DE102009019290B4

DE102009019290B4 - Mikroskopvorrichtung

Info

Publication number: DE102009019290B4
Application number: DE200910019290
Authority: DE
Inventors: Rainer Uhl
Original assignee: Ludwig Maximilians Universitaet Muenchen LMU; Till I D GmbH
Current assignee: Till Id De GmbH
Priority date: 2009-04-30
Filing date: 2009-04-30
Publication date: 2011-09-01
Anticipated expiration: 2029-05-01
Also published as: DE102009019290A1

Abstract

Mikroskopvorrichtung, mit einem Objektiv (10), einer Tubuslinse (14), einer Lichtquelle (16, 216) zum Beleuchten einer Probe, einer Optik (20, 156, 256) zum Einkoppeln des Beleuchtungslichts in das Objektiv, einem feldbegrenzenden Begrenzungselement (26, 122), einem Detektor (34, 234) für an einer Probengrenzfläche (18) reflektiertes Beleuchtungslicht (32, 32', 132, 232), sowie einem Auskoppelelement (30, 130, 230), um einen Teil des von der Probenoberfläche reflektierten und mindestens einen Teil der Einkoppeloptik rückwärts durchlaufenden Beleuchtungslichts auf den Detektor zu lenken, wobei die Anordnung Begrenzungselement, Auskoppelelement und Detektor so gewählt ist, dass sich die Intensitätsverteilung des reflektierten Lichts auf der Detektorfläche in Abhängigkeit von dem Abstand zwischen Objektiv und Probengrenzfläche verändert, so dass das Detektorsignal ein Maß für die Fokussierung des Objektivs bildet, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikroskopvorrichtung für eine TIRF-Beleuchtung der Probe ausgebildet ist, dass die Optik zum Einkoppeln des Beleuchtungslichts (224) in das Objektiv (10) ausgebildet ist, um das Beleuchtungslicht in die Ebene...

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Mikroskopvorrichtung mit einem Objektiv, einer Lichtquelle zum Beleuchten einer Probe, einer Optik zum Einkoppeln des Beleuchtungslichts in das Objektiv und einem Begrenzungselement, um den in das Objektiv einzukoppelnden Beleuchtungslichtstrahl zu begrenzen.
In der Mikroskopie ist es grundsätzlich wünschenswert, die Fokussierung der Probe bezüglich des Objektivs in einfacher Weise bewerkstelligen zu können und eine einmal gefundene Fokusposition der Probe auch dann noch konstant zu halten, wenn sich die Probe (gewollt oder ungewollt) relativ zum Objektiv bewegt.
Hierzu wird bei bekannten Mikroskopvorrichtungen gewöhnlich auf Messlicht zurückgegriffen, das von einer Grenzfläche des das Präparat haltenden Probengefäßes zurückreflektiert wird. Um dabei die eigentliche Probenbeobachtung nicht zu stören und Bilder nicht zu verfälschen, setzt man üblicherweise einen Infrarot-Laser als Messlichtquelle ein, dessen Rückreflexe gemessen werden. In den meisten Fällen wird als reflektierende Fläche die Grenzfläche zwischen dem Deckglas und dem das Präparat einbettenden Medium verwendet.
Dabei muss der für die Infrarot-Lasermessung erforderliche Messlichtbeleuchtungs- und Messlichtmessstrahlengang – zusätzlich zu den anderen Strahlengängen – in das Mikroskop ein- bzw. ausgekoppelt werden. Geschieht dies da, wo in einem Mikroskop üblicherweise Platz ist und Auflicht- bzw. Bildstrahlengang leicht zugänglich sind, d. h. vom Objektiv aus gesehen hinter dem für beispielsweise eine Auflichtfluoreszenzmessung benötigten dichroitischen Strahlteiler, müssen alle Strahlteiler und Sperrfilter zusätzlich zur für die Fluoreszenzmessung erforderlichen spektralen Charakteristik auch noch ein spektrales Fenster für den Infrarot-Laser für die Fokusmessung aufweisen. Da dies eine ernsthafte Einschränkung bedeutet, sind einige Mikroskophersteller mittlerweile dazu übergegangen, zusätzlichen Raum zwischen Objektiv und Strahlteiler zu schaffen, um das Infrarot-Laserfokusmesslicht dort einzukoppeln.
Beispiele für Mikroskope mit separater Infrarot-Lichtquelle zur Fokusmessung sind in der US 4,025,785 und der DE 102 34 757 B4 zu finden.
In der EP 0 273 717 A2 ist ein Mikroskop beschrieben, bei welchem ein separater He-Ne-Laser als Lichtquelle für die Fokusmessung verwendet wird.
In der WO 01/88599 A1 ist eine konfokale Autofokussiereinrichtung für optische Geräte beschrieben, bei welcher eine von einem Messlichtlaser beleuchtete Messblende eine Punktlichtquelle bildet, die auf die Probenoberfläche abgebildet wird, wobei das von der Probenoberfläche reflektierte Messlicht nach Durchlaufen mehrerer Punktblenden auf einem Detektor abgebildet wird, und wobei aus dem Detektorsignal auf die Fokusposition rückgeschlossen wird.
Eine Vorrichtung gemäß dem Oberbegriff von Anspruch 1 ist aus der DE 33 39 970 A1 bzw. aus der US 2007/0138371 A1 bekannt.
Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine TIRF-Mikroskopvorrichtung zu schaffen, bei welcher auf möglichst einfache Weise die Fokusposition kontrolliert werden kann.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch eine Mikroskopvorrichtung gemäß Anspruch 1.
Bei der erfindungsgemäßen Lösung ist vorteilhaft, dass keine zusätzliche Lichtquelle erforderlich ist, weil das für den Betrieb des Mikroskops ohnehin vorhandene Beleuchtungslicht zur Fokusmessung verwendet werden kann. Man bedient sich dabei der Tatsache, dass ein räumlich begrenzter Beleuchtungsstrahl nach Reflexion an der Probengrenzfläche eine Referenzfläche räumlich versetzt passiert und dass dieser Strahlversatz für einen bestimmten Einstrahlwinkel (α) vom Grad der Defokussierung (Δ) abhängt, wie dies schematisch aus 8 ersichtlich ist.
Die Erfindung beinhaltet eine geeignete Auskoppel- und Detektoranordnung, mittels der von der Probengrenzfläche reflektiertes und die Einkoppeloptik rückwärts durchlaufendes Beleuchtungslicht aufgefangen und in ein Messsignal überführt werden kann, das sich in Abhängigkeit von der Fokus-Position verändert. Da dies erfindungsgemäß keine zusätzliche Lichtquelle erforderlich macht, ist naturgemäß immer der passende Strahlteiler im Strahlengang, was den Einsatz spezieller Filterkombinationen, beispielsweise mit einem spektralen Fenster für Infrarotlicht zur Fokusmessung, vermeidet. Es wird nicht nur der Einsatz in allen handelsüblichen Mikroskopen, bei denen zwischen Objektiv und Strahlteiler Extraraum geschaffen wurde, ermöglicht, sondern es wird auch eine kompaktere Bauart des Fokustriebs ermöglicht, der dadurch stabiler ausgelegt sowie schneller und präziser bewegt werden kann.
Vorzugsweise erfolgt die Strahlauskopplung aus dem reflektierten Strahl an einer Stelle, an der der Beleuchtungsstrahl gar nicht oder nur so beeinflusst wird, dass das vom Auge oder der Kamera gesehene Gesichtsfeld nicht obstruiert wird. Im folgenden wird eine Realisierungsform beschrieben, die diese Anforderungen erfüllt.
Erfindungsgemäß ist die Mikroskopvorrichtung für eine TIRF-Beleuchtung der Probe ausgebildet. Dabei ist die Optik zum Einkoppeln des Beleuchtungslichts in das Objektiv so ausgebildet, dass das Beleuchtungslicht in der Ebene der Objektivpupille einen Fokus besitzt, dessen Position in der Pupillenebene den Beleuchtungswinkel vorgibt, unter dem die Probe beleuchtet wird. Dieser (in zwei Dimensionen variable) Fokuspunkt wird durch eine telezentrische Anordnung zweier Linsen (von der die zweite eine Tubuslinse ist) in die Objektivpupille abgebildet. Das Auskoppelelement ist ein im Unendlichraum zwischen den beiden Linsen angeordneter Strahlteiler, der nur einen winzigen Bruchteil des auftreffenden Lichts reflektiert und diesen auf zwei verschiedene Detektoren richtet, einen, der den Bruchteil des eingestrahlten (Beleuchtungs-)Lichts „sieht”, und einen zweiten, der das von der Probengrenzfläche reflektierte Licht detektiert. Vor den Detektoren befindet sich jeweils ein als Blende ausgelegtes Selektionselement, das bei einer in der Objektiv-Pupille zentrierten Fokusposition den geringsten Teil des auftreffenden Lichts passieren lässt. Die Lichtmenge, die der Detektor für das von der Probengrenzfläche reflektierte Licht detektiert, ändert sich mit der Position des Fokuspunktes in der Objektivpupille und nimmt dramatisch zu, sobald der TIRF-Winkel (d. h. der Winkel der Totalreflexion) überschritten ist. Je steiler dieser Übergang ist, um so besser ist der Fokus in der Objektivpupille ausgebildet, und bei einem einmal eingestellten vorgegebenen TIRF-Winkel hängt das Detektorsignal nur noch von der relativen Fokusposition ab. Im Spezialfall von TIRF erlaubt es diese Meß-Variante, die wie die vorher aufgeführten auch nur das Anregungslicht als Meßlicht benötigt, nicht nur die Fokusposition bei einem gegebenen TIRF-Winkel zu bestimmen, sondern auch den TIRF-Winkel bei einer vorgegebenen Fokusposition sowie die Güte der Fokussierung in der Objektivpupille. Um ein Referenzsignal zu haben, wird ein Bruchteil des Anregungslichts vom gleichen Auskoppelelement (Strahlteiler) auf einen zweiten Detektor gelenkt, vor dem ein analoges Begrenzungselement (Blende) angebracht ist. Diese Blende ist so angeordnet, dass das Signal aufgrund einer vom TIRF-Winkel abhängigen Überstrahlung der Maske vom TIRF-Winkel, d. h. von der Dezentrierung der Lichtquelle, abhängt.
Vorzugsweise ist eine Steuereinheit vorgesehen, um das Signal der beiden Detektoren zu vergleichen, um den TIRF-Übergang festzustellen, wobei die Steuereinheit zweckmäßigerweise so ausgebildet ist, dass der TIRF-Übergang festgestellt wird, wenn die Signale der beiden Detektoren in etwa gleich groß sind, wobei die Intensität der Lichtquelle in Abhängigkeit von dem Verhältnis der Signale der beiden Detektoren so gesteuert wird, dass die Intensität der Lichtquelle nach erfolgtem TIRF-Übergang erhöht wird.
Im folgenden wird eine Ausführungsform der Erfindung anhand der beigefügten Zeichnungen näher erläutert. Dabei zeigen:
1A bis 1E eine Seitenansicht des Strahlengangs eines ersten Beispiels einer erfindungsgemäßen Mikroskopvorrichtung, die nicht unter vorliegende Erfindung fällt, mit (A) in der Fokusebene, (B) vor der Fokusebene bzw. (C) hinter der Fokusebene des Objektiv befindlicher Probengrenzfläche, wobei in den 1A, 1B und 1D jeweils der die obere Hälfte der Objektivpupille passierende Teil des Eintrittsstrahls und in den 1C und 1E der den unteren Teil der Objektivpupille passierende Teil des Eintrittsstrahls gezeigt ist;
2A bis 2C schematisch das Signal der ersten Detektorhälfte, der zweiten Detektorhälfte bzw. das Differenzsignal der beiden Detektorhälften in Abhängigkeit von der Fokusposition der Probengrenzfläche;
3 eine Ergänzung der Ausführungsform gemäß 1A bis 1E, die nicht unter vorliegende Erfindung fällt;
4A und 4B eine Seitenansicht des Strahlengangs eines zweiten Beispiels eines Mikroskops, das nicht unter vorliegende Erfindung fällt, mit in der Fokusebene bzw. vor der Fokusebene des Objektivs befindlicher Probengrenzfläche;
5 eine Seitenansicht des Strahlengangs einer Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Mikroskopvorrichtung mit zentriertem Beleuchtungs-Spot und im Fokus des Objektivs befindlicher Probengrenzfläche;
6 die Anordnung von 5 mit dezentriertem Beleuchtungs-Spot;
7 schematisch die Signale der beiden Detektoren in Abhängigkeit vom TIRF-Winkel; und
8 eine schematische Darstellung des Parallelversatzes des an einer Probengrenzfläche reflektierten Strahls in Abhängigkeit von der Defokussierung des Objektivs.
In den 1A bis 1E ist ein Beispiel einer nicht unter die vorliegende Erfindung fallenden Mikroskopvorrichtung gezeigt, die ein Objektiv 10 mit einer Objektpupille 12, eine Tubuslinse 14, eine Beleuchtungslichtquelle 16 zum Beleuchten einer Probenfläche 18, sowie eine schematisch dargestellte Optik 20 zur Beleuchtung der Feldblendenebene 22 mit Hilfe der Lichtquelle 16 aufweist. Vom gesamten Auflichtstrahlengang ist in der Schemazeichnung nur ein Strahlenbündel 24 gezeigt, das sich in der Feldblendenebene vereint und ein Strahlbegrenzungselement 26 mit einer Begrenzungskante 28 gerade noch passiert. Das Strahlbegrenzungselement 26 hat die Funktion, den in das Objektiv 10 einzukoppelnden Beleuchtungsstrahl 24 seitlich so zu begrenzen, dass das Gesichtsfeld des Mikroskop-Detektors (nicht gezeigt) in der Objektebene 18 gerade nicht eingeschränkt wird. Die dem Objektiv 10 zugewandte Fläche 30 des Begrenzungselements 26 ist reflektierend ausgebildet, um gegebenenfalls von der Probenfläche 18 reflektiertes Beleuchtungslicht 32 auf einen Dualdetektor 34 (in 1A nicht dargestellt) mit zwei Hallten bzw. Sektoren 34a und 34b zu reflektieren. Dabei ist eine Linse 36 vorgesehen, die zusammen mit der Tubuslinse 14 das auf der Grenzfläche 30 reflektierte Licht auf dem Detektor 34 leitet und zwar dergestalt, dass sich der Detektor 34 in einer zur Fokusebene 38 des Objektivs 10 konjugierten Ebene befindet. Das Begrenzungselement 26 kann, wie gezeigt, als Prisma ausgebildet sein.
Sofern sich nun, wie in 1A gezeigt, eine reflektierende Grenzfläche 18 der Probe genau in der Fokusebene 38 des Objektivs 10 befindet, wird das Beleuchtungsstrahlenbündel 24, das auf dem Hinweg das Begrenzungselement 26 gerade noch passiert, so zurückreflektiert, dass es in der Feldblendenebene 22 wieder an seinem Ausgangspunkt landet, d. h. es wird durch die Kante 28 des Begrenzungselements 26 nicht beeinträchtigt, sondern kann ungehindert passieren. Somit wird kein Anteil des in der Fokusebene 38 befindlichen Probengrenzfläche 18 reflektierten Lichts auf den Detektor 34 reflektiert. Zur Verdeutlichung der Darstellung ist in 1A sowie in den 1B und 1D jeweils nur die den oberen Teil der Objektivpupille 12 passierende Hälfte des Beleuchtungsstrahlenbündels 24 und die den unteren Teil der Objektivpupille 12 passierende Teil des reflektierten Lichtbündels 32 gezeigt. Gemäß der Definition der Schemazeichnung besitzt der Winkel α dieser Hälfte des Beleuchtungslichts ein positives Vorzeichen, der Winkel des reflektierten Lichts entsprechend ein negatives Vorzeichen.
Befindet sich die Fokusebene 38 des Objektivs 10 dagegen in der Probe, d. h. kommt die Fokusebene 38 des Objektivs 10 jenseits der reflektierenden Probenfläche 18 zu liegen, (siehe 1B und 1C), landet das reflektierte Strahlenbündel 32 dadurch zumindest teilweise auf dem Begrenzungselement 26, d. h. der reflektierenden Fläche 30 und wird aus dem Strahl ausgekoppelt und auf den Detektor 34 gelenkt. Der ausgekoppelte Teil des reflektierten Strahls 32 ist mit 40 bezeichnet. Die beiden Hälften 34a und 34b des Detektors 34 sind so positioniert, dass sie ein scharfes Bild der oberen Hälfte der Pupille 12 (in der Detektorhälfte 34a) bzw. der unteren Hälfte der Pupille 12 (in der Detektorhälfte 34b) erfassen. Wie im Vergleich zu verdeutlicht, trifft bei der gezeigten Fokuslage nur Licht mit Einfallswinkel α > 0 auf den Detektor. Dessen Grenzfläche zwischen den Detektorhälften ist so positioniert und ausgerichtet, dass Licht, das nach Reflexion die „unteren Pupillenhälfte” passiert (bei dem der Winkel „α” nach Reflektion ein negatives Vorzeichen aufweist) auf 34a, reflektiertes Licht, das die obere Pupillenhälfte passiert auf Detektorhälfte 34b landet. Wie groß der Anteil des ausgekoppelten Strahls 40 ist, hängt vom Grad der Defokussierung, d. h. vom Abstand z der reflektierenden Probenfläche 18 von der Fokusebene 38, ab.
Umgekehrt ist die Situation bei der in den 1B und 1E gezeigten Defokussierung in die entgegengesetzte Richtung, wo dann die Detektorhälfte 34a nicht auf die Defokussierung anspricht, während nun die Detektorhälfte 34b mit zunehmender Defokussierung eine größere Lichtmenge erhält und das Signal entsprechend ansteigt, da die reflektierenden Fläche 30 nur Licht aufsammeln kann, das mit Winkeln α < 0 auf die Probengrenzfläche 18 trifft und dessen Probenrückreflex demnach auf der Detektorhälfte 34b landet.
Zusammengefasst wird die Situation in der : Ist die reflektierende Probengrenzfläche 18 genau in der Fokusebene 38 des Objektivs 10, sehen beide Detektorhälften 34a und 34b kein Licht. Liegt die Fokusebene 38 in der Probe, dann sieht nur Detektor 34a ein Signal, das kontinuierlich abnimmt je mehr sich der Objektivfokus der Grenzfläche nähert. Der Detektor 34b sieht derweil kein Signal. Das ändert sich beim „Null-Durchgang”, d. h. wenn der Objektiv-Fokus 38 sich durch die Probengrenzfläche 18 bewegt. Von diesem Punkt an sieht Detektor 34b ein stetig zunehmendes Signal, während Detektor 34a kein Signal mehr sieht. Somit ergibt die Differenz der Signale (2C) der Detektoren 34a (2A) und 34b (2B) ein stetig mit der Fokusposition variierendes Signal.
Um das Detektorsignal unabhängig von Intensitätsschwankungen der Lichtquelle 16 zu machen, wird vorzugsweise ein Referenzsignal registriert. Dies kann gemäß 3 beispielsweise dadurch erfolgen, dass ein Referenzsignal-Auskoppelelement, welches aus einer zweiten reflektierenden Fläche 44 des Begrenzungselements 26 gebildet wird, und ein Referenzsignal-Detektor 46 vorgesehen werden, wobei die Fläche 44 so angeordnet ist, dass ein Teil 48 des einfallenden Beleuchtungslichtstrahls 24 vor dem Eintritt in die Einkoppeloptik des Objektivs 10 auf den Referenzsignal-Detektor 46 ausgekoppelt wird (der ausgekoppelte Teil 48 des Beleuchtungslichts würde dabei ohnehin außerhalb des genutzten Gesichtsfelds ankommen). Auf diese Weise kann das Signal des Detektors 34 bezüglich der Intensität des Beleuchtungslichts kalibriert werden.
In den 4A und 4B ist ein alternatives, nicht unter die vorliegende Erfindung fallendes Beispiel gezeigt. Während bei dem Beispiel gemäß 1A bis 1E das Auskoppelelement 30 in der Feldebene 22 (d. h. in einer zur Objektebene konjugierten Ebene) und der Detektor 34 in einer zur Objektivpupille 12 konjugierten Ebene angeordnet ist, ist bei dem Beispiel gemäß 4A und 4B das Auskoppelelement 130 in einer zur Objektivpupille 12 konjugierten Ebene angeordnet, während sich der Detektor 34 in einer zur Objektebene 38 bzw. Feldblendenebene 22 konjugierten Ebene befindet. Gemäß 4A und 4B befinden sich Strahlbegrenzungselement 122 und Auskoppelelement 130 in unterschiedlichen Ebenen. Letzteres befindet sich in der Ebene 150, einer zur Objektivpupille 12 konjugierten Ebene. Dort entspricht jeder Punkt genau einem Strahl-Winkel im Raum jenseits des Objektivs 10. Somit enthält der vom Auskoppelelement 130 ausgekoppelte Anteil des an der Probenfläche 18 reflektierten Beleuchtungslichtstrahls 132 nur die Winkelanteile „α”, die der Position des Auskoppelelements 130 in der zur Objektivpupille 12 konjugierten Ebene 150 entsprechen. Im in 4A und 4B gezeigten Beispiel sind das nur Winkel „α”, die mit negativem Vorzeichen auf die Probengrenzfläche 18 auftreffen und mit positivem Vorzeichen reflektiert werden. Die entsprechenden Winkel des Beleuchtungslichts 124 mit umgekehrten Vorzeichen (α > 0) werden auf „dem Hinweg” aus dem Strahl entfernt, d. h. die Probe wird mit keiner symmetrischen Winkelverteilung beleuchtet. Das tut der Homogenität der Beleuchtung jedoch keinen Abbruch.
Die Fläche des Dualdetektors 34 mit den beiden Detektorhälften 34a und 34b befindet sich in einer zur Fokusebene 38 des Objektivs 10 und zur Feldblendenebene 22 konjugierten Ebene 152. Zum Abbilden des reflektierten Beleuchtungslichts 132 ist eine Linse 154 zwischen dem Auskoppelelement 130 und dem Detektor 134 vorgesehen. Zwischen der zur Objektivpupille 12 konjugierten Ebene 150 und der Feldblendenebene 22 ist eine Linse 156 angeordnet, in deren Brennebene die Ebene 150 liegt. Die Linse 156 dient zusammen mit der Tubuslinse 14 dazu, das Beleuchtungslicht auf die Objektivpupille 12 zu fokussieren.
Das Auskoppelelement 130 kann beispielsweise als Prisma ausgebildet sein.
Bei der gezeigten Anordnung kann das Bild der Feldblende 122, das zuerst mit Hilfe der Linsen 14 (Tubuslinse) und 10 (Objektiv) auf die Probe abgebildet, dort reflektiert, von den Linsen 10 und 14 rückwärts in die Feldblende 122 und danach von den Linsen 156 und 154 auf den Dualdetektor 34 abgebildet wurde, dort nur dann dort vollständig detektiert werden, wenn sich die reflektierende Fläche 18 genau in der Fokusebene 38 des Objektivs 10 befindet. Sobald das Bild der Feldblende 122 nicht mehr in der Fokusebene 18 des Objektivs liegt, ändert sich die Verteilung der Menge des auf die beiden Detektorhälften 34a und 34b fallenden reflektierten Beleuchtungslichts 132 in Abhängigkeit von der Fokusposition.
In dem in 4A gezeigten Fall, in welchem die Probenfläche 18 genau in der Fokusebene 38 angeordnet ist, passiert der reflektierte Strahl 132 die Feldebenenblende 22 in symmetrischer Weise, was zu einer symmetrischen Verteilung des Reflexbilds auf dem Detektor 34 führt, so dass hier die Differenz des Signals der beiden Detektorhälften 34a und 34b gleich Null ist. Tritt dagegen eine Defokussierung, wie in 4B gezeigt, auf, so wird der reflektierte Strahl 132 gegenüber dem einfallenden Strahl 124 senkrecht zur Strahlachse versetzt, was zu einer asymmetrischen Beleuchtung des Detektors 34 und damit zu einem von der Fokusposition abhängigen Differenzsignal der beiden Detektorhälften 34a und 34b führt. Letztlich wandert hier das Abbild der Begrenzungskante einer als Begrenzungselement im einfallenden Lichtstrahl 124 wirkenden Feldblende (in 4 ist ein Begrenzungselement 122 in einer ersten Feldblendenebene 22 angebracht, es kann sich jedoch auch in einer zur Ebene 22 konjugierten Ebene befinden) in Abhängigkeit von der Fokusposition über den Detektor 34, und zwar in einer Richtung senkrecht zur Trennungslinie zwischen den beiden Detektorhälften 34a und 34b. Dadurch nimmt das Signal auf der einen Detektorhälfte ab, während es auf der anderen Detektorhälfte konstant bleibt (in der in 4b gezeigten Konstellation) oder zunimmt, wenn nämlich das Begrenzungselement bereits in einer „früheren” konjugierten Ebene angebracht ist (nicht gezeigt). Bei dieser Variante benötigt man kein zusätzliches Referenzsignal, man kann stattdessen die Summe der beiden Kanäle, d. h. der Detektorhälften 34a und 34b, als Referenz hernehmen, während die Differenz der beiden Detektorhälften 34a und 34b das fokusabhängige Signal ergibt.
In 5 bis 7 ist eine Ausführungsform der Erfindung dargestellt, die speziell für TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence) geeignet ist. TIRF wird gewöhnlich mit Hilfe von kollimiertem Licht einer kohärenten (Laser-)Lichtquelle durchgeführt, wobei im TIRF-Modus, d. h. nach Überschreiten des kritischen Winkels der Totalreflexion, nicht nur ein geringer Bruchteil, sondern das gesamte eingestrahlte Licht an der Probengrenzfläche 18 reflektiert wird. Dabei ist die Position des „Auskoppelelements” für den Fokus-Positionsdetektor bei weitem unkritischer als im Falle inkohärenter Beleuchtung. Das im folgenden beschriebene Konzept dient nicht nur dem Zweck, eine gewünschte Fokusposition zu finden und zu bewahren, sondern erlaubt darüber hinaus auch eine Optimierung des TIRF-Beleuchtungsstrahls.
Bei der Anordnung gemäß 5 ist eine Beleuchtungslichtquelle 216 in einer zur Pupillenebene 12 des Objektivs 10 konjugierten Ebene angeordnet. Bei der Anordnung gemäß 5 ist die Lichtquelle 216 dabei im Brennpunkt einer Linse 256 angeordnet, die einen Unendlichraum zwischen der Linse 256 und der Tubuslinse 14 erzeugt, in welchem ein Auskoppelelement 230 angeordnet ist, welches ein Großteil, z. B. 99%, des einfallenden Lichts von der Lichtquelle 216 durchlässt und lediglich den verbleibenden kleinen Rest 248 des Anregungslichts 224 auf einen Detektor 235 reflektiert. Der durchgelassene einfallende Lichtstrahl 124 gelangt nach Durchlaufen der Tubuslinse 14, der Objektivpupille 12 und des Objektivs 10 auf die Probenfläche 18, wo im Normalfall (nicht TIRF) ein relativ kleiner Teil des Lichts reflektiert wird und rückwärts durch die genannten Elemente 10, 12, 14 und 22 auf das Auskoppelelement 230 gelangt, wo – analog zum „Hinweg ein Großteil, z. B. 99%, des von der Probengrenzfläche 18 reflektierten Lichts 232 durchgelassen werden und lediglich der verbleibende kleine Rest 248 des reflektierten Lichts 232 auf einen zweiten Detektor 234 reflektiert werden. Die Detektoren 234 und 235 sind jeweils mit einer Maske 236 bzw. 237 versehen, deren Position und Größe so bemessen ist, dass die Detektoren 234 und 235 ein maximales Signal sehen, wenn das Feld unter einem Winkel von 0° beleuchtet wird, d. h. wenn der einfallende Strahl 124 perfekt zentriert ist, wie dies in 5 gezeigt ist. Da unter solchen Bedingungen keine totale interne Reflexion stattfindet, wird das Signal auf dem Detektor 234 deutlich schwacher sein als das Signal auf Detektor 235. Letzteres wird ca. 1% des eingestrahlten Lichts betragen, während ersteres um den Prozentsatz reduziert sein wird, den die Probengrenzfläche 18 durchgelassen d. h. nicht reflektiert hat.
Rückt man nun gemäß 6 den Fokus des Beleuchtungsstrahls, d. h. die Lichtquelle 216, in der Ebene 250 aus ihrer zentralen Position in der Brennebene der Linse 256 heraus in eine Vektorposition „x”, ändert sich entsprechend der Winkel α in der Fokusebene 38 des Objektivs 10. Damit werden sowohl der einfallende Strahl 224 als auch der reflektierte Strahl 232 im Unendlichraum zwischen den Linsen 256 und 14 so gekippt, dass sie nur noch in der Blendenebene 22 vollständig überlappen, davor und dahinter jedoch auseinanderlaufen. Entsprechend landen sie auch räumlich versetzt auf den Detektormasken 236 bzw. 237. Dadurch sehen die beiden Detektoren 234 und 235 ein entsprechend reduziertes Signal. Die Signalreduktion ist in beiden Fällen ein Maß für den Betrag des Vektors x. Sobald jedoch der Versatz x groß genug ist, um das Einsetzen der totalen internen Reflexion zu ermöglichen, d. h. sobald x und damit α einen kritischen Wert überschreiten, wird die Intensität des zurückreflektierten Strahls 232 dramatisch zunehmen.
Die von den beiden Detektoren registrierte Intensität wird deshalb in der in 7 gezeigten Weise vom Winkel α (bzw. der Größe des Vektors x) abhängen. Das gilt für jeden Winkel β, mit dem α variiert werden kann (für eine vorgegebene Dezentrierung α bzw. x gibt β den Winkel des Vektors x um die optische Achse 11 an; der Winkel β spielt wegen der fehlenden Rotationssymmetrie der Anordnung hinsichtlich der Detektoren 234, 235 und des Auskoppelelements 230 eine Rolle).
Wenn man eine „Landkarte” der Signale der Detektoren 234 und 235 als Funktion der Winkel α und β erzeugt, lässt sich daraus die Zentrierung des einfallenden TIRF-Strahls und somit der genaue TIRF-Winkel bestimmen. Aus der Steilheit des TIRF-Übergangs, d. h. der Steilheit der Abhängigkeit der Detektorsignale vom Winkel α, lässt sich zudem bestimmen;, wie gut die Lichtquelle 216 in der Pupillenebene 12 des Objektivs fokussiert ist. Je besser der Fokus, um so „schneller” setzt TIRF ein und umso schneller nimmt das Detektorsignal mit zunehmendem Vektor x zu, wenn man sich dem kritischen Winkel annähert.
Bei festem Winkel α bzw. β hängt das Detektorsignal in charakteristischer Weise von dem Abstand der reflektierenden Probenfläche 18 von der Objektivfokusebene 38 ab. Deshalb kann das Detektorsignal auch dazu herangezogen werden, eine gewünschte Fokusposition zu finden und zu erhalten. Hierbei stellt die Signalamplitude jedoch nur dann ein eindeutiges Maß für die Fokusposition dar, wenn man genau weiß, wo man sich auf der Polarkoordinatenlandkarte von x (bzw. α) und β in der Ebene 250 befindet.
Ferner können die Detektorsignale zum Aufbau einer Lasersicherheitsschaltung herangezogen werden, wobei das Vorwärtssignal (d. h. das Signal des Detektors 235) mit dem Rückwärtssignal (d. h. dem Signal des Detektors 234) verglichen wird, und erst wenn die beiden Signale annähernd gleich groß sind, d. h. wenn TIRF eingesetzt hat und das Laserlicht die Probe nicht mehr verlassen und somit keinen Schaden mehr anrichten kann, wird die Laserleistung auf den vollen gewünschten Wert gesteigert. Davor, d. h. während der TIRF-Einstellung, wird sie automatisch auf einem Wert belassen, der der sicheren Laserklasse 1 entspricht.
Zur Realisierung einer solchen Sicherheitsschaltung kann eine Steuereinheit 260 vorgesehen sein, welche das Signal der beiden Detektoren 234, 235 vergleicht und die Intensität der Lichtquelle 216 in Abhängigkeit von dem Verhältnis des Signale der beiden Detektoren 234, 235 so steuert, dass sich die Intensität der Lichtquelle nach erfolgtem TIRF-Übergang erhöht, wobei der TIRF-Übergang festgestellt wird, wenn die Signale der beiden Detektoren 234, 235 in etwa gleich groß sind.
Der Vollständigkeit halber sei noch erwähnt, dass bei den gezeigten Beispielen natürlich auch ein Detektor zum Erfassen des Emissionslichts von der Probe und ein üblicherweise zwischen der Tubuslinse 14 und der Objektivpupille 12 Hauptstrahlteiler vorgesehen sind, die jedoch in den Figuren nicht dargestellt sind. Es versteht sich, dass, wie bereits erwähnt, für die erfindungsgemäße Fokusmessung keine separate Lichtquelle erforderlich ist, sondern ein Teil des Lichts der für die Fluoreszenzmessung erforderlichen Beleuchtungs/Anregungslichtquelle verwendet wird. Außerdem sei erwähnt, dass die beschriebenen Anordnungen auch bei Durchlichtmessungen zur Fokusfindung und Bewahrung herangezogen werden können, man muss dazu lediglich für die Dauer der Fokusmessung das Fluoreszenz-Anregungslicht einschalten.

Claims

Mikroskopvorrichtung, mit einem Objektiv (10), einer Tubuslinse (14), einer Lichtquelle (16, 216) zum Beleuchten einer Probe, einer Optik (20, 156, 256) zum Einkoppeln des Beleuchtungslichts in das Objektiv, einem feldbegrenzenden Begrenzungselement (26, 122), einem Detektor (34, 234) für an einer Probengrenzfläche (18) reflektiertes Beleuchtungslicht (32, 32', 132, 232), sowie einem Auskoppelelement (30, 130, 230), um einen Teil des von der Probenoberfläche reflektierten und mindestens einen Teil der Einkoppeloptik rückwärts durchlaufenden Beleuchtungslichts auf den Detektor zu lenken, wobei die Anordnung Begrenzungselement, Auskoppelelement und Detektor so gewählt ist, dass sich die Intensitätsverteilung des reflektierten Lichts auf der Detektorfläche in Abhängigkeit von dem Abstand zwischen Objektiv und Probengrenzfläche verändert, so dass das Detektorsignal ein Maß für die Fokussierung des Objektivs bildet, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikroskopvorrichtung für eine TIRF-Beleuchtung der Probe ausgebildet ist, dass die Optik zum Einkoppeln des Beleuchtungslichts (224) in das Objektiv (10) ausgebildet ist, um das Beleuchtungslicht in die Ebene der Objektivpupille (12) zu fokussieren, dass der Beleuchtungswinkel (α) der Probe von der Position des fokussierten Beleuchtungslichts in der Pupillenebene abhängt, und dass die Beleuchtungslichtquelle (216) oder deren Bild (Fokuspunkt) azentrisch bezüglich der optischen Achse angeordnet werden kann, um den Beleuchtungswinkel (α) einstellbar machen zu können.
Mikroskopvorrichtung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Auskoppelelement (230) in einem Unendlichraum für das Beleuchtungslicht (224) angeordnet ist.
Mikroskopvorrichtung gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Optik zum Einkoppeln des Beleuchtungslichts (224) in das Objektiv (10) die Tubuslinse (14) und eine weitere abbildende Linse (256) umfasst, in deren Brennebene die Beleuchtungslichtquelle (216) oder deren Bild (Fokuspunkt) angeordnet ist, wobei die Position des fokussierten Beleuchtungslichts in der Pupillenebene von der Position der Lichtquelle oder deren Bild (Fokuspunkt) in der Brennebene der weiteren Linse (256) abhängt.
Mikroskopvorrichtung gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Auskoppelelement von einem Strahlteiler (230) gebildet wird, der im Unendlichraum zwischen der weiteren Linse (256) und der Feldblendenebene (22) angeordnet ist.
Mikroskopvorrichtung gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Detektor (234) so angeordnet ist, dass er vom Auskoppelelement (230) ausgekoppeltes, von der Probengrenzfläche (18) rückreflektiertes Licht aufsammelt (232) und die Position der Begrenzung dieses reflektierten Beleuchtungslichtstrahls (232) auf der Detektorfläche vom Beleuchtungswinkel (α) der Probe und von dem Abstand zwischen Objektiv (10) und Probengrenzfläche (18) abhängt.
Mikroskopvorrichtung gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Detektor (234) eine Maske (236) aufweist, die so angeordnet ist, dass sie in Abhängigkeit vom Beleuchtungswinkel (α) der Probe unterschiedlich stark überstrahlt wird.
Mikroskopvorrichtung gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Detektor (234) so angeordnet ist, dass die Steilheit des TIRF-Übergangs ein Maß für die Güte der Fokussierung der Beleuchtungslichtquelle 216 in der Objektivpupille (12) ist und somit dazu herangezogen kann, eventuell notwendige Nachfokussierungen zu regeln.
Mikroskopvorrichtung gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das im Unendlichraum angebrachte Auskoppelelement (230) einen Teil (248) des in das Objektiv (10) einzukoppelnden Lichts auf einen zweiten Detektor (235) ablenkt, der eine Maske (237) aufweist, die so angeordnet ist, dass das Signal des zweiten Detektors aufgrund einer von der Dezentrierung der Lichtquelle (216) abhängigen Überstrahlung der Maske von der Dezentrierung der Lichtquelle abhängt.
Mikroskopvorrichtung gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Signale der beiden Detektoren (234, 235) bei vorgegebener Position der Lichtquelle (216) in der Brennebene (250) der weiteren Linse (256) aufgrund der von dem Abstand der Probenfläche (18) von dem Objektiv (10) abhängigen Überstrahlung der Masken (236, 237) vom Abstand der Probengrenzfläche 18 von der Fokusebene (38) des Objektivs (10) abhängen.
Mikroskopvorrichtung gemäß Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass die beiden Masken (236, 237) so angeordnet und ausgebildet sind, dass das Detektorsignal ein lokales Maximum aufweist, wenn die Lichtquelle (216) bezüglich der weiteren Linse (256) zentriert ist.
Mikroskopvorrichtung gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass eine Steuereinheit (260) vorgesehen ist, um das Signal der beiden Detektoren (234, 235) zu vergleichen, um den TIRF-Übergang festzustellen.
Mikroskopvorrichtung gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Steuereinheit (260) so ausgebildet ist, dass der TIRF-Übergang festgestellt wird, wenn die Signale der beiden Detektoren (234, 235) in etwa gleich groß sind.
Mikroskopvorrichtung gemäß Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Steuereinheit (260) ausgebildet ist, um die Intensität der Lichtquelle (216) in Abhängigkeit von dem Verhältnis der Signale der beiden Detektoren (234, 235) so zu steuern, dass die Intensität der Lichtquelle nach erfolgtem TIRF-Übergang erhöht wird.