KR101789356B1 - 전기화학발광 검출에 있어서의 신호 증강 화합물의 용도 - Google Patents

전기화학발광 검출에 있어서의 신호 증강 화합물의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규한 시약 조성물을 사용하여 전기화학발광에 의해 샘플 중의 분석물을 검출하는 방법에 관한 것이다. 신규한 시약 조성물, 전기화학발광 (ECL) 측정용 시약 키트 및 신규한 시약 조성물을 사용하는 전기화학발광 검출 방법이 개시된다. 특히, 본 발명은 향상된 검정 성능을 제공하기 위한 상기 측정에서 사용할 수 있는 화합물의 신규한 조합의 용도에 관한 것이다.

Description

전기화학발광 검출에 있어서의 신호 증강 화합물의 용도 {USE OF SIGNAL ENHANCING COMPOUNDS IN ELECTROCHEMILUMINESCENCE DETECTION}
본 발명은 신규한 시약 조성물을 사용하여 전기화학발광에 의해 샘플 중의 분석물을 검출하는 방법에 관한 것이다. 신규한 시약 조성물, 전기화학발광 (ECL) 측정용 시약 키트 및 신규한 시약 조성물을 사용하는 전기화학발광 검출 방법이 개시된다. 특히, 본 발명은 향상된 검정 성능을 제공하기 위한 상기 측정에서 사용할 수 있는 화합물의 신규한 조합의 용도에 관한 것이다.
전기화학발광 현상을 측정하는 방법이 수년 간 알려져 왔다. 이러한 방법은, 산화에 의해, 전기화학발광을 방사하는, 바닥 상태로 붕괴하는 여기 상태를 이루는 특정 금속 착물의 능력을 이용한다. 검토를 위해서는 [Richter, M.M., Chem. Rev. 104 (2004) 3003-3036] 을 참조한다.
이때, 분석적 측정을 위해 전기화학발광 (ECL) 을 이용하는 수많은 시판 기구가 존재한다. ECL 을 방사하도록 유도될 수 있는 종류 (ECL-활성 종류) 를 ECL 표지로서 사용할 수 있다. ECL 표지의 예는 유기금속 화합물 예컨대 트리스-바이피리딜-루테늄 (RuBpy) 부분을 포함하며, 여기서 금속은 예를 들어 Re, Ru, Ir 및 Os 를 포함하는 VII 및 VIII 족 금속의 것이다. ECL 방법에서 ECL 표지와 반응하는 종류를 본원에서 ECL 공동반응물로서 지칭한다. ECL 에 대해 흔히 사용된 공동반응물은 3 차 아민 (예를 들어, 트리프로필아민 (TPA)), 옥살레이트 및 퍼술페이트를 포함한다. ECL 표지 또는 리간드에 의해 광이 생성되며; ECL 표지로부터 방사된 ECL 을 측정함으로써 결합 상호작용에서의 결합 시약의 관여를 모니터링할 수 있다. 대안적으로는, ECL-활성 화합물로부터의 ECL 신호는 화학적 환경을 나타내는 것일 수 있다 (예를 들어, 특이적 ECL 공동반응물의 존재 또는 소실을 모니터링하는 ECL 검정을 기재하는 미국 특허 제 5,641,623 및 5,643,713 호 참조). ECL, ECL 표지, ECL 검정 및 ECL 검정을 수행하기 위한 기기 장치에 대한 더 많은 배경 지식을 위해서는 미국 특허 제 5,093,268; 5,147,806; 5,240,863; 5,308,754; 5,324,457; 5,591,581; 5,597,910; 5,679,519; 5,705,402; 5,731,147; 5,786,141; 5,846,485; 5,866,434; 6,066,448; 6,136,268 및 6,207,369 호, 및 EP 0 441 875 및 공개된 PCT 번호 WO97/36931;　WO98/12539;　WO99/14599;　WO99/32662;　WO99/58962; WO99/63347; WO00/03233 및 WO98/57154 를 참조한다.
시판 ECL 기구는 뛰어난 성능이 입증되어 있다. 이는 우수한 민감도, 동적 범위, 정확성 및 복잡한 샘플 매트릭스의 허용성 (tolerance) 을 포함하는 이유로 인해 널리 사용되고 있다. 상기 시판 기기 장치는 영구적으로 재사용가능한 유동 세포로의 유동 세포 기반 디자인을 사용한다.
분석물 측정을 위한 이용가능한 샘플 부피는 종종 제한되며 한 샘플로부터 더욱 더 상이한 분석물이 측정되어야 한다. 또한 검정 자동화를 위한 더 빠른 실험실 장비 및 분석물 검출을 위한 보다 민감한 방법의 개발이 필요하다. 이는 그를 수행하기 위한 고 민감도 및 특이적 전기화학발광 검정 및 방법에 대한 필요성으로 이어진다. 추가적으로, 안전 위험성 또는 환경적 우려와 관련된 개선이 고려되어야 한다.
그러나, 분석물의 보다 더 민감한 검출이 크게 유리할 것이다. 따라서, 본 발명의 목적은 특히 ECL 신호의 증강 및 전기화학발광 절차와 결합된 향상된 분석물 검출에 대하여 상기 알려져 있는 방법 및 시약 조성물을 향상시키는 것이었다. 전기화학발광 검정에 있어서 향상된 성능을 갖는 신규한 신호 증강 시약 및/또는 화합물을 발견하는 것이 바람직하다.
발명의 개요
한 구현예에서의 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 전기화학발광 검출을 통해 샘플 중의 분석물을 측정하는 방법에 관한 것이다:
a) 전기화학발광기로 표지된 검출 시약과 함께 샘플을 인큐베이션하는 단계, b) 분석물-결합 및 분석물-불포함 표지된 검출 시약을 분리하는 단계, c) 분리한 표지된 검출 시약을 i) 하나 이상의 공동반응물 및 ii) 하기 화학식 I 및 화학식 II 의 탄산 아미드 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물:
화학식 I
Figure 112013033797153-pct00001
[식 중,
R1 = CH3, CH2F, CH2Cl, CH2CH3, CHClCH3, CH2CH2Cl, C(CH3)2CH3, CH2CH2CH3, CClHCH2CH3 또는 CH2CH2CH2CH3 이고,
R2 = H 이고,
R3 = H 임],
화학식 II
Figure 112013033797153-pct00002
을 포함하는 시약 조성물과 함께 인큐베이션하는 단계, d) 발광의 방출을 전기화학적으로 촉발시키는 단계, 및 e) 전기화학발광 (ECL) 신호를 측정함으로써 분석물을 측정하는 단계.
본 발명은 또한, i) 화학식 I 및 화학식 II 의 탄산 아미드 군에서 선택되는 화합물 및 ii) 하나 이상의 공동반응물을 포함하는 ECL 측정용 시약 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한, i) 화학식 I 및 화학식 II 의 탄산 아미드 군에서 선택되는 화합물 및 ii) 하나 이상의 공동반응물, 조사할 샘플, 및 전기화학발광기로 표지된 하나 이상의 검출 시약을 포함하는, ECL 측정용 시약 조성물을 포함하는 시약 혼합물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 i) 화학식 I 및 화학식 II 의 탄산 아미드 군에서 선택되는 화합물 및 ii) 하나 이상의 공동반응물을 포함하는, ECL 측정용 시약 조성물을 함유하는 ECL 측정용 키트에 관한 것이다.
본 발명 뿐 아니라 이의 추가적 목적, 특징 및 이점은 특정 바람직한 구현예의 하기 상세한 설명으로부터 충분히 이해될 것이다.
상세한 설명
다르게 나타내지 않는 한, 본 발명의 실행은 분자 생물학 (재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 종래 기술을 이용할 것이며, 이는 당업계의 지식 내에 있다. 이러한 기술은 "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 제 2 판 (Sambrook et al., 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, and periodic updates); "PCR: The Polymerase Chain Reaction" (Mullis et al., eds., 1994) 과 같은 문헌에서 충분히 설명된다.
다르게 정의하지 않는 한, 본원에서 사용한 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당업계의 통상의 지식 중 하나에 의해 흔히 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2nd ed., J. Wiley & Sons, New York (1994); March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure, 4th ed., John Wiley & Sons, New York (1992); Lewin, B., Genes V, published by Oxford University Press (1994), ISBN 0-19-854287 9; Kendrew, J. et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd. (1994), ISBN 0-632-02182-9; 및 Meyers, R.A. (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc. (1995), ISBN 1-56081-569 8 은 당업자에게 본 출원에서 사용한 많은 용어에 대한 일반적 안내를 제공한다.
특허 출원 및 출판물을 포함하는 본원에서 인용한 모든 참고문헌은 그 전체가 참조로 포함된다.
정의:
본원에서 사용하는 바와 같이, 하기의 각 용어는 이 부분에서 그와 관련된 의미를 갖는다.
단수형 표현은 본원에서 하나 또는 하나 초과 (즉, 하나 이상) 의 문법적 객체를 지칭하는 것으로 사용된다. 그 예로서, "분석물" 은 하나의 분석물 또는 하나 초과의 분석물을 의미한다. 용어 "~이상" 은 임의로는 하나 또는 그 이상의 추가적인 대상이 존재할 수 있다는 것을 나타내는데 사용된다. 그 예로서, 2 개 이상의 개별 영역을 포함하는 어레이는 임의로는 2 개 또는 그 이상의 개별 시험 영역을 포함할 수 있다.
표현 "하나 이상" 은 1 내지 50, 바람직하게는 1 내지 20, 또한 바람직하게는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12 또는 15 를 나타낸다.
"탄산 아미드" 및 그의 화학적 구조에 대한 예를 하기 표 1 에서 열거한다.
표 1: 다르게 나타내지 않는 한, 탄산 아미드는 하기의 통상적인 구조를 갖는다:
Figure 112013033797153-pct00003
Figure 112013033797153-pct00004
본원에서 사용하는 바와 같은 화학식 I 은 하기를 나타낸다:
Figure 112013033797153-pct00005
[식 중,
R1 = CH3, CH2F, CH2Cl, CH2CH3, CHClCH3, CH2CH2Cl, C(CH3)2CH3, CH2CH2CH3, CClHCH2CH3 또는 CH2CH2CH2CH3 이고,
R2 = H 이고,
R3 = H 임].
본원에서 사용하는 바와 같은 화학식 II 는 표 1 에서 24 번으로 표시한 2-피롤리디논으로 명명된 하기의 구조를 나타낸다:
Figure 112013033797153-pct00006
본 발명의 구현예는 관심 분석물 또는 활성을 포함할 수 있는 다양한 샘플을 시험하는데 사용될 수 있다. 이러한 샘플은 고체, 유액, 현탁액, 액체 또는 기체 형태일 수 있다. 이들은 인간 또는 동물 유래의 또는 이를 함유하는 샘플, 예를 들어 세포 (생 또는 사멸) 및 세포 유래 산물, 무한증식 세포 (immortalized cell), 세포 단편, 세포 분획물, 세포 용해물, 세포 기관, 세포막, 하이브리도마, 세포 배양물 상청액 (항체 생성 유기체 예컨대 하이브리도마로부터의 상청액 포함), 폐수 또는 식수, 식품, 음료, 약학 조성물, 혈액, 혈청, 혈장, 모발, 땀, 소변, 배설물, 대변, 침, 조직, 생검물, 유출물, 분리 및/또는 분획화 샘플, 분리 및/또는 분획화 액체, 기관, 식물, 식물 부분, 식물 부산물, 토양, 물, 배수물, 수원, 유체로부터의 여과 잔류물 (기체 및 액체), 스와이프 (swipe), 흡수체 물질, 겔, 세포골격, 비분획화 샘플, 비분획화 세포 용해물, 세포 핵(들), 핵 분획물, 화학물질, 화학물질 용액, 구조적 생물학적 성분, 골격 (인대, 힘줄) 성분, 분리 및/또는 분획화 골격 성분, 모발 분획물 및/또는 분리물, 피부, 피부 샘플, 피부 분획물, 진피, 내피, 진핵 세포, 원핵 세포, 진균, 효모, 면역 세포, 약물, 치료 약물, 오일, 추출물, 점액, 오물, 환경 샘플, 유기 용매 또는 공기일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 한 구현예에서 샘플은 예를 들어, 물, 알코올, 아세토니트릴, 디메틸 술폭시드, 디메틸 포름아미드, n-메틸-피롤리돈, 메탄올 또는 기타 유기 용매를 추가로 포함할 수 있다.
본원에서 사용하는 바와 같은 "샘플" 은 시험관내 평가 목적으로 수득된다. 숙련된 기술자가 이해할 것이므로, 그 어떤 평가도 시험관내 이루어진다. 샘플이 환자 샘플인 경우, 이는 나중에 폐기된다. 환자 샘플은 오로지 본 발명의 시험관내 진단 방법에 사용되며 환자 샘플 물질은 환자 체내로 다시 옮겨지지 않는다.
측정할 수 있는 분석물은 샘플 중 존재하는 전체 세포, 세포 표면 항원, 단백질 복합체, 세포 신호화 인자 및/또는 성분, 제 2 메신저, 제 2 메신저 신호화 인자 및/또는 성분, 아세포성 입자 (예를 들어, 세포 기관 또는 멤브레인 단편), 바이러스, 프리온, 집먼지 진드기 또는 이의 단편, 비로이드, 면역 인자, 항체, 항체 단편, 항원, 합텐, 지방산, 핵산 (및 합성 유사체), 리보솜, 단백질 (및 합성 유사체), 리포단백질, 다당류, 저해제, 보조인자, 합텐, 세포 수용체, 수용체 리간드, 지질다당류, 당단백질, 펩티드, 폴리펩티드, 효소, 효소 기질, 효소 산물, 핵산 처리 효소 (예를 들어, 폴리머라아제, 뉴클레아제, 인테그라아제, 리가아제, 헬리카아제, 텔로머라아제 등), 단백질 처리 효소 (예를 들어, 프로테아제, 키나아제, 단백질 포스파타아제, 유비퀴틴-단백질 리가아제 등), 세포 대사산물, 내분비 인자, 파라크린 인자, 오토크린 인자, 사이토카인, 호르몬, 약리적 작용제, 약물, 치료 약물, 합성 유기 분자, 유기금속 분자, 진정제, 바르비튜레이트 (barbiturate), 알칼로이드, 스테로이드, 비타민, 아미노산, 당, 렉틴, 재조합 또는 유도 단백질, 비오틴, 아비딘, 스트렙타비딘, 또는 무기 분자를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
전체 세포는 동물, 식물 또는 박테리아일 수 있으며, 생육성이거나 사멸된 것일 수 있다. 그 예는 식물 병원균 예컨대 진균 및 선충을 포함한다. 용어 "아세포성 입자" 는 예를 들어 아세포성 세포 기관, 분열된 세포로부터의 멤브레인 입자, 세포벽의 단편, 리보솜, 다효소 복합체, 및 살아 있는 유기체에서 유래할 수 있는 기타 입자를 포함하는 것을 의미한다. 핵산은 예를 들어 염색체 DNA, 플라스미드 DNA, 바이러스 DNA 및 재조합 DNA (여러 공급원 유래) 를 포함한다. 핵산은 또한 RNA, 예를 들어 메신저 RNA, 리보솜 RNA 및 트랜스퍼 RNA 를 포함한다. 폴리펩티드는 예를 들어 효소, 수송 단백질, 수용체 단백질 및 구조 단백질 예컨대 바이러스 피막 단백질을 포함한다. 바람직한 폴리펩티드는 효소 및 항체이다. 특히 바람직한 폴리펩티드는 단일클론 항체이다. 호르몬은 예를 들어 인슐린 및 T4 갑상선 호르몬을 포함한다. 약리적 작용제는 예를 들어 강심 배당체를 포함한다. 물론, 화학적으로 유사한 생물학적 물질인 합성 물질, 예컨대 합성 폴리펩티드, 합성 핵산, 및 합성 멤브레인, 소낭 및 리포솜을 포함하는 것은 본 발명의 범주 내에 있다. 전술한 것은 본 발명에서 사용하기에 적합한 생물학적 물질의 포괄적 목록인 것으로 의도되는 것이 아니라, 단지 본 발명의 넓은 범주를 설명하는 것을 의미한다.
또한, 통상, 관심 분석물은 10-3 이하의 몰 농도, 예를 들어 적어도 10-18 만큼 낮은 몰 농도로 존재한다.
본 발명에 따른 용어 "분석물 특이적 시약" (ASR) 은 분석물에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 분자 또는 생분자 (예를 들어, 단백질 또는 항체) 로서 이해되어야 한다. "분석물 특이적 시약" (ASR) 은 생물학적 표본 중의 개별적 화학 물질의 양을 확인하고 측정하는데 사용될 수 있는 생물학적 분자의 부류이다. ASR 은 예를 들어 항체 (다클론 및 단일클론 모두), 특이적 수용체 단백질, 리간드, 핵산 서열 및 유사 시약이며, 이는 표본 중의 물질과의 특이적인 결합 또는 화학 반응을 통해 생물학적 표본 중의 개별적 화학 물질 또는 리간드의 확인 및 정량을 위한 진단 적용물에서 사용되는 것으로 의도된다. 간단히 말해, 분석물 특이적 시약은 검정의 활성 성분이다. ASR 은 친화성 뿐 아니라 분석물 결합의 특이성에 대한 기준 모두를 충족시킬 것이다.
용어 "항체" 는 가장 넓은 의미로 사용되며 구체적으로는 단일클론 항체 (전체 길이 단일클론 항체 포함), 다클론 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체) 및 항체 단편을 포함한다. 용어 "항체" 는 전체 항체 및 항체 단편을 포함하는 항체 구조의 다양한 형태를 포함한다. 본 발명에 따른 항체는 한 구현예에서 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 마우스, 염소 또는 양과 같은 기타 동물 종류 유래 항체, 단일클론 또는 다클론 항체, 또는 T 세포 항원 결핍 항체이다. 항체의 유전 공학은 예를 들어 Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; US 5,202,238 및 US 5,204,244; Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327; Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270; Lonberg, N., Nat. Biotechnol. 23 (2005) 1117-1125 에 기재되어 있다.
분석물 특이적 시약의 상기 기준을 보유하는 임의의 항체 단편이 사용될 수 있다. 항체는 예를 들어 Tijssen (Tijssen, P., Practice and theory of enzyme immunoassays, 11, Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam, 책 전체, 특히 페이지 43-78) 에 기재된 바와 같은 최신 절차에 의해 생성된다. 또한, 숙련된 기술자는 항체의 특이적 단리에 사용할 수 있는 면역흡수제 기반의 방법을 인지하고 있다. 이에 의해 항체의 품질 및 그에 따른 면역검정에서의 이의 성능을 증강시킬 수 있다 (상기 Tijssen, P., 페이지 108-115).
본 발명에 따른 "검출 시약" 은 전기화학발광기로 표지된 분석물 특이적 시약 (ASR), 또는 전기화학발광기로 표지된 분석물 동족체를 포함한다. 시험 포맷에 따라서, 검출 시약이 다양한 검정 포맷 (예를 들어, 샌드위치 검정, 이중 항원 가교 검정 (DAGS), 경쟁적 검정, 동질 검정, 이종 검정) 에 대해 선택되어야 한다는 것이 숙련된 기술자에게 알려져 있다. 이종 면역검정에서의 검출 시약은 예를 들어 항체일 수 있다. 검출 시약이 고체상에 고정될 수 있다는 것이 당업자에게 알려져 있다. 한 구현예에서 전기화학발광 검출을 통한 샘플 중의 분석물 측정 방법은 동질 검정으로서 수행될 수 있다. 한 구현예에서 상기 방법은 이종 검정으로서 수행될 수 있다. 한 구현예에서 상기 방법은 샌드위치 검정 포맷으로 수행될 수 있다. 한 구현예에서 상기 방법은 경쟁적 검정 포맷으로 수행될 수 있다. 또한 한 구현예에서 상기 방법은 이중 항원 가교 검정 포맷 (DAGS) 으로 수행될 수 있다. 알려져 있는 면역검정 포맷은 저서 Price, C.P. and Newman, D.J., Principles and Practice of Immunoassay, 2nd ed. (1997) 에 상세히 기재되어 있다.
본원에서 사용하는 바와 같은 용어 "표지" 는 시각적으로 또는 적합한 기기 장치를 사용하여 검출가능한 신호를 생성할 수 있는 임의의 물질을 지칭한다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 다양한 표지는 색원체, 형광, 화학발광 또는 전기화학발광 화합물, 촉매, 효소, 효소 기질, 염료, 콜로이드성 금속 및 비 (non) 금속 입자, 및 유기 중합체 라텍스 입자를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
용어 "발광" 은 에너지원 (예를 들어, 전자기 방사선, 화학 반응, 기계적 에너지의 공급원) 의 온도로부터 에너지를 유도하지 않는 임의의 광 방사를 지칭한다. 일반적으로, 상기 공급원은 원자의 전자가 저 에너지 상태에서 "여기된" 고 에너지 상태로 이동하도록 초래하여; 전자가 저 에너지 상태로 다시 떨어질 때 방사된 광의 형태로 에너지를 배출한다. 이러한 광의 방사는 통상 전자기 스펙트럼의 가시 또는 근가시 (near-visible) 범위에서 발생한다. 용어 "발광" 은 이러한 광 방사 현상 예컨대 인광, 형광, 생물발광, 방사선발광, 전기발광, 전기화학발광 및 열발광을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
용어 "발광 표지" 는 발광 신호, 예를 들어 방사원의 온도로부터 에너지를 유도하지 않는 광의 방사를 생성시키는 표지를 지칭한다. 발광 표지는 예를 들어 형광 분자, 인광 분자, 방사선발광 분자, 발광 킬레이트, 인광체 또는 인광체-함유 화합물 또는 양자점일 수 있다.
"전기화학발광 검정" 또는 "ECLA" 는 결합된 분석물 분자를 검출 작용제 (표적 분자) 에 연결된 표지에 의해 검출하는 전기화학 검정이다. 전극은 검출 작용제에 연결된 화학 표지의 발광을 전기화학적으로 개시시킨다. 표지에 의해 방사된 광은 광 검출기에 의해 측정되며, 결합된 분석물 분자/표적 분자 복합체의 존재 또는 수량을 나타낸다. ECLA 방법은 예를 들어 미국 특허 제 5,543,112; 5,935,779; 및 6,316,607 호에 기재되어 있다. 정확하고 민감한 측정을 위해서 상이한 분석물 분자 농도에 대해 신호 조정이 최대화될 수 있다.
ECLA 절차에서 미세입자는 샘플 중에 현탁되어 분석물에 효과적으로 결합할 수 있다. 예를 들어, 상기 입자는 0.05 μm 내지 200 μm, 0.1 μm 내지 100 μm, 또는 0.5 μm 내지 10 μm 의 직경을 가질 수 있으며, 분석물 분자에 결합할 수 있는 표면 성분을 가질 수 있다. 자주 사용되는 한 ECLA-시스템 (Elecsys®, Roche Diagnostics, Germany) 에서, 미세입자는 약 3 μm 의 직경을 갖는다. 미세입자는 가교된 전분, 덱스트란, 셀룰로오스, 단백질, 유기 중합체, 스티렌 공중합체 예컨대 스티렌/부타디엔 공중합체, 아크릴로니트릴/부타디엔/스티렌 공중합체, 비닐아세틸 아크릴레이트 공중합체, 비닐 클로라이드/아크릴레이트 공중합체, 불활성 무기 입자, 크롬 이산화물, 철, 실리카, 실리카 혼합물의 산화물, 단백질성 물질 또는 이의 혼합물 (세파로오스 비드, 라텍스 비드, 쉘-코어 입자 등을 포함하나 이에 제한되지는 않음) 로 형성될 수 있다. 미세입자는 바람직하게는 단분산성일 수 있으며, 자성일 수 있다 (예컨대 상자성 (paramagnetic) 비드). 예를 들어, 미국 특허 제 4,628,037; 4,965,392; 4,695,393; 4,698,302; 및 4,554,088 호를 참조한다. 미세입자는 약 1 내지 10,000 μg/ml, 바람직하게는 5 내지 1,000 μg/ml 범위의 양으로 사용될 수 있다.
표현 "관심" 은 분석되거나 측정될 관련성 있는 분석물 또는 물질을 지칭한다.
"검출" 은 직접 및 간접 검출을 포함하는 검출의 임의의 수단을 포함한다. 용어 "검출" 은 분석물의 정성 및 정량 측정 모두, 본원에서의 분석물의 측정을 포함하도록 가장 넓은 의미에서 사용된다. 한 양상에서, 본원에서 기재된 바와 같은 검출 방법은 단지 샘플 중의 관심 분석물의 존재를 확인하는데 사용된다. 또 다른 양상에서, 상기 방법은 샘플 중의 분석물 양을 정량하는데 사용될 수 있다.
"감소" 또는 "저해" 는 참조물과 비교하여 활성, 기능 및/또는 양이 줄거나 감소되는 것을 의미한다. 감소 또는 저해는 바람직하게는 10% 이상, 보다 바람직하게는 25% 이상, 가장 바람직하게는 50%, 75%, 90%, 95% 이상의 전체 감소를 일으키는 능력을 의미한다.
"증강", 예를 들어, "특정 신호의 증강" 또는 "ECL 신호의 증강" 은 참조물과 비교하여 활성, 기능 및/또는 양이 증가하거나 상승하는 것을 의미한다. 증가 또는 상승은 바람직하게는 10% 이상, 보다 바람직하게는 25% 이상, 가장 바람직하게는 50% 이상의 전체 증가를 일으키는 능력을 의미한다.
용어 "측정" 은 본원에서 분석물의 정성 및 정량 검출 모두에 대해 사용되며, 분석물의 양 및/또는 농도의 측정을 포함할 수 있다.
과학에 있어서 용어 "측정하는"/"측정" 은 측정 단위, 예컨대 미터 또는 킬로그램에 관해 양의 규모, 예컨대 길이 또는 질량을 추정하거나 측정하는 방법이다. 측정하는/측정은 다른 것들을 그에 대해 평가할 수 있는 참조점을 사용한다. 용어 측정은 또한 측정 방법으로부터 수득한 특정 결과 (측정값) 를 지칭하는 것으로 사용될 수 있다. 이는 비교를 위한 기초이다. 숙련된 기술자는 측정된 신호 또는 측정값을 농도와 상호연관시키는 물질 및 방법을 인지한다.
본 발명에 따른 "시약 조성물" 또는 "ECL-시약 조성물" 은 ECL-신호 생성을 지지하는 시약, 예를 들어 공동반응물, pH 조절용 완충제, 및 임의로는 기타 성분을 포함한다. 숙련된 기술자는 전기화학발광 검출 방법에서 ECL 신호 생성에 필요한 시약 조성물 중에 존재할 성분을 인지한다.
본원에서 사용하는 바와 같은 "수용액" 은 물에 용해된 입자, 물질 또는 액체 화합물의 균질 용액이다. 수용액은 또한 유기 용매를 포함할 수 있다. 유기 용매는 당업자에게 알려져 있다 (예를 들어 메탄올, 에탄올 또는 디메틸술폭시드). 본원에서 사용하는 바와 같이, 수용액이 50% 이하의 유기 용매를 포함할 수 있다는 것이 또한 이해된다.
ECL 방법에서 ECL 표지와 함께 참여하는 종류를 본원에서 ECL "공동반응물" 로서 지칭한다. 통상 사용되는 ECL 용 공동반응물은 3 차 아민 (예를 들어, 트리프로필아민 (TPA)), 옥살레이트 및 퍼술페이트를 포함한다 숙련된 기술자는 전기화학발광 검출 방법에 유용한 이용가능 공동반응물을 인지한다.
"고체 지지체" 로도 알려져 있는 "고체상" 은 이에 라이브러리 일원 또는 시약이 부착되거나 공유 결합되어 (종종 링커를 통해) 고정될 수 있거나 과량의 시약, 용액 반응 부산물 또는 용매로부터 이를 용이하게 분리시킬 수 있는 (여과, 원심분리, 세척 등에 의해) 불용성의, 관능화된, 중합 물질이다. 본 발명에 따른 방법에 대한 고체상은 당업계에서 널리 기재되어 있다 (예를 들어, Butler, J. E., Methods 22 (2000) 4-23 참조). 용어 "고체상" 은 비유체 물질을 의미하며 중합체, 금속 (상자성, 강자성 입자), 유리 및 세라믹과 같은 물질로 만들어진 입자 (미세입자 및 비드 포함); 실리카, 알루미나 및 중합체 겔과 같은 겔 물질; 중합체, 금속, 유리 및/또는 세라믹으로 만들어질 수 있는 모세관; 제올라이트 및 기타 다공성 물질; 전극; 마이크로타이터 플레이트; 고체 스트립; 및 큐벳, 튜브, 칩 또는 기타 분광계 샘플 용기를 포함한다. 검정의 고체상 성분은, "고체상" 이 이의 표면 상에 포획 항체 또는 포획 분자와 상호작용하는 것으로 의도되는 하나 이상의 부분을 함유한다는 점에 있어서 검정이 접촉할 수 있는 불활성 고체 표면과 구별된다. 고체상은 비유동적인 성분, 예컨대 튜브, 스트립, 큐벳, 칩 또는 마이크로타이터 플레이트일 수 있거나, 유동적 성분, 예컨대 비드 및 미세입자일 수 있다. 미세입자는 또한 동질 검정 포맷에 대한 고체상으로서 사용될 수 있다. 단백질 및 기타 물질의 비공유 또는 공유 결합을 가능하게 하는 다양한 미세입자가 사용될 수 있다. 이러한 입자는 폴리스티렌 및 폴리(메틸메타크릴레이트) 와 같은 중합체 입자; 금 나노입자 및 금 콜로이드와 같은 금 입자; 및 실리카, 유리 및 금속 산화물 입자와 같은 세라믹 입자를 포함한다. 예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 Martin, C.R., et al., Analytical Chemistry-News & Features (1998) 322A-327A 를 참조한다.
용어 "칩", "바이오-칩", "중합체-칩" 또는 "단백질-칩" 은 상호교환가능하게 사용되며, 규소 웨이퍼, 나일론 스트립, 플라스틱 스트립 또는 유리 슬라이드의 일부일 수 있는 공유된 기질 (예를 들어, 고체상) 상에 배열된 다수의 프로브, 마커 또는 생화학적 마커의 집합물을 지칭한다.
방법:
한 구현예에서 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 전기화학발광 검출을 통한 샘플 중의 분석물 측정 방법에 관한 것이다: a) 전기화학발광기로 표지된 검출 시약과 함께 샘플을 인큐베이션하는 단계, b) 분석물-결합 및 분석물-불포함 표지된 검출 시약을 분리하는 단계, c) 분리한 표지된 검출 시약을 i) 하나 이상의 공동반응물, 및 ii) 하기 화학식 I 및 화학식 II 의 탄산 아미드 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물:
화학식 I
Figure 112013033797153-pct00007
[식 중,
R1 = CH3, CH2F, CH2Cl, CH2CH3, CHClCH3, CH2CH2Cl, C(CH3)2CH3, CH2CH2CH3, CClHCH2CH3 또는 CH2CH2CH2CH3 이고,
R2 = H 이고,
R3 = H 임],
화학식 II
Figure 112013033797153-pct00008
을 포함하는 시약 조성물과 함께 인큐베이션하는 단계, d) 발광의 방출을 전기화학적으로 촉발시키는 단계, 및 e) 전기화학발광 (ECL) 신호를 측정함으로써 분석물을 측정하는 단계.
본 발명의 한 양상은 본 발명의 시약 조성물을 기반으로 하는 향상된 ECL 방법, 특히 낮은 검출 한계를 특징으로 하는 ECL 방법에 관한 것이다. 상기 시약 조성물은 놀랍게도 특정 신호를 증강시키며 배경 신호를 감소시킨다. 보다 구체적으로, 본 발명의 방법은 ECL 표지의 부재 하에 배경 전기화학발광을 감소시킴으로써 낮은 검출 수준에서 향상된 민감도를 제공한다.
본 발명자는 놀랍게도 탄산 아미드 군으로부터의 특정 화합물의 사용이 ECL 검출 방법에 있어서의 향상된 신호 생성 및 이에 따른 향상된 ECL 검정 성능을 포함하는 다수의 이점을 제공한다는 것을 발견하였다.
본 발명의 특징은 전기화학발광 표지를 사용하는 조사할 샘플 중의 분석물 측정 방법이며, 이때 전기화학발광 현상 측정을 위한 하기 열거한 방법 중 하나를 이용한다.
놀랍게도, 탄산 아미드 군에서 선택되는 화합물을 사용하는 방법은 이들 화합물을 갖지 않는 종래의 시험 시약보다 배경 발광을 덜 방사한다. 이는 특히 낮은 검출 수준에서의 이점이며, 이때 신호 대 배경 비 (= 신호 대 노이즈 비) 를 증가시키는 것이 민감도를 크게 향상시킨다. 놀랍게도 본 발명자는 본 발명에 따른 방법을 사용하여 전기화학발광 검출을 수행하는 것이 10% 내지 60% 향상된 ECL 검출의 신호 대 노이즈 비를 초래한다는 것을 발견하였다.
본 발명에 따른 전기화학발광 검출을 통해 샘플 중의 분석물을 측정하는 방법은 한 구현예에서 수용액 중에서 수행될 수 있다.
한 구현예에서 상기 방법에서 사용한 탄산 아미드는 아세트아미드, 2-플루오로아세트아미드, 2-클로로아세트아미드, 프로판아미드, 2-클로로프로판아미드, 3-클로로프로판아미드, 부탄아미드 및 2-클로로부탄아미드로 이루어지는 군에서 선택된다.
바람직한 구현예에서 상기 방법에서 사용한 탄산 아미드는 아세트아미드, 2-클로로아세트아미드, 프로판아미드 및 부탄아미드로 이루어지는 군에서 선택된다.
바람직한 구현예에서 상기 방법에서 사용한 탄산 아미드는 아세트아미드, 프로판아미드 및 부탄아미드로 이루어지는 군에서 선택된다.
바람직한 구현예에서 탄산 아미드는 0.01 M 내지 0.25 M 의 농도로 상기 방법에서 사용된다. 추가로 바람직한 구현예에서 탄산 아미드는 0.01 M 내지 0.2 M 의 농도로 사용된다. 추가로 바람직한 구현예에서 탄산 아미드는 0.01 M 내지 0.1 M 의 농도로 사용된다.
한 구현예에서 본 발명에 따른 방법은 관심 샘플 중의 생분자, 예컨대 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 펩티드 단편, 호르몬, 펩티드 호르몬, 비타민, 프로비타민, 비타민 대사산물 및 아미노산을 검출하는데 특히 매우 적합하다.
본 발명에 따른 방법에서 사용한 샘플은 한 구현예에서 액체 샘플, 예를 들어 전혈, 혈청 또는 혈장이다. 샘플, 또는 보다 특이적인 관심 샘플은 한 구현예에서 임의의 체액 및 대변을 포함할 수 있다. 한 구현예에서 샘플은 침, 대변 추출물, 소변, 전혈, 혈장 또는 혈청과 같은 액체 샘플이다. 한 구현예에서 샘플은 전혈, 혈장 또는 혈청이다.
상기 방법에서의 단계 "a) 샘플을 전기화학발광기로 표지된 검출 시약과 함께 인큐베이션하는 단계" 및 "b) 분석물-결합 및 분석물-불포함 표지된 검출 시약을 분리하는 단계" 는 동일한 장소, 예를 들어 동일한 반응 용기에서 수행될 수 있다는 것이 당업자에게 알려져 있다. 상기 단계 (a) 및 (b) 는 조절 수단에 의해 조절되는 자동 공정으로 수행될 수 있다.
비특이적인 샘플 성분 및 분석물-불포함 표지된 검출 시약은 분리 공정으로 상기 방법에 따른 단계 (b) 에서 제거될 수 있다. 예를 들어 상기 분석물-결합 및 분석물-불포함 표지된 검출 시약은 세척 단계를 사용하여 분리될 수 있다.
또한, 분석물의 전기화학발광검출을 지지하는 기타 시험 성분을 본 발명에 따른 방법에서 사용할 수 있다.
본 발명의 한 양상은 예를 들어 시약 혼합물 및 시약 조성물의 장기간 보관을 위한 효과적 보존에 대한 필요성을 포함한다. 적합한 보존제는 ECL 신호 생성에 대해 효과를 갖지 않거나, 이상적인 경우 ECL 신호 생성에 대해 긍정적 영향을 갖는다.
적합한 보존제 화합물로서 붕산 및/또는 붕산염이 박테리아 및 진균 성장을 효과적으로 조절하며 놀랍게도 특정 ECL 신호를 증가시키는 것이 확인되었다. 보존제로서 붕산 및/또는 붕산염을 포함하는 시약 조성물을 사용하는 ECL 검출 방법은 특정 ECL 신호 생성을 증가시키는 놀라운 긍정적 효과를 갖는다.
한 구현예에서 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 전기화학발광 검출을 통한 샘플 중의 분석물 측정 방법에 관한 것이다: a) 샘플을 전기화학발광기로 표지된 검출 시약과 함께 인큐베이션하는 단계, b) 분석물-결합 및 분석물-불포함 표지된 검출 시약을 분리하는 단계, c) 분리한 표지된 검출 시약을 i) 하나 이상의 공동반응물 및 ii) 붕산 및 붕산염으로 이루어지는 군에서 선택되는 보존제를 포함하는 시약 조성물과 함께 인큐베이션하는 단계, d) 발광의 방출을 전기화학적으로 촉발시키는 단계, 및 e) 전기화학발광 (ECL) 신호를 측정함으로써 분석물을 측정하는 단계.
한 구현예에서 전기화학발광 검출을 통한 샘플 중의 분석물 측정 방법은 ECL 신호 생성용 시약 조성물이 붕산 및 붕산염으로 이루어지는 군에서 선택되는 보존제를 0.1% 내지 5% 의 농도, 바람직하게는 0.5% 내지 4% 의 농도, 보다 바람직하게는 0.5% 내지 2% 의 농도로 포함하는 것을 특징으로 한다.
한 구현예에서 전기화학발광 검출을 통한 샘플 중의 분석물 측정 방법은 ECL 신호 생성용 시약 조성물이 보존제로서 붕산을 0.1% 내지 5% 의 농도, 바람직하게는 0.5% 내지 4% 의 농도, 보다 바람직하게는 0.5% 내지 2% 의 농도로 포함하는 것을 특징으로 한다.
한 구현예에서 전기화학발광 검출을 통한 샘플 중의 분석물 측정 방법은 ECL 신호 생성용 시약 조성물이 보존제로서 붕산염을 0.1% 내지 5% 의 농도, 바람직하게는 0.5% 내지 4% 의 농도, 보다 바람직하게는 0.5% 내지 2% 의 농도로 포함하는 것을 특징으로 한다.
하나의 시약 조성물에서 탄산 아미드 및 붕산 및/또는 붕산염의 효과를 조합시키는 전기화학발광 검출을 통한 샘플 중의 분석물 측정 방법이 ECL 측정에 있어서 더욱 향상된 신호 대 노이즈 비를 초래할 수 있다는 것이 발명자에 의해 발견되었다. 하나의 시약 조성물에서의 탄산 아미드 및 붕산 및/또는 붕산염의 누적된 효과는 ECL 검출에 있어서 적어도 10%, 25% 또는 50% 향상된 신호 생성을 일으킨다.
한 구현예에서 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 전기화학발광 검출을 통한 샘플 중의 분석물 측정 방법에 관한 것이다: a) 샘플을 전기화학발광기로 표지된 검출 시약과 함께 인큐베이션하는 단계, b) 분석물-결합 및 분석물-불포함 표지된 검출 시약을 분리하는 단계, c) 분리한 표지된 검출 시약을 i) 하나 이상의 공동반응물, ii) 화학식 I 및 화학식 II 의 탄산 아미드 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물 및 iii) 붕산 및 붕산염으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 보존제를 포함하는 시약 조성물과 함께 인큐베이션하는 단계, d) 발광의 방출을 전기화학적으로 촉발시키는 단계, 및 e) 전기화학발광 (ECL) 신호를 측정함으로써 분석물을 측정하는 단계.
한 구현예에서 전기화학발광 검출을 통한 샘플 중의 분석물 측정 방법은 시약 조성물이 추가로 세제 및 완충제를 포함하는 것을 특징으로 한다.
한 구현예에서 전기화학발광 검출을 통한 샘플 중의 분석물 측정 방법은 시약 조성물이 추가로 염 및/또는 소포제를 포함하는 것을 특징으로 한다.
한 구현예에서 본 발명은 전기화학발광 검정을 수행하는 방법에 관한 것이며, 이때 전기화학발광은 본 발명에 따른 시약 조성물의 존재 하에 유도된다.
ECL 면역검정을 위한 통상적인 ECL 측정 방법은 ECL 측정 세포 (예를 들어, 유동 세포) 에서의 액체 및/또는 혼합물의 복수의 교환을 포함한다. 통상적인 ECL 측정 방법은 하기 설명한 여러 단계로 이루어진다.
숙련된 기술자는 ECL 검출 단계가 실행되기 전에 본 발명에 따른 시약 조성물로 ECL 측정 세포를 헹구고 추가적으로 전위를 적용함으로써 상기 ECL 측정 세포가 조건화되거나 재생성되어야 한다는 것을 인지한다. 이러한 단계는 ECL 을 사용하여 분석물을 측정하는 방법의 한 일부이다. 이러한 조건화 단계 동안, ECL 측정 세포 중의 분석물의 측정 동안 신호 생성을 지지하는 측정 전극(들) 의 표면 상에 층이 형성된다는 것이 EP 1 051 621 에 기재되어 있다.
통상적인 ECL 측정 방법에 대해, 시약 혼합물은 ECL 측정 세포 강 (cavity) 으로의 유체 유입구 채널을 통해 세정되고 조건화된 ECL 측정 세포로 유도된다. 상기 혼합물은 샘플, 시약 및 자성 입자의 인큐베이션물이다. 측정 세포로 유도된 상기 혼합물은 상기 혼합물 전 및 후에 흐르는 본 발명에 따른 시약 조성물에 의해 둘러싸일 수 있다.
이러한 ECL 면역검정에서 전기화학발광기로 표지되며 분석에 대한 특징인 복합체-분자를 포함하는 검출 시약은 특이적인 생화학적 결합 파트너, 예를 들어 스트렙타비딘 및 비오틴의 쌍에 의해 이들 자성 입자에 결합한다. 상기 자성 입자는 예를 들어 스트렙타비딘-중합체로 코팅되는 한편, 비오틴은 복합체-분자에 결합한다.
ECL 측정 세포에서 자성 입자는 그에 결합한 표지된 복합체-분자와 함께, 전극 가까이 배열된 자석의 자기장에서 상기 전극 표면에 포획된다. 자기장은 혼합물의 연속 유동 동안 적용되어, 이에 의해 유체 유출구 채널을 통해 ECL 측정 세포 강으로부터 인큐베이션물 및/또는 시약 조성물이 배출된다.
자성 입자 포획 후, 본 발명에 따른 ECL 공동반응물 함유 시약 조성물이 다음 단계에서 ECL 측정 세포로 유도됨으로써, 자성 입자가 상기 시약 조성물에 의해 세척된다. 이러한 세척 단계는 전기화학적 반응을 잠재적으로 방해하는 상기 인큐베이션물의 미결합 성분을 전극으로부터 제거하기 위한 것이다.
그 후에 전기화학발광 (ECL) 신호의 방출은 전위의 적용에 의해 전기화학적으로 촉발되며, 이에 의해 발광 강도가 광센서에 의해 검출되며 전극 표면에 위치한 자성 입자 상의 표지된 복합체-분자의 농도에 대한 측정값으로서 평가될 수 있고, 그로써 이러한 농도는 샘플 중의 분석물 농도에 대한 측정값으로서 다시 역할한다.
전기화학발광 검출 후 ECL 측정 세포를 통상 세정 유체로 헹군다.
전기화학발광에 의해 검출 방법을 실행하기 위한 장치는 실시예 부분 (실시예　1, 2 또는 3) 에 언급되거나 EP 1 892 524 (A1) 에 기재된다. 또한, 이러한 장치는 측정 단위체 및/또는 액체 용기의 온도를 조절하기 위한 수단을 포함할 수 있다. 상기 측정 단위체는 전기화학발광을 측정하는 세포인 것으로 이해된다. 상기 액체 용기는 저장 용기일 수 있으며, 또한 공급 장치; 예를 들어 측정 동안 측정 단위체 중 포함된 시약 용액용 튜브일 수 있다.
조성물:
본 발명의 한 양상은 증강된 신호 대 노이즈 비를 일으키는 ECL-신호 생성을 위한 향상된 시약 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명의 시약 조성물은 ECL 표지의 부재 하에 배경 전기화학발광을 감소시킴으로써 낮은 검출 수준에서 향상된 민감도를 제공한다. 놀랍게도, 탄산 아미드와 같은 화합물을 포함하는 시약 조성물은 이들 화합물을 갖지 않는 종래의 시험 시약보다 배경 발광을 덜 방사한다. 이는 특히 낮은 검출 수준에서의 이점이며, 이때 신호 대 배경 비 (= 신호 대 노이즈 비) 를 증가시키는 것이 민감도를 크게 향상시킨다. 이러한 향상된 시약 조성물은 탄산 아미드 군으로부터의 화합물 뿐 아니라 ECL 생성 방법을 지지하는 다른 화합물을 함유한다. 놀랍게도 본 발명자는 본 발명에 따른 시약 조성물을 사용하여 전기화학발광 검출을 수행하는 것이 10% 내지 60% 향상된 ECL 검출의 신호 대 노이즈 비를 초래한다는 것을 발견하였다
본 발명의 한 양상은 전기화학발광 검정에 있어서 높은 신호 대 배경 비를 제공하는 시약 조성물에 관한 것이다. 특정 신호와 배경 신호 사이의 신호 차이는 증가한다. 이러한 향상된 특성은 ECL 공동반응물, pH 완충제, 세제 및 pH 의 유리한 조합의 확인, 및 특히, 탄산 아미드로 이루어지는 군에서 선택되는 화합물의 사용을 통해 이루어진다.
시약 조성물은 ECL 이 방사되도록 ECL 표지를 효과적으로 유도하고 ECL 의 측정을 통해 ECL 표지를 민감하게 측정하기 위한 적합한 환경을 제공한다. 본 발명의 시약 조성물은 보존제, 세제, 소포제, ECL 활성 종류, 염, pH 조절용 산성 및 염기성 화합물 (완충제), 금속 이온 및/또는 금속 킬레이트제를 포함하는 추가적인 성분을 임의로 포함할 수 있다. 본 발명의 시약 조성물은 또한 생물학적 검정의 성분을 포함할 수 있는데, 일부 경우 이는 결합 시약, 효소, 효소 기질, 보조인자 및/또는 효소 저해제를 포함하는 ECL 표지로 표지될 수 있다. 본 발명은 또한 검정 시약, 조성물, 키트, 시스템 및 시스템 성분 (본 발명의 시약 조성물을 포함), 및 임의로는 추가적인 검정 성분을 포함한다. 본 발명은 또한 본 발명의 시약 조성물을 사용하여 ECL 검정을 수행하는 방법을 포함한다.
한 구현예에서 본 발명은 i) 화학식 I 및 화학식 II 의 탄산 아미드 군에서 선택되는 화합물 및 ii) 하나 이상의 공동반응물을 포함하는 ECL 측정용 시약 조성물에 관한 것이다.
한 구현예에서 시약 조성물의 탄산 아미드는 아세트아미드, 2-플루오로아세트아미드, 2-클로로아세트아미드, 프로판아미드, 2-클로로프로판아미드, 3-클로로프로판아미드, 부탄아미드 및 2-클로로부탄아미드로 이루어지는 군에서 선택된다.
바람직한 구현예에서 탄산 아미드는 아세트아미드, 2-클로로아세트아미드, 프로판아미드 및 부탄아미드로 이루어지는 군에서 선택된다. 추가의 구현예에서 탄산 아미드는 아세트아미드, 프로판아미드 및 부탄아미드로 이루어지는 군에서 선택된다. 탄산 아미드는 ECL 증강 효과를 위한 개별적인 최적 농도를 갖는다. 실험에서 나타낸 바와 같이 (특히 표 2, 3 및 4) 숙련된 기술자는 시약 조성물 중의 선택된 탄산 아미드에 대한 적절한 농도를 선택하는 것을 인지하고 있다. 시약 조성물 중의 탄산 아미드에 대한 최적 농도를 결정하는 방법은 숙련된 기술자에게 알려져 있다.
한 구현예에서 시약 조성물은 탄산 아미드를 0.01 M 내지 0.25 M 의 농도로 포함한다. 추가적인 구현예에서 시약 조성물은 탄산 아미드를 0.01 M 내지 0.2 M 의 농도로 포함한다. 추가적인 구현예에서 시약 조성물은 탄산 아미드를 0.01 M 내지 0.1 M 의 농도로 포함한다.
시약 조성물의 공동반응물은 한 구현예에서 3 차 아민 (예를 들어, 트리프로필아민 (TPA)), 옥살레이트 및 퍼술페이트의 군에서 선택된다. 바람직한 구현예에서 공동반응물은 TPA 이다.
시약 조성물을 보관하는 경우 미생물 성장을 방지하는 보존제를 포함시키는 것이 이로울 수 있다. 추가적으로, 적합한 보존제는 장기간 보관 및 시약 조성물의 사용이 가능하도록 박테리아 및 진균 성장을 조절하는 것으로 확인된다. 본 발명에 따른 시약 조성물은 하나 이상의 보존제를 추가로 함유할 수 있다. 본 발명의 한 구현예에서 시약 조성물은 보존제 (보존 작용제) 를 포함한다.
한 구현예에서 본 발명은 i) 화학식 I 및 화학식 II 의 탄산 아미드 군에서 선택되는 화합물, ii) 하나 이상의 공동반응물 및 iii) 하나 이상의 보존제를 포함하는 ECL 측정용 시약 조성물에 관한 것이다.
바람직하게는, 보존제는 ECL 신호 생성에 대해 효과를 갖지 않거나 긍정적 효과를 갖는다. 옥사졸리딘 (예를 들어, Oxaban　A 또는 4,4 디메틸 옥사졸리딘), 아자이드 및 관련 보존제가 ECL 과 화합가능하다는 것이 당업자에게 알려져 있다. 0.01% 내지 1% 농도의 옥사졸리딘이 보통 시험 시약에 사용된다. 한 구현예에서 시약 조성물은 옥사졸리딘의 군에서 선택되는 보존제, 바람직하게는 Oxaban A 를 포함한다. 한 구현예에서 시약 조성물은 보존제를 0.01% 내지 1% 의 농도로 포함하고, 또 다른 구현예에서 시약 조성물은 보존제를 0.1% 내지 1% 의 농도로 포함한다. 둘 이상의 보존제의 혼합물을 사용하는 것이 또한 이로울 수 있다.
상기 이미 언급한 바와 같은 탄산 아미드 2-클로로아세트아미드 (CAA) 는, 이의 ECL 신호 증강 효과에 추가로 보존제 기능을 또한 갖는다.
상기 언급한 바와 같이, 본 발명의 한 양상은 ECL 신호 생성에 대해 영향을 갖지 않거나 긍정적 영향을 갖는 효과적인 보존제를 추가하기 위한 필요성을 포함한다. 적합한 무기 화합물로서 붕산 및/또는 붕산염이 박테리아 및 진균 성장을 효과적으로 조절하는 것으로 확인되었다. 놀랍게도 발명자는 ECL 측정용 시약 조성물에 존재하는 붕산 및/또는 붕산염이 ECL 신호 생성에 있어서 부정적 영향을 갖지 않는다는 것을 발견하였다. 보존제로서 붕산 또는 붕산염을 포함하는 시약 조성물이 ECL 신호 생성 과정에 대해 긍정적 효과를 갖는다는 것, 즉 특정 신호의 증가를 갖는다는 것이 놀랍게도 발견되었다. 추가적으로 그의 높은 활성 및 안전 위험성 또는 환경적 우려와 관련된 낮은 정도의 문제점이 유리하다. 붕산 또는 붕산염은 시약 조성물에서 흔히 사용되는 일부 다른 보존제와 달리, 할로겐을 갖지 않으며 포름알데히드를 방출하지 않는다. ECL 신호 생성에 있어서 존재하는 붕산으로의 결과를 실시예 부분, 예를 들어 실시예 2 에서 나타낸다.
한 구현예에서 본 발명은 i) 하나 이상의 공동반응물 및 iii) 붕산 및 붕산염으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 보존제를 포함하는 ECL 측정용 시약 조성물에 관한 것이다.
한 구현예에서 본 발명은 i) 하나 이상의 공동반응물 및 iii) 보존제 붕산을 포함하는 ECL 측정용 시약 조성물에 관한 것이다.
한 구현예에서 본 발명은 i) 하나 이상의 공동반응물 및 iii) 보존제 붕산염을 포함하는 ECL 측정용 시약 조성물에 관한 것이다.
한 구현예에서 본 발명은 i) 화학식 I 및 화학식 II 의 탄산 아미드 군에서 선택되는 화합물, ii) 하나 이상의 공동반응물, iii) 붕산 및 붕산염으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 보존제를 포함하는 ECL 측정용 시약 조성물에 관한 것이다.
한 구현예에서 본 발명에 따른 시약 조성물은 보존제로서 붕산 또는 붕산염을 0.1% 내지 5% 의 농도로, 바람직하게는 0.5% 내지 4% 의 농도로, 특히 바람직하게는 0.5% 내지 2% 의 농도로 포함한다.
바람직한 구현예에서 본 발명에 따른 시약 조성물은 보존제로서 붕산을 0.1% 내지 5% 의 농도로, 바람직하게는 0.5% 내지 4% 의 농도로, 특히 바람직하게는 0.5% 내지 2% 의 농도로 포함한다.
바람직한 구현예에서 본 발명에 따른 시약 조성물은 보존제로서 붕산염을 0.1% 내지 5% 의 농도로, 바람직하게는 0.5% 내지 4% 의 농도로, 특히 바람직하게는 0.5% 내지 2% 의 농도로 포함한다.
본 발명에 따른 시약 조성물은 추가로 기타 시험 성분을 임의로 포함한다. 기타 시험 성분은 하나 이상의 세제, 하나 이상의 신호 증강 화합물, pH 조절용 산성 및 염기성 작용제를 포함하는 완충제, 및 물로 이루어지는 군에서 선택된다.
한 구현예에서 본 발명은 i) 화학식 I 및 화학식 II 의 탄산 아미드 군에서 선택되는 화합물, ii) 하나 이상의 공동반응물, iii) 하나 이상의 보존제, iv) 완충제, v) 하나 이상의 세제, vi) 염 및/또는 소포제 및 vii) 임의의 기타 시험 성분을 포함하는 ECL 측정용 시약 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 시약 조성물에 대해 적합한 세제는 지방산 알코올 에톡실레이트, 예를 들어 폴리(에틸렌 글리콜)에테르, 예컨대 폴리도칸올 또는 다른 폴리(에틸렌 글리콜)에테르 (화학식 CXEOY, 식 중 X = 8 - 18 이고 Y = 2 - 9 임), 게나폴 (genapol) (이소트리데실폴리((에틸렌 글리콜 에테르)n), Plantaren® (알킬폴리글루코시드), 옥틸글루코시드 (옥틸-베타-D-글루코피라노시드) 뿐 아니라 양쪽 이온성 세제 예컨대 Zwittergent 3-12 또는 이의 혼합물로 이루어지는 군으로부터의 것들이다. 세제는 0.01% 내지 2% 범위의 농도로 사용된다. 최적 농도는 각각의 세제에 대해 용이하게 결정될 수 있다. 가장 적합한 농도는 0.05% 내지 1% 범위의 농도이다.
한 구현예에서 본 발명에 따른 시약 조성물은 폴리도칸올 또는 다른 폴리(에틸렌 글리콜)에테르 (화학식 CXEOY, 식 중 X = 8 - 18 이고 Y = 2 - 9 임), 옥틸글루코시드 (옥틸-베타-D-글루코피라노시드) 또는 양쪽 이온성 세제 예컨대 Zwittergent 3-12 또는 이의 혼합물로 이루어지는 군에서 선택되는 세제를 포함한다. 바람직한 구현예에서 시약 조성물은 폴리도칸올, 옥틸글루코시드 (옥틸-베타-D-글루코피라노시드) 및 Zwittergent 3-12, 또는 이의 혼합물로 이루어지는 군에서 선택되는 세제를 포함한다.
추가로, 전기화학발광 신호는 또한 pH 를 6.0 내지 8.0, 바람직하게는 6.0 내지 7.5, 특히 바람직하게는 6.2 내지 6.9 의 값으로 조정함으로써 증가될 수 있다. 이는 당업자에게 알려져 있는, 상기 범위에 대해 적합한 pH 완충제를 사용하여 통상적으로 수행될 수 있다. 한 구현예에서 시약 조성물에 대해 적합한 완충제는 KOH 및 인산 (H3PO4) 을 포함한다.
더 나아가, 상기 신호는 무기 염, 예를 들어 NaBr, NaCl, NaJ 를 포함하는 염을 추가함으로써 증가될 수 있다. 염, 특히 NaCl 은 1 mM 내지 1 M, 바람직하게는 10 mM 내지 100 mM, 가장 바람직하게는 10 mM 내지 50 mM 범위의 농도로 추가된다.
이는 버블 또는 거품의 생성을 방지하기 위해 특히 HTS 적용물에 있어서 이로울 수 있다. 이러한 이유로, 시약 조성물에 소포제를 추가하는 것이 바람직할 수 있다. 많은 시판 소포제 (Antifoams o-30, Antifoam 204, Antifoam A, Antifoam SE-15, Antifoam SO-25 및 Antifoam 289 포함) 가 본 발명에 따른 시약 조성물에 추가될 수 있다.
본 발명의 시약 조성물은 ECL 표지를 포함할 수 있다. ECL 표지는 종래의 ECL 표지일 수 있다. ECL 표지의 예는 트리스-바이피리딜-루테늄 (RuBpy), 및 금속이 예를 들어 VII 및 VIII 족 금속 (Re, Ru, Ir 및 Os 포함) 으로부터의 것인 다른 유기금속 화합물을 포함한다. 이들 ECL 표지는 분석물 특이적 시약을 전기화학발광기로 표지하거나, 분석물 자체를 전기화학발광기로 표지하기 위해 당업자에 의해 사용된다. 한 구현예에서 본 발명의 시약 조성물은 표지된 분석물 및/또는 표지된 분석물 특이적 시약을 함유하며, 이때 ECL 표지는 각각 US　5,310,687　(A) (BPRu = Ru(bpy)2-bpyCO-OSu), US　2003/0124572　(A1) (술포-BPRu NHS 에스테르), EP720614(A1) (Bpy2-Ru-bpy-CO-UEEK-korks.-OSu) 및 WO　2002/027317　(A2) (BPRu-(UE)-25-K 및 BPRu2-SK4) 에 개시된 ECL 표지로 이루어지는 군에서 선택된다.
시약 조성물에 사용된 시약 및 이의 혼합물은 사용 전 액체, 동결, 급속 동결, 기화 동결, 동결 건조, 기체, 고체 또는 건조 형태로 제공될 수 있다. 적어도 시약 조성물의 사용 전에 시약은 용매에 용해된다. 본 발명의 시약 조성물은 수용액일 것이다. 바람직한 구현예에서 시약은 물에 용해된다.
이들 개선된 제형은 고 민감도 검정에 있어서 특히 가치가 있다. 본 발명의 일부 구현예에서, ECL 검정의 성능은 시약 조성물과 전극 조성물의 최적 조합을 통해 보다 더 향상된다. 이러한 적합한 ECL 전극 조성물은 Ir, Pt 또는 탄소의 전극을 포함한다.
이들 유리한 조합물은 전술한 ECL 증강 탄산 아미드, 및 붕산 및 붕산염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적합한 보존제를 포함하는데, 이 둘 모두 향상된 특성을 갖는다. 이는 본 발명에 따른 개시된 시약 조성물을 사용하여 결합 표지로부터의 ECL 신호 대 ECL 배경 신호의 향상된 비 및 더 높은 동적 범위를 포함한다. 상기 증가된 민감도는 예를 들어 낮은 검출 한계에서 이득을 얻는 검정 (예를 들어, 트로포닌 T (Troponin T) 검정 (TNThs; 주문 번호: 05092744), 헤파티티스-B 외피 항원 검정 (HBeAg; 주문 번호: 11820583), 항-티로트로핀 수용체 검정 (항-TSHR; 주문 번호: 04388780) - 세부 사항에 대해서는 실시예 부분을 참조한다) 에서 중요하다.
시약 조성물의 이러한 향상된 제형은 보다 양호한 정확도를 제공하여 ECL 검정에 있어서 낮은 검출 한계를 초래할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 샘플, 시험-특이적 시약 및/또는 시험 시약의 필요한 부피 감소로 인한 비용 감소에 관한 것이다. 낮은 시약 부피에 대한 신호 손실은 본 발명에 따른 유리한 시약 조성물을 사용하여 보충될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 본 발명의 시약 조성물을 함유하는 향상된 시스템 및 장치 및/또는 본 발명의 향상된 방법을 수행하기 위해 조정된 향상된 시스템 및 장치에 관한 것이다.
ECL 신호 생성은 또한 상기 결과물이 단독으로 또는 서로 조합으로 사용되는 경우 향상될 수 있다.
시약 혼합물:
ECL 의 측정을 위해서, 본 발명에 따른 시약 조성물을 시약 혼합물을 형성하는 추가적인 화합물과 혼합할 수 있다. 한 구현예에서 본 발명은 i) 화학식 I 및 화학식 II 의 탄산 아미드 군에서 선택되는 화합물, ii) 하나 이상의 공동반응물, iii) 조사할 샘플 및 iv) 전기화학발광기로 표지된 하나 이상의 검출 시약을 포함하는 ECL 측정용 시약 조성물을 포함하는 ECL 측정용 시약 혼합물에 관한 것이다.
한 구현예에서 본 발명은 i) 화학식 I 및 화학식 II 의 탄산 아미드 군에서 선택되는 화합물, ii) 하나 이상의 공동반응물, iii) 하나 이상의 보존제, iv) 조사할 샘플 및 v) 전기화학발광기로 표지된 하나 이상의 검출 시약을 포함하는 ECL 측정용 시약 조성물을 포함하는 ECL 측정용 시약 혼합물에 관한 것이다.
한 구현예에서 본 발명은 i) 화학식 I 및 화학식 II 의 탄산 아미드 군에서 선택되는 화합물, ii) 하나 이상의 공동반응물, iii) 붕산 및 붕산염으로 이루어지는 군에서 선택되는 보존제, iv) 조사할 샘플 및 v) 전기화학발광기로 표지된 하나 이상의 검출 시약을 포함하는 ECL 측정용 시약 조성물을 포함하는 ECL 측정용 시약 혼합물에 관한 것이다.
추가의 구현예에서 본 발명은 i) 붕산 및 붕산염으로 이루어지는 군에서 선택되는 보존제, ii) 하나 이상의 공동반응물, iii) 조사할 샘플 및 iv) 전기화학발광기로 표지된 하나 이상의 검출 시약을 포함하는 ECL 측정용 시약 조성물을 포함하는 ECL 측정용 시약 혼합물에 관한 것이다. 바람직한 구현예에서 상기 시약 혼합물은 보존제 붕산을 포함한다. 바람직한 구현예에서 상기 시약 혼합물은 보존제 붕산염을 포함한다.
본 발명은 한 구현예에서 또한 i) 붕산 및 붕산염으로 이루어지는 군에서 선택되는 보존제, ii) 하나 이상의 공동반응물, iii) 조사할 샘플, iv) 세제, v) 완충제, vi) 전기화학발광기로 표지된 하나 이상의 검출 시약, 및 vii) 염 및/또는 소포제를 포함하는 ECL 측정용 시약 조성물을 포함하는 ECL 측정용 시약 혼합물에 관한 것이다.
추가로 바람직한 구현예에서 본 발명은 i) 화학식 I 및 화학식 II 의 탄산 아미드 군에서 선택되는 화합물, ii) 하나 이상의 공동반응물, iii) 붕산 및 붕산염으로 이루어지는 군에서 선택되는 보존제, iv) 조사할 샘플, v) 세제, vi) 완충제 및 vii) 전기화학발광기로 표지된 하나 이상의 검출 시약을 포함하는 ECL 측정용 시약 조성물을 포함하는 ECL 측정용 시약 혼합물에 관한 것이다..
시약 혼합물은 또한, 하나 이상의 세제 및 pH 조절용 완충제를 포함할 수 있다. 임의로는 상기 시약 혼합물은 염 및/또는 소포제를 포함할 수 있다.
시약 혼합물 중의 기타 시험 성분은 비표지된 분석물 특이적 시약, 분석물 동족체, 고체상 코팅 및 간섭을 감소시키는 물질로 이루어지는 군에서 선택된다.
용도:
본 발명의 한 양상은 전기화학발광 검출 방법을 수행하기 위한 본 발명의 향상된 시약 조성물 및/또는 향상된 시약 혼합물의 용도에 관한 것이다.
한 구현예에서 본 발명은 전기화학발광 검출을 수행하기 위한 화학식 I 및 화학식 II 의 군에서 선택되는 탄산 아미드의 용도에 관한 것이다. 한 구현예에서 본 발명은 전기화학발광 검출 방법 절차를 수행하기 위한 화학식 I 및 화학식 II 의 군에서 선택되는 탄산 아미드의 용도에 관한 것이다.
바람직한 구현예에서 본 발명은 전기화학발광 검출을 수행하기 위한 아세트아미드, 2-플루오로아세트아미드, 2-클로로아세트아미드, 프로판아미드, 2-클로로프로판아미드, 3-클로로프로판아미드, 부탄아미드 및 2-클로로부탄아미드로 이루어지는 군에서 선택되는 탄산 아미드의 용도에 관한 것이다.
또 다른 바람직한 구현예에서 본 발명은 전기화학발광 검출을 수행하기 위한 아세트아미드, 2-클로로아세트아미드, 프로판아미드 및 부탄아미드로 이루어지는 군에서 선택되는 탄산 아미드의 용도에 관한 것이다. 또 다른 구현예에서 본 발명은 전기화학발광 검출을 수행하기 위한 아세트아미드, 프로판아미드 및 부탄아미드로 이루어지는 군에서 선택되는 탄산 아미드의 용도에 관한 것이다.
한 구현예에서 본 발명은 ECL 측정을 위한, i) 화학식 I 및 화학식 II 의 탄산 아미드 군에서 선택되는 화합물, ii) 하나 이상의 공동반응물 및 iii) 하나 이상의 보존제를 포함하는 시약 조성물의 용도에 관한 것이다.
한 구현예에서 본 발명은 ECL 측정을 위한, i) 화학식 I 및 화학식 II 의 탄산 아미드 군에서 선택되는 화합물, ii) 하나 이상의 공동반응물 및 iii) 붕산 및 붕산염으로 이루어지는 군에서 선택되는 보존제를 포함하는 시약 조성물의 용도에 관한 것이다.
한 구현예에서 본 발명은 ECL 측정을 위한, i) 아세트아미드, 2-플루오로아세트아미드, 2-클로로아세트아미드, 프로판아미드, 2-클로로프로판아미드, 3-클로로프로판아미드, 부탄아미드 및 2-클로로부탄아미드로 이루어지는 군에서 선택되는 탄산 아미드 군에서 선택되는 화합물, ii) 하나 이상의 공동반응물 및 iii) 보존제를 포함하는 시약 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따른 시약 조성물은 한 구현예에서 ECL 측정 세포의 조건화 또는 재생성을 위해, 그리고 ECL 신호 측정을 위해 적절하다. 한 구현예에서 상기 시약 조성물은 조건화 용액으로서 사용된다. 한 구현예에서 본 발명에 따른 시약 조성물은 ECL 측정 세포의 조건화 또는 재생성에 사용된다. 한 구현예에서 아세트아미드, 2-플루오로아세트아미드, 2-클로로아세트아미드, 프로판아미드, 2-클로로프로판아미드, 3-클로로프로판아미드, 부탄아미드 및 2-클로로부탄아미드로 이루어지는 군에서 선택되는 탄산 아미드 군에서 선택되는 화합물을 포함하는 상기 시약 조성물은 ECL 측정 세포의 조건화 또는 재생성에 사용된다. 또 다른 구현예에서 아세트아미드, 프로판아미드 및 부탄아미드로 이루어지는 군에서 선택되는 탄산 아미드 군에서 선택되는 화합물을 포함하는 상기 시약 조성물은 ECL 측정 세포의 조건화 또는 재생성에 사용된다.
전기화학발광 검출 방법 수행에 사용하기 위해서, 시약 조성물은 추가적인 화합물, 예를 들어 조사할 샘플, 전기화학발광기를 갖는 하나 이상의 검출 시약 뿐 아니라 시약 혼합물을 형성하는 상기 방법을 지지하는 하기 언급한 기타 성분과 혼합될 수 있다.
한 구현예에서 본 발명은 i) 화학식 I 및 화학식 II 의 탄산 아미드 군에서 선택되는 화합물, ii) 하나 이상의 공동반응물 및 iii) 보존제를 포함하는 a) 시약 조성물, b) 조사할 샘플 및 c) 전기화학발광기로 표지된 하나 이상의 검출 시약을 포함하는 시약 혼합물의 ECL 측정에 있어서의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 i) 화학식 I 및 화학식 II 의 탄산 아미드 군에서 선택되는 화합물, ii) 하나 이상의 공동반응물 및 iii) 붕산 및 붕산염으로 이루어지는 군에서 선택되는 보존제를 포함하는 a) ECL 측정용 시약 조성물, b) 조사할 샘플 및 c) 전기화학발광기로 표지된 하나 이상의 검출 시약을 포함하는 시약 혼합물의 ECL 측정에 있어서의 용도에 관한 것이다.
추가적인 구현예에서 본 발명은 전기화학발광 검출을 측정하기 위한 붕산 또는 붕산염의 용도에 관한 것이다. 또한 한 구현예에서 본 발명은 전기화학발광 검출 방법 절차를 수행하기 위한 붕산 및 붕산염으로 이루어지는 군에서 선택되는 보존제의 용도에 관한 것이다.
한 구현예에서 본 발명은 ECL 측정에 있어서의 i) 붕산 및 붕산염의 군에서 선택되는 보존제 및 ii) 하나 이상의 공동반응물을 포함하는 a) ECL 측정용 시약 조성물, b) 조사할 샘플 및 c) 전기화학발광기로 표지된 하나 이상의 검출 시약을 포함하는 시약 혼합물의 용도에 관한 것이다.
또한 ECL 측정에 사용되는 시약 혼합물은 세제 및 pH 조절용 완충제로 이루어지는 군에서 선택되는 성분을 포함할 수 있다. 임의로는 사용한 시약 혼합물은 염 및/또는 소포제를 포함할 수 있다. 시약 혼합물 중의 기타 시험 성분은 비표지된 분석물 특이적 시약, 분석물 동족체, 고체상 코팅 및 간섭을 감소시키는 물질로 이루어지는 군에서 선택된다.
키트 :
본 발명의 한 양상은 하나 이상의 용기에, 본 발명의 시약 조성물의 하나 이상의 성분을 포함하는 키트에 관한 것이다. 이들 성분은 임의로는 추가적인 시약과 조합되어 본 발명의 시약 조성물을 형성할 수 있다. 상기 키트는 또한 한 구현예에서 추가적인 검정 관련 성분 예컨대 ECL 표지, ECL 표지 검정 시약, 희석제, 세척액, 단백질 변성 시약, 효소, 결합 시약, 검정 플레이트, 일회용품 등을 포함할 수 있다.
한 구현예에서 시약 조성물은 시약 조성물 함량에 관한 정보 및 적절한 보관 및 사용에 관한 지시사항으로 적절히 표시된 하나 이상의 유리 또는 플라스틱 용기에 함유된다. 시약 조성물 함량, 롯트 번호, 제조일, 유통기한에 관한 정보, 적절한 보관 및 사용에 관한 지시사항은 또한 유리 또는 플라스틱 용기 상에 위치한 RFID 칩에 저장될 수 있다. 이러한 RFID 칩에 저장된 정보는 RFID 판독 장치에 연결된 안테나에 의해 판독될 수 있으며 조절 수단에서 추가 처리될 수 있다.
한 구현예에서 시약 조성물의 일부 또는 모든 성분은 한 구현예에서 액체 또는 건조 상태로 저장될 수 있다.
한 구현예에서 본 발명은 i) 화학식 I 및 화학식 II 의 탄산 아미드 군에서 선택되는 화합물 및 ii) 하나 이상의 공동반응물을 포함하는 ECL 측정용 시약 조성물을 함유하는, ECL 측정용 키트에 관한 것이다.
바람직한 구현예에서 본 발명은 i) 아세트아미드, 2-플루오로아세트아미드, 2-클로로아세트아미드, 프로판아미드, 2-클로로프로판아미드, 3-클로로프로판아미드, 부탄아미드 및 2-클로로부탄아미드로 이루어지는 군에서 선택되는 탄산 아미드 및 ii) 하나 이상의 공동반응물을 포함하는 ECL 측정용 시약 조성물을 함유하는, ECL 측정용 키트에 관한 것이다.
또 다른 바람직한 구현예에서 본 발명은 i) 아세트아미드, 2-클로로아세트아미드, 프로판아미드 및 부탄아미드로 이루어지는 군에서 선택되는 탄산 아미드 및 ii) 하나 이상의 공동반응물을 포함하는 ECL 측정용 시약 조성물을 함유하는, ECL 측정용 키트에 관한 것이다.
한 구현예에서 본 발명은 i) 화학식 I 및 화학식 II 의 탄산 아미드 군에서 선택되는 화합물, ii) 하나 이상의 공동반응물 및 iii) 보존제를 포함하는 ECL 측정용 시약 조성물을 함유하는, ECL 측정용 키트에 관한 것이다.
바람직한 구현예에서 본 발명은 i) 화학식 I 및 화학식 II 의 탄산 아미드 군에서 선택되는 화합물, ii) 하나 이상의 공동반응물 및 iii) 붕산 및 붕산염으로 이루어지는 군에서 선택되는 보존제를 포함하는 ECL 측정용 시약 조성물을 함유하는, ECL 측정용 키트에 관한 것이다.
또 다른 바람직한 구현예에서 본 발명은 i) 아세트아미드, 2-플루오로아세트아미드, 2-클로로아세트아미드, 프로판아미드, 2-클로로프로판아미드, 3-클로로프로판아미드, 부탄아미드 및 2-클로로부탄아미드로 이루어지는 군에서 선택되는 탄산 아미드, ii) 하나 이상의 공동반응물 및 iii) 붕산 및 붕산염으로 이루어지는 군에서 선택되는 보존제를 포함하는 ECL 측정용 시약 조성물을 함유하는, ECL 측정용 키트에 관한 것이다.
또 다른 바람직한 구현예에서 본 발명은 i) 아세트아미드, 2-클로로아세트아미드, 프로판아미드 및 부탄아미드로 이루어지는 군에서 선택되는 탄산 아미드, ii) 하나 이상의 공동반응물 및 iii) 붕산 및 붕산염으로 이루어지는 군에서 선택되는 보존제를 포함하는 ECL 측정용 시약 조성물을 함유하는, ECL 측정용 키트에 관한 것이다.
한 구현예에서 본 발명은 적어도 i) 붕산 및 붕산염으로 이루어지는 군에서 선택되는 보존제 및 ii) 하나 이상의 공동반응물을 포함하는 ECL 측정용 시약 조성물을 함유하는, ECL 측정용 키트에 관한 것이다.
전술한 측정법 자체는 공지된 절차를 이미 상당히 향상시킨다. 또한, 이들 측정법을 조합하여, 분석물 검출 검정의 동적 측정 범위 및/또는 민감도를 추가로 상당히 증가시킬 수 있다.
하기 실시예 및 도면을 제공하여 본 발명의 이해를 도우며, 이의 참된 범주를 첨부된 청구항에 나타낸다. 설명한 절차에 있어서 본 발명의 취지를 벗어나지 않고 변형을 가할 수 있다는 것이 이해된다.
도면의 간단한 설명
도 1: 0.001 M 내지 0.25 M 의 프로판아미드 농도 (X 축) 로의 측정 결과; △인공 검정 (인공 검정 - 검정 완충액 배경), 검정 완충액 배경 및 자유 표지 검정의 측정값의 상대 회수율 (참조 %) 을 나타낸다 (Y 축). 세부 사항에 대해서는 실시예 1 을 참조한다.
도 2: 0.001 M 내지 1 M 의 2-클로로아세트아미드 농도 (X 축) 로의 측정 결과; △인공 검정 (인공 검정 - 검정 완충액 배경), 검정 완충액 배경 및 자유 표지 검정의 측정값의 상대 회수율 (참조 %) 을 나타낸다 (Y 축). 세부 사항에 대해서는 실시예 1 을 참조한다.
도 3: 0.001 M 내지 1 M 의 부탄아미드 농도 (X 축) 로의 측정 결과; △인공 검정 (인공 검정 - 검정 완충액 배경), 검정 완충액 배경 및 자유 표지 검정의 측정값의 상대 회수율 (참조 %) 을 나타낸다 (Y 축). 세부 사항에 대해서는 실시예 1 을 참조한다.
도 4: 0.001 M 내지 1 M 의 아세트아미드 농도 (X 축) 로의 측정 결과; △인공 검정 (인공 검정 - 검정 완충액 배경), 검정 완충액 배경 및 자유 표지 검정의 측정값의 상대 회수율 (참조 %) 을 나타낸다 (Y 축). 세부 사항에 대해서는 실시예 1 을 참조한다.
도 5: 0 내지 5% 의 붕산 농도 (X 축) 로의 측정 결과; 인공 검정을 높은 특정 신호에 대한 예로서 사용하였고; 저 수준 교정기로서 TSH 교정기 1 은 배경 신호를 제공하고 (TSH Cal 1); TSH 교정기 2 는 높은 검출 수준에서 신호를 제공한다 (TSH Cal 2). 결과를 붕산을 추가하지 않은 참조 시약 조성물의 % 로서 도표화한다. 세부 사항에 대해서는 실시예 2 를 참조한다.
실시예 1
탄산 아미드를 갖는 검정 완충액 (시약 조성물) 을 사용하는 ECL 측정
하기 언급한 검정에 대해 이용가능한 프로토콜을 사용하여 Roche Elecsys® 2010 장치를 사용하여 ECL 측정을 실행하였다.
표 2, 3 및 4 에서 나타낸 바와 같은 탄산 아미드 군에서 선택되는 다양한 농도의 화합물을 하기의 검정 완충액에 추가하였다:
180 mM 트리프로필아민 (TPA)
0.1% 폴리도칸올
300 mM 인산 완충액
최종 pH 를 KOH/H3PO4 를 사용하여 pH 6.8 로 조정하였다. 검정 완충액을 또한 블랭크 값으로서 사용하였다.
탄산 아미드 군에서 선택되는 화합물 (탄산 아미드의 화학 구조식을 표 1 에 나타냄) 을 표시 농도에서 검정 완충액 (시약 조성물) 에 추가하였다. 이들 화합물이 없는 검정 완충액을 사용한 측정에 대해 신호 회수율로서 결과를 나타낸다.
표 2 에서 나타낸 농도로 탄산 아미드를 함유하는 검정 완충액으로 검정 완충액 배경 측정을 수행하였다. 100% 밑의 값은 표시 농도에서의 선택된 탄산 아미드의 추가에 의한 감소된 ECL 배경 신호를 나타낸다. ECL 표지의 부재 하에 배경 전기화학발광을 감소시키는 것은 낮은 검출 수준에서 특히 유리하며, 이때 신호 대 배경 비 (= 신호 대 노이즈 비) 를 증가시키는 것은 검정의 민감도를 크게 향상시킨다.
표 2:
Figure 112013033797153-pct00009
n.d. = 미측정
유사한 실험에서 자유 표지의 신호를 측정하였다. 자유 표지 값은 미세입자 (검정 완충액 중 10 nM RuBpy) 의 부재 하에 자유 ECL 표지를 함유하는 용액에 의해 생성된 신호를 나타낸다. 상기 값은 임의의 추가적 화합물을 갖지 않는 검정 완충액에 대해 표 3 에서 % 로 언급된다. 이러한 검정 포맷은 또한 동질 측정 또는 동질 검정 포맷으로서 알려져 있다. 100% 를 넘는 값은 선택된 농도에서의 선택된 탄산 아미드의 추가에 의한 증강된 ECL 신호를 나타낸다. 결과를 표 3 에 나타낸다.
표 3:
Figure 112013033797153-pct00010
n.d. = 미측정
추가적으로, 비드를 포함하는 단순화된 검정을 사용하여 값을 측정하였다. 이러한 인공 검정은 높은 특정 신호를 위해 RuBpy 표지 미세입자를 포함하는 검정이다. 이러한 검정 포맷은 또한 이종 측정 또는 이종 검정 포맷으로서 알려져 있다. 특정 인공 검정-신호 및 배경 신호 (검정 완충액 배경) 사이의 차이를, △인공 검정에서 나타낸 바와 같이 추가적인 화합물을 갖는 상기 기재한 바와 같은 검정 완충액을 사용하여 임의의 추가적 화합물을 갖지 않는 검정 완충액에 대해 % 로 나타낸다. 100% 를 넘는 값은 선택된 농도에서의 선택된 탄산 아미드의 추가에 의한 증강된 ECL 신호를 나타낸다. 결과를 표 4 에 나타낸다.
표 4:
Figure 112013033797153-pct00011
n.d. = 미측정
도 1 에서 표 2, 3 및 4 에서 나타낸 바와 같은 프로판아미드에 대한 결과를 포함하는 그래프를 표시한다. 도 2 에서 표 2, 3 및 4 에서 나타낸 바와 같은 2-클로로아세트아미드에 대한 결과를 포함하는 그래프를 표시한다. 도 3 에서 표 2, 3 및 4 에서 나타낸 바와 같은 부탄아미드에 대한 결과를 포함하는 그래프를 표시한다. 도 4 에서 표 2, 3 및 4 에서 나타낸 바와 같은 아세트아미드에 대한 결과를 포함하는 그래프를 표시한다.
실시예 2
신호 증강 보존제로서의 붕산
하기 언급한 검정에 대해 추천된 프로토콜을 사용하여 Roche Elecsys® 2010 장치를 사용하여 ECL 측정을 실행하였다.
하기의 ECL 검정 완충액을 사용하여 블랭크 값을 측정하였다:
180 mM 트리프로필아민 (TPA)
0.1% 폴리도칸올
0.1% Oxaban A
300 mM 인산 완충액
상기 검정 완충액에 증가량의 붕산을 표시한 바와 같이 추가하였다. 최종 pH 를 KOH/H3PO4 를 사용하여 pH 6.8 로 조정하였다.
표 5 에서 나타낸 농도로 붕산을 함유하는 검정 완충액으로의 검정 완충액 배경 측정을 수행하였다. 자유 표지 값은 미세 입자 (검정 완충액 중 10 nM RuBpy, 동질 측정) 의 부재 하 자유 ECL 표지를 함유하는 용액에 의해 생성된 신호를 임의의 추가적인 화합물을 갖지 않는 검정 완충액에 대해 % 로 나타낸다. 인공 검정은 높은 특정 신호를 위해 RuBpy 표지 미세입자를 포함하는 검정이다. 시판되는 시험관내 진단 검정으로서, Elecsys® TSH 검정 (Elecsys® 에 대한 티로트로핀 검정; 주문 번호: 11731459) 을 사용하여 △TSH 를 측정하였다. 저 수준 교정기로서 TSH 교정기 1 (TSH Cal 세트; 주문 번호: 04738551) (분석물이 존재하지 않음) 을 TSH 검정에서 사용하여 배경 신호를 제공하고 (TSH Cal 1); TSH 교정기 2 를 TSH 검정에서 사용하여 높은 신호 값을 제공하였다 (TSH Cal 2).
인공 검정, TSH Cal 1 및 TSH Cal 2 에 대한 결과를 붕산을 추가하지 않은 참조 검정 완충액의 % 로 상대 회수율로서 도 5 에서 도표화한다.
특히 하기 측정을 수행하였다:
표 5:
Figure 112013033797153-pct00012
검정 완충액에서의 보존제로서 붕산의 추가는 특히 인공 검정 및 TSH Cal 2 의 측정에서 특정 이종 신호를 향상시킨다.
실시예 3
Elecsys ® 검정의 낮은 검출 한계에 대한 프로판아미드 및 붕산 함유 검정 완충액의 효과
여러 시판 시험관내 진단 검정 (HBeAg: Roche 주문 번호: 11820583, 항-TSHR: Roche 주문 번호: 04388780, TNThs: Roche 주문 번호: 05092744) 으로의 낮은 검출 한계를 측정하여 2 개 검정 완충액 제제를 비교하였다.
검정 완충액 A:
180 mM TPA, 0.1 % 폴리도칸올, 300 mM 인산 완충액, 0.1% Oxaban A
검정 완충액 B:
180 mM TPA, 0.1% 폴리도칸올, 50 mM 프로판아미드, 300 mM 인산 완충액, 1% 붕산
검정 완충액 A 및 B 모두의 최종 pH 를 KOH/H3PO4 를 사용하여 pH 6.8 로 조정하였다.
상기 언급한 3 개 시판 검정을 분석하여, 매우 낮은 분석물 농도를 검출하는 검정 성능에 대한 탄산 아미드, 프로판아미드 및 보존제 붕산의 효과를 나타내었다.
검정을 Roche Elecsys® 분석기에서 측정하고 그의 포장 삽입물에 기재된 바와 같이 교정하였다. 낮은 검출 한계를 계산하기 위해서 분석물을 갖지 않는 샘플 (HBeAg, 항-TSHR) 또는 매우 낮은 분석물 농도를 갖는 샘플 (TNThs) 의 신호를 측정하였다. 21 배 측정의 표준 편차를 계산하고, 2 (2SD) 또는 3 (3SD) 을 곱하고, 신호 평균값에 더하거나 (HBeAg, TNThs) 뺐다 (항-TSHR, 경쟁적 검정). 계산된 신호의 상응하는 농도를 이후 각 검정에 대한 교정 곡선을 사용하여 측정하였다. 낮은 분석물 농도를 갖는 샘플 (TNThs) 에 대해, 샘플의 분석물 농도를 이들 계산된 농도에서 뺐다.
본 발명에 따른 탄산 아미드를 함유할 뿐 아니라 보존제 기능을 또한 갖는 붕산을 함유하는 향상된 시약 조성물로부터의 3 개 검정은 이익을 얻는다. HBeAg, 항-TSHR 및 TNThs 검정에 대한 결과를 각각 하기 표 6, 7 및 8 에 나타낸다.
표 6:
Figure 112013033797153-pct00013
표 7:
Figure 112013033797153-pct00014
표 8:
Figure 112013033797153-pct00015

Claims (15)

  1. 하기 단계를 포함하는, 전기화학발광 검출을 통한 샘플 중의 분석물 측정 방법:
    a) 전기화학발광기로 표지된 검출 시약과 함께 샘플을 인큐베이션하는 단계,
    b) 분석물-결합 및 분석물-불포함 표지된 검출 시약을 분리하는 단계,
    c) 분리한 분석물-결합 표지된 검출 시약을;
    i) 하나 이상의 공동반응물, 및
    ii) 하기 화학식 I 및 화학식 II 의 탄산 아미드 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물:
    화학식 I
    Figure 112017049082690-pct00016

    [식 중,
    R1 = CH3, CH2F, CH2Cl, CH2CH3, CHClCH3, CH2CH2Cl, C(CH3)2CH3, CH2CH2CH3, CClHCH2CH3 또는 CH2CH2CH2CH3 이고,
    R2 = H 이고,
    R3 = H 임],
    화학식 II
    Figure 112017049082690-pct00017

    을 포함하는 시약 조성물과 함께 인큐베이션하는 단계로서,
    이때, 상기 공동반응물이 3 차 아민, 옥살레이트 및 퍼술페이트로 이루어지는 군에서 선택됨,
    d) 발광의 방출을 전기화학적으로 촉발시키는 단계, 및
    e) 전기화학발광 (ECL) 신호를 측정함으로써 분석물을 측정하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, ECL 을 사용하는 샘플 중의 분석물 측정이 수용액 중에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 탄산 아미드가 아세트아미드, 2-플루오로아세트아미드, 2-클로로아세트아미드, 프로판아미드, 2-클로로프로판아미드, 3-클로로프로판아미드, 부탄아미드 및 2-클로로부탄아미드로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 시약 조성물이 탄산 아미드를 0.01 M 내지 0.25 M 의 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 1c) 의 시약 조성물이 보존제를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 단계 1c) 의 시약 조성물이 보존제를 0.1% 내지 5% 의 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 5 항에 있어서, 단계 1c) 의 시약 조성물이 붕산 및 붕산염으로 이루어지는 군에서 선택되는 보존제를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 1c) 의 시약 조성물이 세제 및 완충제를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 단계 1c) 의 시약 조성물이 염 및/또는 소포제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 하기를 포함하는 ECL 측정용 시약 조성물로서:
    i) 하기 화학식 I 및 화학식 II 의 탄산 아미드 군에서 선택되는 화합물:
    화학식 I
    Figure 112017049082690-pct00023

    [식 중,
    R1 = CH3, CH2F, CH2Cl, CH2CH3, CHClCH3, CH2CH2Cl, C(CH3)2CH3, CH2CH2CH3, CClHCH2CH3 또는 CH2CH2CH2CH3 이고,
    R2 = H 이고,
    R3 = H 임],
    화학식 II
    Figure 112017049082690-pct00024
    , 및
    ii) 하나 이상의 공동반응물,
    이때, 상기 공동반응물이 3 차 아민, 옥살레이트 및 퍼술페이트로 이루어지는 군에서 선택되는 시약 조성물.
  11. 제 10 항에 있어서, 붕산 및 붕산염으로 이루어지는 군에서 선택되는 보존제를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 시약 조성물.
  12. 제 10 항 또는 제 11 항에 따른 시약 조성물, 조사할 샘플 및 전기화학발광기로 표지된 하나 이상의 검출 시약을 포함하는 ECL 측정용 시약 혼합물.
  13. 제 10 항 또는 제 11 항에 따른 시약 조성물을 함유하는 ECL 측정용 키트.
  14. 삭제
  15. 삭제
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