JP2005030950A - 固定化された物質の定量方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 被測定物質を1分子当たり所定個の蛍光物質で標識した後に基板に固定化し(S1、S2)、全反射蛍光顕微鏡等で所定範囲の平均蛍光強度を測定する(S3)。その後、サンプルへのレーザ照射を継続して蛍光の褪色を促進させ、所定時間経った後に上記範囲内の平均蛍光強度と蛍光スポット数とを測定する(S4)。褪色前には隣接する蛍光の重なりが識別できず蛍光スポット数と分子個数との対応とが不正確であるが、褪色が進むと蛍光の重なりの影響が軽減される。そこで、その時点で測定した平均蛍光強度と蛍光スポット数との関係から検量線を作成し(S5)、これを参照して当初の平均蛍光強度から各分子に対応した真の蛍光スポット数を求め、分子密度を算出する(S6、S7)。
【選択図】 図1
Description
a)前記被測定物質を基板に固定化する前又は固定化した後に、1分子当たり所定個数の蛍光物質で標識を行い、
b)前記基板全面又は該基板上の所定範囲にあって前記蛍光物質による蛍光が現れた画像を取得し、
c)前記画像に基づいて蛍光スポット数と各蛍光スポットの蛍光強度とを測定し、
d)その測定結果に基づいて被測定物質の分子数又は分子密度を推算する、
ようにしたことを特徴とする。
まず、タンパク質、DNAなどの被測定物質を1分子当たり所定個数の蛍光物質で標識する(ステップS1)。通常は1分子当たり1個の蛍光標識でよい。このときの蛍光標識方法や蛍光物質の種類は、被測定物質の種類等に応じて適宜に選択すればよい。そうして蛍光標識した被測定物質を基板に固定化する(ステップS2)。基板への固定化の方法は従来知られている各種の方法を採用することができる。このようにして測定対象であるサンプルを作成する。
まず、被測定物質であるDNA(20mer)の5'末端をCy-5で標識し、3'末端をビオチン(Biotin)で標識する。基板12bとしては背景光の小さい石英スライドガラスを使用し、洗浄した石英スライドガラスの表面にBSAを添加したビオチン(Biotin-BSA)を非特異吸着させ、これにストレプトアビジン(Streptavidin)を反応させる。そして、これを介して上記のように蛍光標識したDNA(濃度は100pM)を基板12bに固定化する。その後、この被測定物質12aをカバーガラス12cと封止材12dとしてのマニュキュアによって封入し、気密性を確保する。また、蛍光測定には、プリズム式全反射蛍光顕微鏡を使用する。励起光の光源としては波長が635nmであるレーザを使用し、サンプル12への入射角度は69°とする。また、検出部15はイメージインテンシファイアと冷却したCCDセンサとの組み合わせであり、CCDセンサの画素数は200×200である。
11…レンズ
12…サンプル
12a…試料(被測定物質)
12b…基板
12c…カバーガラス
12d…封止材
13…分光器
14…対物レンズ
15…検出部
16…画像処理部
17…モニタ
18…データ処理部
Claims (4)
- 基板表面に固定された被測定物質の分子数又は分子密度を定量的に求める方法であって、
a)前記被測定物質を基板に固定化する前又は固定化した後に、1分子当たり所定個数の蛍光物質で標識を行い、
b)前記基板全面又は該基板上の所定範囲にあって前記蛍光物質による蛍光が現れた画像を取得し、
c)前記画像に基づいて蛍光スポット数と各蛍光スポットの蛍光強度とを測定し、
d)その測定結果に基づいて被測定物質の分子数又は分子密度を推算する、
ようにしたことを特徴とする固定化された物質の定量方法。 - 前記画像に基づいて初期的な蛍光スポット数と各蛍光スポットの蛍光強度とを測定した後に、該蛍光物質による蛍光の減少を促進させ、その蛍光減少の過程又は蛍光減少後において得られる蛍光強度の変化、蛍光スポット数の変化、又はその両方を考慮した上で、前記初期的な蛍光スポット数と各スポットの蛍光強度とに基づいて被測定物質の分子数又は分子密度を推算するようにしたことを特徴とする請求項1に記載の固定化された物質の定量方法。
- 前記画像に基づいて初期的な蛍光強度を測定した後に、前記蛍光物質による蛍光の減少を促進させ、その蛍光減少の後に蛍光スポット数と蛍光強度とを測定し、該蛍光減少後における蛍光スポット数と蛍光強度との関係を参照して、前記初期的な蛍光強度から被測定物質の分子数又は分子密度を推算するようにしたことをことを特徴とする請求項1に記載の固定化された物質の定量方法。
- 固定化された被測定物質に対してレーザ光を照射することで蛍光の褪色を促進させることにより、又は化学的なクエンチング手法によって蛍光の消失を促進させることにより、前記蛍光物質による蛍光を減少させることを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の固定化された物質の定量方法。
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