JP6878742B2 - アッセイシステム - Google Patents
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Description
本明細書において使用する種々の用語及び語句は、ここで記載するように、特許請求された発明の文脈において意味を有することが意図される。用語「流体」は、流動性の移動をさせられる又はそれが可能な物体の状態を広く包含することを意図し、液体、気体、及び微細な粒子状固体、並びにそれらの組合せ及びコロイド状懸濁液などの懸濁液を含む。本発明の関係で、「液体」は、動物の(ヒトを含むが、それに限定されない)血液、血清、唾液、尿、血漿、気管肺胞の洗浄液、気管洗浄液、組織、腫瘍、及び組織/腫瘍のホモジェネート、並びに植物抽出液、液化された食物、腹水、有機流体、無機流体、緩衝液、標識された緩衝液、洗浄液、その他を含むことができるが、これらに限定されない。
本発明の一部の実施形態によるアッセイシステムの構成要素は、’044出願に記載されている。これらは、例えば、結合部位を越える液体の移動を制御するためのデバイス及び装置を含む。これらは、例えば、陽圧又は陰圧を、それぞれ液体にかけることができるポンプ又は真空デバイスを含んでもよい。他の場合に、デバイス又は装置は、それを通って液体が毛細管作用により移動することができる毛細管又は同様な構造を含んでもよい。任意の場合に、そのようなデバイス及び装置は、液体の流れの1つ又は複数の態様、例えば液体の流速、液体の流れの持続時間、又はある量の液体が結合部位上に流される回数などの制御を可能にする。
1.検出器
ある実施形態において、検出器は、検出器を含むように組み合わされる励起光の光路及び発光の光路を含むことができる。励起光の光路は光源を含むことができ、ある実施形態において、これは、ビーム拡大器及びレーザー光源のサイズを整えて光を平行に整えるアパーチャアセンブリーにより調節された532nmのレーザーであってもよい。
システムは、カートリッジの複数のアッセイ部分(アッセイセル)を通る液体の流れを制御するためのマイクロ流体コントローラーを組み込むことができる。アッセイカートリッジが4つのそのようなアッセイ部分(又はアッセイセル−図2を参照されたい)を備える実施形態において、マイクロ流体コントローラーは、コンピューターで制御される圧力制御器、3方弁、加圧された試料容器、8つの導入弁、4つの排出弁、及びある実施形態においては、流れを4つの排出弁から精密流れセンサーへ向けることができるマイクロマニホールドを含むことができる。次にコントローラーは、流れ事象の精密なタイミングをミリ秒まで可能にし、並びにアッセイ操作前/後でより遅くすることができる。精密流れセンサー(流路の終端にある)と対になった動的に制御される制御器(流路の開始箇所にある)は、タンデムにはたらき、流路特性に無関係な正確な流速及び流量を保証する閉じたループ流れ制御システムを作製することができる。コントローラーは、全ての弁の状態についてリアルタイムのフィードバックも使用者に提供する。流れ制御モジュールは、場合によりシステムの本体部中に組み込まれ、使用者が試料及び試薬を効率的に挿入して置き換えることを可能にするように設計することができる。ある実施形態では、流れ制御モジュールは、8つの導入弁及び4つの排出弁より多く有しても又は少なく有してもよく、弁の数はカートリッジに含まれるアッセイ部分の数に比例し、例えばある実施形態では、各アッセイ部分が2つの導入弁及び1つの排出弁を必要とする(図3を参照されたい)。
図1に示したような一部の実施形態では、アッセイカートリッジ100は、下でさらに詳細に記載するように、捕捉剤(典型的にはタンパク質又は抗体であるが、一部の実施形態では、ホルモン、ウイルス、抗体複合体、抗体断片、ペプチド、細胞、細胞断片、アプタマー、細胞溶解物、DNA、RNA、mRNA、遺伝子、遺伝子発現生成物などの他の生物学的実体、並びに、化学元素、化合物、薬学的に活性な化合物又はそれらの代謝物、鉱物、汚染物質などの化学的実体であってもよい)でプリントされて、流れチャネル及びアッセイ部分(アッセイセル)を含んで成形されたポリジメチルシロキサン(PDMS)ブロック12に結合した処理されたガラス表面20を含む。PDMSは、使用され得る1つの材料にすぎず、言うまでもなく、本発明の範囲を限定すると考えるべきではない。他の適当な材料には、例えば、化学処理されたガラス、ナノ粒子で覆われたガラス、金属でコートされたガラス、他の形態の材料で処理されたガラス、炭素(全ての形態)、ケイ素、ゴム、プラスチック、金属、結晶類、ポリマー、半導体、有機材料及び無機材料が含まれる。
1.アッセイプロセス
一実施形態において、各カートリッジ及び関係するアッセイのための全体の処理時間は、検出及び測定される分析物濃度に依存して2〜200分であり得る。試料が注入されると、少なくとも1つのアッセイを越える少なくとも1種の試料の処理及び関係データの収集/処理は、完全に自動化することができる。使用者は、ただ、使用するアッセイプロトコルを選択すればよく(システムのソフトウェアインターフェースにより)、そうすれば、システムは自動的にアッセイを実行して、全ての関係データを集めて処理することができる。
本明細書で開示したシステムに基づくアッセイを実行するある実施形態において、典型的な設計要因は、アッセイのタイプ、アッセイ試薬及び濃度、カートリッジのアッセイ部分当たりのアッセイ数、並びにマイクロアレイの設計(表面における捕捉剤のパターン)である。カートリッジにおける各アッセイ部分は、同じ又は異なったアッセイについて調製することができる。加えて、各アッセイ部分(又はセル)は、別々の実験又は試料で実行することができる。例になる実験計画を下に示すが、しかしながら、これは単なる例の目的のためであり、時間、配列及び/又は下記に含まれるいくつかの若しくはより多くのパラメータの存在を変化させる他の実験計画も使用することができ、参照により本明細書に組み込まれることが注意されるべきである。
生データ:ある実施形態において、その最も生の形態で、データを16ビットのグレースケールtiff像として集めることができる。像中の各画素は予め選択された像の解像度に対応する。データは、PMTから所望の時間間隔で瞬時に集められる。
本明細書で開示したシステム及び方法から発生したデータの分析は、一部の実施形態ではプリントされ又は他の形態ではマイクロアレイ形態で配置される捕捉試薬(それは一部の実施形態では標的モノクローナル抗体である)と目的の分析物又は標的分析物(それは一部の実施形態では標的タンパク質である)との間の初期結合速度の測定に基づく。定量的分析方法は、測定された初期結合速度及び既知の標準物質からの逆算に基づく。初期結合速度は、2つの時点間のデルタ測定であり、したがって、変動し得るバックグラウンドと関係する絶対シグナル強度の結果に影響され易くないが、検出限界の決定は、変動し得るバックグラウンドのトレンドにより影響される。そういうものとして、データは、各像及び各時点における低シグナルのバックグラウンド領域からのシグナル強度を単に差し引くことにより補正することができる。
速度=(Vmax *Sn)/(Sn+Km n)
ワグナーモデル:適合=exp((A+(B*ln(x)))+(C*(ln(x)2)))
非特異的結合についての1つの部位飽和モデル:適合=(C+((BLmax*x)/(Kd+x)))
双曲線の平衡モデル:適合=(C+(BLmax*(l−(x/(Kd+x)))))
Eadie−Hofsteeモデル:適合=(A+((B*x)/((C*(D+l))+x)))
Cからの双曲線のモデル:適合=(C+((A*x)/(B+x)))
ミカエリス−メンテンモデル:適合=((Vmax*(xn))/((xn)+(Km n)))
積分ミカエリス−メンテンモデル:適合=((l/Vmax)*((S0−x)+(Km*ln(S0/x))))
ミカエリス−メンテン定常状態モデル:適合=(Vmax/(l+(Km/x)))
ミカエリス−メンテン方程式:適合=((BLmax*x)/(Kd+x))
MMFモデル:適合=(((A*B)+(C*(xD)))/(B+(xD)))
並びに当技術分野において知られている多くの他の同様なそのようなモデルが含まれる。
特異的シグナル(標的分析物の捕捉剤に対する結合からのシグナル)を、非特異的シグナル(非標的物質/分子/分析物の捕捉剤に対する結合により発生されるシグナル)から区別することは、アッセイの開発、検証及び処理の多くの領域に大きな利益をもたらす。
本発明の一部の実施形態では、アッセイ感度及び動的範囲を増大するための促進試薬の意図的使用により、非線形の速度データを得ることができ、所与のアッセイプロトコルのために特徴的であることができる。例えば、抗原と捕捉剤の結合から生ずるシグナル強度を促進又は増幅する促進試薬が実行され得る。
本明細書で開示されたシステム及び方法は、アッセイの処理及び関係するアッセイデータの発生を可能にする。データを例示して提示するために使用される典型的なアッセイパラメータは、以下を含むがこれに限定されない。
本項は、本明細書で開示したシステムに基づいてアッセイを実行するための1つの可能な手法をまとめて、一部の例のデータも組み込む。
本明細書で開示されたシステム及び方法のこの実施形態では、3連アッセイが、3種のヒトの分析物:C反応性タンパク質(CRP)、インターロイキン−1β(IL−1b)、及びインターロイキン−6(IL−6)について試験するために使用された。任意の他の分析物及びそれらの任意の数が使用されてもよいが、ここで使用される3種は、アッセイのプロセス、システム、方法及びデバイスを例示する例としてのみ含まれる。3連アッセイの効力及び正確さを試験するために計画された研究が、下記の研究計画並びに関連する手順及びシステム情報で実施された。
図12〜14は、IL−6、CRP、及びIL−1bのそれぞれについて標準物質の結合曲線のプロットを示す。結合曲線は、示したように、個々のシグナル強度に適合する。各結合曲線の初速度は、生じた結合曲線の線形部分の勾配から計算した。特性結合曲線が非線形の場合には、より高次の速度方程式又は所与の時間における多項式の微分を、反応の全体速度を決定するために使用することができる。各標準物質の濃度について、特定の勾配(又は初速度)を決定した。それに続く濃度データに対する初速度は、酵素触媒作用を記載する方程式(その様式は前に開示した)に適合した。標準化に続いて、未知の勾配(又は初速度)を速度方程式及び適合に基づく濃度に逆算することができる。
[発明の項目]
[項目1]
カートリッジデバイスと、測定デバイスとを備えるアッセイシステムであって、
前記カートリッジデバイスが、
1種以上の液体を保持するための1つ以上のリザーバ部分と、
前記1つ以上のリザーバ部分からの前記1種以上の液体を受けるための1つ以上のアッセイ部分であり、前記1つ以上のリザーバ部分からの前記1種以上の液体が該アッセイ部分の上に繰り返し(2回以上)流され得る複数の結合部位を有する、1つ以上のアッセイ部分と
を含み、
前記測定デバイスが、前記1種以上の液体中の1種以上の分析物の複数の結合部位への結合を測定するためのものである、アッセイシステム。
[項目2]
前記カートリッジデバイスが受け入れられたり取り出されたりするインターフェースであって、前記1つ以上のリザーバ部分から前記1つ以上のアッセイ部分を通る前記1種以上の液体の流れ又は移動を制御するための装置を含む、インターフェースをさらに備える、項目1に記載のアッセイシステム。
[項目3]
前記1種以上の液体の流れを制御するための前記装置がコンピューター制御され、該装置が、以下の事項の少なくとも1つ以上、すなわち
前記1つ以上のアッセイ部分を越える前記1種以上の液体の流速、
前記1つ以上のアッセイ部分を越える前記1種以上の液体の流れの持続時間、
ある量の前記1種以上の液体が、前記1つ以上のアッセイ部分の上に流される回数
の1つ以上を独立に制御することができる、項目2に記載のアッセイシステム。
[項目4]
前記インターフェースが、前記1つ以上のアッセイ部分から前記1種以上の液体を取り出す又は流出させるための装置を備える、項目3に記載のアッセイシステム。
[項目5]
前記1種以上の液体が、蛍光標識、発光標識、及び比色標識からなる群から選択される1種以上の標識を含み、
前記測定デバイスが、蛍光測定装置、発光測定装置、及び比色測定装置からなる群から選択される、項目1に記載のアッセイシステム。
[項目6]
前記測定デバイスが、コンピューター制御下で、レーザー又は他の形態の標識刺激を、前記カートリッジデバイスの前記1つ以上のアッセイ部分に向けることができるシステムであって、続いて蛍光、発光又は比色シグナルの検出及び/又は測定を実施できるシステムに構成されている、項目5に記載のアッセイシステム。
[項目7]
前記1種以上の液体が、検出、測定及び/又は分析しようとする1種以上の分析物を含有し得る、項目1に記載のアッセイシステム。
[項目8]
前記カートリッジデバイスの前記アッセイ部分中の結合部位からのシグナルの複数の時系列測定がコンピューター制御下で実施され、生じたシグナルが、前記1つ以上のアッセイ部分中の複数の結合部位の1つ又は複数に結合するこれらの分析物の動的又は速度論的結合曲線の表示を生成するために使用されることをさらに含む、項目1に記載のアッセイシステム。
[項目9]
前記インターフェースが、前記1つ以上のアッセイ部分を越える前記1種以上の液体の流速及び持続時間を制御する可変圧力(陽圧及び/又は陰圧)を提供する、項目2に記載のアッセイシステム。
[項目10]
前記1つ以上のアッセイ部分中における複数の結合部位の1つ又は複数に結合する1種以上の分析物の1つ以上の結合曲線の表示を分析して、前記1種以上の分析物について該分析を既知の標準物質の時間経過(速度論的)結合曲線と比較して、液体中の前記1種以上の分析物の存在及び/又は濃度を決定するためのコンピューターソフトウェアをさらに備える、項目8に記載のアッセイシステム。
[項目11]
前記1つ以上のリザーバ部分が、該リザーバ中の液体を封じる薄い膜により覆われている、項目1に記載のアッセイシステム。
[項目12]
検出用試薬に対する追加の結合部位を提供して、蛍光、発光又は比色シグナルの強度の増大を促進及び/又は増幅することを助長する1種以上の促進剤分子又は実体を、前記液体の1種が含有する、項目1に記載のアッセイシステム。
[項目13]
前記1種以上の促進剤分子又は実体が、ストレプトアビジン、アビジン、色素標識型のストレプトアビジン、アビジン;二量化ビオチン分子、ビオチンで部分的に若しくは完全に標識されたPAMAMデンドリマー、又はビオチン−アビジンネットワークを形成し得る任意のビオチンを含有する分子若しくは高分子、ビオチン化タンパク質、ビオチン化抗体、ビオチン化ペプチド、DNAのビオチン化ストランド、ビオチン化デンドリマー、抗種抗体、及び分析物とは独立した様式で捕捉された活性物質と検出試薬とを架橋させることができる任意の活性物質からなる群から選択される、項目12に記載のアッセイシステム。
[項目14]
増幅の効果が、少なくとも1種の促進剤、少なくとも1種の分析物及び少なくとも1種の検出用試薬の循環的処理によって得ることができ、一部の促進剤が、一部の検出試薬に結合して、さらなる検出試薬が結合する多数の追加の部位を提供することにより、促進されたシグナル効果がもたらされる、項目12に記載のアッセイシステム。
[項目15]
結合部位が、以下の実体の1つ又は複数、すなわち、
タンパク質、ホルモン、抗体、抗原、ウイルス、抗体複合体、抗体断片、ペプチド、細胞、細胞断片、アプタマー、細胞溶解物、分画された細胞溶解物、分画された細胞、DNA、RNA、mRNA、遺伝子、遺伝子発現生成物などの生物学的実体と、
化学元素、化合物、薬学的に活性な化合物若しくはそれらの代謝物、鉱物、又は汚染物質などの化学的実体と
の1つ又は複数を含有する、項目1に記載のアッセイシステム。
[項目16]
動的又は速度論的結合曲線の表示が、1種以上の標的分析物濃度を計算するために使用される、項目10に記載のアッセイシステム。
[項目17]
動的又は速度論的結合曲線の表示が、結合部位内における標的分析物と捕捉剤との特異的相互作用から生ずるシグナルを、非特異的相互作用から生ずるシグナルから区別するために使用される、項目10に記載のアッセイシステム。
[項目18]
項目15に記載のアッセイシステムの使用であって、
時間依存性の結合曲線及び関係する速度の分析による流体中の分析物濃度の決定は、分析物の超高濃度(例えば500,000pg/mLを超える)と同じ試験及び同じカートリッジで、分析物の超低濃度(例えば10pg/mL未満)を流体から検出及び/又は測定することを可能にし、該決定は、超高濃度分析物の結合曲線の分析によりアッセイプロセスにおける初期(例えば最初の20分以内)に達成され、一方、これらの分析対象の結合曲線がシステムで見える場合に、超低濃度分析物は、アッセイプロセスの後期(例えば30分後)に検出/測定される、使用。
[項目19]
項目15に記載のアッセイシステムを使用して分析物濃度を計算する方法であって、
各結合部位の結合曲線の勾配、又は非線形のデータの場合には特定の分析時間における勾配(1次微分又は接線)を計算することにより結合速度のデータ(初速度)を得て、次にその結合速度のデータを酵素触媒作用型の反応方程式に適用して、これらの分析物のための前もって又は同時に開発された既知の標準物質に関する速度に基づく結合曲線と比較する、方法。
[項目20]
項目15に記載のアッセイシステムを使用して結合部位中における標的分析物の捕捉剤に対する特異的結合から非特異的結合を区別する方法であって、
結合曲線の形状が、観察された結果又はシグナルが特異的捕捉剤の標的分析物に対する結合事象の結果であるか又は捕捉剤の1種以上の非標的分析物に対する非特異的相互作用の結果であるかを知るために使用される、方法。
[項目21]
特異的結合と非特異的結合との区別が、選択された結合部位の初期結合速度(最初の2又は3回の検出/測定事象から計算される)を、その後の検出又は測定事象から(3又は4回の検出若しくは測定後、及び/又は10〜15分後の検出又は測定事象から)計算された結合速度と比較することにより行われ、3又は4回の事象後、及び/又は10〜15分後の検出又は測定事象の後に変化する(非線形になる)結合速度が、非特異的結合を表している可能性が高い、項目20に記載の方法。
[項目22]
項目15に記載のアッセイシステムを使用して結合部位中における標的分析物の捕捉剤に対する非特異的結合から特異的結合を区別する方法であって、
シグナルが非特異的相互作用の比較的高い濃度の結果である場合に、初速度が早期の時点で非常に高く、後期の時点でゼロに近づくことが観察される、方法。
[項目23]
項目15に記載のアッセイシステムを使用して結合部位中における標的分析物の捕捉剤に対する特異的結合から非特異的結合を区別する方法であって、
特異的結合のシグナルと非特異的結合のシグナルとの区別が、未知の分析物の存在及び濃度を用いた所与の実験からの結合曲線と、既知の存在及び濃度を用いた標準分析物の結合曲線との比較分析により達成される、方法。
[項目24]
項目15に記載のアッセイシステムを使用して結合部位中における標的分析物の捕捉剤に対する特異的結合から非特異的結合を区別する方法であって、
アッセイ実行の終了時に、試験試料及び検出試薬を、ある濃度の捕捉剤を含有する第1のアッセイ緩衝液及び第2のアッセイ緩衝液で置き換えるステップ、又は
アッセイ実行の終了時に、試験試料及び検出試薬を、ある濃度の検出試薬を含有する第1のアッセイ緩衝液及び第2のアッセイ緩衝液で置き換えるステップ、又は
アッセイ実行の終了時に、試験試料及び検出試薬を、ある濃度の少なくとも1つの標的分析物を含有する第1のアッセイ緩衝液及び第2のアッセイ緩衝液で置き換えるステップと、
第1のアッセイ緩衝液及び第2のアッセイ緩衝液の反復する流れを数サイクル実行するステップと、
カートリッジのアッセイ部分を撮像するステップと
を含み、
特異的結合であれば、シグナルが減少するため、その場合、シグナル及び関係する結合曲線が標的分析物からの特異的シグナルであると推定でき、
シグナルが事実上非特異的であれば、その場合、シグナルが目的の分析物(標的分析物)の存在に依存しないので実質的に安定なままであり、シグナル及び関係する結合曲線が、試料中の非標的物質からの非特異的シグナルであると推定できる、方法。
[項目25]
項目15に記載のアッセイシステムを使用して結合部位中における標的分析物の捕捉剤に対する特異的結合から非特異的結合を区別する方法であって、
非特異的シグナルが捕捉物と検出抗体との異好性抗体の架橋により生ずる場合について、少なくとも1つのアッセイで使用される捕捉剤(この例では捕捉抗体)と同じ種であるが、少なくとも1つのアッセイで測定される標的分析物のいずれにも向けられていない抗体(ヤギ、ウサギ、マウス、その他)の混合物を含有する「陰性対照」スポット(結合部位)が、カートリッジのアッセイ部分に加えられ、そして
どの試料が異好性の抗体を含有するかを、「陰性対照スポット」が試料に依存する様式でシグナルを生じるか否かの観察から推定して、ここで生じるのであれば、該シグナルが非特異的成分を含むと考え、又は
「陰性対照スポット」からのシグナルを使用して分析物に特異的なスポット(結合部位)におけるシグナルを調整して、存在する異好性の抗体の「濃度」を考慮に入れ、したがって、標的分析物濃度のより正確な測定を提供する、方法。
[項目26]
項目15に記載のアッセイシステムを使用して、薬剤開発、薬剤発見、診断の又は他の用途のための新しい候補バイオマーカーを発見する方法であって、
各結合部位を特異的対非特異的結合シグナルについて分析し、特異的シグナルをもたらす結合部位のみが、追加の分画及び/若しくは質量分析法又はどの分析物がこれらの結合部位に存在する(により捕捉された)かを確認するために使える別の技法によりさらに分析される、方法。
[項目27]
結合部位が、分画された細胞溶解物、組織又は他の生物学的試料を含有し、特定の疾患又は状態を有する1名又は複数の対象から採取され、アッセイ中に処理される流体の1つが、健常な対照又は前記特定の疾患又は状態を有する対象のいずれか由来であり、
健常な対照からの流体で実行したアッセイからのデータが、前記特定の疾患又は状態を有する対象からの流体で実行したアッセイからのデータと比較されて、特定の疾患又は状態を有する対象からの流体で特異的結合のシグナルを示し、健常な対照からの流体で特異的結合のシグナルを示さない上記の結合部位が、その後の分画及び/若しくは質量分析法又は前記特異的結合のシグナルを生じさせる候補バイオマーカーを単離して同定する他の分析手順のいずれかによりさらに分析される、項目26に記載の方法。
[項目28]
流速が、カートリッジの出口又は該出口付近にあるカートリッジの前記アッセイ部分に続く流速センサーからのフィードバックに基づいて圧力を動的に調整することにより制御され得る、項目15に記載のアッセイシステム。
[項目29]
レーザー又は他の標識刺激/相互作用プロセスが作用しておらず、使用者が流体の移動を見て、カートリッジが、適切に流れていること及び泡又は他の可視的汚染物質のないことを視覚的に確認することを可能にするのに十分透明である場合に、前記カートリッジが後方から照明され得る、項目15に記載のアッセイシステム。
[項目30]
取り外し可能な廃棄物容器が、カートリッジにより処理された全ての流体を集めるシステムに組み込まれていてもよく、前記廃棄物容器が満杯に近く空にすべきときに使用者に知らせるセンサーを備えていてもよい、項目15に記載のアッセイシステム。
[項目31]
取り外し可能なタブレットがアッセイを遂行してモニターするために遠隔で使用できるように、取り外し可能なタブレットコンピューターが、アッセイを設定して遂行する指示を提供して、分析及び結果の詳細を提供するユーザーインターフェースとして使用される、項目15に記載のアッセイシステム。
[項目32]
着色光がユーザーインターフェース及びシステム自体の両方で使用されて、アッセイを設定して遂行するために関係するステップを通して使用者を導く、例えばインターフェースがカートリッジの視覚的表示を示して、使用者に前記リザーバが緑色(又は他の色)の光等で点灯されたときに、流体1をリザーバ1に挿入するように依頼する、項目15に記載のアッセイシステム。
[項目33]
項目15、28〜32のいずれか一項に記載のアッセイシステムが実験室、介護の近く又は介護環境の場で診断用のバイオマーカーの検出及び測定のために使用される、項目15、28〜32のいずれか一項に記載のアッセイシステムの使用。
[項目34]
流体用のカートリッジを受けるための受け部であって、前記カートリッジは、前記カートリッジ中の1つ以上のリザーバからの1種以上の流体の流速を制御するためのインターフェースを有する、受け部と、
流体を含有する1つ又は2つ以上のリザーバを有する流体用のカートリッジであって、前記流体の1つ以上は1種以上の標的分析物を含有し得る分析しようとする流体であり、1つ以上の前記流体が蛍光、発光又は比色標識を含有し、該カートリッジはさらに、1種以上の流体をコンピューター制御下で該カートリッジの1つの区画から別の1つ以上の区画へ移すことができる流体チャネルを備え、該カートリッジのアッセイ部分は、1種以上の特異的捕捉剤を各々含有する2箇所以上の結合部位のアレイを備える、カートリッジと、
蛍光又は発光又は比色標識と相互作用して及び/又は刺激して、蛍光又は発光又は比色シグナルの強度を、各々のそのような部位において時系列で測定するためのデバイスと、
そのような時系列の測定を取り入れて、結合部位中における非標的物質/分子/分析物と捕捉剤又は他の物質との間の動的又は速度論的結合曲線の表示を作製するためのデバイスと
を具備するシステム。
[項目35]
前記リザーバが、該リザーバ中の流体を封じる薄膜により覆われて、該薄膜が皮下注射用の針又は類似のデバイスにより穴を開けられて、該リザーバからの流体を添加又は引き出しが可能である、項目34に記載のシステム。
[項目36]
流体の1種が、1種以上の促進剤分子又は実体を含有し、検出用試薬に追加の結合部位を提供して、蛍光、発光又は比色シグナルの強度の増大を促進し、及び/又は増幅することを助長する、項目34に記載のシステム。
[項目37]
前記1種以上の促進剤分子又は実体が、ストレプトアビジン、アビジン、色素標準型のストレプトアビジン、アビジン;二量化ビオチン分子、ビオチンで部分的に若しくは完全に標識されたPAMAMデンドリマー、又はビオチン−アビジンネットワークを形成し得る任意のビオチンを含有する分子若しくは高分子、ビオチン化タンパク質、ビオチン化抗体、ビオチン化ペプチド、DNAのビオチン化ストランド、ビオチン化デンドリマー、抗種抗体、及び分析物とは独立した様式で捕捉された活性物質と検出試薬とを架橋させることができる任意の活性物質を含む群から選択される、項目36に記載のシステム。
[項目38]
増幅の効果が、少なくとも1種の促進剤、少なくとも1種の分析物及び少なくとも1種の検出用試薬の循環的処理によって得ることができ、一部の促進剤が、一部の検出試薬に結合して、さらなる検出試薬が結合する多数の追加の部位を提供することにより、促進されたシグナル効果がもたらされる、項目36及び37に記載のシステム。
[項目39]
結合部位が、以下の実体の1つ又は複数、すなわち
タンパク質、ホルモン、抗体、抗原、ウイルス、抗体複合体、抗体断片、ペプチド、細胞、細胞断片、アプタマー、細胞溶解物、分画された細胞溶解物、分画された細胞、DNA、RNA、mRNA、遺伝子、遺伝子発現生成物などの生物学的実体と、
化学元素、化合物、薬学的に活性な化合物若しくはそれらの代謝物、鉱物、又は汚染物質などの化学的実体と
の1種又は複数を含有する、項目34〜38のいずれか一項に記載のシステム。
[項目40]
動的又は速度論的結合曲線の表示が、1種以上の標的分析物濃度を計算するために使用される、項目39に記載のシステム。
[項目41]
動的又は速度論的結合曲線の表示が、結合部位中における標的分析物と捕捉剤との特異的相互作用から生ずるシグナルを、非特異的相互作用から生ずるシグナルから区別するために使用される、項目39に記載のシステム。
[項目42]
項目39に記載のシステムの使用であって、
時間依存性の結合曲線及び関係する速度の分析による流体中の分析物濃度の決定は、分析物の超高濃度(例えば500,000pg/mLを超える)と同じ試験及び同じカートリッジで、分析物の超低濃度(例えば10pg/mL未満)を流体から検出及び/又は測定することを可能にし、該決定は、超高濃度分析物の結合曲線の分析によりアッセイプロセスにおける初期(例えば最初の20分以内)に達成され、一方、これらの分析対象の結合曲線がシステムで見える場合に、超低濃度分析物は、アッセイプロセスの後期(例えば30分後)に検出/測定される、使用。
[項目43]
項目39に記載のシステムを使用して分析物濃度を計算する方法であって、
各結合部位の結合曲線の勾配、又は非線形のデータの場合には特定の分析時間における勾配(1次微分又は接線)を計算することにより結合速度のデータ(初速度)を得て、次にそのデータを酵素触媒作用型の反応方程式に適用して、これらの分析物のために前もって又は同時に開発された既知の標準物質に関する速度に基づく結合曲線と比較する、方法。
[項目44]
項目39に記載のシステムを使用して結合部位中における標的分析物の捕捉剤に対する特異的結合から非特異的結合を区別する方法であって、結合曲線の形状は、観察又は測定されたシグナルが特異的捕捉剤の標的分析物に対する結合事象の結果であるか又は捕捉剤の1種以上の非標的分析物に対する非特異的相互作用の結果であるかを知るために使用される、方法。
[項目45]
特異的結合と非特異的結合との区別が、選択された結合部位の初期結合速度(最初の2又は3回の検出又は測定事象から計算される)を、その後の検出又は測定事象から(3又は4回の後、及び/又は10〜15分後の検出/測定事象から)計算された結合速度と比較することにより行われ、3又は4回の事象後、及び/又は10〜15分後の検出事象後に変化する(非線形になる)結合速度が、非特異的結合を表している可能性が高い、項目44に記載の方法。
[項目46]
項目39に記載のシステムを使用して結合部位中における標的分析物の捕捉剤に対する特異的結合から非特異的結合を区別する方法であって、
シグナルが非特異的相互作用の比較的高い濃度の結果である場合に、初速度が早期の時点で非常に高く、後期の時点でゼロに近づくことが観察される、方法。
[項目47]
項目39に記載のシステムを使用して結合部位中における標的分析物の捕捉剤に対する特異的結合から非特異的結合を区別する方法であって、真のシグナルと真でないシグナルとの区別が、未知の分析物の存在及び濃度を用いた所与の実験からの結合曲線と、既知の存在及び濃度を用いた標準分析物の結合曲線との比較分析により達成される、方法。
[項目48]
項目39に記載のシステムを使用して結合部位中における標的分析物の捕捉剤に対する特異的結合から非特異的結合を区別する方法であって、
アッセイ実行の終了時に、試験試料及び検出試薬を、ある濃度の捕捉剤を含有する第1のアッセイ緩衝液及び第2のアッセイ緩衝液で置き換えるステップ、又は
アッセイ実行の終了時に、試験試料及び検出試薬を、ある濃度の検出試薬を含有する第1のアッセイ緩衝液及び第2のアッセイ緩衝液で置き換えるステップ、又は
アッセイ実行の終了時に、試験試料及び検出試薬を、ある濃度の少なくとも1つの標的分析物を含有する第1のアッセイ緩衝液及び第2のアッセイ緩衝液で置き換えるステップと、
第1のアッセイ緩衝液及び第2のアッセイ緩衝液の反復する流れを数サイクル実行するステップと、
カートリッジのアッセイ部分を撮像するステップと
を含み、
特異的結合であれば、シグナルが減少するため、その場合、シグナル及び関係する結合曲線が標的分析物からの特異的シグナルであると推定でき、
シグナルが事実上非特異的であれば、その場合、シグナルが目的の分析物(標的分析物)の存在に依存しないので実質的に安定なままであり、シグナル及び関係する結合曲線が、試料中の非標的物質からの非特異的シグナルであると推定できる、方法。
[項目49]
項目39に記載のシステムを使用して結合部位中における標的分析物の捕捉剤に対する特異的結合から非特異的結合を区別する方法であって、
非特異的シグナルが捕捉物と検出抗体との異好性の抗体架橋により生ずる場合について、少なくとも1つのアッセイで使用される捕捉剤(この例では捕捉抗体)と同じ種であるが、少なくとも1つアッセイで測定される標的分析物のいずれにも向けられていない抗体(ヤギ、ウサギ、マウス、その他)の混合物を含有する「陰性対照」スポット(結合部位)が、カートリッジのアッセイ部分に加えられて、
どの試料が異好性の抗体を含有するかを、「陰性対照スポット」が試料に依存する様式でシグナルを生じるか否かの観察から推定して、ここで生じるのであれば、該シグナルが非特異的成分を含むと考え、又は
「陰性対照スポット」からのシグナルを使用して分析物に特異的なスポット(結合部位)におけるシグナルを調整して、存在する異好性の抗体の「濃度」を考慮に入れ、したがって、標的分析物濃度のより正確な測定を提供する、方法。
[項目50]
項目39に記載のシステムを使用して、薬剤開発、薬剤発見、診断の又は他の用途のための新しい候補バイオマーカーを発見する方法であって、
各結合部位を特異的対非特異的結合シグナルについて分析し、特異的シグナルをもたらす結合部位のみが、追加の分画及び/若しくは質量分析法又はどの分析物がこれらの結合部位に存在する(により捕捉された)かを確認するために使える別の技法によりさらに分析される、方法。
[項目51]
結合部位が、分画された細胞溶解物、組織又は他の生物学的試料を含有し、特定の疾患又は状態を有する1名又は複数の対象から採取され、アッセイ中に処理される流体の1つが、健常な対照又は前記特定の疾患又は状態を有する対象のいずれか由来であり、
健常な対照からの流体で実行したアッセイからのデータが、前記特定の疾患又は状態を有する対象からの流体で実行したアッセイからのデータと比較されて、特定の疾患又は状態を有する対象からの流体で特異的結合のシグナルを示し、健常な対照からの流体で特異的結合のシグナルを示さない上記の結合部位が、その後の分画及び/若しくは質量分析法又は前記特異的結合のシグナルを生じさせる候補バイオマーカーを単離して同定する他の分析手順のいずれかによりさらに分析される、項目50に記載の方法。
[項目52]
圧力が、カートリッジを出る流体の流速のモニタリングにより、及び所望の流速を設定するのに必要な圧力を確立させるフィードバックにより制御され得る、項目39に記載のシステム。
[項目53]
レーザー又は他の標識刺激/相互作用プロセスが作用しておらず、使用者が流体の移動を見て、カートリッジが、適切に流れていること及び泡又は他の可視的汚染物質のないことを視覚的に確認することを可能にするのに十分透明である場合に、カートリッジを後方から照明することができる、項目39に記載のシステム。
[項目54]
取り外し可能な廃棄物容器がカートリッジにより処理された全ての流体を集めるためにシステムに組み込まれていてもよい、項目39に記載のシステム。
[項目55]
取り外し可能なタブレットがアッセイを遂行してモニターするために遠隔で使用できるように、取り外し可能なタブレットコンピューターが、アッセイを設定して遂行する指示を提供して、分析及び結果の詳細を提供するユーザーインターフェースとして使用される、項目39に記載のシステム。
[項目56]
着色光がユーザーインターフェース及びシステム自体の両方で使用されて、アッセイを設定して遂行するために関係するステップを通して使用者を導く、例えばインターフェースがカートリッジの視覚的表示を示して、使用者に前記リザーバが緑色(又は他の色)の光等で点灯されたときに、流体1をリザーバ1に挿入するように依頼する、項目39に記載のシステム。
[項目57]
項目39及び52〜56のいずれか一項に記載のシステムが実験室、介護の近く又は介護環境の場で診断用のバイオマーカーの検出及び測定のために使用される、項目39及び52〜56のいずれか一項に記載のシステムの使用。
[項目58]
アッセイにおいて特異的結合と非特異的結合を識別する方法であって、
複数のシグナル強度測定の各々が、分析される試料と分析される試料中の標的分析物の捕捉剤との反復する相互作用の間に行われて、分析される試料の複数のシグナル強度測定値を得るステップと、
複数のシグナル強度測定値を分析される試料と捕捉剤の相互作用の累積持続時間の関数としてプロットするステップと、
プロットされたシグナル強度測定値が既知の標準物質の特性を示している場合に、シグナル強度測定値が標的分析物と捕捉剤の特異的結合を示していると判定するステップと
を含む、方法。
[項目59]
分析物を含有する試料中の分析物濃度を計算する方法であって、
試料の成分の分析物に結合することができる捕捉剤への結合を表す複数のシグナル強度測定値を得るステップであって、複数のシグナル強度測定が既知の時間間隔で試料と捕捉剤の間の相互作用の既知の持続時間の間に行われるステップと、
複数のシグナル強度測定値を試料と捕捉剤の相互作用の累積持続時間の関数としてプロットするステップと、
プロットされたシグナル強度測定値に対する1つ以上の1次微分又は接線(初速度)を計算するステップであって、1つ以上の1次微分又は接線(初速度)の各々が近接してプロットされたシグナル強度測定値を使用して計算されるステップと
を含み、
1つ以上の標準分析物濃度についての1次微分又は接線(初速度)は、後で逆算曲線の適合を決定するために使用することができ、酵素基質複合体が反応に先立って形成される場合、逆算の適合は、酵素触媒モデルに基づき、未知の試料の1次微分又は接線(初速度)が、1つ以上の標準物質の分析濃度から濃度を逆算するために使用される、方法。
[項目60]
1種以上の流体を保持するための1つ以上のリザーバ部分と、
前記1つ以上のリザーバ部分からの1種以上の流体を受けるための1つ以上のアッセイ部分であって、該アッセイ部分の上に流体が流される複数の結合部位を有し、流体チャネル又は配管を通して前記1つ以上のリザーバ部分に接続された、1つ以上のアッセイ部分と
を備えるカートリッジデバイス。
[項目61]
流体を漏洩することなく前記アッセイ部分に入る流体のための出口を提供するチャネルをさらに備える、項目60に記載のカートリッジデバイス。
[項目62]
前記リザーバ部分の各々における上部の空気の圧力の制御で該リザーバ部分から出て当該カートリッジデバイスの前記1つ以上のアッセイ部分を通る流体の流れを直接制御するように、前記リザーバ部分の各々の周縁部の周りに気密シールを形成する機構をさらに備える、項目61に記載のカートリッジデバイス。
[項目63]
前記リザーバ部分から当該カートリッジデバイスの前記アッセイ部分を通る流体の制御された反復する流れを可能にするために、前記リザーバ部分の各々にかけられる圧力を変化させることができる機構に対する1つ以上の取り付け箇所をさらに備える、項目62に記載のカートリッジデバイス。
[項目64]
当該カートリッジデバイスの前記アッセイ部分中に、分析しようとする流体から標的の分析物を選択するために特異的な選択された捕捉剤を含有する複数の結合部位をさらに備える、項目60に記載のカートリッジデバイス。
[項目65]
結合部位を越える流体の制御された反復する流れが、結合部位中においてこれらの捕捉剤と結合する流体中のこれらの分析物の速度論的結合曲線の表示を形成するために使用され得る、項目60に記載のカートリッジデバイス。
[項目66]
当該カートリッジデバイスが、
捕捉剤を含有する結合部位が上に所在し得るベース部と、
前記リザーバ部分、前記流体チャネル及び前記アッセイ部分を備える当該カートリッジデバイスの上部又は本体部と
を具備する、項目60に記載のカートリッジデバイス。
[項目67]
前記ベース部が、以下の材料:
ガラス、PDMS、化学処理されたガラス、ナノ粒子で覆われたガラス、金属でコートされたガラス、他の形態の材料で処理されたガラス、炭素(全ての形態)、ケイ素、ゴム、プラスチック、金属、結晶類、ポリマー、半導体、有機材料又は無機材料
の1つ又は複数からなる、項目66に記載のカートリッジデバイス。
[項目68]
当該カートリッジデバイスの前記上部又は前記本体部が、以下の材料:
ガラス、PDMS、化学処理されたガラス、ナノ粒子で覆われたガラス、金属でコートされたガラス、他の形態の材料で処理されたガラス、炭素(全ての形態)、ケイ素、ゴム、プラスチック、金属、結晶類、ポリマー、半導体、有機材料又は無機材料の1つ又は複数からなる、項目66に記載のカートリッジデバイス。
[項目69]
前記ベース部が疎水性であり、
前記ベース部が、所望の捕捉剤又は活性物質を含有する結合部位のアレイを含み、
前記結合部位のアレイを備える前記ベース部が、プラズマでエッチングされており、
前記本体部が、成形された材料、又は、前記流体チャネル、前記アッセイ部分及び前記リザーバ部分を含むように構築された材料から構成され、
前記本体部が前記ベース部と位置を調整して結合されている、
請求項66に記載のカートリッジデバイス。
[項目70]
前記リザーバ部分の各々における上部の周縁部周りの前記気密シールが、前記周縁部の周りの上に置かれた隆起したリングにより達成され、そのシールが、圧力をかける任意の気体又は他の形態の流体の洩れを防止するシールを有する該リザーバ部分の上部に圧力を提供するインターフェースデバイスとかみ合う、項目62に記載のカートリッジデバイス。
[項目71]
前記リザーバ部分の各々における上部を覆って封じる薄膜をさらに備え、
該薄膜は、流体を当該カートリッジデバイスに漏洩を生ずることなく予め充填できて、皮下注射用の針の付いた又は同様な装置により、流体を任意の保存中に容易に挿入し又はそこから取り出すことができるように、かつ、当該カートリッジデバイスをシステムに挿入するとこのシールが自動的に破れて流体が適用された圧力の制御下で流れることを可能にするように、リザーバの周縁部の周りを封じている、項目60に記載のカートリッジデバイス。
[項目72]
当該カートリッジデバイスが透明な材料で作製されており、当該カートリッジデバイスが挿入されるシステムが、可視性のバックライトを提供して、この点灯がアッセイ中に結合事象の検出及び測定に干渉しない場合、使用者が当該カートリッジデバイスを通る流体の移動を見て、流れに勢いがあることを視覚で判定し、泡又は他の汚染物質などの任意の潜在的な不規則性を観察することを可能にする、項目60に記載のカートリッジデバイス。
[項目73]
当該カートリッジデバイスを通る液体の流速を、当該カートリッジデバイスにおける前記アッセイ部分の後ろ又は当該カートリッジデバイスの出口の後ろで、当該カートリッジデバイスが挿入されるシステム内に置かれた又はそれ以外で接続された流れセンサーにより測定することができる、項目60に記載のカートリッジデバイス。
[項目74]
前記アッセイ部分が高さ150ミクロン以下、及び好ましくは50ミクロン以下となるサイズである、項目60に記載のカートリッジデバイス。
[項目75]
前記アッセイ部分が流体の乱流を生じさせる、項目60に記載のカートリッジデバイス。
Claims (11)
- アッセイシステムであって、
カートリッジデバイスであり、
・内部で加圧された試料のリザーバと、
・内部で加圧された前記試料のリザーバからの試料の流体と、内部で加圧された試薬のリザーバからの試薬の流体とを受けるためのアッセイ部分であり、
該アッセイ部分への前記試料の流体の流れの阻止と容認を選択的に行うよう、内部で加圧された前記試料のリザーバに接続された導入弁と、
該アッセイ部分から前記試料の流体を排出する排出弁と、
前記導入弁と前記排出弁との間において前記アッセイ部分の少なくとも一つの表面上に設けられた複数の結合部位であり、該結合部位を経て前記試料の流体が前記導入弁から前記排出弁に反復して流され得る、結合部位と
を有する、アッセイ部分と、
を含むカートリッジデバイスと、
前記試料の流体中の1種以上の分析物の前記複数の結合部位への結合を、前記導入弁から前記排出弁への前記試料の流体の複数の流れの各反復の後に、測定するための測定装置であり、結合の各測定は前記1種以上の分析物の累積的な結合を測定する、測定装置と
を含む、アッセイシステム。 - 前記カートリッジデバイスが受け入れられたり取り出されたりするインターフェースであって、内部で加圧された前記試料のリザーバから前記アッセイ部分を通る前記試料の流体の流れ又は移動を制御するための装置を含む、インターフェースをさらに備え、
前記試料の流体の流れを制御するための前記装置が、以下の事項の少なくとも1つ、すなわち
前記アッセイ部分を横切る前記試料の流体の流速、
前記アッセイ部分を横切る前記試料の流体の流れの持続時間、及び、
ある量の前記試料の流体が、前記アッセイ部分を通って流される回数
の少なくとも1つを独立に制御することができる、請求項1に記載のアッセイシステム。 - 流速センサーをさらに備え、
前記インターフェースが、前記流速センサーからの出力に基づいて、前記アッセイ部分を横切る前記試料の流体の流速と持続時間の少なくとも一方を制御する可変の陽圧と可変の陰圧の両方又はその一方を提供する、請求項2に記載のアッセイシステム。 - 前記試料の流体が、蛍光標識、発光標識、及び比色標識からなる群から選択される1種以上の標識を含む液体であり、
前記測定装置が、蛍光測定装置、発光測定装置、及び比色測定装置からなる群から選択される、請求項1に記載のアッセイシステム。 - 前記測定装置が、コンピューター制御下で、レーザー又は他の形態の標識刺激を、前記カートリッジデバイスの前記アッセイ部分に向けることができるように、かつ、続いて蛍光、発光又は比色シグナルの検出及び/又は測定を実施できるように、当該アッセイシステムに構成されている、請求項4に記載のアッセイシステム。
- コンピューターソフトウェアをさらに備え、
該コンピューターソフトウェアは、実行されると、
前記アッセイ部分中における前記複数の結合部位の1つ又は複数に結合する1種以上の分析物の1つ以上の結合曲線の表示を分析し、
前記1種以上の分析物について該分析を1つ以上の既知の標準物質の時間経過結合曲線と比較し、
前記試料の流体中の前記1種以上の分析物の存在と濃度の少なくとも一方を決定する
ように動作する、請求項1に記載のアッセイシステム。 - 前記リザーバの一部が、前記試料のリザーバ内の前記試料の流体を封じる薄い膜により覆われている、請求項1に記載のアッセイシステム。
- 前記流体が、
ストレプトアビジン、アビジン及び色素標識型のストレプトアビジンを含むストレプトアビジン種、
二量化ビオチン分子、ビオチンで部分的に若しくは完全に標識されたPAMAM(ポリアミドアミン)デンドリマー、又はビオチン−アビジンネットワークを形成し得る任意のビオチン含有分子若しくは高分子、ビオチン化タンパク質、ビオチン化抗体、ビオチン化ペプチド、DNAのビオチン化ストランド、及びビオチン化デンドリマーを含むビオチン化種、又は、
分析物とは独立した態様で、捕捉された活性物質と検出試薬とを架橋させることができる任意の活性物質及び抗種抗体
のうち少なくとも1つを含む液体である、請求項1に記載のアッセイシステム。 - 前記複数の結合部位の少なくとも1つが、生物学的実体と化学的実体の一方又は両方を含む、請求項1に記載のアッセイシステム。
- 前記生物学的実体が、タンパク質、ホルモン、抗体、抗原、ウイルス、抗体複合体、機能的抗体断片、ペプチド、細胞、細胞断片、アプタマー、細胞溶解物、分画された細胞溶解物、分画された細胞、DNA、RNA、mRNA、遺伝子、及び遺伝子発現生成物からなる群から選択され、
前記化学的実体が、化学元素、化合物、薬学的に活性な化合物又はそれらの代謝物、鉱物、及び汚染物質からなる群から選択される、請求項9に記載のアッセイシステム。 - 前記カートリッジデバイスが、前記排出弁に接続された廃棄物チャンバーをさらに備える、請求項1に記載のアッセイシステム。
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