JP4701739B2

JP4701739B2 - 蛍光測定装置

Info

Publication number: JP4701739B2
Application number: JP2005040163A
Authority: JP
Inventors: 仁平田畑; 智宮川
Original assignee: Panasonic Corp; Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Corp; Panasonic Holdings Corp
Priority date: 2005-02-17
Filing date: 2005-02-17
Publication date: 2011-06-15
Anticipated expiration: 2025-02-17
Also published as: US20070002325A1; CN1821753A; JP2006226803A; US7349093B2; CN100533125C

Description

本発明は、試料が発する蛍光を測定する技術に関し、より詳細には、励起光を照射された試料を支持する基板の自家蛍光を低減する技術に関する。

従来、核酸、タンパク質、酵素等の生体分子を検出する手法として、蛍光反応を利用する蛍光測定法が採用されてきた。既存の光源や受光素子等の光学部品を組み合わせて、ラジオアイソトープを使わず安全、安価に生体分子の測定が可能であることから、蛍光測定法は酵素免疫測定、電気泳動、共焦点走査型蛍光顕微鏡法など様々な生体分子の検出に応用されている。

蛍光測定法は、励起光を照射することで試料から発せられる蛍光信号を検出する方法である。例えばＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）は、波長４９５ｎｍの励起光に対して波長５２０ｎｍの蛍光を発する物質である。蛍光を発する物質を検出するためには、励起波長を有する光と、蛍光波長を検出する受光部の組み合わせで測定される。これらを実用化するために、落射式と呼ばれている蛍光測定方法が知られている。これは、励起光を試料上方から照射し、励起光によって起こる蛍光反応の変化を、励起光照射側に配置した受光素子で検出するものである（例えば特許文献１、図８参照）。このように、蛍光を発する物質と、それに対応した励起光と受光素子を利用することで、様々な蛍光物質や蛍光標識した生体分子を検出できるようになる。

蛍光測定を行う場合、試料を支持するための基板やセル、流路などの基板が用いられるが、基板の材料として、石英ガラスは紫外光に対する透過率が良いことから従来から利用されている。しかし、近年は、成型加工が容易でかつ使い捨てが可能な高分子材料が頻繁に用いられている。高分子材料は成型が容易であるが、一方で励起光による高分子材料からの自家蛍光を発しやすい特徴を有している。

基板からの自家蛍光は蛍光波長と同一領域の波長帯を有することから、ダイクロイックミラーや受光フィルターを透過し、受光部に到達する。これにより、自家蛍光成分が蛍光測定時のバックグラウンドノイズ光となり、測定のＳ/Ｎ比を悪化させる。上記理由により、従来から基板からの自家蛍光の影響を低減する様々な方法が提案されている。

例えば、特許文献２には、試料からの蛍光波長と基板からの自家蛍光波長がわずかに異なることを利用して分光測定を行い、試料からの蛍光成分と基板からの自家蛍光成分とを分離する方法が提案されている。また、特許文献３には、基板において蛍光測定部以外を遮光膜で覆うことで基板からの自家蛍光を低減する方法が提案されている。また、特許文献４には、蛍光物質を配置する基板表面に金属膜や誘電多層膜の反射膜を配置し、励起光を反射させることで基板からの自家蛍光を発生させない方法が提案されている。また、特許文献５及び特許文献６には、基板の材料自体を自家蛍光の発生しにくいものにする方法が提案されている。

蛍光測定を電気泳動に用いる場合、落射式の蛍光測定方法が知られているが（例えば特許文献７）、前記と同様に基板からの自家蛍光発生の問題がある。そこで、特許文献８には、測定部以外を遮光部で覆い、基板である電気泳動ゲルカセットの側面から励起光を照射することで、電気泳動ゲルカセットから自家蛍光を発生させない方法が提案されている。

これらの従来技術のように、基板からの自家蛍光の影響を低減するため、種々の方法が検討されてきた（下記特許文献参照）。
特公平６−６０９０１号公報特開２０００−３３８０３５号公報特開２００２−２８６６２７号公報特公平６−９５０７３号公報特開２００３−１３０８７３号公報特開２００３−１８３４２５号公報特許第２６２４６５５号公報特開２００４−２７９３０６号公報

近年、微量の試料を測定し、感度良く判別する技術が求められている。このような技術の一つとして、励起光を試料に照射し、試料から発せられる光を分析する技術が知られている。そのような技術において、基板からの自家蛍光や励起光の漏れ光、散乱光等のバックグラウンドノイズ光等が問題となっており、これらの除去は、ますます重要になりつつある。

そのような技術のうち、従来、提案されている分光測定により自家蛍光と蛍光信号を分離する方法は、自家蛍光の波長帯域と試料からの蛍光波長帯域はほぼ同一か、あるいは広く重複しているため、分光測定で両者を完全に分離することは困難である。このため、自家蛍光成分が蛍光成分に上乗せされてしまう。特に蛍光信号が小さい微量な試料の場合、蛍光成分が自家蛍光成分に埋もれてしまい、高感度な蛍光測定が困難になる課題を有している。

また、基板において蛍光測定部以外を遮光膜で覆うことで基板からの自家蛍光を低減する方法は、蛍光試料が保持されている検出容器の底面部から自家蛍光が発生してしまう。このため、蛍光信号が小さい微量な試料を測定する場合、蛍光成分が自家蛍光成分に埋もれてしまい、高感度な検出が困難になるだけでなく、遮光膜の作製には複数の薄膜プロセスが用いられるので、作業が煩雑である課題を有している。

また、蛍光物質を配置する基板表面に金属膜や誘電多層膜の反射膜を配置し、励起光を反射させることで基板からの自家蛍光を発生させない方法は、ダイクロイックミラーや受光フィルターが１０〜１０^-6％の透過性能限界（（漏れ光強度／入射光強度）×１００（％））であることから、反射した励起光を完全に遮断することが難しく、励起光のフィルターからの漏れ光が検出時のノイズ成分となる。特に蛍光信号が小さい微量な試料の場合、これらのノイズ光がＳ／Ｎ比の悪化に与える影響は大きくなる。

また、基板の材料自体を自家蛍光の発生しにくいものにする方法は、材料からの自家蛍光を完全に発生させなくすることは困難であり、微量の自家蛍光成分が基板から発生してしまう。特に蛍光信号が小さい微量な試料の場合、自家蛍光成分がＳ／Ｎ比の悪化に与える影響は大きくなる。

また、電気泳動法における蛍光測定において、測定部以外を遮光部で覆い、電気泳動ゲルカセットの側面から励起光を照射する方法は、電気泳動ゲルカセットの側面から励起光を照射するために、ゲル全体に励起光を均一に照射することが困難であるだけでなく、励起光を電気泳動ゲルカセットの側面から照射するための複雑な光学調整が必要であり、実用的ではない。

このように、従来から自家蛍光の影響を低減させる方法は種々提案されているが、いずれの方法も、微量な試料を検出するための性能を満足させるに至っていない。

本発明は、前記課題を解決するためになされたものであって、基板からの自家蛍光や励起光の受光フィルターからの漏れ光による検出感度の低下の問題を無くし、測定試料を高感度に検出可能となる、蛍光測定装置を提供することを目的とする。

前記課題に鑑みて、本発明の蛍光測定装置は、励起光を照射されると蛍光を発する試料に励起光を照射し前記試料が発する蛍光を測定する蛍光測定装置において、励起光を反射し蛍光を透過する選択手段を備え、一方の面に励起光を反射し蛍光を透過する誘電多層膜を形成した天板と前記選択手段とによって試料を覆い、前記選択手段と前記誘電多層膜とで励起光を多重反射させ、前記選択手段を透過した蛍光を測定する、ことを特徴とする蛍光測定装置。

さらに、選択手段が基板に形成した複数層を有するコーティング層からなることを特徴とする。

さらに、選択手段が基板に形成した誘電多層膜からなることを特徴とする。

さらに、選択手段が基板に形成した二酸化チタンの層と二酸化ケイ素の層とからなる。

さらに、蛍光によって基板から発生する自家蛍光を遮断する遮断手段を備えたことを特徴とする。

さらに、基板が高分子材料からなることを特徴とする。

さらに、選択手段が基板に形成した平板からなる。

さらに、選択手段が基板に形成した窪みからなる。

さらに、選択手段が基板に形成した溝からなる。

さらに、基板を透過した蛍光を測定することを特徴とする。

本発明の蛍光測定装置は、励起光を照射することで蛍光を発生する試料を支持する基板の表面で、励起光を反射し、蛍光を透過する。これにより、従来問題となっていた励起光による基板からの自家蛍光の影響を大幅に低減することができ、高感度な測定が可能となる。

たとえ、試料が発する蛍光によって基板から２次的な自家蛍光が発生した場合においても、自家蛍光の波長は蛍光波長よりさらに長波長領域へシフトしたものであるので、受光部の前段に蛍光波長以外の光を遮断する受光フィルターを配置することで自家蛍光を遮断可能である。

さらに、励起光からの散乱光は、受光部の前段に励起波長を遮断する受光フィルターを配置することで遮断が可能となるので、高感度な蛍光測定が可能となる。

また、誘電多層膜によって反射された励起光が試料を照射することで、蛍光信号が増加する利点を有する。

さらに、基板底面以外の側面や天板面に誘電多層膜を配置することで、励起光が試料に対し複数回照射され、このことで蛍光の増幅が可能となる。

また、基板表面から微小な励起光が漏れた場合においても、微小な漏れ光に対する自家蛍光の強度は微小であり、直接、基板に励起光を照射することにより発生する自家蛍光の強度と比較して非常に小さい。

このように、本発明に係る蛍光測定装置は、微量な蛍光物質を高感度に測定する場合において、その効果は非常に大きい。

（実施の形態１）
以下に、本発明に係る蛍光測定装置の一例を図面とともに詳細に説明する。

図１は、本発明の選択手段が平板を形成してなる蛍光測定装置の一例を示したものである。図１に示すように、基板１１の表面に誘電多層膜１２が配置される。誘電多層膜１２上には、測定する試料が配置される。なお、図１に示す実施形態は、マイクロプレートなど従来の方法に用いてもよい。

図２は、本発明の選択手段が溝及び窪みを形成してなる蛍光測定装置の一例を示したものである。図２に示すように、基板２１表面の凹状底面に誘電多層膜２２が配置される。誘電多層膜２２上には、測定する試料が配置される。図２に示す実施の形態は、断面がＶ字状、Ｕ字状、円状の溝や窪みを形成してなるものであってもよく、また、ウェルプレートなど従来の方法に用いてもよい。また、図３に示すように基板３１の側面に誘電多層膜３２を配置するものであってもよい。

誘電多層膜は、高屈折率膜と、高屈折率膜の屈折率より屈折率の小さい低屈折率膜を交互にコーティングされたものが好ましい。

高屈折率膜は五酸化タンタル、五酸化ニオブ、五酸化チタン、二酸化チタン、二酸化ジルコニウムからなる群から選択される。

低屈折率膜は二酸化ケイ素、フッ化材料からなる群から選択される。

混合層は、２種類以上の材料を用いて作製される。例えば、五酸化ニオブ（屈折率２．３）と二酸化ケイ素（屈折率１．５）とを混合することで、屈折率１．９の混合層が得られる。上記混合層の場合、五酸化ニオブと二酸化ケイ素とを同時に蒸着し、それぞれの成膜速度を制御して混合比をコントロールすることによって、所望の屈折率を得ることができる。

誘電多層膜の形成は真空蒸着法、熱蒸散法、電子ビーム法、スパッタリング法、イオンプレーティング法、ＣＶＤ法等の従来の薄膜形成方法が適応可能である。さらに、成膜速度を調整することで屈折率の再現性が高い所望の膜厚を形成できる。

これらの誘電多層膜の波長透過特性は、測定すべき蛍光試料により決定され、励起光を遮断し、前記励起光によって試料から発生した蛍光を透過するように選択される。

誘電多層膜は、励起光を遮断し蛍光を透過するように選択されるため、材料の選択と膜厚の制御を行う。所望の透過特性を得るために、分光シミュレーション、分光感度特性測定等の従来の方法が適応可能である。

誘電多層膜の膜厚を変えることで透過特性を変えることができる。例えば、光が透過しない波長領域（阻止域幅）を決められるが、阻止域幅が４００ｎｍから５００ｎｍまでの場合、ＦＩＴＣ（蛍光励起波長；４９５ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）と、例えばＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４３０（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ社製、蛍光励起波長４３０ｎｍ、蛍光波長５４０ｎｍ）とを同じ誘電多層膜を用いて測定することが可能となる。

本発明における蛍光測定装置に用いる誘電多層膜は２種類の誘電材料を交互に積層させる多層膜構造に限らず、３種以上の誘電材料を組み合わせた多層膜構造でも良い。

本発明の選択手段としては、励起光を遮断し、蛍光を透過する特徴を有する必要があるが、この特徴を有する波長フィルターとして、バンドパスフィルター、短波長カットフィルター、ダイクロイックフィルター、コールドフィルターが、実際に市販されている。

基板の材質は、ガラスや高分子材料が用いられ、高分子材料はポリメチルメタクリレート、ポリアクリロニトリル、ポリエチレンテレフタレート、ポリイミド、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、テフロン（登録商標）、ポリフッ化エチレン、メラミン、ナイロンのいずれか、または、これらの混合物を用いてもよい。

（実施の形態２）
以下に、本発明の蛍光測定装置の一例を図面とともに詳細に説明する。

本発明に係る蛍光測定装置の一例の概略図を図４に示す。

蛍光励起波長を有する励起光４１は、試料４６に照射される。試料４６は基板４４にある誘電多層膜４５上に配置されている。試料４６は励起光４１の照射により蛍光４３を発する。蛍光励起に使われなかった励起光成分は、実施の形態１で用いた誘電多層膜４５により反射される（反射光４２）。励起光が誘電多層膜によって反射されることで、励起光による基板からの自家蛍光は発生しない。一方、蛍光４３は誘電多層膜と基板を透過し、基板に対し励起光照射側と反対側に配置した受光部で検出される。さらに好適には、励起光は試料部で最も絞られることで、微量な試料の測定が可能となる。

さらに、試料から発生した蛍光によって基板から発生する２次的な自家蛍光や、励起光の漏れ光や散乱光などのノイズ光は、蛍光を受光部へ導く導光経路上に蛍光波長以外を遮断する受光フィルターを配置することで、上記のノイズ光の影響をなくすことができる。
（実施の形態３）
以下、本発明による蛍光測定装置の一例について図５を用いて説明する。なお、本発明は本実施の形態３に限定して解釈されるものではない。

表面に凹状の溝を形成した透明性の高いポリメチルメタクリレートからなる基板５７を用意し、溝の底面に誘電多層膜５８のコーティングを行う。誘電多層膜５８は高屈折率層Ａ（二酸化チタン、屈折率２．４）と、低屈折率層Ｂ（二酸化ケイ素、屈折率１．５）を交互に積層した構造となっている。Ａ、Ｂともに反応性スパッタリング法により成膜を行う。

Ａ、Ｂの膜厚はλ／４に設定し、成膜を行う。λは阻止域幅の中心波長を表わしており、本実施例では４７０ｎｍに設定されている。本実施の形態３ではＡとＢが交互に３０回繰り返し重ねられた誘電多層膜が形成されている。図６は本実施の形態３で作製した基板５７を用いた蛍光測定装置の光透過特性を表した図である。

次に、本実施の形態３で作製した基板５７を用いた蛍光測定装置について説明する。

励起光源５１は励起光５５（中心波長４７０ｎｍ）を発生する。ミラー５２により反射された励起光５５は基板５７の流路内にあるＦＩＴＣを標識した試料５９に照射される。

励起光５５によって発生した試料からの蛍光５６は基板５７、受光フィルター５３を透過し、基板５７に対し励起光照射側と反対側に配置した受光部５４（フォトンカウンター）で発光量をカウントされ、検出される。また、蛍光励起に使われなかった励起光成分は、誘電多層膜５８で反射される。検出された蛍光信号データは外部メモリ６０に格納され、さらに出力機器６１で出力される。

本実施の形態３を実施した結果、試料最小時３ｆｍｏｌの蛍光信号が得られた。このように、本実施の形態３において、蛍光信号を得ることが示された。
（実施の形態４）
以下、本発明による蛍光測定装置の一例について図７を用いて説明する。なお、本発明は下記の実施の形態４に限定して解釈されるものではない。

基板７７は、実施の形態１で作製したものを用いる。励起光源７１は励起光７５（中心波長４７０ｎｍ）を発生する。ミラー７２により反射された励起光７５は基板７７の流路内にあるＦＩＴＣを標識した試料８１に照射される。

試料８１は、天板７９によっても保持されており、天板７９の試料を保持する側の表面は、励起光に対しては反射し、前記蛍光に対しては透過する誘電多層膜８０がコーティングされている。励起光７５は、天板７９を照射することなく試料に照射されている。

励起光７５によって発生した試料からの蛍光７６は基板７７、受光フィルター７３を透過し、基板７７に対し励起光照射側と反対側に配置した受光部７４（フォトンカウンター）で発光量をカウントされ、検出される。また、蛍光励起に使われなかった励起光成分は、誘電多層膜７８及び８０で反射される。この反射が流路内で多重反射となり、蛍光７６は増幅される。

検出された蛍光信号データは外部メモリ８２に格納され、さらに出力機器８３で出力される。本実施の形態４において、試料最小時２ｆｍｏｌの蛍光信号が得られた。このように、本実施の形態４において、蛍光信号を得ることが示された。

本発明にかかる蛍光測定装置は、基板からの自家蛍光や励起光の漏れ光などのバックグラウンドノイズ成分が極力低減可能であるため、非常に高感度に蛍光物質を検出可能である。このため、高感度測定が必要な１塩基変異多型や細菌検査、ウイルス検査に有用である。

本発明の実施の形態１に係る選択手段が平板を形成してなる蛍光測定装置を示した概略図本発明の実施の形態１に係る選択手段が溝及び窪みを形成してなる蛍光測定装置を示した概略図本発明の実施の形態１に係る基板の側面に誘電多層膜を配置した蛍光測定装置の概略図本発明の実施の形態２に係る蛍光測定装置の概略図本発明の実施の形態３に係る蛍光測定装置の概略図本発明の実施の形態３で作製した蛍光測定装置の光透過特性を表した図本発明の実施の形態４に係る蛍光測定装置の概略図従来の一般的な落射式蛍光測定装置の概略図

符号の説明

１,５１,７１励起光源
２ダイクロイックミラー
３,５３,７３受光フィルター
４,５４,７４受光部
５,４１,５５,７５励起光
６,４３,５６,７６蛍光
７,１１,２１,３１,４４,５７,７７基板
８,４６,５９,８１試料
１２,２２,３２,４５,５８,７８,８０誘電多層膜
４２励起光の誘電多層膜からの反射光
５２,７２ミラー
６０外部メモリ
６１,８２出力機器
７９,８３天板

Claims

励起光を照射されると蛍光を発する試料に励起光を照射し前記試料が発する蛍光を測定する蛍光測定装置において、
励起光を反射し蛍光を透過する選択手段を備え、
一方の面に励起光を反射し蛍光を透過する誘電多層膜を形成した天板と前記選択手段とによって試料を覆い、前記選択手段と前記誘電多層膜とで励起光を多重反射させ、前記選択手段を透過した蛍光を測定する、ことを特徴とする蛍光測定装置。
前記選択手段が基板に形成した複数層を有するコーティング層からなる、ことを特徴とする請求項１記載の蛍光測定装置。
前記選択手段が基板に形成した誘電多層膜からなる、ことを特徴とする請求項１記載の蛍光測定装置。
前記選択手段が基板に形成した二酸化チタンの層と二酸化ケイ素の層とからなる、ことを特徴とする請求項１記載の蛍光測定装置。
前記蛍光によって前記基板から発生する自家蛍光を遮断する遮断手段を備えた、ことを特徴とする請求項２乃至請求項４のいずれかに記載の蛍光測定装置。
前記基板が高分子材料からなる、ことを特徴とする請求項２乃至請求項５のいずれかに記載の蛍光測定装置。
前記選択手段が前記基板に形成した平板からなる、ことを特徴とする請求項２乃至請求項６のいずれかに記載の蛍光測定装置。
前記選択手段が前記基板に形成した窪みからなる、ことを特徴とする請求項２乃至請求項６のいずれかに記載の蛍光測定装置。
前記選択手段が前記基板に形成した溝からなる、ことを特徴とする請求項２乃至請求項６のいずれかに記載の蛍光測定装置。
前記基板を透過した蛍光を測定する、ことを特徴とする請求項２乃至請求項４のいずれかに記載の蛍光測定装置。