CN101292187B - 荧光显微镜 - Google Patents

Abstract

本发明提供了荧光显微镜和用它测量荧光的方法。该显微镜包含高度平坦和不发荧光的硅晶片过滤膜。此外，它具有非常高的孔眼密度，以便小的表面区域就足够用于有效测量。此外，将相机用作位置敏感检测器使得可以利用更好的光学分辨率，这意味着可以在较大工作距离上应用具有较小数值孔径和较小放大倍数的光学部件。所有这些因素加在一起提供了能够比现有荧光显微镜更迅速测量的荧光显微镜。

Description

荧光显微镜

技术领域

本发明涉及荧光显微镜。

具体地，本发明涉及一种荧光显微镜，其包含：外壳，带有被设计成发出激发光的激发光源；滤光器件，将激发光与由荧光物质生成的荧光分开；物镜；基片座；位置敏感光检测器；和用于位置敏感光检测器的成像透镜。

背景技术

这种类型的荧光显微镜广泛应用在研究荧光样本或样品的荧光研究中。如果需要，本身不发荧光的样本可以配有荧光物质。如果用适当光(通常但不排他地是可见光或紫外光)照射这样的样本或样品，样本中的荧光物质将被波长比激发光长的荧光点亮。荧光的强度往往很低，这意味着，几乎在所有情况下，都可以借助于滤光片滤出激发光。然后，原则上，弱荧光是唯一可见的图像。

实际上，人们常常对微生物进行荧光研究。这通常牵涉到较高的放大率，物镜上最好大于50倍直到100倍，和总共大约1000倍，以便能够通过肉眼检查。除此之外，使用的基片的典型尺寸是，例如，直径25毫米。这样的尺寸常常是必需的，例如，在微生物样本的情况中，其中，应该让一定量的样本液体经过基片，以便获得集中在基片上的、随后要研究的微生物颗粒。在该过程中，样本液体经过基片中的细孔眼，颗粒保留在基片的表面上。

已知荧光显微镜的缺点是测量时间可以变得非常长。例如，在所希望分辨能力小于1微米和基片具有25毫米的直径，以及测量时间为每个图像几秒的微生物研究的情况下，总测量时间达到多个小时甚至一天也并不罕见。

发明内容

本发明的目的是提供在保持分辨能力的同时使测量时间短得多的荧光显微镜。

这个目的是通过根据本发明的荧光显微镜达到的，该荧光显微镜包含含有基于晶片的过滤膜的基片，其中，过滤膜由适合光刻处理技术的材料制成，过滤膜包含通过光刻引入的连续孔眼的图案。

具体地，过滤膜是借助于晶片制造的。事实是可以使这样的晶片特别平坦，以便可以使呈现晶片表面形状的过滤膜同样格外平坦，尤其是平坦到对于提供1微米或更小分辨能力(例如，0.5微米)的荧光显微镜的设置，实质上可以锐聚焦地成像整个基片表面。这意味着在例如3毫米的直径上，基片应该平坦到0.5微米内。

光刻技术一方面提供了提供这样平坦基片的技术，另一方面使得可能将非常多、轮廓分明的孔眼引入基片中。可以想到，对于例如，0.1-1微米的孔眼尺寸，孔隙率是5-20％，甚至高达40％。其结果是，正如下文更详细说明的那样，可以有利地使基片小得多。此外，与这种类型的基片(孔眼尺寸小于0.19微米)有关的滤液将是无菌的。

由硅制成的这种类型的过滤膜由fluXXion提供。来自fluXXion的硅过滤膜具有非常薄的附加优点，并且，由于轮廓分明的大量孔眼，还具有非常高的透过率。其结果是，可以提供在仍然具有相同总透过率的同时，具有明显比迄今为止习惯使用的基片小的尺度的基片。例如，可以用具有具体地说小于10毫米(例如，3毫米)的直径的硅过滤膜取代具有25毫米的直径的现有技术基片。这意味着处在样本液体中的待研究材料以比针对现有技术基片高得多的浓度经过过滤膜。实际上，这也意味着需要研究小得多的区域。例如，要研究的区域从25毫米直径的面积减小到3毫米直径的面积意味着节省了大约50倍的时间。

就此而言，基片，即，过滤膜无需由硅制成，而是如上所述，可以由适合光刻技术的材料制成。具体地说，基片实质上由硅、硅化合物、蓝宝石、硅酸盐玻璃或它们的组合组成。这样的材料具有确凿的对这些技术适应性、良好的机械特性、良好的耐化学性、和低的固有荧光性。可想到组合材料包括例如所谓的SoS，即蓝宝石上外延硅。

更具体地说，基片实质上包含硅。这种元素极其适合光刻处理，并且已经开发出最佳的相关技术。

具体地说，基片的表面可以掺杂一种或多种元素，以便提高一种或多种特性，尤其是硬度或耐化学性。基片具有渗氮或渗碳表面是有利的。使硅基片局部地渗氮或渗碳分别产生非常硬和耐用氮化硅或碳化硅层，从而进一步提高了机械特性。

在有利实施例中，基片实质上包含碳化硅或二氧化硅。取代仅仅使表面渗碳，整个基片也可以实质上由碳化硅制成，一种替代物是石英(二氧化硅)。

在现有技术荧光显微镜中经常发生的另一个问题是基片可能发荧光。这意味着在荧光测量结果中存在背景信号或噪声。这种背景信号可以干扰待研究材料的真实测量结果。因此，最好提供不发荧光或只在低水平上发荧光的基片。这个目的是通过实质上包含上述材料的基片达到的。

在基片表面的至少一侧上涂敷金属层是有利的。这样的措施保证了基片更加低的固有荧光性。这提供了通过光刻在根据本发明的基片上精确地生成孔眼的优点。在这样做的时候，常常使用其残留物可以引发荧光的化学制品。这些残留物现在与“真正”基片一起被薄金属层屏蔽。这样金属层的一个例子是汽相沉积铬层，但也可以是其它金属。

另一重要点涉及基片上的锐聚焦。毕竟，由于基片无需处在显微镜的锐聚焦面上，因此即使使用完全平坦的基片，仍然有必要依次使基片的每个新研究部分变成锐聚焦。事实上，可以为每个位置确定与锐聚焦面有关的高度。但是，对于完全或至少足够平坦的基片，对锐聚焦点进行3点测量就足够了，从而确定与显微镜锐聚焦面有关的基片位置。然后，可以使基片倾斜，以便的确处在显微镜的锐聚焦面上。接着，一个可替代选项是为所希望锐聚焦校正的每个位置进行简单计算，然后，如果需要，可以自动进行该计算。随着基片移动，接着可以自动控制锐聚焦。在这个实施例中，平坦的基片也节省了大量聚焦时间。

在一个有利的实施例中，荧光显微镜包含聚焦照射系统，该聚焦照射系统具有被设计成发出聚焦光的聚焦光源，其中，聚焦光的光路和荧光的光路同轴地经由物镜通向基片。因此，在使用荧光显微镜期间，这牵涉到在聚焦操作期间使光照射在基片上。聚焦光从基片到检测器的光路部分与荧光的光路部分相同。换句话说，可以利用聚焦光和荧光两者产生基片的图像。这提供了将荧光图像与基片的普通光学图像、以及样本或样品一起相关联的选项。这对于解释荧光图像和例如剥离它们的假像(artefact)是有益的。

在这样的布置中，聚焦光原则上可以包含普通可见光。如果需要，聚焦光只包含一部分可见光谱。有利地，聚焦光实质上包含激发光之外的波长区中的光，毕竟，该光将被直接将激发光引向基片的镜等反射掉。例如，聚焦光实质上包含波长接近或等于荧光波长的光，或甚至实质上包含荧光。

荧光显微镜最好进一步包含部分透过聚焦光的镜，该镜以将来自基片的光引向光检测器的方式放置在聚焦光的光路中。这提供了经由物镜提供聚焦光的选项。换句话说，聚焦光经由与应用于收集用于形成聚焦图像的反射聚焦光的光学部件相同的光学部件被照射到基片上。这里，重要的是：基片完全平坦，最好是像例如硅晶体过滤膜那样的镜。此外，这样还具有在观看样本或样品的时候，只用聚焦光照射在那个瞬间观看的部分的优点。这对于样品或样本的常常迅速光诱发褪色或类似引起的荧光物质的击穿是有益的。另一个优点是在与发出荧光的一侧相同的那一侧上供应聚焦光。此外，透明基片是另一个选项。但是，这对于晶片过滤膜不是非常有效，因为，事实上，这经由连续孔眼形成了具有非常小数值孔径、由此非常大焦深的光学元件。这又意味着从下面对聚焦光进行锐聚焦变得困难，就成像光学部件和相机而言，“锐度”与样品或样本的聚焦有关。毕竟，这些光学部件具有比过滤膜中的连续孔眼的有效数值孔径小得多的数值孔径。

但是，应该注意到，聚焦光也可以经由一些其它光路供应，例如，通过比如全部围绕物镜供应聚焦光的聚焦光源倾斜地入射到基片上。在这个实施例中，本发明也提供了一些优点，因为对于所选的光学设置，工作距离一般大于现有技术荧光显微镜中的工作距离，并且肯定大于浸润式光学显微镜。下面将更详细说明这些点。

当将应用像素的相机用作位置敏感检测器时，所谓的像素分辨率最好至少与荧光显微镜的光学分辨率一样好，以便保留通过相机检测的光学图像当中的尽可能多信息。像素分辨率简单地是像素尺寸除以放大倍数，最好在1/3×光学分辨率与1×光学分辨率之间，即，像素分辨率最好至少与光学分辨率(信息保持力)一样好，但最好至多好3倍，即，1/3×光学分辨率。毕竟，即使“更好”的像素分辨率也只能产生更高有效分辨率的假象，因为实际上在提供的光学图像中不存在那种信息。

如果特别是根据相机的特性而不是肉眼的那些特性来选择适度光学分辨率(即，不大于所需的)，则较小的放大率可能就足够了。这带来了可以减少所要求的像素数量或至少测量的像场与像素数量之间的关系合适的主要优点。所述像素数量不仅决定相机的价格和复杂性，而且，最重要的是，决定读出速度。可替代地，可以只使用预设为记录图像的CCD(电荷耦合器件)的有限个像素，不超过取得所希望分辨率所需的像素。在这两种情况中，少的像素数量意味着高的读出速度，因此实现更迅速的测量。

举例来说，所希望分辨率是0.5微米，使用波长为530纳米的绿光。然后，相应数值孔径为至少0.40。对于5微米的像素尺寸和0.5×光学分辨率，即，0.25微米的所希望像素分辨率，这导致了总共20倍(×)的相机放大倍数。在实际中，接着的可行选项是选择，例如，f＝10毫米的物镜和f＝200毫米的成像透镜。这些数值是使显微镜的结构变得紧凑，同时使工作距离仍然是大约2厘米的焦距。显然，与其它荧光波长、像素尺寸、像素分辨率与光学分辨率之比(最好在1∶1与1∶3之间)、物镜和成像透镜的焦距一样，其它所希望分辨率也是可以的，显然，可选地，成像透镜是复合透镜系统。

在上述方式下，可以保证物镜的强度或放大倍数可以降低，而总放大率与小像素尺寸结合仍然足以取得所希望的分辨能力。另外的优点是物镜的数值孔径(NA)无需保持特别大，这意味着大放大率的浸润是没有必要的。

事实上，当使用相机取代肉眼时，根据所希望分辨率确定显微镜要求的NA的估计值，然后根据像素尺寸和所希望像素分辨率确定所要求的放大倍数。

具有相对小NA(有利的是0.45和更小)的透镜的主要优点是焦深相对较大。这又意味着不要求或至少不经常要求更新基片的锐聚焦，甚至可以在不调整显微镜的情况下仍然完整测量相对较厚的基片。

这提供了一些优点，尤其当与非常平坦的晶片过滤膜结合时，因为现在可以利用单次锐聚焦操作实现完整测量基片。事实上，晶片过滤膜形成二维基片，允许锐聚焦在基片表面上的薄膜中的小孔上，同时使样品或样本直接位于那个表面上。

浸润在例如水或油中总是带来各自浸润液体的蒸发，这常常不是所希望的。此外，可能以与不同样品发生交叉污染的形式发生污染，这是更严重的缺点。这不仅可以由例如混入微生物或其它材料的浸润液体的蒸发引起，而且可以由上述材料经由浸润液体从一个样品转移到另一个样品引起。给定物镜的小的放大倍数，本发明提供了设置大工作距离因此防止污染的简单方式。

有利的是，部分透射镜包含一个镜或所谓的圆点分束器，聚焦光的反射系数与透射系数之比至少是10(有利的是，至少是100)。最好，荧光的反射系数与透射系数之比至少是100。在聚焦光同轴入射的情况下，存在光学元件，其首先部分透射聚焦光，然后将它部分反射到检测器，或如果交换检测器和聚焦光源的位置，则反过来操作。

本发明进一步涉及利用根据前面权利要求的任何一项所述的荧光相机检测基片上的样品的荧光的方法，该方法包含：用激发光照射基片上的样品，和检测来自样品的荧光。通过使用根据本发明的荧光显微镜，尤其是硅晶片基片，可以在荧光测量中显著节省时间。此外，没有或几乎没有由基片引起的荧光。

具体地说，只有当使样品聚焦时，聚焦光源才实质上发出聚焦光。其结果是，基片上的样品或样本褪色较少。借助于最好与激发辐射同轴的聚焦光的照射，可以交替选择在必要时产生可见光图像的聚焦光图像、和荧光图像，这些图像之间的关联可以容易地取得。在如果要求通过更新锐聚焦重新定位基片的情况下，可以在短(聚焦)时间内简单地开关聚焦光源。

而且，聚焦光源发出非常少的光，或至少非常少的光到达样品或样本。聚焦光原则上局限到允许锐聚焦所需的亮级，因此使样品或样本上的褪色或其它不利效应达到最小化。显然，如果样品不受此影响，所述光亮级可以较高，因此使锐聚焦更迅速和/或更准确。

在特定实施例中，从基片上的样品的许多分区的每一个中检测荧光，然后根据在分区中检测的荧光确定相关图像信息，分区是从样品中随机选择的，如果当前测量的来自所有分区的相关图像信息总体上超过预定置信水平阈值，则中断荧光的测量。因此，可以更进一步缩短测量时间。然后，应该事先选择指示在哪一点上特定样品或样本被测量到足够置信水平的阈值。简单的例子是要求存在要证实的特定微生物。此处，毕竟，检测到那种微生物的一个或许多个个体就足够了。显然，选择(正当)标准值作为阈值也是可以的，这足以确定是否超过标准等。以这种方式把超过阈值的检测包含进来可以通过例如最好是自动模式识别装备来实现。

本发明还提供了用在根据本发明的荧光显微镜中的基片，它包含由适合光刻处理技术的材料制成的基于晶片过滤膜，其中，过滤膜包含通过光刻引入的连续孔眼的图案，在基片表面的至少一侧上涂敷金属层。由于金属层，可以有效地抑制基片材料的残余固有荧光。就基片的基本材料和金属层中金属的类型而论，可以使用上文已经描述过的材料。

本发明还提供了制造根据本发明的基片的方法，它包含如下步骤：提供基于晶片过滤膜，通过光刻技术提供带有孔眼的过滤膜，然后在过滤膜的至少一侧上涂敷金属层。如上文所述，孔眼可以具有，例如，0.1到1微米之间的直径，但不排除其它直径或形状。应该注意到，首先汽相沉积金属层，此后引入孔眼也是可以的，这样就具有在孔眼内部没有金属的优点。但是，在那种情况下，金属可能干扰光刻步骤，而且可能保留残余光刻化学制品，这带来了残余荧光的风险。

此外，根据本发明的荧光显微镜、方法和基片使荧光测量加速。此外，所述加速来源于晶片过滤膜的使用，所述晶片过滤膜是通过与已知基片相比在小得多、因此可以更迅速测试的表面区上提供同等有效的过滤器导致加速的。此外，平坦的过滤器不需要反复锐聚焦。三点测量就足够了，所需的任何随后控制都能够自动实现。而且，使用了提供比肉眼更好的分辨能力的相机，因此允许使用的透镜的数值孔径较小。这意味着使用较便宜的透镜，以及在许多情况下，再也没有必要浸润。除此之外，至少，如果就所希望光学分辨能力而言，相机的像素不太大，较小的放大倍数就足够了，从而允许应用较长的焦距，导致较大的工作距离。这又有利于防止浸润引起的污染。另外，一旦观察的统计结果给出这样做的原因，就停止测量是有益的。总之，根据本发明的荧光显微镜、方法和基片可以用于非常迅速地、可靠地、和以非接触方式测量荧光。

附图说明

下面参照附图说明本发明，附图的单个图形是根据本发明的荧光显微镜的横截面的示意性描述。

图1用横截面示出了根据本发明的荧光显微镜。

具体实施方式

荧光显微镜一般用标号1表示，它包含带有安装在上面的相机12的外壳10。配备在外壳10中的是激发光源14，以及第一透镜16、激发滤光片18和分色镜20。

在图1中配备在外壳10底部的是物镜22，经由物镜22可以照射基片24。基片24容纳在基片座26中，而28指示x-y-z基片平移台。

标号30指示局部透射镜或分束器，32指示发射滤光片，34指示成像透镜。

指示在外壳10顶部的是聚焦光源36和聚焦透镜38。

根据本发明的荧光显微镜1的外壳10是实质上不透光外壳。外壳10原则上可以由像金属和/或塑料那样的任何材料制成。排列在外壳10中的是大量光学和其它部件。

激发光源14处在外壳10中，提供激发光。激发光源原则上可以包含适合这种用途的任何光源，例如一个或多个LED(发光二极管)、(高压)水银灯、激光器等。激发光源14的激发光的波长作为要研究的荧光材料的函数来选择，但一般说来，是波长相对较短的光。常用波长处在绿光到(且包括)近紫外光的区域中，但不排除其它波长。在这种情况下，例如，激发光源14是蓝色LED光源。

激发光源14发出的光经过第一透镜16，第一透镜16被设计成形成例如均匀性足够高的适当激发光束。该光束还经过设计成滤出不想要部分光的激发滤光片18。具体地，这涉及到激发光当中与荧光相对应的部分光。激发光中这样的小部分毕竟可能干扰随后的荧光测量。必要时，还可以设置激发滤光片18以去除一部分幅度大于或小于激发光或荧光的光。因此，尽量防止来源于与荧光测量无关的光的可能噪声。视使用什么类型的激发光和/或荧光而定，本领域的普通技术人员可以容易地选择适当滤光片。必要时，激发滤光片可以包含2个或更多个分滤光片。

虽然在当前情况中，激发光源被显示成在外壳10内，但也可以将激发光源安装在外壳10的外部，必要时，在激发光源14与外壳10之间提供不透光耦合-也参见下文讨论的与相机12的耦合。

如此准直和滤光的激发光经由分色镜20以及经由物镜22朝基片24照射。分色镜20被设计成例如反射尽可能多的激发光，而使得来自基片24的荧光高透射率地经过。如本领域的普通技术人员所知，通过适当堆叠介电层，可以容易地实现这一切。

物镜22可以是例如标准显微镜物镜，具有在例如10倍到45倍之间的放大倍数。数值孔径可以在例如0.2与0.5之间。工作距离可以是例如几毫米甚至可以直到几厘米。应该注意到，这个工作距离足以允许基片24的非接触测量。

基片24原则上可以是适合这种用途的任何基片，例如，玻璃片等。对于微生物测量，具体地说，常常使用配有许多小孔眼的基片。在测量之前，例如，使包含要研究的微生物等的样本经过基片，要研究的材料保留下来，而液体可以从基片中的孔眼排出。用于这些测试的典型基片包含例如聚合物基片。但是，有利的是，基片24包含例如硅膜过滤器。例如，fluXXion销售的这种类型的硅膜过滤器由硅制成，所述硅不发荧光或只在非常低的水平上发荧光，其结果是，不会干扰任何荧光测量。而且，这种类型的硅过滤膜是以如用在半导体技术中的硅晶片为基础制成的。因此，硅过滤膜也非常平坦，这意味着，在与荧光显微镜的光轴垂直的布置中，完全可以不用调整地获得清晰图像，即便在高放大率下。此外，由于限定在非常窄的有限空间内的大量孔眼，这种类型的硅过滤膜的另一个优点是渗透率非常高。这意味着过滤膜在过滤期间可以具有高度可选择性，并且还意味着基片24的尺度可以保持非常小，但仍然允许在实际习惯的时间长度内过滤相同数量的样本液体。具有例如3毫米的横截面的硅过滤膜足以满足这种用途，当然其它尺度也是可以的。

基片24容纳在包含基片平移台28(只示出轮廓)的基片座26中。基片平移台28用于沿着位于荧光显微镜1的图像平面内的方向(这里也称为x和y方向)，和另外为了锐聚焦，沿着与上述方向垂直的方向(这里也称为z方向)平移基片24。另外，基片平移台可以设计成使基片24围绕x和/或y轴，以使基片表面位于荧光显微镜1的锐聚焦面内的方式倾斜。由于高度平坦的硅过滤膜能够通过三点测量在锐聚焦平面内完全对准，这后一种特征是有利的。而且，基片如此平坦，以及在根据本发明的荧光显微镜中焦深如此大，以致于在整个x，y平移内整个基片都保持在焦深内。然后，可以简单地将z值设置成x和y的函数，例如，x和y的线性组合。

入射在携带待研究材料的基片24上的激发光源14的激发光将能够在那里引起荧光。如此生成的荧光又经由物镜22进入外壳10中，在外壳10中该荧光实质上经过分色镜20。然后，荧光落在部分透射镜30上，从而被反射到相机12。但是，它首先经过设计成实质上只让荧光透过的发射滤光片32。更一般地说，发射滤光片32的用途是提高荧光与其它光(尤其是激发光)的比率。原则上，让发射滤光片32只将激发辐射锁定在较大范围上就足够了，但发射滤光片32也可以用于选择特定类型的荧光。毕竟，除要研究的那些之外的其它材料都可能发荧光，尤其是基片。但是，如果将硅过滤膜用作基片24，这种类型的荧光通常可忽略不计。

接着，让具有，例如，530纳米的波长的荧光经过成像透镜34。相机12可以是具有10微米或更小的像素尺寸的CCD相机等。在具体例子中，像素尺寸是，例如，4.65微米，像素分辨率与光学分辨率之间的期望比至少是2倍。对于，例如大约0.5微米的所要求光学分辨能力，像素分辨率是例如0.23微米，所需的放大倍数是大约20。例如，物镜22具有10毫米的焦距和0.42的NA，和成像透镜34具有200毫米的焦距。给定这样的组合，还实现了一个优点，即物镜22上的足够大工作距离。

作为CCD相机12的可替代物，也可以使用例如CMOS(互补金属氧化物半导体)相机，或例如照相底板。CCD相机或CMOS相机具有可以用电子手段处理图像的优点，并且，如前所述，它们具有比肉眼好的有效光学分辨率。为此，可以将相机12与例如配有图像处理和/或图像识别装备和/或软件(未示出)的计算机连接。

应该注意到，如图1所示的荧光辐射的光路，即，经由部分透射镜30到相机的光路是针对聚焦光源36选择的。在缺乏聚焦光源36的情况下，相机也可以位于所述聚焦光源36的位置中，其结果是，部分透射镜30实际上变成多余的。但是，描绘在图1中的荧光显微镜1的确包含聚焦光源36。它的用途是应用足够数量的光，以便能够以简单方式在荧光显微镜1的锐聚焦面中定位基片24。为此，聚焦光源36发出例如白光或绿光，尤其是透过发射滤光片32和明显透过分色镜20的光。因此，聚焦光源36发出的光的颜色取决于来自激发光源14的光的颜色和荧光的颜色。本领域的普通技术人员可以容易地选择所有这些方面。聚焦光源36又可以是，例如，LED光源，或可替代地，(卤素)白炽灯或(高压)汞汽灯。其它光源同样可以。有利的是，可以使用LED光源，其优点包括：迅速开关从而不需要机械快门、旋镜等，以及长的服务寿命和由高内在效率、相对窄的带宽引起的有效照射，这意味着滤光片和基片需要应付相对低的功率。此外，在激发光源包含LED光源的情况中，这些优点同样存在。

聚焦透镜38的用途是获取有助于锐聚焦的足够均匀光束。另一个优点是在也称为对准的聚焦过程中，基片24，要研究的可能存在材料，尤其是标记细菌不会褪色。褪色将对随后进行的荧光测量产生负面影响。为了防止褪色，在聚焦期间只使用聚焦光源36。在到达基片24时，选择激发光与来自聚焦光源36的光之间的高光强比也是有益的。当将上述LED光源用于激发光源14和聚焦光源36时，例如，可以容易地取得2000∶1的激发光与对准光之比。在部分透射镜30与聚焦透镜38之间，可以可选地放置能够实质上对应于发射滤光片32的第二发射滤光片。在这样的情况下，可以容易地取得10000∶1的比率。给定这样的比率，可以可靠地避免待研究材料由聚焦光引起的褪色。平坦、小基片的使用具有只需进行少数次镜聚焦的优点。

与术语“透镜”的使用有关的一般注释是，在所有情况下，这个透镜也可以是复合透镜，即，包含多个光学元件。而且，原则上，发射滤光片32和激发滤光片18相对于相关透镜，即，成像透镜34和照射透镜16的位置可以反转。

所述的实施例应该当作非限制性例子。本发明的保护范围由所附权利要求书限定。

Claims (15)

1.一种荧光显微镜，包含：带有设计成发出激发光的激发光源的外壳；将激发光与由荧光物质生成的荧光分开的滤光器件；物镜；基片座；位置敏感光检测器；和用于该位置敏感光检测器的成像透镜，还包含基片，该基片含有由适合光刻处理技术的材料制成的基于晶片的过滤膜，其中，该过滤膜包含通过光刻引入的连续孔眼的图案，所述连续孔眼的尺寸在0.1-1微米的范围内。

2.根据权利要求1所述的荧光显微镜，其中，所述基片由硅、硅化合物、蓝宝石、硅酸盐玻璃或它们的组合组成。

3.根据权利要求2所述的荧光显微镜，其中，所述基片包含硅。

4.根据权利要求3所述的荧光显微镜，其中，所述基片含有渗氮或渗碳表面。

5.根据权利要求2所述的荧光显微镜，其中，所述基片包含碳化硅或二氧化硅。

6.根据权利要求2到5的任何一项所述的荧光显微镜，其中，在所述基片表面的至少一侧上涂敷有金属层。

7.根据权利要求1-5中的任何一项所述的荧光显微镜，包含：锐聚焦控制系统，被设计成用于输入所述基片在三个非共线点上的聚焦距离，所述锐聚焦控制系统根据该聚焦距离确定锐聚焦面。

8.根据权利要求1-5中的任何一项所述的荧光显微镜，进一步包含：聚焦照射系统，其含有被设计成发出聚焦光的聚焦光源，其中，所述聚焦光的光路和荧光的光路同轴地经由所述物镜通向所述基片。

9.根据权利要求8所述的荧光显微镜，进一步包含：部分透过聚焦光、且以将来自所述基片的光引向所述光检测器的方式被放置在所述聚焦光的光路中的部分透射镜。

10.根据权利要求9所述的荧光显微镜，进一步包含：位于所述部分透射镜与所述聚焦光源之间、且具有比荧光辐射低的激发光透射率的滤光片。

11.根据权利要求8所述的荧光显微镜，其中，所述聚焦光源只有当使所述基片上的样品聚焦时才发出聚焦光。

12.一种利用根据前面权利要求的任何一项所述的荧光显微镜来检测基片上的样品的荧光的方法，包含：

用激发光照射基片上的样品；和

检测来自该样品的荧光。

13.根据权利要求12所述的方法，其中，从所述基片上的样品的许多分区的每一个中检测荧光，然后根据在分区中检测到的荧光确定相关图像信息，所述分区是从所述样品中随机选择的，其中，如果当前测量的来自所有分区的相关图像信息总体上超过预定置信水平阈值，则中断荧光的测量。

14.一种用在根据权利要求1-10的任何一项所述的荧光显微镜中的基片，包含由适合光刻处理技术的材料制成的基于晶片的过滤膜，其中，该过滤膜包含通过光刻引入的连续孔眼的图案，在该基片表面的至少一侧上涂敷有金属层。

15.一种制造根据权利要求14所述的基片的方法，包含如下步骤：提供基于晶片的过滤膜，通过光刻技术为该过滤膜提供孔眼，然后在该过滤膜的至少一侧上涂敷金属层。

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