JP4993494B2 - 蛍光検出方法 - Google Patents

Description

本発明は、蛍光標識された生体試料をマイクロチップに供給し、励起光を照射することにより発生する蛍光強度を検出する蛍光検出方法に関するものである。

従来、蛍光標識された生体試料から発生する蛍光強度を検出する蛍光検出方法が知られている。この蛍光検出方法によれば、蛍光強度を検出することによって、遺伝子配列、遺伝子の発現レベル、タンパク質の分離、同定、あるいは分子量、特性の評価などを行うことができる。

例えば、μＴＡＳ−イムノアッセイシステム（微細総分析システム（Micro Total Analysis System）−酵素免疫測定方法（ＥＬＩＳＡ＝Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assey）が知られている。これは、きわめて微小な幅と深さのマイクロ流路が形成されたマイクロチップを使用し、マイクロチップの流路に泳動液（緩衝液）を注入すると共に、生体試料をマイクロ流路に注入し、高電圧（泳動電圧）を印加して電気泳動させ、得られた物質をマイクロチップの測定部分で励起光を照射することにより蛍光標識を励起して、生じた蛍光強度を検出することにより、生体由来の物質を解析するものである。

また、マイクロチップをベースとした分析デバイスとしてマイクロアレイも挙げることができ、マイクロアレイ解析システムが注目されている。例えば、スライドガラス板やメンブレンフィルタなどの担体表面上の異なる位置に、ホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他の蛋白質、核酸、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡなど、生体由来の物質と特異的に結合可能で、かつ、塩基配列や塩基の長さ、組成などが既知の特異的結合物質を、スポッター装置を用いて滴下して、多数の独立したスポットを形成し、次いで、ホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他の蛋白質、核酸、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ｍＲＮＡなど、抽出、単離などによって生体から採取され、あるいは、化学的、化学修飾などの処理が施された生体由来の物質であって、蛍光標識された物質を、ハイブリダイゼーションなどによって、特異的結合物質に、特異的に結合させたマイクロアレイに、励起光を照射して、蛍光標識から発生する蛍光強度を光電的に検出して、生体由来の物質を解析することができる。

しかしながら、上述の解析手法においては、励起光を照射することにより、マイクロチップに供給され蛍光標識された生体試料から発生する蛍光の中には、蛍光標識された生体試料から発生する蛍光の他に、マイクロチップ自体から発生する蛍光も含まれるため、これがバックグラウンドとして影響し、蛍光強度の検出精度すなわちＳ／Ｎ比が低下するという問題がある。

特許文献１には、マイクロチップ自体から発生する蛍光強度が十分に減衰した後から、蛍光標識された生体試料から発生する蛍光を検出することにより、マイクロチップ自体から発生する蛍光がバックグラウンドとして影響しても蛍光強度が小さいために、その影響を抑えて、検出精度すなわちＳ／Ｎ比の低下を低減する蛍光検出方法が提案されている。

また、特許文献２には、マイクロチップに消光剤を含むブロッキング剤で処理することにより、バックグラウンドを低減する方法が提案されている。
特開２００２−１８１７０８号公報 特開２００３−８４００２号公報

しかしながら近年、マイクロチップの価格を下げるため、マイクロチップの材質を、従来の石英ガラスから樹脂材質を用いることが提案されている。樹脂製のマイクロチップに励起光を照射すると、マイクロチップ自体から発生する蛍光が、石英ガラス製のマイクロチップと比較して強い蛍光が検出される。樹脂製のマイクロチップは成形後の平坦度を確保するため、石英ガラス製のマイクロチップより厚みがあるため、より強い蛍光が発生する。したがって、マイクロチップ自体から発生する蛍光の蛍光強度が十分に減衰するまでの時間が、従来の石英ガラス製のマイクロチップに比較して長時間となり、バックグラウンドとして影響する時間が長いため、生体試料の蛍光強度の検出精度への影響が大きくなる。さらに、蛍光検出装置の生産性の向上のため、蛍光標識された生体試料から発生する蛍光強度の検出時間を短縮することも要求されている。

特許文献１に開示されている技術では、バックグラウンドとして影響することによる蛍光強度の検出精度への影響は低減されるが、生体試料の蛍光強度の検出時間を短縮することはできない。

特許文献２に開示されている技術では、マイクロチップに消光剤を含有するブロッキング剤を処理する必要があり、マイクロチップの価格が高くなる。

本発明の目的は、上記事情に鑑み、マイクロチップに付加的な処理を施すことなく、且つマイクロチップ自体から発生する蛍光強度がバックグラウンドとして影響しても高精度、かつ短時間に蛍光標識された生体試料の蛍光強度を検出することができる蛍光検出方法を提供することにある。

以上の課題を解決するために、本発明の蛍光検出方法は、蛍光標識された生体試料が供給されたマイクロチップに励起光を照射することにより発生する蛍光の蛍光強度を検出する蛍光検出方法において、マイクロチップと同等のマイクロチップ自体から発生する蛍光の蛍光強度を励起光の照射開始から蛍光強度が十分に減衰するまで検出し、検出された蛍光強度の経時変化を記憶し、マイクロチップに励起光を照射すると共に、マイクロチップに生体試料をマイクロチップ自体から発生する蛍光の蛍光強度が十分に減衰する前に供給し、マイクロチップから発生する蛍光の蛍光強度を励起光の照射開始から生体試料がマイクロチップに供給された後まで検出し、記憶された同等のマイクロチップ自体から発生する蛍光の蛍光強度が十分に減衰するまでの経時変化の値を、生体試料が供給されたマイクロチップから検出された蛍光強度から減算することにより、生体試料が励起光に照射されて発生した蛍光の蛍光強度を検出することを特徴とするものである。

ここで、上記「供給」とは、マイクロチップ内の生体試料を励起光照射位置に移動させることを広く意味するものであり、具体的には、例えば、マイクロ流路を有するマイクロチップ内の生体試料を電気泳動せしめることにより、マイクロ流路内の励起光照射部分に移動させること、およびマイクロ流路を有さないマイクロアレイの試料保持部を励起光照射位置に移動させることをも含むものである。上記「同等のマイクロチップ」とは、使用されるマイクロチップと形状、材質、製作ロットのいずれかにおいて同等であることを意味するものであり、好ましくは、全てにおいて同等であることが望ましい。上記「励起光の照射開始」とは、励起光の照射開始から瞬時に検出を開始する場合だけでなく、励起光の照射開始から多少の時間的なずれがある場合も含むものとする。「蛍光強度が十分に減衰」とは、励起光の照射開始時に検出されるマイクロチップ自体の蛍光強度の値を基準として、２０％程度に蛍光強度が減衰している状態を意味し、望ましくは１０％程度に減衰している状態を意味する。上記「蛍光強度の経時変化」とは、励起光を照射することにより検出される蛍光強度の変化の時間特性を意味するものとする。「蛍光強度が十分に減衰する前」とは、励起光の照射開始時に検出されるマイクロチップ自体の蛍光強度の値を基準として、８０％程度に蛍光強度が減衰する前を意味し、望ましくは７０％程度に減衰する前であることを意味する。「供給された後」とは、蛍光標識された生体試料がマイクロチップに供給され、生体試料に励起光が照射されることで、生体試料から発生される蛍光の蛍光強度が十分に検出された後を意味するものであり、蛍光標識された生体試料がマイクロチップに供給された直後を意味するものではない。

上記蛍光検出方法において、マイクロチップと同等のマイクロチップ自体から発生する蛍光の蛍光強度の経時変化を記憶する工程を、複数の材質の異なるマイクロチップについて実施して複数種類の経時変化を記憶し、該複数種類の経時変化の中から、使用されているマイクロチップの材質に基づいて、減算する経時変化を選択して減算を行うようにすることができる。

ここで、上記「複数の材質の異なるマイクロチップ」とは、材質の異なるマイクロチップが、複数存在することを意味するものである。「複数種類の経時変化」とは、上述の複数存在する材質の異なるマイクロチップついての夫々の経時変化を意味するものである。

「使用されているマイクロチップの材質に基づいて」とは、使用しているマイクロチップの材質から判断することを意味するものである。

また、第２の本発明による蛍光検出方法は、蛍光標識された生体試料が供給されたマイクロチップに励起光を照射することにより発生する蛍光の蛍光強度を検出する蛍光検出方法において、マイクロチップに励起光を照射すると共に、マイクロチップに生体試料をマイクロチップ自体から発生する蛍光の蛍光強度が十分に減衰する前に供給し、マイクロチップから発生する蛍光の蛍光強度を励起光の照射開始から生体試料がマイクロチップに供給された後まで検出し、検出により得られたマイクロチップから発生する蛍光の蛍光強度の初期の経時変化に基づいて、マイクロチップから発生する蛍光の蛍光強度の十分に減衰するまでの経時変化を予測し、予測されたマイクロチップから発生する蛍光強度の十分に減衰するまでの経時変化の値を、生体試料が供給されたマイクロチップから検出された蛍光強度から減算することにより、生体試料が前記励起光に照射されて発生した蛍光の蛍光強度を検出することを特徴とするものである。

ここで、上記「蛍光強度の初期の経時変化に基づいて」とは、励起光の照射開始から生体試料が供給される前までの蛍光強度の経時変化であって、励起光の照射開始時に検出される蛍光強度の値を基準として、７０％程度に蛍光強度が減衰する間の蛍光強度の経時変化に基づくことを意味するものであり、望ましくは６０％程度に蛍光強度が減衰する間の蛍光強度の経時変化に基づくことを意味する。上記「経時変化を予測」とは、蛍光強度の初期の経時変化の値に基づいて、蛍光強度が十分に減衰するまでの蛍光強度の値を予測することを意味するものである。

この経時変化の予測は、マイクロチップから発生する蛍光の蛍光強度の初期の経時変化に基づいて、指数関数により近似することにより行うことができる。

また、この経時変化の予測は、マイクロチップから発生する蛍光の蛍光強度の初期の経時変化に基づいて、べき級数により近似することにより行うこともできる。

さらに、この経時変化の予測は、マイクロチップから発生する蛍光の蛍光強度の初期の経時変化に基づいて、対数関数により近似することにより行うこともできる。

あるいは、この経時変化の予測は、マイクロチップから発生する蛍光の蛍光強度の初期の経時変化に基づいて、分数関数により近似することにより行うことも可能である。

さらに、この経時変化の予測は、マイクロチップから発生する蛍光の蛍光強度の初期の経時変化に基づいて、複数種類のマイクロチップが励起光に照射されて発生する蛍光の蛍光強度を励起光の照射開始から蛍光強度が十分に減衰するまで検出して得た複数種類の経時変化の中から選択することにより行うようにしてもよい。

ここで上記「複数種類のマイクロチップ」とは、使用するマイクロチップと同一材質で製造ロットの異なるマイクロチップを含むものである。

本発明の蛍光検出方法によれば、マイクロチップ自体から発生する蛍光の強度が十分に減衰するまでの蛍光強度の経時変化が予め記憶されており、若しくは検出された蛍光の初期の蛍光強度の経時変化から蛍光強度が十分に減衰するまでの蛍光強度が予測され、予め記憶された経時変化、若しくは予測された経時変化の値を、生体試料が供給されたマイクロチップから検出された蛍光強度から減算するようにしたので、マイクロチップ自体から発生する蛍光の蛍光強度が十分に減衰するまで、蛍光標識された生体試料の供給を待機することなく、マイクロチップ自体から発生する蛍光のバックグラウンドとしての影響を低減した、蛍光標識された生体試料からの蛍光の強度を検出することができる。また、蛍光強度の検出時間の短縮が可能である。さらに、マイクロチップに消光剤を含有するブロッキング剤を処理する必要もなく、マイクロチップの価格が高くなることもない。

以下、本発明の蛍光強度検出方法の実施形態について、図面を参照しながら説明する。

図１は、本発明の実施に用いられるマイクロチップの概略構成を示す図である。

マイクロチップ１０は、幅１００μｍ（図中Ｘ方向）、深さ２４μｍ（図中Ｚ方向）程度の溝が一方向（図中矢印Ｙ方向）に延びるマイクロ流路１２を有している。このマイクロチップ１０の材質は、樹脂材質、もしくは石英ガラスである。具体的な樹脂材質としては、ＰＭＭＡ（メタクリル酸メチル樹脂）や、スチロール系樹脂を用いる。マイクロ流路１２には、蛍光標識された生体試料Ｒが収容可能となっている。

図２は、マイクロ流路１２中を電気泳動せしめられる生体試料Ｒを示す模式図である。

生体試料Ｒが収容されたマイクロ流路１２の一方の端部１２ａと他方の端部１２ｂとに電極を挿入して両者の間に電位差を与える。ここでは、例えば３０００Ｖの電位差を与える。電位差の付与により、生体試料Ｒに含まれる互いに異なる成分が互いに異なる速度でマイクロ流路１２中を流路長方向（図中矢印Ｙ方向）に沿って移動する。すなわち、互に異なる成分の間では電極に引き付けられる力が違うため、各成分が互に異なる速度でマイクロ流路１２中を流路長方向へ移動する。例えば、成分Ｒ１、成分Ｒ２が、マイクロ流路１２中を端部１２ｂへ向って移動することになる。上述の通り、成分Ｒ１、成分Ｒ２は移動速度が異なるため、後述する共焦点顕微鏡２００からの励起光Ｌｅが照射されるマイクロ流路１２中の照射範囲Ｓｏに別々に供給される。

図３は、本発明の実施に用いられる共焦点蛍光顕微鏡２００と制御装置１００の概略構成を示す図である。

共焦点蛍光顕微鏡２００は、生体試料Ｒに含まれる成分を特定するためのものであり、励起光Ｌｅを照射する励起光照射部２１０と、励起光Ｌｅの照射により発生する蛍光Ｌｋの蛍光強度Ｕｒを検出する蛍光検出部２３０を備えている。

制御装置１００は、共焦点蛍光顕微鏡２００により検出された蛍光強度Ｕｒからマイクロチップ１０自体から発生する蛍光Ｌｋ０がバックグラウンドとして作用する影響を除去する処理をするものであり、蛍光検出部２３０により検出された蛍光強度Ｕｒの経時変化の値を記憶するメモリ１０１と、検出された蛍光強度Ｕｒからバックグラウンドの影響が低減された蛍光強度Ｕｃを演算するＣＰＵ１０２と、検出された蛍光強度Ｕｒとバックグラウンドの影響が低減された蛍光強度Ｕｃのいずれもが表示可能なモニタ１０３とを備えている。なお、メモリ１０１には、複数の検出された蛍光強度Ｕｒの経時変化の値を記憶させておくことができる。

共焦点蛍光顕微鏡２００の構成について詳細に説明する。励起光照射部２１０は、被検出物へ励起光Ｌｅを照射するものであり、レーザ光Ｌｚを射出するレーザ光源２１２と、射出されたレーザ光Ｌｚを平行光とするコリメーションレンズ２１４と、レーザ光Ｌｚ中の不要な波長成分を遮断して上記励起光Ｌｅの波長範囲内の光成分を透過させる波長フィルタ２１６と、透過した励起光Ｌｅを反射させるダイクロイックミラー２１８と、反射された励起光Ｌｅを物点側焦点Ｆｂに集光させる物点側集光レンズ２２２とを備えている。具体的には、励起光Ｌｅには、波長６４０ｎｍ、出力１０ｍＷ程度の赤色レーザ光が、本実施例においては用いられている。ダイクロイックミラー２１８は、励起光Ｌｅを反射し蛍光Ｌｋを透過させるものである。なお、励起光照射部２１０と蛍光検出部２３０は、ダイクロイックミラー２１８および物点側集光レンズ２２２を共用している。

蛍光検出部２３０は、励起光Ｌｅの照射受けた被検出物から発生する蛍光Ｌｋを検出するものであり、被検出物から発生する蛍光Ｌｋを集光する物点側集光レンズ２２２と、物点側集光レンズ２２２から射出された蛍光Ｌｋを透過させ、励起光Ｌｅを反射させるダイクロイックミラー２１８と、透過した蛍光Ｌｋに混入したノイズ光を遮断するノイズ光カットフィルタ２３２と、ピンホールＨｏが形成されたピンホール板２３６と、ノイズ光カットフィルタ２３２を通った蛍光Ｌｋをピンホール板２３６上に形成されたピンホールＨｏに集光させる像点側集光レンズ２３４と、ピンホールＨｏを通った蛍光Ｌｋを検出する検出部２３８とを備えている。具体的には、波長６７７ｎｍ程度の蛍光Ｌｋの蛍光強度Ｕｒを本実施例においては検出している。物点側集光レンズ２２２と像点側集光レンズ２３４は、被検出物上の１点をピンホールＨｏに結像させる結像光学系２４６を構成するものである。結像光学系２４６に関し、物点側焦点Ｆｂに位置する被検出物上の１点と像点側焦点Ｆｚに位置するピンホールＨｏとは共役な位置関係にある。

次に、共焦点蛍光顕微鏡２００を用いて、マイクロ流路１２中の生体試料Ｒに含まれる成分が特定される作用について説明する。

マイクロチップ１０を共焦点蛍光顕微鏡２００に装着する。このとき、共焦点蛍光顕微鏡２００の物点側焦点Ｆｂが、マイクロチップ１０のマイクロ流路１２中の照射範囲Ｓｏの位置となる。

励起光照射部２１０により励起光Ｌｅを照射範囲Ｓｏへ照射する。励起光Ｌｅの照射を受けたマイクロ流路１２中の照射範囲Ｓｏから発せられた蛍光Ｌｋは蛍光検出部２３０の側へ射出される。

蛍光検出部２３０は、入射した蛍光ＬｋをピンホールＨｏに結像させ、ピンホールＨｏを通った蛍光Ｌｋが検出部２３８で検出される。ここでは、ピンホールＨｏに結像された蛍光Ｌｋの像の形状は、照射範囲Ｓｏの形状と一致する。なお、共焦点蛍光顕微鏡２００においては、物点側焦点Ｆｂに位置するマイクロ流路１２中の照射範囲Ｓｏと像点側焦点Ｆｚに位置するピンホールＨｏとが共役な位置関係となっているため、励起光Ｌｅの照射を受けて照射範囲Ｓｏ以外の位置から発せられた蛍光や励起光等はピンホールＨｏで遮断され検出部２３８では殆ど検出されない。

生体試料Ｒを電気泳動せしめることにより、図２で示すように、例えば、成分Ｒ１、成分Ｒ２が、マイクロ流路１２中を端部１２ｂへ向って移動する。成分Ｒ１、Ｒ２は、移動速度が異なるため、順に照射範囲Ｓｏに供給される。成分Ｒ１、Ｒ２が照射範囲Ｓｏに供給されると、成分Ｒ１、Ｒ２から蛍光Ｌｋ１、Ｌｋ２が順に発生する。

再び、図３を参照して説明する。

蛍光検出部２３０において、生体試料Ｒから発生した蛍光Ｌｋが検出される。例えば、成分Ｒ１、Ｒ２から発生した蛍光Ｌｋ１、Ｌｋ２は、蛍光強度Ｕｒ１、Ｕｒ２として順に検出される。検出された蛍光強度Ｕｒは、経時的に制御装置１００のメモリ１０１に記憶されるため、例えば、成分Ｒ１、Ｒ２が照射範囲Ｓｏを通過するのに要した時間Ｔ１、Ｔ２を求めることができる。

このようにして、例えば、蛍光強度Ｕｒ１、Ｕｒ２の比較により、または、成分Ｒ１、Ｒ２が照射範囲Ｓｏに供給されるのに要した時間Ｔ１、Ｔ２を比較することにより、生体試料Ｒに含まれる成分を特定することができる。具体的には、成分Ｒ１が既知の成分である場合には、これをリファレンスとしてＵｒ１をＵｒ２で除算することにより、Ｒ２の成分を相対的に特定できる。

なお、複数のマイクロ流路１２を有するマイクロチップ１０を用意して、それぞれの流路に異なる成分が流れることにより、各成分を特定する方法でもよい。

次に、検出される蛍光強度Ｕｒの経時変化について説明する。

図４は、検出された蛍光強度Ｕｒの経時変化を示す図である。図４の横軸は時間Ｔ、縦軸は蛍光強度Ｕｒを示す。

図４（ａ）は、理想的な蛍光強度Ｕｒの経時変化を示す図である。マイクロチップ１０自体から蛍光が発生しないため、電気泳動せしめられた生体試料Ｒからのみ蛍光Ｌｋが発生する。例えば、生体試料Ｒの成分Ｒ１、Ｒ２から発生した蛍光Ｌｋ１、Ｌｋ２の蛍光強度Ｕｒ１、Ｕｒ２が、検出時間Ｔ１、Ｔ２においてマイクロチップ１０自体から発生する蛍光Ｌｋ０の蛍光強度Ｕｒ０が加算されずに、順に検出されている。したがって、検出された蛍光強度Ｕｒ１、Ｕｒ２に基づいて、成分Ｒ１、Ｒ２を高精度に特定できる。

図４（ｂ）は、実際の蛍光強度Ｕｒの経時変化を示す図である。マイクロチップ１０自体から蛍光Ｌｋ０が発生することにより蛍光強度Ｕｒ０が検出される。蛍光強度Ｕｒ０が、バックグランドとして影響し、蛍光強度Ｕｒに加算する。例えば、生体試料Ｒの成分Ｒ１、Ｒ２の蛍光強度Ｕｒ１、Ｕｒ２が、検出時間Ｔ１、Ｔ２においてマイクロチップ１０自体の蛍光強度Ｕｒ０に加算されて検出される。

図４（ｃ）は、従来技術での蛍光強度Ｕｒの経時変化を示す図である。従来技術では、マイクロチップ１０自体の蛍光強度Ｕｒ０のバックグラウンドとしての影響を低減するため、所定の待機時間Ｔｗを設け、Ｕｒ０が十分減衰したのちに、例えば、生体試料Ｒの成分Ｒ１、Ｒ２を照射範囲Ｓｏに供給することで、成分Ｒ１、Ｒ２の蛍光強度Ｕｒ１、Ｕｒ２が、検出時間Ｔ１、Ｔ２において検出される。具体的には、本実施例においては、ＰＭＭＡ製マイクロチップを使用した場合に、励起光照射開始から３００秒程度の待機時間Ｔｗを設けている。

本発明の蛍光検出方法について説明する。

図５は、本発明の第１の実施形態のフローチャートである。

蛍光標識された生体試料Ｒがマイクロ流路１２中に充填されておらず、後に生体試料Ｒの成分を特定するのに使用するマイクロチップ１０と同等のマイクロチップ１１を用意する（ＳＴ１−１）。なお、同等のマイクロチップ１１は一つとは限らず、複数の、材質の異なる同等のマイクロチップ１１を用意することも含まれる。

共焦点蛍光顕微鏡２００に同等のマイクロチップ１１を装着し、蛍光強度Ｕｒが検出可能な状態にする（ＳＴ１−２）。

同等のマイクロチップ１１に励起光Ｌｅが照射され、励起光Ｌｅの照射により同等のマイクロチップ１１自体から蛍光Ｌｋ０が発生し、蛍光強度Ｕｒ０が検出される（ＳＴ１−３）。

蛍光強度Ｕｒ０が十分に減衰するまで検出し、蛍光強度Ｕｒ０の経時変化を制御装置１００のメモリ１０１に記憶させる（ＳＴ１−４）。具体的には、本実施例においては、ＰＭＭＡ製マイクロチップを使用した場合に、励起光Ｌｅ照射開始から、蛍光強度Ｕｒ０が２０％程度に減衰する２００秒程度であるが、望ましくは蛍光強度Ｕｒ０が１０％程度に減衰する３００秒程度である。なお、複数の、材質の異なる同等のマイクロチップ１１を用意した場合には、それぞれの同等のマイクロチップ１１の蛍光強度Ｕｒ０を記憶させる。

蛍光標識された生体試料Ｒがマイクロ流路１２中に充填されているマイクロチップ１０を用意する（ＳＴ１−５）。

マイクロチップ１０を共焦点蛍光顕微鏡２００に装着し、蛍光強度Ｕｒの検出が可能な状態にする（ＳＴ１−６）。

蛍光標識された生体試料Ｒがマイクロ流路１２中に充填されたマイクロチップ１０に励起光Ｌｅが照射され、励起光Ｌｅの照射によりマイクロチップ１０自体から蛍光Ｌｋ０が発生し、蛍光強度Ｕｒ０が検出される（ＳＴ１−７）。

蛍光強度Ｕｒ０の蛍光強度が十分に減衰する前に、生体試料Ｒを電気泳動せしめることにより、生体試料Ｒを照射範囲Ｓｏに供給する（ＳＴ１−８）。例えば、成分Ｒ１、Ｒ２を照射範囲Ｓｏに供給する。具体的に、供給するタイミングは、ＰＭＭＡ製マイクロチップを使用した場合に、励起光Ｌｅ照射開始から、蛍光強度Ｕｒ０が８０％程度に減衰する２０秒程度であるが、望ましくは蛍光強度Ｕｒ０が７０％程度に減衰する４０秒程度である。

検出された蛍光強度Ｕｒから制御装置１００のメモリ１０１に記憶されている同等のマイクロチップ１１の蛍光強度Ｕｒ０の経時変化の値を読み出し、検出された蛍光強度Ｕｒの経時変化から記憶された蛍光強度Ｕｒ０の経時変化を減算する（ＳＴ１−９）。なお、メモリ１０１からの読み出しには、複数の、材質の異なる同等のマイクロチップ１１の経時変化の値が記憶されている場合に、生体試料Ｒの成分特定に用いるマイクロチップ１０の材質の同一である同等のマイクロチップ１１の経時変化の値を選択し、読み出すことも含まれる。

蛍光強度Ｕｒ０のバックグラウンドとしての影響が低減された蛍光強度Ｕｃが検出される（ＳＴ１−１０）。例えば、成分Ｒ１、Ｒ２の蛍光強度Ｕｃ１、Ｕｃ２である。

図６は、本発明の第１の実施形態の作用を示す図である。

図６（ａ）に示すように、同等のマイクロチップ１１に励起光Ｌｅが照射されることにより、同等のマイクロチップ１１自体から蛍光Ｌｋ０が発生し、蛍光強度Ｕｒ０が検出される。蛍光強度Ｕｒ０は徐々に減衰し、検出時間Ｔｅにおいて十分減衰するので、この間の経時変化を記憶する。

図６（ｂ）に示すように、蛍光標識された生体試料Ｒがマイクロ流路１２中に充填されたマイクロチップ１０に励起光Ｌｅを照射し、生体試料Ｒを電気泳動せしめることにより、蛍光強度が検出される。例えば、マイクロチップ１０自体から発生する蛍光Ｌｋ０の蛍光強度Ｕｒ０が検出され、次に生体試料Ｒの成分Ｒ１、Ｒ２の蛍光強度Ｕｒ１、Ｕｒ２が、検出時間Ｔ１、Ｔ２において検出される。

図６（ｃ）に示すように、同等のマイクロチップ１１の蛍光強度Ｕｒ０の励起光照射開始から検出時間Ｔｅまでの経時変化を記憶しているため、蛍光強度Ｕｒにバックグラウンドとして加算しているＵｒ０が推定される。

したがって、記憶された蛍光強度Ｕｒ０を用いて減算することにより、高精度な、バックグラウンドの影響を低減した蛍光強度Ｕｃが、短時間に検出される。例えば、生体試料Ｒの成分Ｒ１、Ｒ２の蛍光強度Ｕｃ１、Ｕｃ２である。また、マイクロチップ１０には、いかなる付加的な処理も必要としない。

図７は、本発明の第２の実施形態のフローチャートである。

蛍光標識された生体試料Ｒがマイクロ流路１２中に充填されているマイクロチップ１０を用意する（ＳＴ２−１）。

マイクロチップ１０を共焦点蛍光顕微鏡２００に装着し、蛍光強度Ｕｒの検出が可能な状態にする（ＳＴ２−２）。

蛍光標識された生体試料Ｒがマイクロ流路１２中に充填されたマイクロチップ１０に励起光Ｌｅが照射され、励起光Ｌｅの照射によりマイクロチップ１０自体から蛍光Ｌｋ０が発生し、蛍光強度Ｕｒ０が検出される（ＳＴ２−３）。

蛍光強度Ｕｒ０が減衰を開始し、蛍光強度Ｕｒ０の初期の経時変化を検出される。蛍光強度Ｕｒ０の初期の経時変化に基づいて、制御装置１００のＣＰＵ１０２が、蛍光強度Ｕｒ０が十分に減衰するまでの経時変化の値を予測する（ＳＴ２−４）。具体的には、本実施例においては、ＰＭＭＡ製マイクロチップを使用した場合に、励起光Ｌｅ照射開始から、蛍光強度Ｕｒ０が７０％程度に減衰する４０秒程度であるが、望ましくは蛍光強度Ｕｒ０が６０％程度に減衰する５０秒程度である。また、具体的な予測方法は、指数関数、べき級数、対数関数、分数関数による近似があり、望ましくは、指数関数による近似がよい。さらに、予め複数の複数種類のマイクロチップを用意し、発生する蛍光の励起光の照射開始から蛍光強度が十分に減衰するまでの経時変化を夫々記憶し、記憶された複数種類の経時変化の中から蛍光強度Ｕｒ０の初期の経時変化に基づいて選択するにより近似する方法も含まれる。

生体試料Ｒを電気泳動せしめることにより、生体試料Ｒを照射範囲Ｓｏに供給する（ＳＴ２−５）。例えば、生体試料Ｒの成分Ｒ１、Ｒ２Ｗ照射範囲Ｓｏに供給する。

検出された蛍光強度Ｕｒから予測された蛍光強度Ｕｒ０の経時変化を減算する（ＳＴ２−６）。

蛍光強度Ｕｒ０のバックグラウンドとしての影響を除去した蛍光強度Ｕｃが検出される（ＳＴ２−７）。例えば、生体試料Ｒの成分Ｒ１、Ｒ２の蛍光強度Ｕｃ１、Ｕｃ２である。

図８は、本発明の第２の実施形態の作用を示す図である。

図８（ａ）に示すように、蛍光標識された生体試料Ｒがマイクロ流路１２中に充填されたマイクロチップ１０に励起光Ｌｅが照射されることにより、マイクロチップ１０自体から蛍光Ｌｋ０が発生し、蛍光強度Ｕｒ０が検出される。蛍光強度Ｕｒ０は徐々に減衰し、検出時間Ｔｉでの初期の経時変化（図中において実線）に基づいて、蛍光強度Ｕｒ０の蛍光強度が十分に減衰するまでの検出時間Ｔｅまでの蛍光強度Ｕｒを予測（図中において破線）する。

図８（ｂ）に示すように、生体試料Ｒを電気泳動せしめることにより、例えば、マイクロチップ１０自体の蛍光強度Ｕｒ０が加算されている生体試料Ｒの成分Ｒ１、Ｒ２の蛍光強度Ｕｒ０、Ｕｒ１、Ｕｒ２が順に検出される。

図８（ｃ）に示すように、マイクロチップ１０の蛍光強度Ｕｒ０の励起光Ｌｅの照射開始から検出時間Ｔｅまでの経時変化を予測しているため、蛍光強度Ｕｒに加算しているＵｒ０が推定される。

したがって、予測された蛍光強度Ｕｒ０を用いて減算することにより、高精度な、バックグラウンドの影響が低減されたＵｃが、短時間に検出される。例えば、生体試料Ｒの成分Ｒ１、Ｒ２の蛍光強度Ｕｃ１、Ｕｃ２である。また、マイクロチップ１０には、いかなる付加処理も必要がない。

本発明の実施に用いられるマイクロチップの概略構成を示す図 マイクロ流路１２中を電気泳動せしめられる生体試料Ｒを示す模式図 本発明の実施に用いられる共焦点蛍光顕微鏡２００と制御装置１００の概略構成を示す図 従来技術での蛍光強度Ｕｒの経時変化を示す図 本発明の第１の実施形態のフローチャートを示す図 本発明の第１の実施形態による作用を示す図 本発明の第２の実施形態のフローチャートを示す図 本発明の第２の実施形態による作用を示す図

符号の説明

Ｒ 生体試料
Ｌｅ 励起光
Ｌｋ 蛍光
Ｌｋ０ マイクロチップ自体から発生する蛍光
Ｕｒ 検出された蛍光強度
Ｕｒ０ マイクロチップ自体から発生する蛍光強度
Ｕｃ バックグランドの影響が低減された蛍光強度
１０ マイクロチップ
１１ 同等のマイクロチップ

Claims (8)

1. 蛍光標識された生体試料が供給されたマイクロチップに励起光を照射することにより発生する蛍光の蛍光強度を検出する蛍光検出方法において、
   前記マイクロチップと同等のマイクロチップ自体から発生する蛍光の蛍光強度を励起光の照射開始から蛍光強度が十分に減衰するまで検出し、
   該検出された蛍光強度の経時変化を記憶し、
   前記マイクロチップに励起光を照射すると共に、該マイクロチップに前記生体試料を前記マイクロチップ自体から発生する蛍光の蛍光強度が十分に減衰する前に供給し、
   前記マイクロチップから発生する蛍光の蛍光強度を励起光の照射開始から前記生体試料が前記マイクロチップに供給された後まで検出し、
   前記記憶された前記同等のマイクロチップ自体から発生する蛍光の蛍光強度が十分に減衰するまでの経時変化の値を、前記生体試料が供給された前記マイクロチップから検出された蛍光強度から減算することにより、該生体試料が前記励起光に照射されて発生した蛍光の蛍光強度を検出することを特徴とする蛍光検出方法。
2. 前記マイクロチップと同等のマイクロチップ自体から発生する蛍光の蛍光強度を励起光の照射開始から蛍光強度が十分に減衰するまで検出して、該蛍光強度の経時変化を記憶する工程を、複数の材質の異なるマイクロチップについて実施して複数種類の経時変化を記憶し、該複数種類の経時変化の中から、使用されているマイクロチップの材質に基づいて、前記減算する経時変化を選択して前記減算を行うことを特徴とする請求項１に記載の蛍光検出方法。
3. 蛍光標識された生体試料が供給されたマイクロチップに励起光を照射することにより発生する蛍光の蛍光強度を検出する蛍光検出方法において、
   前記マイクロチップに励起光を照射すると共に、該マイクロチップに前記生体試料を前記マイクロチップ自体から発生する蛍光の蛍光強度が十分に減衰する前に供給し、
   前記マイクロチップから発生する蛍光の蛍光強度を励起光の照射開始から前記生体試料が前記マイクロチップに供給された後まで検出し、
   該検出により得られた該マイクロチップから発生する蛍光の蛍光強度の初期の経時変化に基づいて、該マイクロチップから発生する蛍光の蛍光強度が十分に減衰するまでの経時変化を予測し、
   該予測された前記マイクロチップから発生する蛍光の蛍光強度が十分に減衰するまでの経時変化の値を、前記生体試料が供給された前記マイクロチップから検出された蛍光強度から減算することにより、該生体試料が前記励起光に照射されて発生した蛍光の蛍光強度を検出することを特徴とする蛍光検出方法。
4. 前記経時変化の予測を、前記マイクロチップから発生する蛍光の蛍光強度の初期の経時変化に基づいて、指数関数により近似することにより行うことを特徴とする請求項３に記載の蛍光検出方法。
5. 前記経時変化の予測を、前記マイクロチップから発生する蛍光の蛍光強度の初期の経時変化に基づいて、べき級数により近似することにより行うことを特徴とする請求項３に記載の蛍光検出方法。
6. 前記経時変化の予測を、前記マイクロチップから発生する蛍光の蛍光強度の初期の経時変化に基づいて、対数関数により近似することにより行うことを特徴とする請求項３に記載の蛍光検出方法。
7. 前記経時変化の予測を、前記マイクロチップから発生する蛍光の蛍光強度の初期の経時変化に基づいて、分数関数により近似することにより行うことを特徴とする請求項３に記載の蛍光検出方法。
8. 前記経時変化の予測を、前記マイクロチップから発生する蛍光の蛍光強度の初期の経時変化に基づいて、複数種類のマイクロチップが励起光に照射されて発生する蛍光の蛍光強度を励起光の照射開始から蛍光強度が十分に減衰するまで検出して得た複数種類の経時変化の中から選択することにより行うことを特徴とする請求項３に記載の蛍光検出方法。

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