung der Probe gehalten werden.
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Die
Erfindung wird anhand von Ausführungsbeispielen näher
erläutert, die in den Zeichnungen dargestellt sind.
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Es
zeigen:
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1 ein
Mikroskop mit einer Autofokusvorrichtung in einer schematischen
Darstellung,
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2 einen
schematisiert dargestellten Strahlengang bzw.
-
Beleuchtungspfade
der Autofokuseinrichtung auf eine Probe,
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3–6 Reflexionsstrahlengänge
bzw. Detektionspfade von der Probe auf zwei Detektorelemente,
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7 ein
Diagramm von Signalen der Detektorelemente und eines veränderten
Arbeitsabstands über die Zeit,
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8 ein
schematisiertes Diagramm der Signale mit einem Differenzsignal,
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9 eine
Projektion eines Lichtpunkts auf eine bewegte schiefe Probe,
-
10 eine
Projektion eines Lichtquellenmusters auf eine ruhende schiefe Probe,
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11 eine
Auftrennung eines Strahlengangs durch einen halbdurchlässigen
Spiegel und
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12 eine
Auftrennung eines Strahlengangs durch einen dichroidischen Spiegel.
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1 zeigt
eine Autofokusvorrichtung 2, die in ein optisches Abbildungssystem 4 integriert
ist. Das optische Abbildungssystem ist in dieser speziellen Ausführungsform
ein Mikroskop zur Fluoreszenzanalyse von biologischem Material in
einer Probe 6. Hierzu umfasst das optische Abbildungssystem 4 einen
Bilddetektor 8 bzw. eine Kamera, der mit einem Steuermittel 10 zur
Aufnahmesteuerung und Speichern aufgenommener Bilder verbunden ist,
oder ein Okular zur direkten Beobachtung der Probe. Das Steuermittel 10 ist
Teil sowohl des optischen Abbildungssystems 4 als auch
der Autofokusvorrichtung 2 und dient zur Steuerung des
im Folgenden beschriebenen Autofokusverfahrens.
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Die
Autofokusvorrichtung 2 umfasst eine Lichtquelle 12,
die Licht für das Autofokusverfahren zur Verfügung
stellt. Sie kann auch das Licht für die Fluoreszenzanalyse
zur Verfügung stellen, wobei es in der Regel zweckmäßiger
sein wird, dass das optische Abbildungssystem 4 hierfür
eine andere, nicht dargestellte Lichtquelle umfasst. Die Lichtquelle 12 weist
einen Lichterzeuger 14 auf, z. B. eine LED (Light Emitting
Diode), und eine Optik 16 zum Formen des abgestrahlten
Lichts, die einen Lichtdiffusor umfassen kann. Eine Blende 18 mit
einem Öffnungsmuster erzeugt ein ein- oder zweidimensionales Lichtquellenmuster,
das zweckmäßigerweise symmetrisch zu einer optischen
Achse 20 eines optischen Systems 22 ist, das neben
der Optik 16 weitere optische Elemente 24 und
ein Objektiv 26 des optischen Abbildungssystems 4 umfassen
kann. Eine räumlich definierte Lichtquelle kann auch die
Elemente 16 und 18 ersetzen. Ein Mittel 28,
das einer Apertur gleich kommt, trennt die Beleuchtung der Probe 6 aus
der Lichtquelle 12 in mehrere Lichtpfade auf, die getrennt
voneinander vom Mittel 28 zur Probe 6 verlaufen
und in der Probe 6 in einen gemeinsamen Messlichtfokus
gebracht werden (Beleuchtungspfade). Das Mittel 28 kann
ebenfalls im Dektionspfad (s. unten) insbesondere bei Fokussierung
auf streuende Objekten zwischen Elementen 30 und 46 angebracht
sein.
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Über
zwei Strahlteiler 30, 32 in Form von dichroidischen
oder halbdurchlässigen Spiegeln wird Licht aus der Lichtquelle 12 in
das Objektiv 26 des optischen Abbildungssystems 4 gelenkt,
das in einem Mikroskopgehäuse 34 gelagert ist
und das Licht auf die Probe 6 fokussiert. Hierzu umfasst
das Objektiv 26 ein optisches Element 36, z. B.
eine Linse, die mittels eines Aktuators 38 entlang der
optischen Achse 20 des Objektivs 26 steuerbar
beweglich ist. Die Steuerung der Position des optischen Elements 36 und
damit des Fokus in der Probe 6 wird durch das Steuermittel 10 vorgenommen.
Der Aktuator selbst kann einen unabhängigen Abstandsmesser
umfassen.
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Von
der Probe 6 reflektiertes Licht durchtritt das Objektiv 26 in
entgegengesetzter Richtung, wie durch einen gestrichelten Pfeil
angedeutet ist, und wird über den Strahlteiler 32 einerseits
in eine Optik 40 und in den Bilddetektor 8 und
andererseits über den Strahlteiler 30 und eine
weitere Optik 42 zu einem Detektor 44 geleitet,
der mehrere Detektorelemente umfasst (Detektionspfad). Die Detektorelemente
können einzelne Sensoren, z. B. Fotodioden, sein oder ein
Gitter von Sensoren. Vor dem Detektor 44 ist eine Blende
mit einer Blendenöffnung 46 angeordnet, die entsprechend
der Blendenöffnung der Blende 18 geformt ist und
in der Bildebene des optischen Systems 22 angeordnet ist,
in der ein Bild der Probe 6 und damit des in der Probe 6 abgebildeten des
Lichtquellenmusters erzeugt ist. Die Blendenöffnung 46 kann
eine oder mehrere Öffnungen umfassen und wird im Folgenden
nur als Blendenöffnung 46 bezeichnet. Der Detektor 44 liefert
seine Signale an das Steuermittel 10, das diese auswertet
und als Steuer- oder Regeleingang für eine Steuerung des Ak tuators 38 verwendet.
Das Steuermittel kann außerdem das unabhängige
Abstandssignal des Aktuators 38 verarbeiten und wahlweise
zur Regelung nutzen.
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2 zeigt
einen schematisiert dargestellten Strahlengang (Beleuchtungspfad)
der Autofokuseinrichtung 2 in zwei Lichtpfaden 48, 50 auf
die Probe 6. Zur Vereinfachung der Darstellung ist das
Lichtmuster der Lichtquelle 12 auf einen Lichtpunkt reduziert, der
durch zwei Öffnungen des Mittels 28 zum Auftrennen
in die Lichtpfade 48, 50 hindurchstrahlt. Licht aus
beiden Lichtpfaden 48, 50 wird in einem punktförmigen
Messlichtfokus 52 in der Probe 6 fokussiert. Da
sowohl für das Messlicht aus der Lichtquelle 12 als
auch das Licht für die Probenuntersuchung durch das Objektiv 26 geführt
wird, kann der Messlichtfokus 52 im Fokus der Kamera bzw.
des optischen Abbildungssystems 4 liegen, der eine Fokusebene
sein kann. Es ist jedoch auch möglich, dass der Messlichtfokus 52 um
eine vorbekannte Abstand 54 von einem Fokus 56 der
Kamera entfernt ist.
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Die
typische Probe 6 umfasst einen Probenträger 58,
auf den biologisches Probenmaterial 60 aufgebracht ist,
das mit einem dünnen transparenten Deckglas 62 abgedeckt
ist. Diese Probe 6 reflektiert einfallendes Licht an drei
Grenzflächen 64, 66, 68, nämlich
der stark reflektierenden Luft-Glas-Grenzfläche 64,
an der deutlich weniger stark reflektierenden Glas-Probenmaterial-Grenzfläche 66 und
an der im Folgenden nicht weiter betrachteten Probenmaterial-Glas-Grenzfläche 68,
wobei bei sehr dünnen Probenmaterialien die Signale eine
Kombination aus den Grenzflächen 66 und 68 entsteht.
Die Glas-Probenmaterial-Grenzfläche 66 bildet
hierbei eine in diesem ersten Ausführungsbeispiel beschriebene
Fokuszielebene 70, in die der Messlichtfokus 52 durch
das Autofokusverfahren geführt werden soll.
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Das
hierzu durchgeführte Autofokusverfahren wird anhand der 3–8 beschrieben.
Die 3–6 zeigen
das optische System 22 und das Objektiv 26 stark
vereinfacht über der Probe 6, die nur anhand der
Grenzflächen 64, 66 angedeutet ist. Der
Detektor 44 ist anhand zweier Detektorelemente 72, 74 dargestellt,
die beidseitig der optischen Achse 20 angeordnet sind.
Die Blendenöffnung 46 vor dem Detektor 44 ist
so angeordnet, dass sie unsymmetrisch versetzt zur optischen Achse 20 zu
liegen kommt, wobei die Achse 20 außerhalb der
Blendenöffnung 46 liegt, sie also nicht durchtritt.
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Die
beiden Lichtpfade 48, 50 sind in ihrem auf die
Probe 6 einfallenden Teil dünn punktiert dargestellt
und auf den Messlichtfokus 52 gerichtet, der im Probenträger 58 liegt,
also unterhalb der Fokuszielebene 70, die identisch mit
der Grenzfläche 66 ist. Von der stark reflektierenden
Grenzfläche 64 reflektiertes Licht ist in durchgezogenen
Linien dargestellt und von der weniger stark reflektierenden Grenzfläche 66 reflektiertes
Licht in gestrichelten Linien. Es ist ersichtlich, dass zum einen
im Messlichtfokus 52 kein oder vernachlässigbar
wenig Licht reflektiert wird und zum anderen das von den Grenzflächen 64, 66 reflektierte
Licht die Blendenöffnung 46 verfehlt, so dass
kein Licht zu den Detektorelementen 72, 74 gelangt.
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In 4 ist
die Probe 6 im Vergleich zur Abbildung in 3 nach
unten bewegt, wie durch Pfeile angedeutet ist, so dass der Messlichtfokus 52 relativ zur
Probe 6 nach oben bewegt wurde. Die Bewegung der Probe 6 ist äquivalent
zur Bewegung des Objektivs 26 anhand des Aktuators 38.
Bei der in 4 dargestellten Stellung der
Probe 6 zum Objektiv 26 liegt der Messlichtfokus 52 knapp
unterhalb der Grenzfläche 66. Durch die Asymmetrie
der Blendenöffnung 46 zur optischen Achse 20 tritt
bei dieser Position reflektiertes Licht aus dem Lichtpfad 48 durch die
Blendenöffnung 46 und fällt auf das Detektorelement 72,
wohingegen Licht vom Lichtpfad 50 die Blendenöffnung 46 verfehlt,
so dass das Detektorelement 74 abgeschattet bleibt.
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Bei
einer weiteren Bewegung der Probe 6 nach unten oder des
Messlichtfokus 52 in der Probe 6 nach oben erreicht
der Messlichtfokus 52 die Grenzschicht 66 und
Fokuszielebene 70, wie in 5 dargestellt
ist. Die Reflexionen beider Lichtpfade 48, 50 kreuzen
sich in der Bildebene, in der die Blende und die Blendenöffnung 46 angeordnet
sind. Durch die asymmetrische Blendenöffnung 46 außerhalb
der optischen Achse 20 werden beide Lichtpfade 48, 50 weitgehend
abgeschattet, jedoch nicht vollständig wegen der flächigen
Apertur der Lichtpfade 48, 50. Beide Detektorelemente 72, 74 empfangen jeweils
etwas und gleich viel Licht und senden ein gleiches Signal an das
Steuermittel 10.
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6 zeigt
die Lichtpfade 48, 50 bei einer noch weiteren
Bewegung der Probe 6 nach unten oder des Messlichtfokus 52 in
der Probe 6 nach oben. Der Messlichtfokus 52 verlässt
die Grenzschicht 66 und nähert sich der Grenzschicht 64,
so dass die Reflexion der Grenzschicht 66, die nur noch das
Detektorelement 74 erreicht, immer weiter abgeschattet
wird und die Reflexion der Grenzschicht 64 immer stärker
durch die Blendenöffnung 46 auf das Detektorelement 72 fällt.
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In 7 sind
die Amplituden A des Signals 76 des Detektorelements 72 und
des Signals 78 des Detektorelements 74 bei einer
Bewegung des Messlichtfokus 52 in der Probe 6 wie
zu den 3–6 beschrieben über
die Zeit t dargestellt. Außerdem ist die Bewegung der Position 80 des
Messlichtfokus 52 in z-Richtung, die parallel zur optischen
Achse 20 des Objektivs 26 ist, über die
Zeit t korrelierend zu den Signalen 76, 78 dargestellt.
Vier Zeitpunkte III, IV, V, VI sind markiert, die den Positionen 80 des
Messlichtfokus 52 in den 3, 4, 5, 6 entsprechen.
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Zum
automatischen Fokussieren der Probe 6 wird zunächst
der Lichterzeuger 14 der Autofokus-Lichtquelle 12 eingeschaltet
und das Objektiv 26 bzw. deren durch den Aktuator 38 bewegliches
optisches Element 36 in ihre Ausgangsstellung – in
den Figuren in Richtung der Probe 6 ganz nach unten – bewegt,
damit der Messlichtfokus 52 innerhalb der Probe 6 liegt
und dort zweckmäßigerweise innerhalb des Probenträgers 58.
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Nun
wird der Aktuator 38 so bewegt, dass der Messlichtfokus 52 ganz
durch das Probenmaterial 60 und durch die Fokuszielebene 70 hindurchbewegt
wird. Gleichzeitig werden kontinuierlich die Signale 76, 78 der
Detektorelemente 72, 74 und zweckmäßigerweise
auch ein Positionssignal des Aktuators 38 aufgenommen.
Zunächst steigt das Signal 76 des Detektorelements 72 an,
um schnell wieder abzufallen. Dann steigt das Signal 78 des
Detektorelements 74 an und fällt ebenfalls wieder
ab, beide entsprechend des Lichteinfalls durch die Blendenöffnung 46 wie
zu den 4–6 beschrieben.
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Insbesondere
wird die Position des Schnittpunkts der Flanken der Signale 76, 78 – im
Folgenden Zielposition – aufgenommen, in der der Messlichtfokus 52 in
der Fokuszielebene 70 liegt. Diese Zielposition wird durch
das Steuermittel 10 erfasst, das mit dem Aktuator 38 verbunden
ist, der seine Position bzw. die des optischen Elements 36 ständig oder
auf Anfrage des Steuermittels 10 an das Steuermittel 10 gibt.
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Das
erneute starke Ansteigen erst des Signals 76 und dann des
Signals 78 über einen Grenzwert g wird als Zeichen
und Orientierung dafür genommen, dass sich der Messlichtfokus 52 der
stark reflektierenden Grenzfläche 64 nähert
und somit oberhalb der Fokuszielebene 70 liegt. Das Bewegen des
Messlichtfokus 52 nach oben wird gestoppt.
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Nun
kann in einem einfachen Verfahrensschritt der Aktuator 38 entsprechend
der erfassten Zielposition eingestellt werden und die Probe 6 ist sehr
zügig fokussiert. Der Messlichtfokus 52 ist auf die
Fokuszielebene 70 eingestellt und damit auch der Fokus
des Mikroskops 4, wenn der Messlichtfokus 52 in
diesem Fokus liegt. Ansonsten ist der Fokus auf eine gewünscht
Ebene eingestellt, die um eine bekannte Strecke von der Fokuszielebene 70 entfernt ist.
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Eine
genauere Fokussierung wird erreicht, wenn die Bewegung des Messlichtfokus 52 umgekehrt
wird und der Messlichtfokus 52 diesmal langsamer in das
Probenmaterial 60 hineingeführt wird, wie in 7 dargestellt
ist. Es bildet sich wieder das Maximum des Signals 76,
und ein Einstellen der Signale 76, 78 auf Signalgleichheit
führt den Messlichtfokus 52 in die Fokuszielebene 70.
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Eine
Regelung auf die Zielposition anhand der Signale 76, 78 ist
im Folgenden anhand 8 erläutert. Es wird
ein Differenzsignal 82 aus der Differenz zwischen den Signalen 76, 78 gebildet,
z. B. durch Subtraktion der Signale 76, 78, und
als Regelgröße verwendet mit dem Nulldurchgang 84 als
Regelzielwert. Im Nulldurchgang 84 liegt der Messlichtfokus 52 in
der Zielposition 86. Vorteilhafterweise ist der Detektor 44 hierzu
so kalibriert, dass die Signale 75, 78 gleich
sind, wenn der Messlichtfokus 52 in der Fokuszielebene 70 liegt.
Soll der Messlichtfokus 52 etwas außerhalb der
reflektierenden Grenzschicht 66 liegen, so kann ein Offset
auf ein Signal 76, 78 gegeben oder ein Signal 76, 78 mehr
oder weniger verstärkt werden. Hierdurch verschiebt sich
der Nulldurchgang 84 entsprechend in z-Richtung. Ist die
Relation von Offset oder Verstärkung zur Verschiebung bekannt,
so kann die Fokuszielebene 70 entsprechend um die Grenzfläche 66 herum
eingestellt werden, ohne dass das zu den 7 und 8 geschilderte
Autofokusverfahren geändert werden muss. Die entsprechende
Einstellung des Detektors 44 kann als Kalibrierung vor
einem Autofokusverfahren durchgeführt werden oder während
des Autofokusverfahrens auf entsprechende Anweisung des Steuermittels 10.
-
Nach
dem Einstellen oder Einregeln der Fokusposition kann der Lichterzeuger 14 ausgeschaltet und
die Fokusposition mittels des Positionssignals des Aktuators 38 geregelt
oder gehalten werden. Dies hat den Vorteil, dass das Autofokus-Lichtmuster während
der Belichtung nicht mit der Kamera abgebildet wird. Optional kann
der Lichterzeuger 14 kontinu ierlich eingeschaltet bleiben
und die Regelung nach dem Differenzsignal 82 durchgeführt
werden.
-
Nun
können Bilder der Probe 6 bzw. des Probenmaterials 60 aufgenommen
werden, ggf. an mehreren z-Positionen. Diese können durch
eine entsprechende Steuerung des Aktuators 38 angefahren werden.
Es ist auch möglich, diese durch eine Signalverschiebung
eines oder beider Signale 76, 78 zu erreichen.
-
Zur
Aufnahme mehrerer Bilder einer großen Probe 6 wird
diese in x-y-Richtung 88, also senkrecht zur s-Achse bzw.
optischen Achse 20 bewegt, wie in 9 angedeutet
ist. Die Fokussierung kann hierbei erhalten bleiben. Ist die Probe 6 jedoch
schief, verrutscht der Messlichtfokus 52 um eine Strecke 90 in z-Richtung
innerhalb der Probe 6. Um dies zu erkennen, werden die
Signale 76, 78 an der neuen x-y-Position auf Plausibilität überprüft.
Falls die Signale 76, 78 nicht der Erwartung entsprechen,
also außerhalb von Grenzwerten liegen, wird das grobe Finden
der Fokuszielebene 70 eingeleitet, wie zu 7 beschrieben
ist. Sind die Signale 76, 78 akzeptabel kann direkt
mit der Regelung begonnen werden, z. B. auf den Nulldurchgang 84.
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10 zeigt
eine Projektion eines Lichtquellenmusters auf eine ruhende, schiefe
Probe 6. Anhand eines einzigen Autofokus-Lichtpunkts kann nicht
erkannt werden, ob die Probe 6 relativ zur optischen Achse 20 schief
ist. Umfasst jedoch der Messlichtfokus 52 mehrere Fokuspunkte 92,
z. B. indem ein Lichtmuster an mehreren Fokuspunkten 92 in
der Probe abgebildet wird, können Reflexionen aus jedem
Fokuspunkt 92 über jeweils zumindest zwei Lichtpfade
getrennt ausgewertet werden, wie oben beschrieben wurde. Auf diese
Weise kann erkannt werden, dass die jeweils gefundenen Fokuszielebenen
zu den einzelnen Fokuspunkten 92 nicht identisch sind.
Es kann ein Fehlersignal ausgegeben werden, so dass die Probe 6 erneut
und gerade in ihre Halterung eingesetzt wird.
-
11 und 12 zeigen
alternative Detektionsschemen, die zwei im optischen System 22 räumlich
nicht getrennte optische Pfade nutzen. In 11 wird
ein Strahl im Detektionspfad erst nach dem optischen System 22 und
vor den Detektoren 72, 74 mittels eines halbdurchlässigen
Spiegels 94 getrennt. Mittels zweier Blendenöffnungen 46,
die asymmetrisch zum Spiegel 94 vor den Detektoren 72, 74 angeordnet
sind, wird das Abstandssignal der gering unterschiedlichen Wege
detektiert. Die Asymmetrie ist durch die unterschiedlichen Abstände 96, 98 der
Blendenöffnungen 46 senkrecht zum Spiegel 94 dargestellt.
-
In 12 emittiert
der Lichterzeuger 14 Strahlung mit zwei unterschiedlichen
Frequenzen (λ1, λ2), die vor den Detektoren 72, 74 mittels
eines dichroidischen Spiegels 100 getrennt werden. Wiederum
wird mit Hilfe der Blendenöffnungen 46 das Abstandsignal
erzeugt. In diesem Fall können die Blendenöffnungen 46 symmetrisch
zum dichroidischen Spiegel 100 angeordnet sein, wenn der
Brechungsindex des optischen Systems 22 die Lichtpfade
der unterschiedlichen Frequenzen ausreichend räumlich trennt,
wie in 12 durch die Abstände
der beiden Lichtpfade vor dem Spiegel 100 dargestellt ist.
-
- 2
- Autofokusvorrichtung
- 4
- Mikroskop
- 6
- Probe
- 8
- Bilddetektor
- 10
- Steuermittel
- 12
- Lichtquelle
- 14
- Lichterzeuger
- 16
- Optik
- 18
- Blende
- 20
- optische
Achse
- 22
- optisches
System
- 24
- optisches
Element
- 26
- Objektiv
- 28
- Mittel
- 30
- Strahlteiler
- 32
- Strahlteiler
- 34
- Mikroskopgehäuse
- 36
- optisches
Element
- 38
- Aktuator
- 40
- Optik
- 42
- Optik
- 44
- Detektor
- 46
- Blendenöffnung
- 48
- Lichtpfad
- 50
- Lichtpfad
- 52
- Messlichtfokus
- 54
- Abstand
- 56
- Fokus
- 58
- Probenträger
- 60
- Probenmaterial
- 62
- Deckglas
- 64
- Grenzfläche
- 66
- Grenzfläche
- 68
- Grenzfläche
- 70
- Fokuszielebene
- 72
- Detektorelement
- 74
- Detektorelement
- 76
- Signal
- 78
- Signal
- 80
- Position
- 82
- Differenzsignal
- 84
- Nulldurchgang
- 86
- Zielposition
- 88
- Richtung
- 90
- Strecke
- 92
- Fokuspunkt
- 94
- Spiegel
- 96
- Abstand
- 98
- Abstand
- 100
- Spiegel
- A
- Amplitude
- g
- Grenzwert
- t
- Zeit
- z
- Richtung
der optischen Achse
-
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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