DE102010030430A1

DE102010030430A1 - Autofokuseinrichtung für Mikroskope und geeignete Autofokus-Aperturblenden

Info

Publication number: DE102010030430A1
Application number: DE102010030430A
Authority: DE
Inventors: Ralf Krüger
Original assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Current assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date: 2010-06-23
Filing date: 2010-06-23
Publication date: 2011-12-29
Anticipated expiration: 2030-06-24
Also published as: JP2012008566A; US8829402B2; JP5841750B2; US20110317260A1; CN102313976B; DE102010030430B4; CN102313976A

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Autofokus-Aperturblende (5, 6) in einer triangulierenden Autofokuseinrichtung (21) für ein Mikroskop (40), wobei die Autofokus-Aperturblende (5, 6) mindestens eine Blendenöffnung (3, 4) aufweist, mit welcher ein zur Autofokussierung eingesetztes, in Richtung der optischen Achse (18) der Autofokuseinrichtung (21) verlaufendes Messstrahlenbündel (34) in seinem Querschnitt begrenzbar ist, wobei die Blendenöffnung (3, 4) der Autofokus-Aperturblende (5, 6) dezentriert mit Abstand zur optischen Achse (18) der Autofokuseinrichtung (21) angeordnet ist, wobei durch die Blendenöffnung (3, 4) in einer Hälfte des Querschnitts (17) des Messstrahlenbündels (34) ein dezentrierter Autofokus-Messstrahl (36) erzeugbar ist.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Autofokus-Aperturblende in einer triangulierenden Autofokuseinrichtung für ein Mikroskop, wobei die Aperturblende mindestens eine Blendenöffnung aufweist und ausgestaltet ist, um ein zur Autofokussierung eingesetztes, in Richtung der optischen Achse der Autofokuseinrichtung verlaufendes Messstrahlenbündel in seinem Querschnitt zu begrenzen, sowie eine triangulierende Autofokuseinrichtung für ein Mikroskop mit einer solchen Aperturblende zur Erzeugung eines Autofokus-Messstrahls und einer Autofokussieroptik, um unter Verwendung eines Objektivs des Mikroskops mittels des Autofokus-Messstrahls ein Messmuster auf einem Objekt zu erzeugen. Unter Messmuster wird beispielsweise ein Messspot oder ein Messspalt oder ein anderes geeignetes Muster verstanden, das typischerweise in einer triangulierenden Autofokussiereinrichtung zur Detektion einer Defokussierung eingesetzt wird.
Eine triangulierende Autofokuseinrichtung ist aus der US 5,136,149 B1 bekannt. Die DE 195 37 376 A1 diskutiert diese US-Patentschrift und bezeichnet das dort beschriebene Autofokus-Prinzip als ”triangulierendes” Autofokus-Prinzip. Eine Reihe von Mikroskopen im Stand der Technik weisen triangulierende (engl.: ”triangulating”) Autofokuseinrichtungen bzw. Autofokussierungsabtasteinheiten auf, die einen schrägen bzw. schiefen Autofokus-Messstrahl und eine spiegelnde bzw. regelmäßige bzw. gerichtete Reflexion am Objekt verwenden. Daher wird, wie in der beigefügten 1 dargestellt ist, die dem triangulierenden Autofokus-Prinzip aus der erwähnten US 5,136,149 B1 entspricht, eine Autofokussierungslichtquelle 19 derart angeordnet, dass nach Umlenkung des Messstrahls 30 und Durchtritt des selbigen durch das Mikroskopobjektiv 10 die Objektebene 16 schräg bzw. schief vom Autofokus-Messstrahl getroffen wird. Die Autofokussierungsabtasteinheit beinhaltet zusätzlich einen positionssensitiven Autofokus-Detektor 28 zum Detektieren der seitlichen Versetzung des Strahls (wie weiter unten beschrieben wird) sowie einen Motor 27 zum Bewegen des Objektivs 10. Alternativ kann auch die Objektebene 16 in Richtung der optischen Achse verschoben werden.
Bei der Autofokuseinrichtung mit Mikroskop gemäß 1 wird der mit 30 bezeichnete Messstrahl durch den Strahlenteiler 20 an einem Punkt A in eine Hälfte des Strahlenquerschnitts (bezogen auf die optische Achse 8) abgelenkt. Der abgelenkte Strahl 30 wird durch das Objektiv 10 derart abgelenkt bzw. gebeugt, um die Objektebene 16 an einem Reflexionspunkt C in einem Winkel α schräg bzw. schief zu treffen. Der Strahl 30 wird als reflektierter Messstrahl 32 reflektiert bzw. remittiert und anschließend über das Objektiv 10 wiederum durch den Strahlenteiler 20 an einem Punkt B auf der anderen Seite des Strahlengangs (bezogen auf den Punkt A) abgelenkt. Der abgelenkte Strahl 32 beleuchtet dann den Detektor 28, z. B. einen positionsempfindlichen Detektor (PSD) Dessen Ausgangssignal hängt von dem Ort, an welchem der Strahl 32 auftrifft, ab, so dass der Ort dadurch bestimmt ist.
Im Falle einer Defokussierung, d. h. im vorliegenden Beispiel gemäß 1 einer Verschiebung der Objektebene 16 in die Ebene 16' (oder einer Verlagerung eines abzubildenden Punktes aus der Ebene 16 in die Ebene 16'), wird der Messstrahl 30 erst am Reflexionspunkt D reflektiert, der gegenüber dem Punkt C nicht nur in Richtung der optischen Achse 8, sondern auch lateral bzw. seitlich hierzu verschoben ist. Wie ersichtlich, erreicht der entsprechende reflektierte Strahl 32' den Detektor 28 an einem unterschiedlichen Ort und liefert somit ein verändertes Signal gegenüber der Fokuslage. Auf diese Weise kann der Grad der Defokussierung gemessen und durch besagten Motor 27, der die Objektivlinse bewegt, wieder kompensiert werden.
Die folgenden Patentschriften behandeln Systeme, die auf diesem oben beschriebenen Triangulationsprinzip basieren.
Aus der DE 32 19 503 A1 ist eine Autofokussierungs-Vorrichtung für optische Geräte, insbesondere Auflichtmikroskope, bekannt. Bei dieser Vorrichtung ist eine Laserautofokusanordnung vorgesehen, die ein Messstrahlenbündel erzeugt, dessen eine Hälfte mittels eines optischen Bauelements abgeblendet wird. Das im Querschnitt auf die Hälfte begrenzte Messstrahlenbündel wird als Autofokus-Messstrahl in den Beleuchtungsstrahlengang des Auflichtmikroskops eingekoppelt, der seinerseits über die Objektivpupille und das Objektiv auf ein Objekt fällt. Auf diese Weise erzeugt der zur Hälfte abgeblendete Messstrahl – vorzugsweise gepulstes Laserlicht im IR-Bereich – einen die mikroskopische Beobachtung nicht störenden Messspot auf dem Objekt für den Autofokus. Bei einer Defokussierung ”wandert” dieser Messspot auf der Oberfläche des Objektes.
Bei dem optischen Bauteil, das eine Hälfte des Messstrahlenbündels abdeckt, handelt es sich hier beispielsweise um ein Umlenkprisma, welches bis zur optischen Achse in den Messstrahlengang hälftig eingeführt wird. Die zur Laserlichtquelle zeigende Seite des Umlenkprismas ist hierbei voll verspiegelt, so dass ein zur Hälfte abgeblendeter Messstrahl in Richtung zur optischen Achse bis zur Objektivpupille verläuft und durch das Objektiv als Messspot auf das Objekt fokussiert wird. Nach Reflexion an der Objektoberfläche verläuft der remittierte (halbe) Autofokus-Messstrahl ebenfalls in Richtung der optischen Achse zurück zu besagtem Umlenkprisma, wobei der remittierte Autofokus-Messstrahl auf dem ”Rückweg” in der dem Hinweg gegenüberliegenden Pupillenhälfte verläuft, in der der auf das Objekt gerichtete abgeblendete Teil des Messlichtstrahlenbündels liegt. Der remittierte Autofokus-Messstrahl wird über das Umlenkprisma einem Detektor zugeleitet, der im Wesentlichen aus einer Differenzdiode (zwei Dioden) bestehen kann. Ist das System optimal fokussiert, so liegt das Bild des Messspots in exakt symmetrischer Lage bezüglich der beiden Dioden des Detektors. Im Falle der Defokussierung wandert das Bild des Messspots aus der Zentrallage in Richtung einer der beiden Dioden, je nach Richtung der Defokussierung. In erster Näherung ist der Betrag der Verschiebung des Messspots auf der Differenzdiode proportional zum Betrag der Defokussierung. Die Vorrichtung erlaubt, die ermittelte Defokussierung durch entsprechende Gegensteuerung des Objektivs und/oder des Objekttisches in z-Richtung rückgängig zu machen. Mit der dort vorgeschlagenen Vorrichtung können auch definierte Defokussierungen (”Offset”) eingestellt werden, um beispielsweise bei in z-Richtung strukturierten Objekten in verschiedenen Höhenebenen mikroskopische Beobachtungen durchführen zu können.
Ein Autofokussystem mit einem ähnlichen Messprinzip ist auch aus der US 2004/0113043 A1 bekannt. Wiederum wird ein zur Hälfte ausgeblendeter Messstrahl zur Erzeugung eines Messspalts auf ein mikroskopisch zu untersuchendes Objekt gerichtet. Der reflektierte Messstrahl wird einem CCD-Sensor zugeführt. Eine nachgeschaltete Signalverarbeitungseinrichtung liefert Signale zur Defokussierung an eine Recheneinheit (CPU), die ihrerseits den Objekttisch und/oder das Objektiv zur Korrektur einer Defokussierung ansteuert. Besagter Messspalt wird mittels infrarotem Licht erzeugt, wobei das Bild des Messspalts an Grenzflächen des Objekts (Oberfläche des Deckglases, Oberfläche der Probe unterhalb des Deckglases) reflektiert wird. Der reflektierte Messspalt wird über eine Optik, die zuletzt eine Zylinderlinse aufweist, auf einen Zeilendetektor (CCD-Sensor) abgebildet. Der Zusammenhang zwischen dem entsprechenden Detektionssignal und der tatsächlichen Fokuslage ist in besagter US-Schrift zeichnerisch dargestellt.
Ein ähnliches Autofokussystem für ein inverses Mikroskop mit Durchlichtbeleuchtung ist aus der US 7,345,814 B2 bekannt. Zur Streulichtminimierung sind im Strahlengang der Autofokusvorrichtung ein Polarisationsstrahlteiler sowie ein λ/4-Plättchen vorgesehen. Im dort geschilderten Anwendungsfall wird mittels der Autofokusvorrichtung auf das Deckglas fokussiert, um anschließend das Objektiv des Mikroskops um einen vorbestimmten Betrag in z-Richtung (”Offset”) zu verschieben.
Der Vollständigkeit halber sei angemerkt, dass eine Autofokuseinrichtung für Mikroskope bereits aus der älteren deutschen Patentschrift 21 02 922 bekannt ist. Eine ähnliche Einrichtung zum automatischen Fokussieren eines Mikroskops auf unterschiedliche Objektebenen ist aus der österreichischen Patentschrift AT-353 497 bekannt.
Den oben beschriebenen Autofokussierungsverfahren ist gemeinsam, dass sie mit einer festen Halbblende arbeiten, insbesondere einer zentralen Irisblende, die von der optischen Achse bis zum Rand des Strahlquerschnitts halbseitig abgeschaltet ist. Dadurch wird das Objekt einseitig mit dem Autofokus-Messstrahl beleuchtet (Prinzip der Triangulation). Aus dieser Geometrie ergibt sich bei einer Defokussierung ein Schieben des Bildes der Autofokusmarke auf dem Sensor, wobei die Defokussierung in erster Näherung proportional zu der Dezentrierung des Bildschwerpunktes ist. Die Größe des Detektors begrenzt den maximalen Fangbereich für Fokuseinstellungen in z-Richtung im Bereich des Objekts. Insbesondere zum Suchen der Fokuslage bei einem großen Defokus sind diese Systeme somit ungeeignet.
Ein weiterer Nachteil der bekannten Systeme sind die sogenannten Reflexe erster Ordnung, die am stärksten an den Flächenscheiteln der optischen Flächen (Linsen) entstehen, und die sich sehr störend auf das Messsignal auswirken. Das durch Reflexe erster Ordnung verschlechterte Signal-Rausch-Verhältnis macht sich insbesondere bemerkbar, wenn eine Grenzfläche zwischen Deckglas und wässriger Lösung als Referenzfläche zum Halten des Fokus benutzt wird, da die Reflexion dieser Grenzfläche nur etwa vier Promille (4‰) aufweist. Dadurch kann der Autofokus-Reflex vom Streulicht überdeckt werden. Zur Streulichtminimierung werden daher in der bereits genannten US 7,345,814 B2 Polarisationsstrahlteiler mit λ/4-Plättchen verwendet.
Es ist daher erstrebenswert, ein verbessertes triangulierendes Autofokussystem für die Mikroskopie anzugeben, das die oben genannten Nachteile des bekannten Standes der Technik soweit als möglich vermeidet, wobei insbesondere ein erfindungsgemäßes System einen großen Fangbereich aufweisen, den Einfluss störenden Streulichts beschränken und/oder für die Autofokussierung auf sehr schwach reflektierende Proben geeignet sein soll.
Zur Lösung dieser Aufgabe schlägt die Erfindung eine Autofokus-Aperturblende in einer triangulierenden Autofokuseinrichtung für ein Mikroskop sowie eine solche Autofokuseinrichtung gemäß den unabhängigen Patentansprüchen vor. Entsprechende Ausgestaltungen finden sich in den jeweiligen Unteransprüchen sowie in der nachfolgenden Beschreibung. Außerdem ist eine entsprechende Verwendung von mindestens zwei erfindungsgemäßen Autofokus-Aperturblenden beansprucht.
Eine Autofokus-Aperturblende in einer triangulierenden Autofokuseinrichtung für ein Mikroskop, wobei die Aperturblende mindestens eine Blendenöffnung aufweist, mit welcher ein zur Autofokussierung eingesetztes, in Richtung der optischen Achse der Autofokuseinrichtung verlaufendes Messstrahlenbündel in seinem Querschnitt begrenzbar ist, wenn die Autofokus-Aperturblende in das Messtrahlenbündel eingefügt ist, ist erfindungsgemäß derart ausgestaltet, dass die Blendenöffnung der Aperturblende dezentriert mit Abstand zur optischen Achse der Autofokuseinrichtung angeordnet ist, wobei durch die Blendenöffnung in einer Hälfte des Querschnitts des Messstrahlenbündels ein dezentrierter Autofokus-Messstrahl erzeugbar ist.
Soweit nicht anders angegeben, meint die Definition ”die Blendenöffnung ist mit Abstand zur optischen Achse angeordnet”, dass jeder Punkt der Blendenöffnung einen Abstand größer Null zur optischen Achse aufweist. Des Weiteren ist die Blendenöffnung vollständig in einer Hälfte des Querschnitts eines Messstrahlenbündels untergebracht, so dass im Ergebnis die Blendenöffnung der Autofokus-Aperturblende ein in Richtung der optischen Achse der Autofokuseinrichtung verlaufendes Messstrahlenbündel in seinem Querschnitt so begrenzt, dass dieses abgeblendete Bündel, nachfolgend als Autofokus-Messstrahl bezeichnet, den achsnahen Bereich nicht durchläuft. Die erfindungsgemäße Autofokus-Aperturblende erzeugt also mit der dezentrierten Blendenöffnung einen dezentrierten, die optische Achse nicht überdeckenden Autofokus-Messstrahl in einer Hälfte des ursprünglichen Messstrahlenbündelquerschnitts. Dabei kann der mit der Autofokus-Aperturblende abgeblendete Autofokus-Messstrahl in seinem Strahlenbündel Strahlen mit divergenten, konvergenten oder parallelen Verlauf aufweisen.
Die erfindungsgemäß vorgeschlagene Autofokus-Aperturblende begrenzt also den Querschnitt des Messstrahlenbündels nicht nur auf höchstens ein Halbkreissegment, sondern deckt darüber hinaus auch einen großen Teil des anderen Halbkreissegments und einen Bereich um die optische Achse ab. Auf diese Weise können achsnahe Strahlen, die zu den erwähnten Reflexen erster Ordnung führen, weitgehend vermieden werden. Die Flächenscheitel der im Messstrahlengang vorhandenen optischen Flächen (Linsen) werden somit vom Autofokus-Messstrahl nicht durchlaufen, so dass keine dort entstehenden Reflexe auf den Detektor der Autofokuseinrichtung auftreffen können. Dadurch kann das Signal/Rausch-Verhältnis des Messsignals zugunsten einer hochpräzisen Messung verbessert werden. Dies kommt insbesondere Autofokussystemen zugute, die Grenzflächen mit niedrigem Reflexionsgrad, wie die Grenzfläche Deckglas/wässrige Lösung oder Petrischale/wässrige Lösung, als Referenzfläche zum Halten des Fokus benutzen. Der Reflexionsgrad beträgt dort nur etwa 4 Promille (= 0,004), was sehr viel weniger ist als der Reflexionsgrad an Glas, der ca. 4% (0,04) beträgt. Bisher übliche Maßnahmen zur Streulichtreduktion durch zusätzliche optische Bauteile können entfallen.
Es ist vorteilhaft, wenn die Blendenöffnung der Autofokus-Aperturblende ein Kreissegment ist, das von zwei Kreisbögen mit unterschiedlichen Radien begrenzt ist. Dieses Kreissegment kann in Umfangsrichtung das gesamte Halbkreissegment umfassen. Günstiger ist jedoch eine geringere Ausdehnung in Umfangsrichtung. Für eine besonders gute Abbildung des Messmusters, insbesondere eines Messspalts, hat sich eine ellipsoide, ovale oder nierenförmige Form der Blendenöffnung der Autofokus-Aperturblende erwiesen.
Eine besonders effektive Unterdrückung von Reflexen erster Ordnung kann erzielt werden, wenn der Abstand des Flächenschwerpunkts der Blendenöffnung zur optischen Achse der Autofokuseinrichtung bzw. des Messstrahlenbündels mindestens gleich dem halben Radius der Eintrittspupille des Mikroskopobjektivs entspricht. Als Mindesterfordernis für eine erfolgreiche Reflexunterdrückung gilt, dass der Abstand des Flächenschwerpunkts der Blendenöffnung zur optischen Achse der Autofokuseinrichtung bzw. des Messstrahlenbündels mindestens 0,5 mm bis 1,0 mm, je nach Objektiv-Typ, beträgt. Wird nämlich ein Bereich um die optische Achse mit einem Radius von mindestens 0,5 mm bis 1,0 mm von der Aperturblende abgedeckt, so können bei Objektiven mit kleiner Eintrittspupille bereits ein großer Teil der Reflexe erster Ordnung unterdrückt werden. Der maximale Abstand wird nur durch den Radius der Eintrittspupille begrenzt. Für eine gute Reflexminderung von über 50% sollte der Mindestabstand zur optischen Achse 25% bis 40% des Pupillenradius der Eintrittspupille des Mikroskopobjektivs betragen (beispielsweise 25% für ein 40×-Objektiv und ca. 40% für 63×-und 100×-Objektive). Hierbei sollte außerdem vorzugsweise die Blendenöffnung möglichst am Rand des Querschnitts des Messstrahlenbündels liegen. Auf diese Weise ist der resultierende Autofokus-Messstrahl ausreichend stark dezentriert. Die Maßgabe bezüglich des Abstandes des Flächenschwerpunkts der Blendenöffnung zur optischen Achse begrenzt gleichzeitig die Größe der Blendenöffnung im Verhältnis zum Querschnitt des Messstrahlenbündels.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine triangulierende Autofokuseinrichtung für ein Mikroskop mit einer Autofokus-Aperturblende zur Begrenzung des Querschnitts eines Messstrahlenbündels der Autofokuseinrichtung und mit einer Autofokussieroptik, um unter Verwendung eines Objektivs des Mikroskops mittels des von der Autofokus-Aperturblende erzeugten Autofokus-Messstrahls ein Messmuster auf dem Objekt zu erzeugen. Der prinzipielle Aufbau und die Funktionsweise solcher gattungsgemäßen triangulierenden Autofokuseinrichtungen wurden in der Beschreibungseinleitung bereits ausführlich beschrieben. Erfindungsgemäß ist bei einer derartigen Autofokuseinrichtung mindestens eine Autofokus-Aperturblende gemäß dem oben behandelten ersten Aspekt der Erfindung zur Erzeugung des Autofokus-Messstrahls auswählbar und in den Messstrahlengang der Autofokuseinrichtung einsetzbar. Mit einer solchen Autofokuseinrichtung erhält man optimale Signal-/Rausch-Verhältnisse, die es erlauben, Grenzflächen mit extrem niedriger Reflexion zum Halten des Fokus zu benutzen.
Vorteilhafterweise sind bei einer solchen triangulierenden Autofokuseinrichtung mindestens zwei unterschiedliche Autofokus-Aperturblenden, deren dezentrierten Blendenöffnungen in unterschiedlichen Abständen zur optischen Achse der Autofokuseinrichtung angeordnet sind, vorgesehen und alternativ auswählbar und in den Messstrahlengang einsetzbar.
Aus der eingangs erläuterten Funktionsweise einer triangulierenden Autofokuseinrichtung wird klar, dass eine ”stärker dezentrierte” Aperturblende, d. h. mit einer Blendenöffnung in einem großen Abstand von der optischen Achse, zu einem Autofokus-Messstrahl mit größerem Abstand von der optischen Achse und somit einem größeren Winkel α an dem Objekt führt (vgl. die Eingangs erläuterte 1) als bei einer ”geringer dezentrierten” Aperturblende, d. h. der Autofokus-Messstrahl verläuft näher zur optischen Achse. Ein größerer Winkel α hat bei einer Defokussierung im Objektbereich wiederum ein starkes Verschieben des Messmusters auf dem Detektor zur Folge. Bereits geringe Defokussierungen des Objekts (Verlagerung in z-Richtung, vgl. 1) führen daher zu einem messbaren Ergebnis. Aufgrund dieser Tatsache lässt sich die ”stärker dezentrierte” Aperturblende mit Vorteil einsetzen, um eine hohe Genauigkeit beim Nachregeln der Fokuseinstellung (sogenannter ”Haltefokus”) zu erzielen, nicht aber, um bei einem großen Defokus die Fokuslage zu suchen. Im letztgenannten Fall der hohen Defokussierung des Objekts in z-Richtung besteht nämlich die Wahrscheinlichkeit, dass das Messmuster aus dem Detektorbereich herausläuft, dass also der maximale Fangbereich des Detektors überschritten wird.
Hingegen erlaubt der Einsatz einer Autofokus-Aperturblende ”geringerer Dezentrierung” ein Suchen der Fokuslage bei einem großen Defokus, da die geringer dezentrierte Aperturblende einen kleineren Winkel α bewirkt, der wiederum ein vergleichsweise geringeres Verschieben des Messmusters auf dem Detektor beim Verschieben der mit dem Autofokus angetasteten Objekt-Grenzfläche zur Folge hat. Somit ist der Fangbereich zum Finden einer Fokusposition bei unveränderter Detektorgröße mit der weniger stark dezentrierten Autofokus-Aperturblende, d. h. Blendenöffnung weniger dezentriert, viel höher als bei der stärker dezentrierten Aperturblende.
In der Praxis wird häufig der Autofokus auf eine definierte Grenzfläche, z. B. eine Probenfläche an Luft oder eine Grenzfläche zwischen Probenflüssigkeit und Glas, scharf gestellt. Dies erfolgt entweder von Hand durch den Benutzer unter visueller Kontrolle der Probe oder durch einen speziellen Fokus-Suchlauf der Autofokuseinrichtung, bei dem die Fokusposition aus den Ausgangssignalen des Detektors ermittelt wird, indem diese Ausgangssignale mit den Signal-Werten einer vorher aufgenommenen Kalibierkurve verglichen werden. Dabei kann die eigentliche mikroskopische Untersuchung mit einem ”Offset” arbeiten, indem der Autofokus vom Benutzer auf eine andere, besser antastbare Grenzfläche eingestellt wird, als der visuelle Fokus (vgl. Beschreibungseinleitung). Dies setzt voraus, dass der Abstand zwischen diesen beiden Foki bekannt ist, beispielsweise die Deckglasdicke eines mikroskopischen Präparates oder die Bodendicke einer Petrischale, in der sich die visuell beobachtetet Probe befindet.
Insbesondere bei lang dauernden mikroskopischen Untersuchungen (beispielsweise von Zellenproben) ist ein Haltefokus auf einer definierten Grenzfläche (beispielsweise zwischen (Deck-)Glas und wässriger Lösung) vorteilhaft, bei dem der vom Benutzer gewählte Fokus stets nachgeregelt wird. Zum Suchen der Grenzfläche kann mit Vorteil eine Autofokus-Aperturblende mit geringer dezentrierter Blendenöffnung zur Erzielung eines größeren Fangbereichs benutzt werden, während im Bereich der Grenzfläche eine Autofokus-Aperturblende mit einer stärker dezentrierter Blendenöffnung einen geringeren Fangbereich und somit eine höhere Empfindlichkeit liefert
In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung sind mindestens zwei unterschiedliche Autofokus-Aperturblenden unterschiedlichen Eintrittspupillendurchmessern verschiedener Mikroskopobjektive zugeordnet und jeweils in Abhängigkeit von dem Eintrittspupillendurchmesser des aktuell gewählten Objektivs auswählbar und in den Messstrahlengang einsetzbar. Es wäre sogar denkbar, für jedes im Mikroskop vorhandene Objektiv eine entsprechende Autofokus-Aperturblende bereitzuhalten. Es hat sich jedoch in der Praxis gezeigt, dass zwei Autofokus-Aperturblenden, deren Blendenöffnungen in unterschiedlichen Abständen zur optischen Achse der Autofokuseinrichtung angeordnet sind, ausreichend sind, um den üblichen Bereich von Eintrittspupillendurchmessern der Mikroskopobjektive abzudecken. Die hier betrachteten Mikroskope arbeiten üblicherweise mit Objektiven im Vergrößerungsbereich von 10× bis 100×, andere Objektive sind aber ebenso möglich (z. B. 150×).
Zum besseren Verständnis der hier bevorzugten Abhängigkeit der Dezentrierung der Autofokus-Aperturblendenöffnung in Abhängigkeit vom Eintrittspupillendurchmesser des verwendeten Mikroskopobjektivs sei zunächst auf die objektseitige und bildseitige Tiefenschärfe bei der mikroskopischen Abbildung eingegangen. Die mikroskopische Abbildung verwendet Objektive hoher Vergrößerung und großer numerischer Apertur, um Objektstrukturen mit Hilfe einer Tubuslinse stark vergrößert in eine Bildebene abzubilden (Zwischenbild für die Betrachtung durch ein Okular). Die Brennweite der Tubuslinse ist hierbei um ein Vielfaches größer als die des Objektivs. Während die Tiefenschärfe im Objektbereich mit steigender Objektivvergrößerung und steigender numerischer Apertur abnimmt und sich insgesamt in einem Bereich von nur etwa 0,5 bis 10 λ (Wellenlänge des verwendeten Lichts) bewegt, nimmt die Tiefenschärfe für die gleichen Objektive im Bildbereich (z. B. auf der Detektoroberfläche) mit zunehmender Objektivvergrößerung zu und bewegt sich insgesamt in einem sehr viel größeren Bereich von etwa 1.000 bis 5.000 λ. Als grobe Abschätzung für die Genauigkeit der Fokuseinstellung gilt der Wert Tiefenschärfe/3.
Der Eintrittspupillendurchmesser eines Objektivs ist proportional zum Produkt aus numerischer Apertur und Brennweite des Objektivs. Da zwar die numerische Apertur üblicher Mikroskopobjektive mit wachsender Vergrößerung zunimmt, die Brennweite hingegen stärker abnimmt, sinkt der Eintrittspupillendurchmesser der Objektive mit wachsender Vergrößerung. Es ist daher zweckmäßig, für Mikroskopobjektive niedriger Vergrößerung stärker dezentrierte Aperturblenden einzusetzen als für Mikroskopobjektive hoher Vergrößerung. Wie bereits erläutert, weisen stärker dezentrierte Aperturblenden (großer Abstand der Blendenöffnung von der optischen Achse) einen geringen Fangbereich auf, erlauben aber wegen des sensitiven Verhaltens am Detektor eine hohe Genauigkeit der Fokuseinstellung bzw. Fokusregelung (sogenannter ”Haltefokus”), wie sie auch – wie vorstehend ausführlich erläutert – bei Objektiven niedriger Vergrößerung erforderlich ist. Mikroskopobjektive hoher Vergrößerung mit ihren kleineren Eintrittspupillendurchmesser sollten hingegen zweckmäßigerweise mit weniger stark dezentrierten Autofokus-Aperturblenden eingesetzt werden. Diese eignen sich aufgrund der geringeren Dezentrierung der Blendenöffnung zum Suchen der Fokuslage aufgrund des höheren Fangbereichs. Dies passt wiederum zur oben ausführlich erläuterten sehr viel größeren Toleranz bei der Fokusgenauigkeit von Objektiven mit hoher Vergrößerung.
Bei den hier betrachteten Mikroskopobjektiven mit Vergrößerungen im Bereich von 10× bis 100× hat es sich als ausreichend erwiesen, zwei unterschiedlich dezentrierte Autofokus-Aperturblenden für das Einsetzen in den Messstrahlengang bzw. das Einfügen in das Messstrahlenbündel vorzusehen. Hierbei ist es besonders vorteilhaft, wenn die Abstände der jeweiligen Flächenschwerpunkte der Blendenöffnungen zur optischen Achse der Autofokuseinrichtung bzw. des Messstrahlenbündels sich um mindestens den Faktor 2 unterscheiden. Prinzipiell ist dieses Erfordernis selbstverständlich nicht auf nur zwei vorhandene Aperturblenden begrenzt.
Für eine exakte Autofokusmessung ist es zweckmäßig, wenn die mindestens zwei Autofokus-Aperturblenden jeweils derart im Messstrahlenbündel anzuordnen sind, dass die Flächenschwerpunkte ihrer Blendenöffnungen jeweils auf derselben Geraden senkrecht zur optischen Achse der Autofokuseinrichtung liegen, weil die Objektstrukturen dann mit beiden Autofokus-Aperturblenden aus der gleichen Richtung vom Autofokus-Messstrahl getroffen werden. Damit sind die Spaltbilder des Autofokus-Messtrahls auf dem Detektor in gleicher Weise auswertbar. Bevorzugt weisen die Autofokus-Aperturblenden gleiche Flächeninhalte auf, um gleiche Signalstärken zu erhalten.
In der Praxis können für die verschiedenen vorhandenen Autofokus-Aperturblenden Kalibrierkurven für die Fokussignale hinterlegt werden. Zu diesem Zweck wird für jede Autofokus-Aperturblende der Fokus am Objekt durchgefahren (”z-Durchstimmen” durch Höhenverstellung des Mikroskoptisches oder des Objektivs) und am Detektor entsprechende Signalkurven aufgenommen, welche die Detektor-Signale der jeweiligen z-Position zuordnen. Dies erlaubt das Speichern von Fokuspositionen durch den Kunden mit der jeweils optionalen Aperturblende in Hinblick auf Signalstärke, Kontrast usw..
Es ist weiterhin vorteilhaft, wenn sich die Blendenöffnungen zweier Autofokus-Aperturblenden in ihrer Projektion auf den Querschnitt des Messstrahlenbündels nicht überlappen. Insbesondere mit um den Faktor 2 unterschiedlichen Abständen der Flächenschwerpunkte der Blendenöffnungen von der optischen Achse erhält man Autofokus-Aperturblenden, die in ausreichendem Maße unterschiedlich stark von der optischen Achse dezentriert sind.
Vorteilhaft sind die automatische Auswahl einer geeigneten Aperturblende und der Einsatz derselbigen in den Messstrahlengang in Abhängigkeit von dem gerade verwendeten Mikroskopobjektiv bzw. dessen Eintrittspupillendurchmesser. Hierzu werden bei einem motorisierten bzw. automatisierten Mikroskop die verwendeten Objektive mit ihren Kenndaten erfasst.
Es hat sich in der Praxis als vorteilhaft erwiesen, wenn für ”niedrigere Objektivvergrößerungen”, also solche zwischen 10× bis 63× (Zwischenwerte sollen explizit mit offenbart sein) eine stärker dezentrierte Autofokus-Aperturblende verwendet wird als für ”höhere Objektivvergrößerungen”, insbesondere solche über 63× bis 100× und mehr, wobei wiederum Zwischenwerte explizit mit offenbart sein sollen. Somit ist es also vorteilhaft, beispielsweise bei einem Übergang von einer Objektivvergrößerung 20× auf eine Objektivvergrößerung 100× oder beispielsweise von einer Objektivvergrößerung 40× auf eine Objektivvergrößerung 150× auch die Autofokus-Aperturblenden und damit die Dezentrierung des Autofokus-Messstrahls zu wechseln.
Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Die Erfindung ist anhand eines Ausführungsbeispieles in der Zeichnung schematisch dargestellt und wird im Folgenden unter Bezugnahme auf die Zeichnung ausführlich beschrieben.
Figurenbeschreibung
1 zeigt ein schematisch dargestelltes Beispiel einer triangulierenden Autofokuseinrichtung gemäß Stand der Technik;
2a zeigt ein erstes Beispiel mit einer stark dezentrierten Autofokus-Aperturblende in schematischer Ansicht;
2b zeigt ein zweites Beispiel mit einer schwach dezentrierten Autofokus-Aperturblende in schematischer Ansicht;
3 zeigt schematisch den Gesamtstrahlengang durch eine triangulierende Autofokuseinrichtung gemäß Erfindung;
4 zeigt schematisch den Strahlengang durch ein inverses Mikroskop mit Anschluss an eine Autofokuseinrichtung;
5 zeigt schließlich die Verläufe der relativen Reflexintensitäten von Reflexen erster Ordnung für unterschiedliche Objektive aufgetragen gegen den Pupillenradius.
Die triangulierenden Autofokuseinrichtung gemäß 1 wurde bereits ausführlich in der Beschreibungseinleitung diskutiert.
Die 2a und 2b zeigen nunmehr zwei verschiedene Autofokus-Aperturblenden 5 und 6, wie sie mit Vorteil jeweils alternativ in eine triangulierende Autofokuseinrichtung für ein Mikroskop eingesetzt werden können, um ein zur Autofokussierung verwendetes, in Richtung der optischen Achse der Autofokuseinrichtung verlaufendes Messstrahlenbündel 17 in seinem Querschnitt zu begrenzen. Hierfür weist die Autofokus-Aperturblende 5 eine stark dezentrierte Blendenöffnung 3 und die Autofokus-Aperturblende 6 eine schwach dezentrierte Blendenöffnung 4 auf. Jede der beiden Blendenöffnung 3 und 4 ist dezentriert mit Abstand zur optischen.
Achse 18 der Autofokuseinrichtung bzw. des Messtrahlenbündels angeordnet, so dass jede Blendenöffnung 3 bzw. 4 außerhalb besagter optischer Achse 18 liegt. Zusätzlich liegt zur Realisierung einer triangulierenden Autofokusmessung jede Blendenöffnung 3, 4 in einer Hälfte des Querschnitts 17 des Messstrahlenbündels. Die genaue äußere Gestalt der Autofokus-Aperturblenden 5 und 6 ist in 2 nicht dargestellt, da sie unterschiedlich ausgestaltet sein können. Beispielsweise können sie auf einen in den Strahlengang einschiebbaren Blenden-Schieber angeordnet sein. Alternativ können sie an schwenkbaren Hebeln angebracht sein. Durch Schwenken des zugehörigen Hebels ist dann die jeweilige Autofokus-Aperturblende in das Messstrahlenbündel einfügbar. Die Aperturblenden 5 bzw. 6 decken den Querschnitt 17 des Messstrahlenbündels jeweils bis auf den Bereich der Blendenöffnung 3 bzw. 4 vollständig ab, so dass nach Durchtritt durch die Aperturblende 5 bzw. 6 jeweils ein dezentrierter Autofokus-Messstrahl entsteht. Die kreisförmigen Bereiche 1 und 2 bezeichnen die Querschnitte der Eintrittspupillen der jeweiligen Mikroskopobjektive, die bevorzugt zusammen mit der jeweiligen Autofokus-Aperturblende 5 bzw. 6 verwendet werden.
Beide Ausführungsformen der Autofokus-Aperturblenden 5 und 6 besitzen Blendenöffnungen 3 bzw. 4 von ovaler Gestalt, die jeweils am Rand der Aperturblende 5 bzw. 6 derart angeordnet sind, dass die laterale Ausdehnung der Blendenöffnungen 3 und 4 größer ist als die radiale Ausdehnung der jeweiligen Blendenöffnung. Dadurch erhöht sich die Fläche der jeweiligen Blendenöffnung bei beibehaltener Dezentrierung. Durch die größere Fläche wird die Signalstärke am Ausgang des Detektors größer als bei kreisförmiger Blendenöffnung. Dies verbessert das Signal-Rausch-Verhältnis besonders bei schwach reflektierenden Proben bzw. Grenzflächen im Fokus. Die Abstände der Flächenschwerpunkte der Blendenöffnungen 3 und 4 von der optischen Achse 18 unterscheiden sich um mindestens den Faktor 2. Weiterhin überlappen sich die Blendenöffnungen 3 und 4 in ihrer Projektion auf den Querschnitt 17 des Messstrahlenbündels nicht. Auf diese Weise ist sichergestellt, dass zwei Autofokus-Aperturblenden 5 und 6 zum Einsatz kommen können, deren Blendenöffnungen 3 bzw. 4 im Strahlenquerschnitt deutlich unterschiedlich dezentriert angeordnet sind. Dies ist für den weiter unten behandelten Einsatz der dargestellten Autofokus-Aperturblenden 5 und 6 in einer triangulierenden Autofokuseinrichtung von großem Vorteil.
3 zeigt den Einsatz einer der beiden Autofokus-Aperturblenden 5 oder 6 aus 2 – hier Autofokus-Aperturblende 5 – in einer triangulierenden Autofokuseinrichtung, die insgesamt mit 21 bezeichnet ist. Gleiche Elemente wie die der Autofokuseinrichtung gemäß 1 sind mit denselben Bezugszeichen versehen. Ausgehend von einem Beleuchtungsspalt 22, der beispielsweise über eine LED mit vorgeschaltetem Kollektor und einer Spaltblende erzeugt werden kann, verläuft ein Messstrahlenbündel 34 entlang der optischen Achse 18 der Autofokuseinrichtung 21. Mit ihrem Zentrum auf der optischen Achse 18 angeordnet ist eine Autofokus-Aperturblende 5, wie sie beispielsweise in 2 dargestellt ist. Es sei in diesem Zusammenhang darauf hingewiesen, dass die Autofokus-Aperturblende 5 ihrerseits Bestandteil beispielsweise eines Blendenrads oder eines Blendenschiebers sein kann. Solche mechanischen Konstruktionen zum Austausch bzw. Wechsel von Blenden sind an sich bekannt und sind nicht Gegenstand der vorliegenden Betrachtungen.
Die Beleuchtungsoptik 23 bildet zusammen mit der Fokussierlinse 24 den Beleuchtungsspalt 22 in die Leuchtfeldblende 26 ab. Über die sogenannte Transportoptik 25, die die entlang der optischen Achse verschiebbare Fokussierlinse 24 und eine weitere Transportlinse 35 umfasst, wird der Autofokus-Messstrahl 36 zum Objektiv 10 des Mikroskops geleitet. Ein dichroitischer Strahlteiler 20 teilt den zum Tubus 41 führenden Abbildungsstrahlengang 42 des Mikroskops von dem hier dargestellten Strahlengang der Autofokuseinrichtung ab. Der Autofokus-Messstrahl 36 erreicht die Objektebene 16 und bildet auf dem Objekt ein Messmuster, hier einen Messspalt, ab. Wenn das Bild des Messspalts scharf ist, befindet sich der Autofokus-Messstrahl 36 im Fokus.
Wie aus 3 ersichtlich, erzeugt die Autofokus-Aperturblende 5 mit ihrer Blendenöffnung 3 einen Autofokus-Messstrahl 36 in der einen Hälfte des Querschnitts 17 eines entlang der optischen Achse 18 verlaufenden Messstrahlenbündels 34, wobei der Autofokus-Messstrahl 36 dezentriert von der optischen Achse 18 verläuft. Im Ergebnis durchläuft der Autofokus-Messstrahl 36 nicht mehr den achsnahen Bereich der optischen Achse 18. Somit werden Reflexe erster Ordnung, beispielsweise an der Transportoptik 25 oder dem Objektiv 10 stark vermindert und gelangen nicht in den Detektor 28.
Der remittierte, d. h. vom Objekt reflektierte Autofokus-Messstrahl 36' gelangt, wie in 3 schematisch dargestellt, seinerseits wiederum über den Strahlteiler 20 und die Transportoptik 25 zum Umlenkprisma 33. Durch das Umlenkprisma 33 wird der Autofokus-Messstrahl 36' zu einer der Beleuchtungsseite gegenüberliegenden Detektorseite der Autofokuseinrichtung 21 reflektiert. Zusammen mit der Detektoroptik 29 wird der remittierte Autofokus-Messstrahl 36' wiederum als Spaltbild auf dem Detektor 28, hier als zweidimensionale CCD-Kamera vorgesehen, abgebildet. Alternativ ist die Verwendung einer zeilenförmigen CCD-Matrix möglich. Als Spektralbereich des Autofokus-Messstrahls eignet sich insbesondere der infrarote Bereich, so dass der Messspalt auf dem Objekt 16 für das Auge nicht sichtbar ist. Es sind aber auch Autofokus-Messstrahlen im sichtbaren Spektralbereich verwendbar. Zur Ausfilterung von Streulicht dient ein Spektralfilter 31, das vor den Detektor 28 geschaltet ist, und nur für solche dem Autofokus-Messstrahl entsprechende Wellenlängen durchlässig ist. Selbstverständlich muss in diesem Spektralbereich auch die Empfindlichkeit des Detektors 28 liegen.
Mit der in 3 dargestellten Anordnung lässt sich eine triangulierende Autofokuseinrichtung 21 realisieren, die den Fokus beispielsweise auf einer Grenzfläche mit sehr niedrigem Reflexiongrad hält. Aufgrund der unterdrückten Reflexe erster Ordnung ist das Signal-/Rausch-Verhältnis ausreichend hoch, um auch bei niedrigen Reflexionsgraden im Promillebereich den Haltefokus dauerhaft stabil zu halten.
Für eine Grundeinstellung des Fokus am Mikroskop (vgl. weiter unten 4) wird beispielsweise durch den Benutzer unter visueller Kontrolle auf eine Grenzfläche zwischen einem Deckglas und einer wässrigen Präparateinbettung fokussiert. Die sich hieraus ergebende Messspaltposition auf dem Detektor 28 wird als ”Null-Linie” erfasst. Hierbei handelt es sich um ein Intensitätssignal des positionsempfindlichen Detektors 28, z. B. eines CCD-Chips, das das Bild des Messspaltes als Intensitätskurve über eine Richtung des Detektors 28 darstellt. Bei schwachen Signalen kann die Kurve auch mehrmals aufaddiert werden, um eine Signal-Rausch-Überhöhung zu erzielen. Die Intensitätskurve weist am Ort des Messspaltes einen Peak auf, dessen Halbwertshöhe an seiner linken oder seiner rechten Flanke als Fokussignal definiert ist.
Da die Blendenöffnung 3 der Autofokus-Aperturblende 5 relativ zur optischen Achse 18 dezentriert auf der Autofokus-Aperturblende angeordnet ist, erzeugt der Messspalt des Autofokus eine schräge Beleuchtung auf der Probe. Dadurch sind die beiden Flanken des Peak etwas unterschiedlich, da eine von beiden in der Regel etwas abgeschattet ist und die Bestimmung der Halbwerthöhe erschwert ist. Es wird daher vorzugsweise vor Beginn der Messungen durch den Benutzer ausgewählt, welche Flanke für die Signalgewinnung genutzt wird. Selbstverständlich kann auch eine automatische Signalauswertung vorgesehen sein, welche die „bessere” Flanke aus dem Intensitätssignal des Detektors 28 automatisch ermittelt.
Ab Überschreiten eines bestimmten Schwellwertes des Fokussignals ermöglicht die Autofokusvorrichtung eine Regelung der Fokusposition, die entweder zum Auffinden des Fokus bei optimalem Fokussignal genutzt werden kann oder zum Halten bzw. automatischen Nachjustieren des Fokus bei Änderungen des Abstandes zwischen Präparat und Objektiv (z. B. durch thermische Einflüsse am Mikroskop oder Präparatänderungen, wie Zellteilung, Zellwanderung etc.)
Bei visuell scharfgestelltem Bild, also visuellem Fokus, kann der Autofokus-Messspalt eventuell. noch außer Fokus sein. Um ein scharfes Spaltbild zu erhalten, kann daher bei festgehaltenem visuellem Fokus, also unverändertem Abstand z zwischen der Präparatgrenzfläche und dem Objektiv, die Fokussierlinse 24 in Achsrichtung verschoben werden, bis das Fokussignal des Detektors 28 den Schwellwert überschreitet oder einen vorgegebenen optimalen Wert erreicht hat. In einem solchen Fall ist der visuelle Fokus (am Mikroskop) gleich dem Messspalt-Fokus der Autofokuseinrichtung.
Zu jedem verwendeten Objektiv werden in der Ansteuereinrichtung der Autofokuseinrichtung die technischen Daten, wie Vergrößerung, Trocken- oder Nass-Objektiv, numerische Apertur, hinterlegt. Dazu kommen bei Bedarf noch Angaben über zulässige z-Werte, d. h. den Abstand, des Objektivs relativ zum Prapärat. Dies verhindert unbeabsichtes Aufsetzen der Frontlinse des Objektivs auf das Präparat, wodurch sie beschädigt werden kann. Außerdem wird in der Ansteuereinrichtung der Autofokuseinrichtung für die geplanten Untersuchungen hinterlegt, welche Dicke die verwendeten Deckgläser haben.
Auf diese Weise kann in einer anderen Grundeinstellung als Position des Messspalt-Fokus die dem Objekt abgewandte Seite eines Deckglases gewählt werden (Deckglasdicke beträgt ungefähr 170 μm), während der visuelle Fokus des Mikroskops unterhalb des Deckglases, also auf besagter Grenzfläche, liegt. Herzu erfolgt die Einstellung des visuellen Fokus und des Messspalt-Fokus, wie bereits zuvor beschrieben. Die Position des Messspalt-Fokus wird dann auf die dem visuellen Fokus gegenüberliegende Seite des Deckglases verschoben, indem die Fokussierlinse 24 entlang der optischen Achse um einen definierten Betrag verfahren wird, welcher der bekannten Dicke des Deckglases entspricht. Dies hat den Vorteil, dass der Messspalt des Autofokus auf eine Glas-Luftfläche fokussiert ist, wo er einen stärkeren Reflex erhält und somit stärkere Fokussignale mit besserem Regelverhalten erzeugt werden.
Nach Wahl einer passenden Grundeinstellung erfolgt die mikroskopische Untersuchung, während derer der Messspalt-Fokus mittels der Autofokuseinrichtung 21 konstant gehalten wird, wodurch auch sichergestellt ist, dass der visuelle Fokus unverändert bleibt.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform ist die im allgemeinen Teil der Beschreibung bereits erläuterte Wahl einer Autofokus-Aperturblende 5, 6 in Abhängigkeit vom Eintrittspupillendurchmesser eines Objektivs des Mikroskops, das zusammen mit der triangulierenden Autofokuseinrichtung 21 verwendet wird. Hierzu sei zunächst der Strahlengang eines Mikroskops anhand eines konkreten Ausführungsbeispiels gemäß 4 kurz beschrieben.
Im Falle der 4 handelt es sich um einen Strahlengang eines inversen Forschungsmikroskops, wie es häufig für die Zelluntersuchung eingesetzt wird. Mit inversen Mikroskopen lassen sich insbesondere auch Proben in Petrischalen bequem untersuchen. Insbesondere eignen sie sich zur Manipulation von Zellen während der mikroskopischen Untersuchung, da der obere Objektraum frei zugänglich ist. Bezüglich weiterer Einzelheiten zu inversen Mikroskopen und allgemein zu Mikroskopen zur Untersuchung von Vorgängen in (lebenden) Zellen, sei auf die allgemeine Fachliteratur verwiesen. 4 zeigt ein Objektiv 10 eines insgesamt mit 40 bezeichneten inversen Mikroskops. Die Objektivpupille (oder Eintrittspupille des Objektivs) ist mit 11 bezeichnet und liegt im hinteren (vom Objekt abgewandten) Teil des Gesamtobjektivs 10, das in der Praxis aus einer Vielzahl von Linsengliedern besteht, von denen hier nur schematisch ein Linsenglied stellvertretend gezeigt ist. Das Objektiv 10 erzeugt zusammen mit der Tubuslinse 12, 13 ein erstes Zwischenbild in einer Bildebene 14. Konjugiert zur Objektivpupille 11 ist die Zwischenpupille 11'. Ein zweites Zwischenbild wird über eine Transportoptik 12', 13' in der Ebene 15 erzeugt und mittels eine Okulars mit dem Auge betrachtet. Anstelle einer Betrachtung über das menschliche Auge ist selbstverständlich auch der Anschluss einer Kamera oder eines andersartigen Bilddetektors möglich. Der dichroitische Strahlteiler ist in 4 ebenfalls wieder mit 20 bezeichnet. Er dient zur Einkopplung des Autofokus-Messstrahls 36 bzw. zur Auskopplung des am Objekt reflektierten Autofokus-Messstrahls 36' aus bzw. in die Autofokuseinrichtung 21, wie sie beispielsweise in 3 dargestellt ist.
Wie aus der Zusammenschau der 2 und 3 unter Berücksichtigung der Grundlagen der triangulierenden Autofokussierung (vgl. Ausführungen zu 1) erkennbar ist, führt bei Einsatz der gering dezentrierten Aperturblende 6 bei vorgegebenem Objektiv 10 und vorgegebener Größe des Detektors 28 eine Defokussierung der Objektebene 16 zu sehr viel kleineren Verschiebungen auf dem Detektor 28 als bei Verwendung der stark dezentrierten Aperturblende 5. Somit ist der Fangbereich, also die maximale Defokussierung, die vom Detektor 28 noch registriert werden kann, für die geringer dezentrierte Aperturblende 6 um ein Vielfaches höher als für die stärker dezentrierte Aperturblende 5.
Unter den weiter unten genannten Voraussetzungen ergeben sich für folgende beispielhaft gewählte Objektive die folgenden typischen Fangbereiche:

– für 20×, trocken: von –50 μm unter der Grenzfläche bis ca. 200 μm oberhalb, d. h. in die Probe hinein fokussiert;
– für 40×, trocken: von –20 μm unter der Grenzfläche bis ca. 80 μm oberhalb, d. h. in die Probe hinein fokussiert;
– für 40×, Öl: von –20 μm unter der Grenzfläche bis ca. 80 μm oberhalb, d. h. in die Probe hinein fokussiert;
– für 100×, Öl: von –20 μm unter der Grenzfläche bis ca. 30 μm oberhalb, d. h. in die Probe hinein fokussiert.

Für unterschiedliche Dezentrierungen des Autofokus-Messstrahls in der Objektivpupille sollen nachfolgend die erzielbaren Empfindlichkeiten für ein Objektiv 40×/0,85 betrachtet werden. Dabei besitzt das Objektiv die numerische Apertur NumAp = 0,85. Bei einem System mit Unendlichobjektiven (Objektivbrennweite 5 mm; Leica = Bezugsbrennweite 200 mm), sowie einer Detektorbrennweite von 100 mm und eine CCD-Chip-Breite von 3 mm sowie einer mittleren Autofokus-Wellenlänge von Lambda = 546 nm ergeben sich für exemplarische Dezentrierungen des Autofokus-Messstrahls um 2 mm und 4 mm in der Objektivpupille die folgende Beziehungen für die Tiefenschärfe TS: TS = Lambda/(NumAp)² = 546 nm/0,85² = 0,75 μm.
Eine Defokussierung des Objekts in z-Richtung um genau eine Tiefenschärfe TS bewirkt bei 2 mm Dezentrierung des Autofokus-Messstrahls in der Objektivpupille auf dem Detektor eine laterale Verschiebung von 13 μm.
Eine Defokussierung des Objekts in z-Richtung um genau eine Tiefenschärfe TS bewirkt jedoch bei 4 mm Dezentrierung des Autofokus-Messstrahls in der Objektivpupille auf dem Detektor eine laterale Verschiebung von 40 μm.
Bei Verwendung eines Trockenobjektivs 40× und der Autofokus-Aperturblende 5 mit einer Dezentrierung der Blendenöffnung 3 von der optischen Achse 18 um 4 mm ergibt sich ein Fangbereich im Objektraum von ±28 μm. Bei Verwendung desselben Trockenobjektivs 40× lassen sich beim Einsatz einer Autofokus-Aperturblende 6 mit geringerer Dezentrierung des Autofokus-Messstrahls der Blendenöffnung 4 von der optischen Achse um lediglich 2 mm deutlich größere Fangbereiche von ±88 μm erzielen. Damit lässt sich der oben beschriebene große Fangbereich für das Trockenobjektiv 40× durch Zuordnung der passenden Autofokus-Aperturblende mit geeignet dezentrierter Blendenöffnung realisieren und gleichzeitig in dem wichtigen Bereich um die für den Autofokus benutzte Grenzfläche eine sehr hohe Empfindlichkeit erreichen, d. h. eine sehr hohe Fokusstabilität durch Nachregeln realisieren.
5 zeigt die relative Reflexintensität für Reflexe erster Ordnung für drei exemplarisch ausgewählte Objektive aus dem Haus der Anmelderin. Aufgetragen ist die relative Reflexintensität gegen den Pupillenradius in Millimeter. Die relative Reflexintensität ist dimensionslos und im Punkt des Linsenscheitels auf 1 (= 100%) normiert. Dargestellt sind drei Kurven für Objektive mit den Vergrößerungen 40×, 63× und 100×. Für das 100×-Objektiv erhält man den steilsten Abfall der relativen Reflexintensität, während sich für die beiden anderen Objektive weniger starke Intensitätsabfälle ergeben.
Aus den dargestellten Kurven sind auch die Eintrittspupillen ersichtlich, die sich aus den Endpunkten der Kurven ergeben. So beträgt der Radius der Eintrittspupille des hier verwendeten 100×-Objektivs etwas über 2,5 mm, so dass sich der Eintrittspupillendurchmesser zu etwas über 5 mm ergibt. Das hier dargestellte 63×-Objektiv hat demgemäß einen Eintrittspupillendurchmesser von etwa 10 mm, das hier dargestellte 40×-Objektiv einen Eintrittspupillendurchmesser von etwa 12 mm.
Aus den in 5 dargestellten Kurven für die dort exemplarisch verwendeten Objektive kann eine Wahl getroffen werden, in welchem Abstand der Flächenschwerpunkt der Blendenöffnung der Autofokus-Aperturblende von der optischen Achse des Messstrahlenbündels sich befinden sollte: Beispielsweise ergibt sich für das dargestellte 100×-Objektiv bei einem Wert von etwa 1 mm für den Pupillenradius ein Abfall der relativen Reflexintensität auf 0,4, d. h. 40%. Somit ist es hier sinnvoll, den Abstand des Blendenöffnungsschwerpunktes von der optischen Achse mit etwa 1 mm zu bemessen, um die Reflexintensität um 60% zu senken.
Möchte man nur die Bereiche der Pupille für den Autofokus benutzen, deren relative Reflexhelligkeit kleiner als 0,4 ist, so müsste man bei dem 40×-Objektiv auf einen Zentralbereich von etwa 25% des Pupillenradius verzichten, bei dem dargestellten 63×-Objektiv auf einen Zentralbereich von etwa 40% sowie beim 100×-Objektiv von etwa 30%–40% des Pupillenradius. Liegt umgekehrt der _Schwerpunkt der Autofokusbeleuchtung bei ca. 2 mm Pupillenradius, so ergeben sich für die verschiedenen Objektive Reflexminderungen um den Faktor 2,5 bis 4 gegenüber dem zentralen Bereich der Pupille.
Bezugszeichenliste

1, 2: Querschnitt Eintrittspupille
3, 4: Blendenöffnung
5, 6: Aperturblende
8: optische Achse
10: Objektiv
11: Objektivpupille, Eintrittspupille
11': Zwischenpupille
12, 13: Tubuslinse
12', 13': Transportoptik
14, 15: Bildebene
16, 16': Objektebene
17: Querschnitt Messstrahlenbündel
18: optische Achse
19: Autofokus-Lichtquelle
20: Strahlteiler, Dichroit
21: Autofokuseinrichtung
22: Beleuchtungsspalt
23: Beleuchtungsoptik
24: Fokussierlinse
25: Transportoptik
26: Leuchtfeldblende
27: Motor
28: Autofokus-Detektor,
29: Detektoroptik
30: Messstrahl
31: Spektralfilter
32, 32': remittierter Messstrahl
33: Umlenkprisma
34: Messstrahlenbündel
35: Transportlinse
36: Autofokus-Messstrahl
36': reflektierter Autofokus-Messstrahl
40: inverses Mikroskop
41: Tubus
42: Mikroskop-Abbildungsstrahlengang
A: Ablenkpunkt
B, B': Ablenkpunkt
C: Reflexionspunkt
D: Reflexionspunkt
α: Winkel

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

US 5136149 B1 [0002, 0002]
DE 19537376 A1 [0002]
DE 3219503 A1 [0006]
US 2004/0113043 A1 [0008]
US 7345814 B2 [0009, 0012]
DE 2102922 [0010]

Claims

Autofokus-Aperturblende (5, 6) in einer triangulierenden Autofokuseinrichtung (21) für ein Mikroskop (40), wobei die Autofokus-Aperturblende (5, 6) mindestens eine Blendenöffnung (3, 4) aufweist, mit welcher ein zur Autofokussierung eingesetztes, in Richtung der optischen Achse (18) der Autofokuseinrichtung (21) verlaufendes Messstrahlenbündel (34) in seinem Querschnitt begrenzbar ist, dadurch gekennzeichnet, dass die Blendenöffnung (3, 4) der Autofokus-Aperturblende (5, 6) dezentriert mit Abstand zur optischen Achse (18) der Autofokuseinrichtung (21) angeordnet ist, wobei durch die Blendenöffnung (3, 4) in einer Hälfte des Querschnitts (17) des Messstrahlenbündels (34) ein dezentrierter Autofokus-Messstrahl (36) erzeugbar ist.
Autofokus-Aperturblende nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Blendenöffnung (3, 4) von zwei Kreisbögen mit unterschiedlichen Radien begrenzt ist.
Autofokus-Aperturblende nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Blendenöffnung (3, 4) ellipsoide, ovale oder nierenförmige Form aufweist.
Autofokus-Aperturblende nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Abstand des Flächenschwerpunktes der Blendenöffnung (3, 4) zur optischen Achse (18) der Autofokuseinrichtung (21) mindestens gleich dem halben vom Mikroskopobjektiv (10) vorgegebenen Radius der Eintrittspupille (1, 2), insbesondere mindestens gleich dem halben Radius des Querschnitts (17) des Messstrahlenbündels (34) entspricht.
Autofokus-Aperturblende nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Abstand des Flächenschwerpunktes der Blendenöffnung (3, 4) zur optischen Achse (18) der Autofokuseinrichtung (21) mindestens 0,5 mm bis 1,0 mm beträgt.
Autofokus-Aperturblende nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Abstand des Flächenschwerpunktes der Blendenöffnung (3, 4) zur optischen Achse (18) der Autofokuseinrichtung (21) 25% bis 40% des Radius der Eintrittspupille (1, 2) des Mikroskopobjektivs (10), beträgt.
Triangulierende Autofokuseinrichtung (21) für ein Mikroskop (40) mit einer Autofokus-Aperturblende (5, 6), die mindestens eine Blendenöffnung (3, 4) zur Begrenzung des Querschnitts eines in Richtung der optischen Achse (18) der Autofokuseinrichtung (21) verlaufenden Messstrahlenbündels (34) und zur Erzeugung eines Autofokus-Messstrahls (36) aufweist, und mit einer Autofokussieroptik (25, 26), um unter Verwendung eines Objektivs (10) des Mikroskops (40) mittels des Autofokus-Messstrahls (36) ein Messmuster auf einem Objekt zu erzeugen, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine Autofokus-Aperturblende (5, 6) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Erzeugung des Autofokus-Messstrahls (36) auswählbar ist.
Autofokuseinrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass eine von mindestens zwei unterschiedlichen Autofokus-Aperturblenden (5, 6) auswählbar ist, deren Blendenöffnungen (3, 4) in unterschiedlichen Abständen zur optischen Achse (18) der Autofokuseinrichtung (21) angeordnet sind.
Autofokuseinrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens zwei unterschiedlichen Autofokus-Aperturblenden (5, 6) unterschiedlichen Durchmessern der Eintrittspupillen (1, 2) verschiedener Mikroskopobjektive (10) zugeordnet sind und jeweils in Abhängigkeit von dem Eintrittspupillendurchmesser des gewählten Objektivs (10) zur Erzeugung des Autofokus-Messstrahls (36) auswählbar sind.
Autofokuseinrichtung nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass zwei Autofokus-Aperturblenden (5, 6) vorgesehen sind, deren Abstände der Flächenschwerpunkte der Blendenöffnungen (3, 4) zur optischen Achse (18) der Autofokuseinrichtung (21) sich um mindestens den Faktor 2 unterscheiden.
Autofokuseinrichtung nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens zwei Autofokus-Aperturblenden (5, 6) jeweils derart anzuordnen sind, dass die Flächenschwerpunkte ihrer Blendenöffnungen (3, 4) jeweils auf derselben Geraden senkrecht zur optischen Achse (18) der Autofokuseinrichtung (21) liegen.
Autofokuseinrichtung nach einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Blendenöffnungen (3, 4) zweier Autofokus-Aperturblenden (5, 6) sich in ihrer Projektion auf den Querschnitt (17) des Messstrahlengangs (34) nicht überlappen.
Autofokuseinrichtung nach einem der Ansprüche 8 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass genau zwei Autofokus-Aperturblenden (5, 6) vorgesehen sind.
Autofokuseinrichtung nach einem der Ansprüche 7 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Auswahl einer Autofokus-Aperturblende (5, 6) in Abhängigkeit von dem im Mikroskop (40) verwendeten Objektiv (10) erfolgt.
Verwendung von mindestens zwei Autofokus-Aperturblenden (5, 6) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, deren Blendenöffnungen (3, 4) in unterschiedlichen Abständen zur optischen Achse (18) der triangulierenden Autofokuseinrichtung (21) angeordnet sind, für eine solche Autofokuseinrichtung (21) für ein Mikroskop (40) mit auswechselbaren und/oder umschaltbaren Objektiven (10).