JP2002139418A - マイクロウエルプレート及びマイクロウエルプレートを備える蛍光検出装置 - Google Patents

マイクロウエルプレート及びマイクロウエルプレートを備える蛍光検出装置

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JP2002139418A JP2000334221A JP2000334221A JP2002139418A JP 2002139418 A JP2002139418 A JP 2002139418A JP 2000334221 A JP2000334221 A JP 2000334221A JP 2000334221 A JP2000334221 A JP 2000334221A JP 2002139418 A JP2002139418 A JP 2002139418A
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隆之 菅
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 試料以外に対する励起光の照射を低減して高
いＳ／Ｎ比で試料から発生する蛍光を検出できるマイク
ロウエルプレート及びマイクロウエルプレートを備える
蛍光検出装置を提供する。 【解決手段】 透明基板１０の上面にウエル２１が所定
ピッチで形成されたウエル形成部材２０を配置する。ウ
エル形成部材２０と透明基板１０との間に反射膜３０を
設けている。透明基板１０の上面１０ａにはプリズム４
１，４２が密着する。プリズム４１から透明基板１０に
臨界角以上の入射角で励起光Ｌを入射させると、励起光
Ｌは透明基板１０の上面１０ａ及び下面１０ｂで全反射
を繰り返しながら伝搬し、透明基板１０の上面１０ａ及
び下面１０ｂの近傍外側にエバネセント波が発生する。
このエバネセント波によってウエル２１中の試料中の蛍
光色素を励起して、透明基板１０の上面１０ａと試料と
の境界面近傍の蛍光色素だけを励起させる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】この発明は試薬のスクリーニ
ングを行なうとき等に使用されるマイクロウエルプレー
ト及びマイクロウエルプレートを備える蛍光検出装置に
関する。
【０００２】
【従来の技術】薬の研究においてスクリーニングは薬効
を解くキーとなる重要な技術である。
【０００３】スクリーニングを行なうときには複数のウ
エルを備えるマイクロウエルプレートが使用されること
が多い。このマイクロウエルプレートは通常透明又は黒
色のプラスチックで形成されている。
【０００４】細胞を使用したスクリーニングでは予め各
ウエルに細胞を導入し、この細胞に試薬を投与したとき
の細胞の変化を検出して試薬の効果を評価する。
【０００５】古くは放射線標識したプローブを使用して
放射性物質の有無から細胞中の変化を検出していたが、
近年は蛍光性のプローブを使用して蛍光強度の変化等か
ら細胞中の変化を検出している。
【０００６】この蛍光性のプローブを使用した検出方法
は例えば下記の蛍光検出装置を用いて行なわれる。
【０００７】図５は従来のマイクロウエルプレートを備
える蛍光検出装置の概略構成図である。
【０００８】この蛍光検出装置は、水銀灯の光源１５１
と、励起波長を選択する励起フィルタ１５８と、励起光
を反射し蛍光を透過させるダイクロイックミラー１５９
と、レンズ１５５と、マイクロウエルプレート１０１
と、蛍光だけを透過させる吸収フィルタ１５６と、２次
元に配置されたＣＣＤを備えるＣＣＤカメラ１５７とか
ら構成される。
【０００９】なお、マイクロウエルプレート１０１は、
透明基板１１０と、少なくとも１つのウエル１２１を有
するウエル形成部材１２０とを備えている。ウエル形成
部材１２０は透明基板１１０の上面に設けられている。
【００１０】光源１５１から出射された光（励起光）は
励起フィルタ１５８を透過した後、ダイクロイックミラ
ー１５９で反射し、レンズ１５５によって透明基板１１
０の下面全体に照射される。
【００１１】透明基板１０を透過した励起光の照射によ
って各ウエル１２１中の細胞から発生した蛍光は、透明
基板１１０、レンズ１５５へと光路を逆行し、ダイクロ
イックミラー１５９及び吸収フィルタ１５６を透過して
カメラ１５７へ入射し、ＣＣＤで検出される。
【００１２】この蛍光検出装置によれば一度の光の照射
によって総てのウエル１２１内の細胞からの蛍光をＣＣ
Ｄで検出することができる。
【００１３】なお、別の検出方法として次の方法があ
る。レンズ１５５の代わりに図示しないレンズによって
励起光を複数のウエル１２１のいずれか１つに集光さ
せ、そのウエル１２１内の細胞からの蛍光を光電子倍増
管で検出し、その後マイクロウエルプレート１０１を２
次元方向へ動かして光路上の別のウエルを位置させ、同
様の検出を繰り返す。このようにして総てのウエル１２
１内の細胞からの蛍光を検出する。
【００１４】上記装置を用いて各ウエル１２１での試薬
を投与する前後の細胞の蛍光強度等の変化を検出し、投
与した試薬の効果を評価する。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】しかし、励起光は細胞
だけでなくウエル形成部材１２０やウエル１２１内の溶
液にも照射され、ウエル形成部材１２０や溶液で蛍光が
発生する。
【００１６】このウエル形成部材１２０や溶液で発生す
る蛍光は細胞で発生する蛍光に対してノイズとなり、蛍
光検出のＳ／Ｎ比を低下させるという問題がある。
【００１７】この発明はこのような事情に鑑みてなされ
たもので、その課題は試料以外に対する励起光の照射を
低減して高いＳ／Ｎ比で試料から発生する蛍光を検出で
きるマイクロウエルプレート及びマイクロウエルプレー
トを備える蛍光検出装置を提供することである。
【００１８】
【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
に請求項１に記載の発明は、互いに平行な上面及び下面
で励起光を全反射可能な透明基板と、この透明基板の上
面に配置され、少なくとも１つのウエルを有するウエル
形成部材とを備え、前記透明基板の上面と前記ウエル形
成部材の下面との間に反射膜を設けたことを特徴とす
る。
【００１９】励起光を透明基板中で全反射させたとき、
透明基板近傍にエバネセント波が生じる。このエバネセ
ント波で試料中の蛍光色素を励起すれば、透明基板の上
面と試料との境界面近傍の蛍光色素だけが励起され、こ
の境界面近傍以外にある物質は励起されない。
【００２０】また、透明基板とウエル形成部材とが接合
している境界面には反射膜が設けられているので、ウエ
ル形成部材への励起光の侵入が防止される。
【００２１】請求項２に記載の発明は、請求項１記載の
マイクロウエルプレートにおいて、前記励起光を所定の
入射角度で前記透明基板内へ入射させる励起光入射用光
学部材を備えていることを特徴とする。
【００２２】励起光を透明基板へ入射させるとき、励起
光入射用光学部材を用いることによって透明基板の上方
から励起光を所定の入射角度で透明基板内へ入射させる
ことができる。
【００２３】請求項３に記載の発明は、請求項１又は２
記載のマイクロウエルプレートにおいて、前記透明基板
の上面及び下面で全反射した励起光を外部へ出射させる
励起光出射用光学部材を備えていることを特徴とする。
【００２４】透明基板の上面及び下面との間で全反射し
ながら伝搬した励起光を、透明基板内で散乱させること
なく励起光出射用光学部材を介して外部へ出射させるこ
とができる。
【００２５】請求項４に記載の発明は、請求項１〜３の
いずれか１項記載のマイクロウエルプレートを備えるこ
とを特徴とする蛍光検出装置。
【００２６】高いＳ／Ｎ比で試料中の蛍光色素から発生
する蛍光を検出してスクリーニングを行うことができ
る。
【００２７】
【発明の実施の形態】以下、この発明の実施の形態を図
面に基づいて説明する。
【００２８】図１はこの発明に係るマイクロウエルプレ
ートの側面図、図２はその平面図である。なお、図２中
の黒色部分は透明基板１０とウエル形成部材２０との接
合面である。
【００２９】このマイクロウエルプレート１は、透明基
板１０と、ウエル形成部材２０と、反射膜３０と、プリ
ズム４１（励起光入射用光学部材）とプリズム４２（励
起光出射用光学部材）とを備える。
【００３０】透明基板１０の上面１０ａ及び下面１０ｂ
は互いに平行であり、その上面１０ａ及び下面１０ｂで
励起光を全反射可能である。
【００３１】透明基板１０は石英ガラス、ＢＫ７（硼珪
クラウンガラス）、プラスチック等で製造される。
【００３２】ウエル形成部材２０は透明基板１０の上面
１０ａに配置されている。このウエル形成部材２０には
複数（例えば９６）のウエル２１が所定ピッチでマトリ
ックス状に形成されている。
【００３３】ウエル２１はウエル形成部材２０を厚さ方
向へ貫通する孔である。各ウエル２１には図示しない試
料が導入されている。
【００３４】ウエル形成部材２０はプラスチック、石英
ガラス、ＢＫ７等の部材で製造される。
【００３５】ウエル形成部材２０と透明基板１０とは接
着剤によって固着されている。
【００３６】反射膜３０はウエル形成部材２０と透明基
板１０との間に設けられている。反射膜３０はアルミニ
ウム、金等の金属膜や誘電体膜等で形成される。
【００３７】なお、反射膜３０を透明基板１０の上面１
０ａに一体に形成しても、ウエル形成部材２０の下面２
０ａに一体に形成してもよい。また、ウエル形成部材２
０及び透明基板１０と別体のシート状の反射膜３０とし
てもよい。
【００３８】プリズム４１，４２は三角プリズムであ
り、それぞれ透明基板１０の上面１０ａにグリセロール
等を介して密着されている。このプリズム４１，４２は
透明基板１０と同じ材質が好ましく、例えば石英ガラス
で製造される。
【００３９】プリズム４１は、励起光Ｌが透明基板１０
の上面１０ａ及び下面１０ｂとの間で全反射するよう
に、励起光Ｌを透明基板１０の上方から入射させる励起
光入射用光学部材として機能する。
【００４０】また、プリズム４２は励起光Ｌを透明基板
１０の上方へ出射させる励起光出射用光学部材として機
能する。
【００４１】なお、プリズム４１，４２は透明基板１０
の上面１０ａ及び下面１０ｂで全反射させることができ
るものであれば三角プリズムに限られるものではない。
【００４２】プリズム４１を介して透明基板１０に臨界
角以上の入射角で励起光Ｌが入射すると、励起光Ｌは透
明基板１０の上面１０ａ及び下面１０ｂで全反射を繰り
返しながら伝搬し、透明基板１０の上面１０ａ及び下面
１０ｂの近傍外側にエバネセント波が発生する。
【００４３】このとき、透明基板１０の上面１０ａ（ウ
エル形成部材２０と透明基板１０との境界面）近傍に発
生するエバネセント波によってウエル２１中の試料の境
界面近傍に存在する蛍光色素が励起される。
【００４４】この実施形態によれば、試料の境界面近傍
に存在する物質だけが励起され、この境界面近傍以外で
は溶液中に存在する物質は励起されないので、Ｓ／Ｎ比
を向上させることができる。
【００４５】また、透明基板１０とウエル形成部材２０
とが接合している境界面には反射膜３０が設けられてい
るので、励起光Ｌは反射膜３０で反射され、ウエル形成
部材２０への励起光Ｌの侵入が防止される。
【００４６】そのため、境界面で全反射条件が維持さ
れ、ウエル形成部材２０から発生する蛍光を低減してＳ
／Ｎ比を向上させることができる。
【００４７】更に、プリズム４１を介して上方から透明
基板１０へ励起光Ｌを入射させることができるので、薄
い透明基板１０の側面から励起光Ｌを入射させる場合よ
り容易に透明基板１０に励起光Ｌを入射させることがで
きる。
【００４８】また、励起光Ｌを透明基板１０内で散乱さ
せることなくプリズム４２を介して外部へ出射させるこ
とができるので、励起光Ｌが試料中に侵入して蛍光を発
生させることがなく、Ｓ／Ｎ比をより向上させることが
できる。
【００４９】図３はマイクロウエルプレートを備える蛍
光検出装置の概略構成図であり、マイクロウエルプレー
トには図１と同一符合を付してその説明を省略する。
【００５０】この蛍光検出装置５０は、励起光源５１
と、ビーム整形光学系５２と、ミラー５３，５４と、マ
イクロウエルプレート１と、レンズ５５と、蛍光フィル
タ５６と、冷却ＣＣＤを備えるカメラ５７とから構成さ
れる。
【００５１】励起光源５１はアルゴンレーザであり、波
長４８８ｎｍのレーザ光を出射する。
【００５２】ビーム整形光学系５２はレーザ光のビーム
径を調節するとともに、光線群を平行にする。また、必
要によってシリンドリカルレンズを挿入して励起光をシ
ート状にすることもできる。
【００５３】ミラー５３，５４は、レーザ光が透明基板
１０内で全反射するように、レーザ光のプリズム４１へ
の入射角を調節する。
【００５４】蛍光フィルタ５６は蛍光のみを透過させ
る。
【００５５】カメラ５７には冷却ＣＣＤが２次元に配置
されている。なお、冷却ＣＣＤは例えば−２０℃に冷却
されている。
【００５６】この蛍光検出装置５０を用いたスクリーニ
ングを説明する。
【００５７】図４はスクリーニングを説明するフローチ
ャートであり、Ｓ１〜Ｓ１０はスクリーニングの各ステ
ップを示す。
【００５８】各ウエル２１に試料となる細胞を培養する
（Ｓ１）。
【００５９】なお、ウエル２１内には細胞を生存させて
おくための塩溶液が満たしてある。
【００６０】培養液をウエル２１内から除去する（Ｓ
２）。
【００６１】蛍光色素溶液（カルシウム観察用の蛍光色
素ｆｌｕｏ３及びＡＭ体）をウエル２１に導入する（Ｓ
３）。
【００６２】マイクロウエルプレート１を図示しない培
養器（インキュベータ）内に３０分間収容し、細胞を染
色する（ＡＭ体を用いて蛍光色素ｆｌｕｏ３を細胞内に
導入する）(Ｓ４)。
【００６３】なお、培養器内は３７℃程度の温度に保た
れている。
【００６４】ウエル２１から蛍光色素溶液を除去し、塩
溶液で数回洗浄後、ウエル２１中に塩溶液を導入する
(Ｓ５)。
【００６５】その後、マイクロウエルプレート１を蛍光
検出装置５０の所定位置に載置する。
【００６６】透明基板１０内に導入された励起光は透明
基板１０内で全反射を繰り返しながら伝搬し、透明基板
１０の上面１０ａ及び下面１０ｂの近傍にエバネセント
波が発生する。
【００６７】このとき、励起光は反射膜３０によって反
射されるので、エバネセント波はウエル２１と対向する
透明基板１０の上面１０ａ近傍に発生する。また、反射
膜３０によってウエル形成部材には励起光は照射されな
いので、蛍光は発生せず、Ｓ／Ｎが向上する。このエバ
ネセント波の到達距離は２００ｎｍ程度であるので、エ
バネセント波は透明基板１０の上面１０ａに密着してい
る細胞だけに照射される。
【００６８】エバネセント波によって上面１０ａに密着
している細胞に存在する蛍光色素ｆｌｕｏ３が励起さ
れ、蛍光が発生する。
【００６９】蛍光はレンズ５５で集光され、蛍光フィル
タ５６を透過した後、カメラ５７に入射し、冷却ＣＣＤ
で検出される（Ｓ６）。
【００７０】このとき、エバネセント光は塩溶液にも照
射され、塩溶液からも蛍光を発生するが、エバネセント
光の到達距離は上述したように極めて短いので、塩溶液
から発生する蛍光は極めて微弱である。
【００７１】したがって、細胞中の蛍光色素を主に観測
することができ、蛍光検出のＳ／Ｎ比が向上する。
【００７２】次に試薬であるイオノマイシンを細胞に投
与する。このとき、イオノマイシンは各ウエル２１に対
して異なる濃度のものを投与する(Ｓ７)。
【００７３】その後、再度蛍光を検出する。このとき、
任意の時間間隔で蛍光強度の経時変化を測定するように
してもよい（Ｓ８）。
【００７４】検出された蛍光は画像解析装置（図示せ
ず）へ出力され、この画像解析装置で蛍光強度が解析さ
れる(Ｓ９)。
【００７５】解析された試薬投与前後の蛍光強度の変化
から細胞の応答（カルシウム濃度の変化）を検出し、細
胞内のカルシウム濃度に対するイオノマイシンの効果を
判定する（Ｓ１０）。
【００７６】なお、カルシウム濃度が上昇したときには
蛍光強度が高くなる。
【００７７】この蛍光検出装置５０によれば、細胞中の
蛍光色素から発生する蛍光を高Ｓ／Ｎ比で検出できるの
で、イオノマイシン投与前後の蛍光強度の変化を精度良
く検出してイオノマイシンの濃度に対する影響をスクリ
ーニングできる。
【００７８】シート状の励起光を使用することによって
一度の励起光の照射でマイクロウエルプレート１全体に
エバネセント波を発生させて、蛍光を検出することがで
きる。
【００７９】また、上記実施形態ではプリズム４１，４
２と透明基板１０とを別体としたが、プリズム４１，４
２と透明基板１０とを一体としてもよい。この構成によ
れば、プリズム４１，４２を透明基板１０の上面１０ａ
にグリセロール等を介して密着する作業を省略すること
ができる。
【００８０】更に、上記実施形態ではプリズム４１，４
２を透明基板１０の上面１０ａに密着させたが、プリズ
ム４１，４２を透明基板１０の下面１０ｂに密着させる
ようにしてもよい。
【００８１】
【発明の効果】以上に説明したように請求項１記載の発
明のマイクロウエルプレートによれば、境界面で全反射
条件が維持され、ウエル形成部材から発生する蛍光及び
塩溶液の蛍光が減少して蛍光検出のＳ／Ｎ比が向上す
る。
【００８２】請求項２記載の発明のマイクロウエルプレ
ートによれば、励起光を透明基板へ入射させるとき、励
起光入射用光学部材を用いることによって透明基板の上
方から励起光を所定の入射角度で透明基板内へ入射させ
ることができるので、透明基板が薄い場合であっても容
易に透明基板に励起光を入射させることができる。
【００８３】請求項３記載の発明のマイクロウエルプレ
ートによれば、透明基板の上面及び下面との間で全反射
しながら伝搬した励起光を、透明基板内で散乱させるこ
となく励起光出射用光学部材を介して外部へ出射させる
ことができるので、励起光が試料中に侵入して蛍光を発
生させることがなく、Ｓ／Ｎ比をより向上させることが
できる。
【００８４】請求項４記載の発明の蛍光検出装置によれ
ば、試薬投与前後の蛍光強度の変化を精度良く検出して
試薬の濃度に対する影響をスクリーニングできる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１はこの発明に係るマイクロウエルプレート
の側面図である。
【図２】図２はマイクロウエルプレートの平面図であ
る。
【図３】図３はマイクロウエルプレートを備える蛍光検
出装置の概略構成図である。
【図４】図４はスクリーニングを説明するフローチャー
トである。
【図５】図５は従来のマイクロウエルプレートを備える
装置の概略構成図である。
【符号の説明】
１ マイクロウエルプレート １０ 透明基板 １０ａ 上面 １０ｂ 下面 ２０ ウエル形成部材 ２１ ウエル ３０ 反射膜 ４１ プリズム（励起光入射用光学部材） ４２ プリズム（励起光出射用光学部材） ５０ 蛍光検出装置
フロントページの続き Ｆターム(参考） 2G043 AA03 BA16 CA03 DA02 EA01 GA02 GA03 GA07 GB01 GB07 HA01 HA02 HA09 KA03 KA09 LA03 NA13 2G057 AA04 AB03 AB04 AB07 AB09 AC01 BA03 BD01 DA03 DB03 DC07 4B063 QA05 QQ05 QQ61 QQ89 QQ98 QR66 QR74 QS20 QS24 QS36 QS39 QX02

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 互いに平行な上面及び下面で励起光を全
    反射可能な透明基板と、 この透明基板の上面に配置され、少なくとも１つのウエ
    ルを有するウエル形成部材とを備え、 前記透明基板の上面と前記ウエル形成部材の下面との間
    に反射膜を設けたことを特徴とするマイクロウエルプレ
    ート。
  2. 【請求項２】 前記励起光を所定の入射角度で前記透明
    基板内へ入射させる励起光入射用光学部材を備えている
    ことを特徴とする請求項１記載のマイクロウエルプレー
    ト。
  3. 【請求項３】 前記透明基板の上面及び下面で全反射し
    た励起光を外部へ出射させる励起光出射用光学部材を備
    えていることを特徴とする請求項１又は２記載のマイク
    ロウエルプレート。
  4. 【請求項４】 請求項１〜３のいずれか１項記載のマイ
    クロウエルプレートを備えることを特徴とする蛍光検出
    装置。
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