BR112013007614B1 - método para medir um analito, composição reagente, mistura reagente, uso de uma composição reagente, uso de uma amida de ácido carbônico e kit - Google Patents

Abstract

MÉTODO PARA MEDIR UM ANALITO, COMPOSIÇÃO REAGENTE, MISTURA REAGENTE, USO DE UMA COMPOSIÇÃO REAGENTE, USO DE UMA AMIDA DE ÁCIDO CARBÔNICO E KIT [001]A invenção refere-se a métodos para a detecção de um analito em uma amostra por eletroquimioluminescência com o uso de novas composições de reagentes. São divulgadas as novas composições de reagentes, kits de reagentes para medir eletroquimioluminescência (ECL) e métodos de detecção de eletroquimioluminescência com o uso das novas composições de reagentes. Em particular, a invenção refere-se ao uso de novas combinações de compostos que podem ser usadas nas ditas medições para fornecer desempenho aprimorado do ensaio.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A invenção refere-se a métodos para a detecção de um analito em uma amostra por eletroquimioluminescência com o uso de novas composições de reagentes. São divulgadas as novas composições de reagentes, kits de reagentes para medir eletroquimioluminescência (ECL) e métodos de detecção de eletroquimioluminescência com o uso das novas composições de reagentes. Em particular, a invenção refere-se ao uso de novas combinações de compostos que podem ser usadas nas ditas medições para fornecer desempenho aprimorado do ensaio.

ANTECEDENTES E TÉCNICA ANTERIOR

[002] Os métodos para medir fenômenos eletroquimioluminescentes já são conhecidos há alguns anos. Esses métodos fazem uso da capacidade de complexos de metais especiais para atingir, por meio de oxidação, um estado excitado, a partir do qual eles decaem ao estado de energia mínima, emitindo eletroquimioluminescência. Para revisão, consulte Richter, M.M., Chem. Rev. 104 (2004) 3003-3036.

[003] Nesse momento, há uma série de instrumentos disponíveis comercialmente que utilizam eletroquimioluminescência (ECL) para medições analíticas. Espécies que podem ser induzidas para emitir ECL (espécies de ECL ativas) têm sido usadas como marcadores de ECL. Exemplos de marcadores de ECL incluem compostos organometálicos, como o componente tris-bipiridil-rutênio (RuBpy) onde o metal é, por exemplo, dos metais dos grupos VII e VIII, incluindo Re, Ru, Ir e Os. Espécies que reagem com o marcador de ECL no processo de ECL são citadas no presente pedido como correagentes de ECL. Os correagentes comumente usados para ECL incluem as aminas terciárias (por exemplo,  tripropilamina (TPA)), oxalato e persulfato. A luz é gerada por marcadores ou ligantes de ECL; a participação do reagente de ligação em uma interação de ligação pode ser monitorada por medição de ECL emitida a partir do marcador de ECL. Alternativamente, o sinal de ECL do composto de ECL ativo pode ser indicativo do meio químico (consulte, por exemplo, patentes US 5.641.623 e 5.643.713, que descrevem os ensaios de ECL que monitoram a presença ou destruição dos correagentes de ECL especiais). Para mais informação sobre ECL, marcadores de ECL, ensaios de ECL e instrumentação para conduzir ensaios de ECL, consulte patentes US 5.093.268; 5.147.806; 5.240.863; 5.308.754; 5.324.457; 5.591.581; 5.597.910; 5.679.519; 5.705.402; 5.731.147; 5.786.141; 5.846.485; 5.866.434; 6.066.448; 6.136.268 e 6.207.369, e patente EP 0 441 875 e PCT publicado documentos WO97/36931; WO98/12539; WO99/14599; WO99/32662; WO99/58962; WO99/63347; WO00/03233 e WO98/57154.

[004] Instrumentos de ECL disponíveis comercialmente demonstraram desempenho excepcional. Eles tornaram-se amplamente usados por razões que incluem sensibilidade excelente, faixa dinâmica, precisão e tolerância de matrizes complexas de amostra. A instrumentação disponível comercialmente usa designs baseados em células de fluxo com células de fluxo reutilizáveis permanentes.

[005] Volumes de amostras disponíveis para a determinação de analitos são com frequência limitados, e mais e mais analitos diferentes têm sido determinados fora de uma amostra. Também o desenvolvimento de equipamentos de laboratório mais rápidos para automação de ensaio e métodos mais sensíveis para a detecção de analitos são necessários. Isso leva à necessidade de ensaios e métodos eletroquimioluminescentes de alta sensibilidade e especificidade, para a realização deles. Além disso, melhorias associadas com os perigos de segurança ou preocupações ambientais devem ser consideradas.

[006] No entanto, a detecção ainda mais sensível de analitos seria de grande vantagem. Dessa forma, o objetivo da presente invenção foi melhorar os ditos métodos conhecidos e composições de reagentes, especialmente, em relação ao aprimoramento do sinal de ECL e uma detecção de analitos melhorada em combinação com procedimentos eletroquimioluminescentes. Seria desejável encontrar novos reagentes aprimoradores de sinal e/ou compostos com desempenho melhorado em ensaios eletroquimioluminescentes.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[007] A presente invenção em uma realização refere-se a um método para medir um analito em uma amostra através de detecção eletroquimioluminescente, que compreende as etapas de a) incubar a amostra com um reagente de detecção marcado com um grupo eletroquimioluminescente, b) separar o analito ligado e analito livre marcado com reagente de detecção, c) incubar do reagente de detecção separado marcado com uma composição de reagentes que compreende i) pelo menos um correagente e ii) pelo menos um composto selecionado a partir do grupo de amidas de ácido carbônico de Fórmula I e Fórmula II,

[008] Fórmula I,

com R1 = CH3, CH2F, CH2Cl, CH2CH3, CHClCH3, CH2CH2Cl, C(CH3)2CH3, CH2CH2CH3, CClHCH2CH3 ou CH2CH2CH2CH3, com R2 = H, e com R3 = H, Fórmula II, 

d) acionar eletroquimicamente a liberação de luminescência, e e) determinar o sinal de eletroquimioluminescência (ECL), através disso, medindo o analito.

[009] A presente invenção refere-se também a uma composição de reagentes para determinar ECL, que compreende i) um composto selecionado a partir do grupo de amidas de ácido carbônico de Fórmula I e Fórmula II e ii) pelo menos um correagente.

[010] A presente invenção refere-se também a uma mistura de reagentes, que compreende uma composição de reagentes para determinar ECL, que compreende i) um composto selecionado a partir do grupo de amidas de ácido carbônico de Fórmula I e Fórmula II e ii) pelo menos um correagente, uma amostra a ser investigada, e pelo menos um reagente de detecção marcado com um grupo eletroquimioluminescente.

[011] A presente invenção refere-se também a um kit para medir ECL, o qual contém uma composição de reagentes para determinar ECL, que compreende i) um composto selecionado a partir do grupo de amidas de ácido carbônico de Fórmula I e Fórmula II e ii) pelo menos um correagente.

[012] A invenção, bem como objetos adicionais, características e vantagens da mesma serão compreendidas de maneira mais completa a partir da descrição detalhada de certas realizações preferenciais a seguir.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[013] A prática da presente invenção empregará, a menos que indicado de outra forma, técnicas convencionais de biologia molecular (incluindo técnicas recombinantes), microbiologia, biologia celular, bioquímica e imunologia,  que estão dentro das técnicas do assunto. Essas técnicas são totalmente explicadas na literatura, como, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, segunda edição (Sambrook et al., 1989); “Oligonucleotide Synthesis” (M. J. Gait, ed., 1984); “Animal Cell Culture” (R. I. Freshney, ed., 1987); “Methods in Enzymology” (Academic Press, Inc.); “Current Protocols in Molecular Biology” (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, e periódicos atuais); “PCR: The Polymerase Chain Reaction”, (Mullis et al., eds., 1994).

[014] A menos que definido de outra forma, termos técnicos e científicos usados no presente pedido têm o mesmo significado como geralmente entendido por um técnico no assunto para o qual pertence essa invenção. Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2aed., J. Wiley & Sons, Nova York (1994); March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4aed., John Wiley & Sons, Nova York (1992); Lewin, B., Genes V, publicado por Oxford University Press (1994), ISBN 0-19-854287 9); Kendrew, J. et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Science Ltd. (1994), ISBN 0-632-02182-9); e Meyers, R.A. (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc. (1995), ISBN 1-56081-569 8) fornece a um técnico no assunto um guia geral para muitos dos termos usados no presente pedido.

[015] Todas as referências citadas no presente pedido, incluindo pedidos e publicações de patentes, são integralmente incorporadas ao presente pedido como referência.

DEFINIÇÕES

[016] Como usado no presente pedido, cada um dos termos a seguir tem o significado associado a ele nessa seção.

[017] Os artigos “um” e “uma” são usados no presente pedido para referir-se a um ou mais de um (isto é, a pelo menos um) objeto gramatical do artigo. A título de exemplo, “um analito” significa um analito ou mais de um analito. O termo “pelo menos” é usado para indicar que, opcionalmente, um ou mais objetos adicionais podem estar presentes. A título de exemplo, um ensaio que compreende pelo menos duas áreas discretas podem opcionalmente compreender duas ou mais áreas testes discretas.

[018] A expressão “um ou mais” denota 1 a 50, preferencialmente 1 a 20, também preferencialmente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12 ou 15.

[019] Exemplos de “amidas de ácido carbônico” e suas estruturas químicas estão listadas na Tabela 1. TABELA 1 As AMIDAS DE ÁCIDO CARBÔNICO TÊM AS ESTRUTURAS COMUNS A SEGUIR, A MENOS QUE INDICADO DE OUTRO MODO

[020] Fórmula I, como usado no presente pedido, denota

com R1 = CH3, CH2F, CH2Cl, CH2CH3, CHClCH3, CH2CH2Cl, C(CH3)2CH3, CH2CH2CH3, CClHCH2CH3 ou CH2CH2CH2CH3, com R2 = H, e com R3 = H.

[021] Fórmula II, como usado no presente pedido, denota a estrutura a seguir, chamada 2-pirrolidinona, representada na Tabela 1 como N° 24

[022] As realizações da invenção podem ser usadas para testar uma variedade de amostras que podem conter um analito ou atividade de interesse. Essas amostras podem estar sob forma sólida, líquida, gasosa, de emulsão ou de suspensão. Elas podem ser, mas não se limitam a amostras contendo ou derivadas de humanos ou animais, por exemplo, células (vivas ou mortas) e produtos derivados de células, células imortalizadas, fragmentos celulares, frações celulares, lisados celulares, organelas, membranas celulares, hibridomas, sobrenadantes de cultura celular (incluindo sobrenadantes a partir de organismos produtores de anticorpos, como hibridomas), água residual ou potável, alimento, bebidas, composições farmacêuticas, sangue, soro, plasma, cabelo, suor, urina, fezes, saliva, tecido, biópsia, efluente, amostras separadas e/ou fracionadas, líquidos separados e/ou fracionados, órgãos, plantas, partes de plantas, subprodutos de plantas, solo, água, suprimento de água, fontes de água, resíduo filtrado a partir de fluidos (gás e líquido), esfregaços, materiais absorventes, géis, citoesqueleto, amostras não fracionadas, lisados celulares não fracionados, núcleo/núcleos de células, frações nucleares, produtos químicos, soluções químicas, componentes biológicos estruturais, componentes esqueléticos (ligamentos, tendões), componentes esqueléticos separados e/ou fracionados, frações e/ou separações de cabelo, pele, amostras de pele, frações de pele, derme, endoderme, células eucariontes, células procariontes, fungos, leveduras, células imunológicas, drogas, drogas terapêuticas, óleos, extratos, muco, esgoto, amostras do meio ambiente, solventes orgânicos ou ar. Em uma realização, a amostra também pode compreeder, por exemplo, água, álcoois, acetonitrila, dimetilsulfóxido, dimetil formamida, n-metil-pirrolidona, metanol ou outros solventes orgânicos.

[023] Uma “amostra”, como usado no presente pedido, é obtida para o propósito de uma avaliação in vitro. Como o técnico no assunto apreciará, qualquer uma dessas avaliações é feita in vitro. Se a amostra é uma amostra de paciente, ela será descartada posteriormente. A amostra de paciente é somente usada para o método diagnóstico in vitro da invenção e o material da amostra de paciente não é transferido de volta ao corpo do paciente.

[024] Analitos que podem ser medidos incluem, mas não se limitam a células inteiras, antígenos de superfície celular, complexos proteicos, fatores e/ou componentes de sinalização celular, segundo mensageiros, fatores e/ou componentes de sinalização de segundo mensageiros, partículas subcelulares (por exemplo, organelas ou fragmentos membranosos), vírus, príons, ácaros do pó ou fragmentos dos mesmos, viroides, fatores imunológicos, anticorpos, fragmentos de anticorpos, antígenos, haptenos, ácidos graxos, ácidos nucleicos (e análogos sintéticos), ribossomos, proteínas (e análogos sintéticos), lipoproteínas, polissacarídeos, inibidores, cofatores, receptores celulares, ligantes celulares, lipopolissacarídeos, glicoproteínas, peptídeos, polipeptídeos, enzimas, substratos de enzima, produtos de enzima, enzimas processadoras de ácido nucleico (por exemplo, polimerases, nucleases, integrases, ligases, helicases, telomerases, etc.), enzimas processadoras de proteínas (por exemplo, proteases, quinases, fosfatases de proteína, ligases da proteína ubiquitina, etc.), metabólitos celulares, fatores endócrinos, fatores parácrinos, fatores autócrinos, citocinas, hormônios, agentes farmacológicos, drogas, drogas terapêuticas, moléculas orgânicas sintéticas, moléculas organometálicas, tranquilizantes, barbitúricos, alcaloides, esteroides, vitaminas, aminoácidos, açúcares, lectinas, proteínas recombinantes e derivadas, biotina, avidina, estreptavidina ou moléculas inorgânicas presentes na amostra.

[025] As células inteiras podem ser de animal, planta ou bactéria, e podem ser viáveis ou mortas. Exemplos incluem patógenos de planta, como fungos e nemátodes. O termo “partículas subcelulares” tem a intenção de englobar, por exemplo, organelas subcelulares, partículas membranosas a partir de células afetadas, fragmentos de parede celular, ribossomos, complexos multienzimáticos e outras partículas que podem ser derivadas a partir de organismos vivos. Os ácidos nucleicos incluem, por exemplo, DNA cromossomal, DNA plasmidial, DNA viral e DNA recombinante derivado a partir de múltiplas fontes. Os ácidos nucleicos também incluem RNAs, por exemplo, RNAs mensageiros, RNAs ribossomais e RNAs de transferência. Os polipeptídeos incluem, por exemplo, enzimas, proteínas de transporte, proteínas de receptor e proteínas estruturais, como proteínas de revestimento viral. Os polipeptídeos preferenciais são enzimas e anticorpos. Os polipeptídeos particularmente preferenciais são anticorpos monoclonais. Os hormônios incluem, por exemplo, insulina e hormônio tireoidiano T4. Os agentes farmacológicos incluem, por exemplo, glicosídeos cardíacos. Certamente, substâncias sintéticas que se assemelham quimicamente a materiais biológicos, como os polipeptídeos sintéticos, ácidos nucleicos sintéticos, e membranas, vesículas e lipossomos sintéticos, estão incluídas dentro do escopo dessa invenção. O disposto acima não tem a intenção de ser uma lista abrangente das substâncias biológicas adequadas para uso nessa invenção, mas destina-se somente a ilustrar o amplo escopo da invenção.

[026] Também, tipicamente, o analito de interesse está presente a uma concentração de 10-3molar ou menos, por exemplo, pelo menos tão baixo quanto 10-18molar.

[027] O termo “reagente específico de analito” (ASR), de acordo com a presente invenção, tem que ser entendido como uma molécula ou biomolécula (por exemplo, uma proteína ou anticorpo) com a capacidade de ligar- se especificamente ao analito. Os “reagentes específicos de analito” (ASRs) são uma classe de moléculas biológicas que podem ser usadas para identificar e medir a quantidade de uma substância química individual em espécimes biológicas. ASRs são, por exemplo, anticorpos, tanto policlonal como monoclonal, proteínas de receptores específicos, ligantes, sequências de ácido nucleicos e reagentes similares que, através de ligação específica ou reação química com substâncias em um espécime, destinam-se ao uso em uma aplicação diagnóstica para identificação e quantificação de uma substância química individual ou ligante em espécimes biológicos. Em termos simples, um reagente específico de analito é o ingrediente ativo de um ensaio. Um ASR irá satisfazer tanto os critérios para afinidade bem como para especificidade de ligação do analito.

[028] O termo “anticorpo” é usado no sentido mais amplo e abrange especificamente anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos monoclonais inteiros), anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) e fragmentos de anticorpos. O termo “anticorpo” engloba as várias formas de estruturas de anticorpo, incluindo anticorpos inteiros e fragmentos de anticorpos. O anticorpo de acordo com a invenção é em uma realização um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, um anticorpo derivado a partir de outras espécies animais como camundongo, cabra ou ovelha, um anticorpo monoclonal ou policlonal, ou um anticorpo depletado de antígeno de célula T. A engenharia genética de anticorpos é, por exemplo, descrita em Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; patentes US 5.202.238 e US 5.204.244; Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327; Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270; Lonberg, N., Nat. Biotechnol. 23 (2005) 1117-1125.

[029] Qualquer fragmento de anticorpo que retém os critérios acima de um reagente específico de analito pode ser usado. Os anticorpos são gerados por procedimentos de ponta conforme descrito, por exemplo, em Tijssen (Tijssen, P., Practice and theory of enzyme immunoassays, 11, Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdã, o livro inteiro, especialmente as páginas 43 a 78). Além disso, o técnico no assunto está bem ciente dos métodos baseados em imunosorventes que podem ser usados para o isolamento específico de anticorpos. Por esses meios, a qualidade de anticorpos e, portanto seus desempenhos em imunoensaios podem ser aprimorados (Tijssen, P., acima, páginas 108 a 115).

[030] Um “reagente de detecção”, de acordo com a presente invenção, compreende um reagente específico de analito (ASR) marcado com um grupo eletroquimioluminescente, ou um analito homólogo marcado com um grupo eletroquimioluminescente. De acordo com o formato do teste, o técnico no assunto saberá qual reagente de detecção tem que ser selecionado para os vários formatos de ensaio (por exemplo, ensaio sanduíche, ensaio de ponte de antígeno duplo (DAGS), ensaio competitivo, ensaio homogêneo, ensaio heterogêneo). Um reagente de detecção em um imunoensaio heterogêneo pode ser, por exemplo, um anticorpo. Um técnico no assunto sabe que o reagente de detecção pode ser imobilizado em uma fase sólida. Em uma realização, o método para medir um analito em uma amostra através de detecção eletroquimioluminescente pode ser realizado como um ensaio homogêneo. Em uma realização, o método pode ser realizado como um ensaio heterogêneo. Em uma realização, o método pode ser realizado em um formato de ensaio sanduíche. Em uma realização, o método pode ser realizado em um formato de ensaio competitivo. Além disso, em uma realização, o método pode ser realizado em um formato de ensaio de ponte de antígeno duplo (DAGS). Formatos conhecidos de imunoensaio são descritos em detalhe no livro de Price, C.P. e Newman, D.J., Principles and Practice of Immunoassay,2aed. (1997).

[031] O termo “marcador”, como usado no presente pedido, refere- se a qualquer substância que é capaz de produzir um sinal detectável, quer seja visível ou por uso de instrumentação adequada. Vários marcadores adequados para uso na presente invenção incluem, mas não se limitam a cromógenos, compostos fluorescentes, quimioluminescentes ou eletroquimioluminescentes, catalisadores, enzimas, substratos enzimáticos, corantes, partículas coloidais metálicas e não metálicas e partículas de látex de polímero orgânico.

[032] O termo “luminescência” refere-se a qualquer emissão de luz que não derive energia a partir da temperatura de uma fonte de energia (por exemplo, uma fonte de radiação eletromagnética, uma reação química, energia mecânica). Em geral, a fonte causa movimento de um elétron de um átomo a partir de um estado energético mais baixo para um estado energético mais alto “excitado”; então, o elétron libera aquela energia na forma de luz emitida quando ele volta a um estado energético mais baixo. Essa emissão de luz, geralmente, ocorre na faixa visível ou quase visível do espectro eletromagnético. O termo “luminescência” inclui, mas não se limita a esse fenômeno de emissão de luz, como fosforescência, fluorescência, bioluminescência, radioluminescência, eletroluminescência, eletroquimioluminescência e termoluminescência.

[033] O termo “marcador luminescente” refere-se a um marcador que gera um sinal luminescente, por exemplo, uma emissão de luz que não deriva energia a partir da temperatura da fonte de emissão. O marcador luminescente pode ser, por exemplo, uma molécula fluorescente, uma molécula fosforescente, uma molécula radioluminescente, um quelato luminescente, um fósforo ou composto contendo fósforo ou um ponto quântico.

[034] Um “ensaio de eletroquimioluminescência” ou “ECLA” é um ensaio eletroquímico, em que a molécula de analito ligada é detectada por um marcador ligado a um agente de detecção (molécula alvo). Um eletrodo inicia eletroquimicamente luminescência de um marcador químico ligado a um agente de detecção. A luz emitida pelo marcador é medida por um fotodetector e indica a presença ou quantidade de complexos de moléculas de analito ligadas/moléculas alvo. Os métodos de ECLA são descritos, por exemplo, nas patentes US 5.543.112, 5.935.779 e 6.316.607. A modulação de sinal pode ser maximizada por diferentes concentrações de moléculas de analito para medidas precisas e sensíveis.

[035] Em um procedimento de ECLA, micropartículas podem ser suspensas na amostra para ligar-se eficientemente ao analito. Por exemplo, as partículas podem ter um diâmetro de 0,05 μm a 200 μm, 0,1 μm a 100 μm ou 0,5 μm a 10 μm, e um componente de superfície capaz de ligação a uma molécula de analito. Em um sistema de ECLA frequentemente usado (Elecsys®, Roche Dagnsotics, Alemanha), as micropartículas têm um diâmetro de cerca de 3 μm. As micropartículas podem ser formadas de amido reticulado, dextrano, celulose, proteína, polímeros orgânicos, copolímero de estireno, como copolímero de estireno/butadieno, copolímero de acrilonitrila/butadieno/estireno, copolímero de acrilato de vinilacetil, copolímero de cloreto de vinila/acrilato, partículas inorgânicas inertes, dióxido de cromo, óxidos de ferro, sílica, misturas de sílica, matéria proteinácea ou misturas dos mesmos, incluindo, mas não se limitando a microesferas de sefarose, microesferas de látex, partículas core-shell e similares. As micropartículas são preferencialmente monodispersas e podem ser magnéticas, como microesferas paramagnéticas. Consulte, por exemplo, patentes US 4.628.037, 4.965.392, 4.695.393, 4.698.302 e 4.554.088. As micropartículas podem ser usadas em uma concentração de cerca de 1 a 10.000 μg/mL, preferencialmente de 5 a 1.000 μg/mL.

[036] A expressão “de interesse” denota um analito ou substância de possível relevância que deve ser analisada ou determinada.

[037] “Detecção” inclui qualquer meio de detecção, incluindo detecção direta e indireta. O termo “detecção” é usado no sentido mais amplo para incluir tanto medidas qualitativas como quantitativas de um analito, medidas de um analito no presente pedido. Em um aspecto um método de detecção, como descrito no presente pedido, é usado para identificar a mera presença de um analito de interesse em uma amostra. Em outro aspecto, o método pode ser usado para quantificar uma quantidade de analito em uma amostra.

[038] “Reduzir” ou “inibir” é diminuir ou reduzir uma atividade, função e/ou quantidade em comparação a uma referência. Entende-se por reduzir ou inibir, a capacidade de causar uma diminuição geral preferencialmente de 10% ou mais, mais preferencialmente de 25% ou mais, e com a máxima preferência de 50%, 75%, 90%, 95% ou mais.

[039] “Aprimorar”, por exemplo, “aprimorar sinais específicos” ou “o aprimoramento de sinais de ECL” é aumentar ou elevar uma atividade, função e/ou quantidade em comparação a uma referência. Entende-se por aumentar ou elevar, a capacidade de causar um aumento geral preferencialmente de 10% ou mais, mais preferencialmente de 25% ou mais, e com a máxima preferência de 50% ou mais.

[040] O termo “determinar” é usado, no presente pedido, tanto para detecção qualitativa como quantitativa de um analito e pode incluir a determinação da quantidade e/ou concentração do analito.

[041] O termo “medição”/“medida” em ciência é o processo de estimar ou determinar a magnitude de uma quantidade, como comprimento ou massa, em relação a uma unidade de medida, como um metro ou um quilograma. Medição/medida usa um ponto de referência contra o qual outras coisas podem ser avaliadas. O termo medida também pode ser usado para referir-se a um resultado específico (valores determinados) obtidos a partir de um processo de medição. É uma base para comparação. O técnico no assunto tem conhecimento sobre materiais e métodos para correlacionar sinais medidos ou valores determinados para concentrações.

[042] Uma “composição de reagentes” ou “composição de reagentes de ECL”, de acordo com a presente invenção, compreende reagentes que suportam geração de sinal de ECL, por exemplo, um correagente, um agente tamponante para controle de pH e opcionalmente outros componentes. O técnico no assunto tem conhecimento sobre componentes que estão presentes em uma composição de reagentes que são requeridos para geração de sinal de ECL em métodos de detecção eletroquimioluminescente.

[043] Uma “solução aquosa”, como usado no presente pedido, é uma solução homogênea de partículas, substâncias ou compostos líquidos dissolvidos em água. Uma solução aquosa também pode compreender solventes orgânicos. Os solventes orgânicos são conhecidos pelo técnico no assunto, por exemplo, metanol, etanol ou dimetilsulfóxido. Como usado no presente pedido, também entende-se que uma solução aquosa pode compreender no máximo 50% de solventes orgânicos.

[044] Uma espécie que participa com o marcador de ECL no processo de ECL é citada no presente pedido como ”correagente”de ECL. Os correagentes comumente usados para ECL incluem as aminas terciárias (por exemplo, tripropilamina (TPA)), oxalato e persulfato. O técnico no assunto tem conhecimento sobre correagentes úteis disponíveis para métodos de detecção eletroquimioluminescente.

[045] Uma “fase sólida”, também conhecida como “suporte sólido” é um material insolúvel, funcionalizado e polimérico, ao quais membros ou reagentes de biblioteca podem ser fixados ou covalentemente ligados (com frequência através de um ligante) para serem imobilizados ou para permitir que eles sejam separados de imediato (por filtração, centrifugação, lavagem, etc.) a partir de reagentes em excesso, subprodutos de reação solúveis ou solventes. As fases sólidas para o método, de acordo com a invenção, são amplamente descritas no estado da arte (consulte, por exemplo, Butler, J. E., Methods 22 (2000) 4-23).

[046] O termo “fase sólida” significa uma substância não fluida e inclui partículas (incluindo micropartículas e microesferas) feitas a partir de materiais como polímero, metal (partículas paramagnéticas, ferromagnéticas), vidro e cerâmica; substâncias de gel, como géis de sílica, alumina e polímero; capilares que podem ser feitos de polímero, metal, vidro e/ou cerâmica; zeólitos e outras substâncias porosas; eletrodos, placas de microtítulo, tiras sólidas e cadinhos, tubos, chips ou outros recipientes de amostra de espectrômetro.

[047] Um componente de fase sólida de um ensaio se distingue das superfícies sólidas inertes com as quais o ensaio pode estar em contato, em que uma “fase sólida” contém pelo menos um componente em sua superfície que tem a intenção de interagir com o anticorpo de captura ou molécula de captura. Uma fase sólida pode ter um componente estacionário, como um tubo, tira, cadinho, chip ou placa de microtítulo, ou pode ter componentes não estacionários, como microesferas e micropartículas.

[048] As micropartículas também podem ser usadas como uma fase sólida para formatos de ensaio homogêneo. Uma variedade de micropartículas que permite tanto a fixação não covalente como covalente de proteínas e outras substâncias pode ser usada.

[049] Essas partículas incluem partículas de polímero, como poliestireno e poli(metilmetacrilato); partículas de ouro, como nanopartículas de ouro e coloides de ouro e partículas de cerâmica, como partículas de sílica, vidro e óxido metálico. Consulte, por exemplo, Martin, C.R., et al., Analytical Chemistry-News & Features (1998) 322A-327A, que é incorporado ao presente pedido como referência.

[050] Os termos “chip”, “bio-chip”, “chip de polímero” ou “chip de proteína” são usados de forma intercambiável e referem-se a uma coleção de um grande número de sondas, marcadores ou marcadores bioquímicos arranjados em um substrato compartilhado (por exemplo, uma fase sólida), que poderia ser uma porção de uma pastilha de silício, uma tira de náilon, uma tira plástica ou uma lâmina de vidro.

MÉTODOS

[051] Em uma realização, a presente invenção refere-se a um método para medir um analito em uma amostra através de detecção eletroquimioluminescente, que compreende as etapas de a) incubar a amostra com um reagente de detecção marcado com um grupo eletroquimioluminescente, b) separar o analito ligado e analito livre marcado com reagente de detecção, c) incubar o reagente de detecção separado marcado com uma composição de reagentes que compreende i) pelo menos um correagente e ii) pelo menos um composto selecionado a partir do grupo de amidas de ácido carbônico de Fórmula I e Fórmula II, Fórmula I,

com R1 = CH3, CH2F, CH2Cl, CH2CH3, CHClCH3, CH2CH2Cl, C(CH3)2CH3, CH2CH2CH3, CClHCH2CH3 ou CH2CH2CH2CH3, com R2 = H, e com R3 = H,

d) acionamento eletroquímico da liberação de luminescência, e e) determinação do sinal de eletroquimioluminescência (ECL), com isso medindo o analito.

[052] Um aspecto da invenção refere-se a métodos de ECL aprimorados baseados nas composições de reagentes da presente invenção, particularmente métodos de ECL que caracterizam limites baixos de detecção. As composições de reagentes, surpreendentemente, aprimoram os sinais específicos e reduzem os sinais de fundo. Mais especificamente, os métodos da invenção fornecem sensibilidade aprimorada a níveis baixos de detecção por redução da eletroquimioluminescência de fundo na ausência de marcadores de ECL.

[053] Os inventores surpreendentemente descobriram que o uso de certos compostos do grupo de amidas de ácido carbônico fornece uma série de vantagens, incluindo geração de sinal aprimorado em métodos de detecção de ECL e, dessa forma, desempenho aprimorado de ensaio de ECL.

[054] Uma característica da invenção são os métodos para a determinação de um analito em uma amostra a ser investigada com o uso de um marcador eletroquimioluminescente, em que é empregado um dos seguintes métodos listados para medição de fenômeno eletroquimioluminescente.

[055] Surpreendentemente, os métodos com o uso de compostos selecionados a partir do grupo de amidas de ácido carbônico emitem menos luminescência de fundo do que reagentes de teste convencionais sem esses compostos. Isso é particularmente uma vantagem em níveis baixos de detecção, em que o aumento do sinal em relação à razão de fundo (= relação sinal-ruído) melhora muito a sensibilidade. Surpreendentemente, os inventores descobriram que a realização de uma detecção eletroquimioluminescente com o uso de um método, de acordo com a presente invenção, resulta em um sinal melhorado em 10 a 60% na relação sinal-ruído de detecção de ECL.

[056] O método para medir um analito em uma amostra através de detecção eletroquimioluminescente de acordo com a presente invenção pode ser realizado, em uma realização, em uma solução aquosa.

[057] Em uma realização, a amida de ácido carbônico usada no método é selecionada a partir do grupo que consiste em acetamida, 2- fluoracetamida, 2-cloroacetamida, propanamida, 2-cloropropanamida, 3- cloropropanamida, butanamida e 2-clorobutanamida.

[058] Em uma realização preferencial, a amida de ácido carbônico usada no método é selecionada a partir do grupo que consiste em acetamida, 2- cloroacetamida, propanamida e butanamida.

[059] Em uma realização preferencial, a amida de ácido carbônico usada no método é selecionada a partir do grupo que consiste em acetamida, propanamida e butanamida.

[060] Em uma realização preferencial, a amida de ácido carbônico é usada no método em uma concentração de 0,01 M a 0,25 M. Em uma realização ainda mais preferencial, a amida de ácido carbônico é usada em uma concentração de 0,01 M a 0,2 M. Em uma realização ainda mais preferencial, a amida de ácido carbônico é usada em uma concentração de 0,01 M a 0,1 M.

[061] Em uma realização, o método de acordo com a presente invenção é particularmente bem adequado para detectar biomoléculas, como proteínas, polipeptídeos, peptídeos, fragmentos peptídicos, hormônios, hormônios peptídicos, vitaminas, pró-vitaminas, metabólitos de vitamina e aminoácidos em uma amostra de interesse.

[062] A amostra usada nos métodos, de acordo com a presente invenção, é em uma realização uma amostra líquida, por exemplo, sangue total, soro ou plasma. A amostra ou, mais especificamente, a amostra de interesse em uma realização pode compreender qualquer fluido corpóreo e fezes. Em uma realização, a amostra será uma amostra líquida, como saliva, extratos de fezes, urina, sangue total, plasma ou soro. Em uma realização, a amostra será sangue total, plasma ou soro.

[063] Um técnico no assunto sabe que as etapas de “a) incubar a amostra com um reagente de detecção marcado com um grupo eletroquimioluminescente” e “b) separar o analito ligado e analito livre marcado com reagente de detecção” no método podem ser realizadas no mesmo local, por exemplo, no mesmo recipiente de reação. As ditas etapas (a) e (b) podem ser realizadas em um processo automático controlado por um meio de controle.

[064] Componentes de amostra não específica e reagente de detecção marcado livre de analito podem ser removidos na etapa (b), de acordo com o método, em um processo de separação. Por exemplo, aquele analito ligado e analito livre marcado com reagente de detecção pode ser separado com o uso de uma etapa de lavagem.

[065] Além disso, outros componentes de teste que suportam a detecção eletroquimioluminescente de um analito podem ser usados nos métodos de acordo com a presente invenção.

[066] Um aspecto da invenção abrange a necessidade de preservação efetiva, por exemplo, por armazenamento a longo prazo de misturas de reagentes e composições de reagentes. Conservantes adequados não devem ter efeito sobre a geração de sinal de ECL ou, em um caso ideal, uma influência positiva sobre a geração de sinal de ECL.

[067] Foram identificados como compostos conservantes adequados, ácido bórico e/ou borato que controlam de maneira efetiva o crescimento bacteriano e fúngico e, supreendentemente, aumentam os sinais de ECL específicos. Um método de detecção de ECL com o uso de uma composição de reagentes que compreende ácido bórico e/ou borato como conservantes tem o surpreendente efeito positivo de aumento no sinal de ECL específico gerado.

[068] Em uma realização, a presente invenção refere-se a um método para medir um analito em uma amostra através de detecção eletroquimioluminescente, que compreende as etapas de a) incubar a amostra com um reagente de detecção marcado com um grupo eletroquimioluminescente, b) separar o analito ligado e analito livre marcado com reagente de detecção, c) incubar o reagente de detecção separado marcado com uma composição de reagentes que compreende i) pelo menos um correagente, e ii) um conservante selecionado do grupo que consiste de ácido bórico e borato, d) acionar eletroquimicamente a liberação de luminescência, e e) determinar o sinal de eletroquimioluminescência (ECL), através disso, medindo o analito.

[069] Em uma realização, o método para medir um analito em uma amostra através de detecção eletroquimioluminescente é caracterizado pelo fato da composição de reagentes para geração de sinal de ECL compreender um conservante selecionado a partir do grupo que consiste em ácido bórico e borato a uma concentração de 0,1% a 5%, preferencialmente a uma concentração de 0,5% a 4%, e com mais preferencialmente a uma concentração de 0,5 a 2%.

[070] Em uma realização, o método para medir um analito em uma amostra através de detecção eletroquimioluminescente é caracterizado pelo fato da composição de reagentes para geração de sinal de ECL compreender ácido bórico como conservante a concentrações de 0,1% a 5%, preferencialmente a concentrações de 0,5% a 4%, e com mais preferencialmente a concentrações de 0,5% a 2%.

[071] Em uma realização, o método para medir um analito em uma amostra através de detecção eletroquimioluminescente é caracterizado pelo fato da composição de reagentes para geração de sinal de ECL compreender borato como conservante a concentrações de 0,1% a 5%, preferencialmente a concentrações de 0,5% a 4%, e com mais preferencialmente a concentrações de 0,5% a 2%.

[072] Os inventores descobriram que um método para medir um analito em uma amostra através de detecção eletroquimioluminescente combinando o efeito de amidas de ácido carbônico e ácido bórico e/ou borato em uma composição de reagentes pode resultar em um sinal melhorado de relação sinal-ruído na detecção de ECL. O efeito acumulado de amidas de ácido carbônico e ácido bórico e/ou borato em uma composição de reagentes leva a uma geração de sinal melhorado em, pelo menos, 10%, 25% ou 50% na detecção de ECL.

[073] Em uma realização, a presente invenção refere-se a um método para medir um analito em uma amostra através de detecção eletroquimioluminescente, que compreende as etapas de a) incubar a amostra com um reagente de detecção marcado com um grupo eletroquimioluminescente, b) separar o analito ligado e analito livre marcado com reagente de detecção, c) incubar o reagente de detecção separado marcado com uma composição de reagentes que compreende i) pelo menos um correagente, ii) pelo menos um composto selecionado a partir do grupo de amidas de ácido carbônico de Fórmula I e Fórmula II e iii) pelo menos um conservante selecionado do grupo de ácido bórico e borato, d) acionar eletroquimicamente a liberação de luminescência, e e) determinar o sinal de eletroquimioluminescência (ECL), através disso, medindo o analito.

[074] Em uma realização, o método para medir um analito em uma amostra através de detecção eletroquimioluminescente é caracterizado pelo fato da composição de reagentes que compreende, além disso, um detergente e um agente tamponante.

[075] Em uma realização, o método para medir um analito em uma amostra através de detecção eletroquimioluminescente é caracterizado pelo fato da composição de reagentes que compreende, além disso, um sal e/ou um agente antiespumante.

[076] Em uma realização a invenção refere-se a um método para conduzir um ensaio eletroquimioluminescente, em que a eletroquimioluminescência é induzida na presença de uma composição de reagentes, de acordo com a presente invenção.

[077] Um processo de medição de ECL típico para um imunoensaio de ECL compreende múltiplas trocas de líquidos e/ou misturas na célula de medição de ECL (por exemplo, uma célula de fluxo). Um processo de medição de ECL típico consiste em várias etapas explicadas abaixo.

[078] O técnico no assunto tem conhecimento que uma célula de medição de ECL tem que ser condicionada ou regenerada antes que a etapa de detecção de ECL ocorra por elevação da dita célula de medição de ECL com uma composição de reagentes, de acordo com a presente invenção e adicional à aplicação de um potencial elétrico. Essa etapa é uma parte do processo de determinação de analitos com o uso de ECL. Foi descrito na patente EP 1 051 621 que durante essa etapa de condicionamento, uma camada é formada na superfície do(s) eletrodo(s) de medição que suportam a geração de sinal durante a medição de um analito em uma célula de medição de ECL.

[079] Para um processo de medição de ECL típico, uma mistura de reagentes é induzida dentro da célula de medição de ECL limpa e condicionada através dos canais de entrada de fluidos dentro da cavidade da célula de medição de ECL. Essa mistura é um incubado da amostra, reagentes e partículas magnéticas. A dita mistura induzida dentro da célula de medição pode estar circundada por uma composição de reagentes de acordo com a presente invenção que flui antes e depois da dita mistura.

[080] Nesse imunoensaio de ECL, um reagente de detecção que compreende complexos de moléculas que são marcadas com um grupo eletroquimioluminescente e que são características para a análise, são ligadas a essas partículas magnéticas por um par de parceiros de ligação bioquímica específicos, por exemplo, estreptavidina e biotina. As partículas magnéticas são, por exemplo, revestidas com polímero de estreptavidina, enquanto que a biotina é ligada ao complexo de moléculas.

[081] Na célula de medição de ECL, as partículas magnéticas são aprisionadas à superfície de um eletrodo junto com o complexo de moléculas marcadas ligado ao mesmo no campo magnético de um ímã disposto próximo ao dito eletrodo. O campo magnético é aplicado durante um fluxo contínuo da mistura, através do qual o incubado e/ou composição de reagentes é descarregado a partir da cavidade da célula de medição de ECL através do canal de saída de fluido.

[082] Após aprisionamento das partículas magnéticas, uma composição de reagentes, de acordo com a presente invenção, contendo um correagente de ECL é induzido dentro da célula de medição de ECL em uma próxima etapa através do qual as partículas magnéticas são lavadas pela dita composição de reagentes. Essa etapa de lavagem é para remover os componentes não ligados do dito incubado a partir do eletrodo que, potencialmente, interfere com a reação eletroquímica.

[083] Desde então a liberação do sinal de eletroquimioluminescência (ECL) é acionada eletroquimicamente por aplicação de um potencial elétrico, através do qual a intensidade da luz luminescente é detectada por meio de um fotosensor e pode ser avaliada como uma medida para a concentração do complexo de moléculas marcadas nas partículas magnéticas localizadas na superfície do eletrodo, através do qual essa concentração serve novamente como uma medida para a concentração do analito na amostra.

[084] Após a detecção de eletroquimioluminescência, a célula de medição de ECL geralmente é lavada com um fluido de limpeza.

[085] Um aparelho para conduzir os métodos de detecção por meio de eletroquimioluminescência é mencionado na seção de exemplos (Exemplos 1, 2 ou 3) ou descrito na patente EP 1 892 524 (A1). Além disso, esse aparelho pode compreender meios para controlar a temperatura da unidade de medição e/ou um recipiente líquido. Entende-se que a unidade de medição seja uma célula na qual a eletroquimioluminescência é medida. O recipiente líquido pode ser um recipiente de armazenamento, mas também um dispositivo de alimentação; por exemplo, um tubo para a solução de reagentes, contido na unidade de medição durante a medição.

COMPOSIÇÕES

[086] Um aspecto da invenção refere-se a uma composição de reagentes melhorada para a geração de sinal de ECL, que leva ao aumento de relação sinal-ruído. Mais especificamente, a composição de reagentes da invenção fornece sensibilidade aprimorada a níveis baixos de detecção por redução da eletroquimioluminescência de fundo na ausência de marcadores ECL. Surpreendentemente, uma composição de reagentes que compreende compostos como amidas de ácido carbônico emitem menos luminescência de fundo do que reagentes de teste convencionais sem esses compostos. Isso é particularmente uma vantagem em níveis baixos de detecção, em que o aumento do sinal em relação à razão de fundo (= relação sinal-ruído) melhora muito a sensibilidade. Essa composição de reagentes melhorada contém um composto a partir do grupo de amidas de ácido carbônico, bem como outros compostos que dão apoia ao método para geração de ECL. Surpreendentemente, os inventores descobriram que a realização de uma detecção eletroquimioluminescente com o uso de uma composição de reagente de acordo com a presente invenção resulta em um sinal melhorado em 10 a 60% na relação sinal-ruído de detecção de ECL.

[087] Um aspecto da invenção refere-se a uma composição de reagentes que fornece sinal alto em relação às razões de fundo em ensaios de eletroquimioluminescência. A diferença de sinal entre sinais específicos e sinais de fundo é aumentada. Essas propriedades melhoradas foram alcançadas através da identificação de combinações vantajosas de correagente de ECL, agentes tamponantes de pH, detergente e pH e, em particular, através do uso de compostos selecionados a partir do grupo que consiste em amidas de ácido carbônico.

[088] A composição de reagentes fornece um meio adequado para induzir eficientemente marcadores de ECL para emitir ECL e para medir de forma sensível os marcadores de ECL através da medição de ECL. A composição de reagentes da invenção pode opcionalmente compreender componentes adicionais, incluindo conservantes, detergentes, agentes antiespumantes, espécies ativas ECL, sais, compostos ácidos e básicos para controle de pH (agentes tamponantes), íons de metais e/ou agentes quelantes metálicos. A composição de reagentes da invenção também pode incluir componentes de um ensaio biológico que, em alguns casos, pode ser marcado com um marcador de ECL, que inclui reagentes de ligação, enzimas, substratos de enzimas, cofatores e/ou inibidores enzimáticos. A invenção também inclui reagentes de ensaio, composições, kits, sistemas e componentes de sistema que compreendem a composição de reagentes da invenção e, opcionalmente, componentes de ensaio adicionais. A invenção também inclui métodos para a condução de ensaios de ECL com o uso da composição de reagentes da invenção.

[089] Em uma realização a presente invenção refere-se a uma composição de reagentes para determinar ECL, que compreende i) um composto selecionado a partir do grupo de amidas de ácido carbônico de Fórmula I e Fórmula II e ii) pelo menos um correagente.

[090] Em uma realização, a amida ácida carbônica da composição de reagentes é selecionada a partir do grupo que consiste em acetamida, 2- fluoracetamida, 2-cloroacetamida, propanamida, 2-cloropropanamida, 3- cloropropanamida, butanamida e 2-clorobutanamida.

[091] Em uma realização preferencial, a amida de ácido carbônico é selecionada a partir do grupo que consiste em acetamida, 2-cloroacetamida, propanamida e butanamida. Em uma realização adicional, a amida de ácido carbônico é selecionada a partir do grupo que consiste em acetamida, propanamida e butanamida. As amidas de ácido carbônico têm uma concentração individual ótima para o efeito aprimorador de ECL. Conforme mostrado nos experimentos (especialmente 2, 3 e 4), o técnico no assunto tem conhecimento para selecionar a concentração apropriada para a amida de ácido carbônico na composição de reagentes. Os métodos para determinar a concentração ótima para uma amida de ácido carbônico na composição de reagentes são conhecidos pelo técnico no assunto.

[092] Em uma realização a composição de reagentes compreende as amidas de ácido carbônico em uma concentração de 0,01 M a 0,25 M. Em uma realização adicional a composição de reagentes compreende as amidas de ácido carbônico em uma concentração de 0,01 M a 0,2 M. Em uma realização adicional a composição de reagentes compreende as amidas de ácido carbônico em uma concentração de 0,01 M a 0,1 M.

[093] O correagente da composição de reagentes em uma realização é selecionado a partir do grupo de aminas terciárias (por exemplo, tripropilamina (TPA)), oxalato e persulfato. Em uma realização preferencial o correagente é TPA.

[094] Pode ser benéfico quando armazenar uma composição de reagentes incluir um conservante que evita crescimento microbiano. Adicionalmente, conservantes adequados são identificados para controlar o crescimento bacteriano e fúngico para permitir armazenamento a longo prazo e uso da composição de reagentes. A composição de reagentes de acordo com a presente invenção pode adicionalmente conter um ou mais conservantes. Em uma realização da presente invenção a composição de reagentes compreende um conservante (agente conservante).

[095] Em uma realização a presente invenção refere-se a uma composição de reagentes para determinar ECL, que compreende i) um composto selecionado a partir do grupo de amidas de ácido carbônico de Fórmula I e Fórmula II, ii) pelo menos um correagente, e iii) pelo menos um conservante.

[096] Preferencialmente, o conservante não tem ou tem um efeito positivo na geração de sinal de ECL. Um técnico no assunto sabe que oxazolidinas (por exemplo, Oxaban A ou 4,4-dimetil oxazolidina), azida e conservantes relacionados são compatíveis com ECL. Oxazolidinas a concentrações de 0,01% a 1% são normalmente usadas nos reagentes de teste. Em uma realização a composição de reagentes compreende conservantes selecionados a partir do grupo de Oxazolidinas, preferencialmente Oxaban A. Em uma realização, a composição de reagentes compreende conservantes a uma concentração de 0,01% a 1%, em outra realização, a composição de reagentes compreende conservantes a uma concentração de 0,1% a 1%. Também pode ser benéfico o uso de uma mistura de dois ou mais conservantes.

[097] A amida de ácido carbônico 2-cloroacetamida (CAA) como já mencionado acima, tem em adição ao seu efeito aprimorador de sinal de ECL, também uma função conservante.

[098] Conforme mencionado acima, um aspecto da invenção abrange a necessidade de adicionar um conservante efetivo que não tenha ou que tenha uma influência positiva sobre a geração de sinal de ECL. Foram identificados como compostos inorgânicos adequados, ácido bórico e/ou borato que controlam de maneira efetiva o crescimento bacteriano e fúngico, Surpreendentemente, os inventores descobriram que ácido bórico e/ou borato presentes em uma composição de reagentes para determinar ECL não têm influência negativa na geração de sinal de ECL. Surpreendentemente, descobriu- se que uma composição de reagentes que compreende ácido bórico ou borato como conservantes tem um efeito positivo no processo de geração de sinal de ECL, em outras palavras, um aumento do sinal específico. Adicionalmente, sua alta atividade e baixo grau de problemas associados a perigos de segurança ou preocupações ambientais são vantajosos. Ácido bórico ou borato são opostos a alguns outros conservantes comumente usados em composições de reagentes, por serem desprovidos de halogênio e não liberarem formaldeído. Os resultados com ácido bórico presentes na geração de sinal de ECL são mostrados na seção de Exemplos, por exemplo, Exemplo 2.

[099] Em uma realização a presente invenção refere-se a uma composição de reagentes para determinar ECL, que compreende i) pelo menos um correagente, e iii) pelo menos um conservante selecionado a partir do grupo que consiste em ácido bórico e borato.

[100] Em uma realização a presente invenção refere-se a uma composição de reagentes para determinar ECL, que compreende i) pelo menos um correagente, e iii) o conservante ácido bórico.

[101] Em uma realização a presente invenção refere-se a uma composição de reagentes para determinar ECL, que compreende i) pelo menos um correagente, e iii) o conservante borato.

[102] Em uma realização a presente invenção refere-se a uma composição de reagentes para determinar ECL, que compreende i) um composto selecionado a partir do grupo de amidas de ácido carbônico de Fórmula I e Fórmula II, ii) pelo menos um correagente, iii) pelo menos um conservante selecionado a partir do grupo que consiste em ácido bórico e borato.

[103] Em uma realização, a composição de reagentes de acordo com a presente invenção compreende ácido bórico ou borato como conservante a uma concentração de 0,1% a 5%, preferencialmente a uma concentração de 0,5% a 4%, e particularmente preferencial a uma concentração de 0,5% a 2%.

[104] Em uma realização preferencial, a composição de reagentes, de acordo com a presente invenção, compreende ácido bórico como conservante a concentrações de 0,1% a 5%, preferencialmente a uma concentração de 0,5% a 4%, e particularmente preferencial a uma concentração de 0,5% a 2%.

[105] Em uma realização preferencial, a composição de reagentes, de acordo com a presente invenção, compreende borato como conservante a concentrações de 0,1% a 5%, preferencialmente a uma concentração de 0,5% a 4%, e particularmente preferencial a uma concentração de 0,5% a 2%.

[106] A composição de reagentes de acordo com a presente invenção, opcionalmente compreende, além disso, outros componentes de teste. Outros componentes de teste são selecionados a partir do grupo que consiste em pelo menos um detergente, pelo menos um composto aprimorador de sinal, agentes tamponantes, que compreendem agentes ácidos e básicos para controle de pH e água.

[107] Em uma realização a presente invenção refere-se a uma composição de reagentes para determinar ECL, que compreende i) um composto selecionado a partir do grupo de amidas de ácido carbônico de Fórmula I e Fórmula II, ii) pelo menos um correagente, iii) pelo menos um conservante, iv) agentes tamponantes, v) pelo menos um detergente, vi) um sal e/ou um agente antiespumante, e vii) opcionalmente outros componentes de teste.

[108] Detergentes adequados para uma composição de reagentes, de acordo com a presente invenção, são aqueles a partir do grupo que consiste em etoxilatos de álcool de ácido graxo, que incluem poli(etileno glicol)éteres, por exemplo, polidocanol ou outros poli(etileno glicol)éteres com a fórmula CXEOY com X = 8 - 18 e Y = 2 - 9, genapol (isotridecilpoli((etileno glicol éter)n), Plantaren® (alquilpoliglucosido), octilglucosido (octil-beta-D-glucopiranosido), bem como detergentes zwitteriônicos, como Zwittergent 3-12 ou uma mistura dos mesmos. Os detergentes são usados a concentrações que variam entre 0,01% e 2%. A concentração ótima pode ser facilmente determinada para cada detergente. As concentrações mais adequadas são aquelas que variam entre 0,05% e 1%.

[109] Em uma realização, a composição de reagentes, de acordo com a presente invenção, compreende detergentes selecionados a partir do grupo que consiste em polidocanol ou outros poli(etileno glicol)éteres com a fórmula CXEOY com X = 8 - 18 e Y = 2 - 9, octilglucosido (octil-beta-D-glucopiranosida) ou detergentes zwitteriônicos, como Zwittergent 3-12 ou uma mistura dos mesmos. Em uma realização preferencial, a composição de reagentes compreende detergentes selecionados a partir do grupo que consiste em polidocanol, octilglucosido (octil-beta-D-glucopiranosida) e Zwittergent 3-12, ou uma mistura dos mesmos.

[110] Além disso, o sinal eletroquimioluminescente pode ser aumentado por ajuste do pH para um valor entre 6,0 e 8,0, preferencialmente entre 6,0 e 7,5, particularmente preferencial entre 6,2 e 6,9. Isso pode ser feito convencionalmente por uso de um agente tamponante de pH adequado para essa faixa, conhecido por um técnico no assunto. Em uma realização o agente tamponante adequado para a composição de reagentes compreende KOH e ácido fosfórico (H3PO4).

[111] Além disso, o sinal pode ser aumentado por adição de sais, que incluem sais inorgânicos como, por exemplo, NaBr, NaCl, NaJ. Os sais, especialmente NaCl, são adicionados a concentrações que variam entre 1 mM e 1 M, preferencialmente entre 10 mM e 100 mM, e com a máxima preferência entre 10 mM e 50 mM.

[112] Pode ser benéfico, especialmente em aplicações HTS, evitar a produção de bolhas ou espuma. Por essa razão, pode ser desejável adicionar agentes antiespumantes a uma composição de reagentes. Muitos agentes antiespumantes comerciais (incluindo Antifoams o-30, Antifoam 204, Antifoam A, Antifoam SE-15, Antifoam SO-25 e Antifoam 289) podem ser adicionados à composição de reagentes de acordo com a presente invenção.

[113] A composição de reagentes da invenção pode incluir marcadores de ECL. Os marcadores de ECL podem ser marcadores de ECL convencionais. Exemplos de marcadores de ECL incluem tris-bipiridil-rutênio (RuBpy) e outros compostos organometálicos, onde o metal é, por exemplo, dos metais dos grupos VII e VIII, incluindo Re, Ru, Ir e Os. Esses marcadores de ECL são usados por um técnico no assunto para marcar um reagente específico do analito com um grupo eletroquimioluminescente ou para marcar o próprio analito com um grupo eletroquimioluminescente. Em uma realização, a composição de reagentes da invenção contém um analito marcado e/ou reagente específico do analito marcado, em que o marcador de ECL é selecionado a partir do grupo que consiste em marcadores de ECL divulgados na patente US 5.310.687 (A) (BPRu = Ru(bpy)2-bpyCO-OSu), patente US 2003/0124572 (A1) (Sulfo-BPRu NHS Ester), patente EP720614(A1) (Bpy2-Ru-bpy-CO-UEEK-korks.-OSu) e documento WO 2002/027317 (A2) (BPRu-(UE)-25-K e BPRu2-SK4), respectivamente.

[114] Os reagentes e misturas dos mesmos usados na composição de reagentes podem ser fornecidos tanto na forma líquida, congelada, ultracongelada, vaporizada, liofilizada, gasosa, sólida ou seca antes do uso. Pelo menos antes do uso da composição de reagentes, os reagentes são resolvidos em um solvente. As composições de reagentes da presente invenção serão uma solução aquosa. Em uma realização preferencial, os reagentes serão resolvidos em água.

[115] Essas formulações aprimoradas são de valor particular em ensaios de alta sensibilidade. Em algumas realizações da invenção, o desempenho de ensaios de ECL é aprimorado ainda mais através de combinações ótimas de composições de reagentes com composições de eletrodos. Essas composições adequadas de eletrodos de ECL compreendem eletrodos de Ir, Pt ou carbono.

[116] Essas combinações vantajosas, anteriormente mencionadas, incluindo as amidas de ácido carbônico aprimoradoras de ECL e conservantes adequados selecionados a partir do grupo que consiste em ácido bórico e borato, ambos os quais têm propriedades melhoradas. Essas incluem faixa dinâmica mais alta e uma razão melhorada de sinal de ECL a partir do marcador ligado em relação ao sinal de fundo de ECL com o uso da composição de reagentes divulgada, de acordo com a presente invenção. Essa sensibilidade aumentada é importante, por exemplo, em ensaios que se beneficiam de um limite de detecção mais baixo (por exemplo, ensaio de TroponinaT (TNThs; Pedido N°: 05092744), ensaio do antígeno do envelope de Hepatite-B (HBeAg; Pedido N°: 11820583), ensaio do receptor anti-Tirotropina (anti-TSHR; Pedido N°: 04388780) - para detalhes consulte a seção de Exemplos).

[117] Essas formulações melhoradas de composições de reagentes podem dar uma melhor precisão, que podem resultar em um limite de detecção mais baixo em ensaios de ECL.

[118] Outro aspecto da invenção refere-se a uma redução de custos devido a uma redução dos volumes de amostra necessários, reagentes específicos de teste e/ou reagentes de teste. A perda de sinal por volumes mais baixos de reagentes pode ser compensada por uso da composição vantajosa de reagentes, de acordo com a presente invenção.

[119] Ainda outro aspecto da invenção refere-se a sistemas melhorados e aparelhos que contêm a composição de reagentes da invenção e/ou sistemas melhorados e aparelhos adaptados para realizar os métodos melhorados da invenção.

[120] A geração de sinal de ECL também pode ser melhorada quando as descobertas acima são usadas tanto sozinhas como em combinação umas com as outras.

MISTURA DE REAGENTES

[121] Para a determinação de ECL a composição de reagentes, de acordo com a presente invenção, pode ser misturada com compostos adicionais que formam uma mistura de reagentes. Em uma realização a presente invenção refere-se a uma mistura de reagentes para determinar ECL, que compreende uma composição de reagentes para determinar ECL, que compreende i) um composto selecionado a partir do grupo de amidas de ácido carbônico de Fórmula I e Fórmula II, ii) pelo menos um correagente, iii) uma amostra a ser investigada, e iv) pelo menos um reagente de detecção marcado com um grupo eletroquimioluminescente.

[122] Em uma realização, a presente invenção refere-se a uma mistura de reagentes para determinar ECL, que compreende uma composição de reagentes para determinar ECL, que compreende i) um composto selecionado a partir do grupo de amidas de ácido carbônico de Fórmula I e Fórmula II, ii) pelo menos um correagente, iii) pelo menos um conservante, iv) uma amostra a ser investigada, e v) pelo menos um reagente de detecção marcado com um grupo eletroquimioluminescente.

[123] Em uma realização a presente invenção refere-se a uma mistura de reagentes para determinar ECL, que compreende uma composição de reagentes para determinar ECL, que compreende i) um composto selecionado a partir do grupo de amidas de ácido carbônico de Fórmula I e Fórmula II, ii) pelo menos um correagente, iii) um conservante selecionado a partir do grupo que consiste em ácido bórico e borato, iv) uma amostra a ser investigada, e v) pelo menos um reagente de detecção marcado com um grupo eletroquimioluminescente.

[124] Em uma realização adicional, a presente invenção refere-se a uma mistura de reagentes para determinar ECL, que compreende uma composição de reagentes para determinar ECL, que compreende i) um conservante selecionado a partir do grupo que consiste em ácido bórico e borato, ii) pelo menos um correagente, iii) uma amostra a ser investigada, e iv) pelo menos um reagente de detecção marcado com um grupo eletroquimioluminescente. Em uma realização preferencial, a mistura de reagentes compreende o conservante ácido bórico. Em uma realização preferencial, a mistura de reagentes compreende o conservante borato.

[125] A presente invenção refere-se também em uma realização a uma mistura de reagentes para determinar ECL, que compreende uma composição de reagentes para determinar ECL, que compreende i) um conservante selecionado a partir do grupo que consiste em ácido bórico e borato, ii) pelo menos um correagente, iii) uma amostra a ser investigada, iv) um detergente, v) um agente tamponante, vi) pelo menos um reagente de detecção marcado com um grupo eletroquimioluminescente, e vii) que compreende um sal e/ou um agente antiespumante.

[126] Em uma realização ainda mais preferencial, a presente invenção refere-se a uma mistura de reagentes para determinar ECL, que compreende uma composição de reagentes para determinar ECL, que compreende i) um composto selecionado a partir do grupo de amidas de ácido carbônico de Fórmula I e Fórmula II, ii) pelo menos um correagente, iii) um conservante selecionado a partir do grupo que consiste em ácido bórico e borato, iv) uma amostra a ser investigada, v) um detergente, vi) um agente tamponante, e vii) pelo menos um reagente de detecção marcado com um grupo eletroquimioluminescente.

[127] A mistura de reagentes, além disso, pode compreender pelo menos um detergente e um agente tamponante para controle de pH.  Opcionalmente, a mistura de reagentes pode compreender um sal e/ou um agente antiespumante.

[128] Outros componentes de teste na mistura de reagentes são selecionados a partir do grupo que consiste em reagentes específicos de analito não marcado, homólogos de analito, revestimentos de fase sólida e substâncias que reduzem interferência.

USO

[129] Um aspecto da presente invenção refere-se ao uso de uma composição de reagentes melhorada e/ou uma mistura melhorada de reagentes da invenção para realizar um método de detecção eletroquimioluminescente.

[130] Em uma realização, a invenção refere-se ao uso de uma amida de ácido carbônico selecionada a partir do grupo de Fórmula I e Fórmula II para realizar uma detecção eletroquimioluminescente. Em uma realização, a presente invenção refere-se ao uso de uma amida de ácido carbônico selecionada a partir do grupo de Fórmula I e Fórmula II para realizar um procedimento de método de detecção eletroquimioluminescente.

[131] Em uma realização preferencial, a invenção refere-se ao uso de amidas de ácido carbônico selecionadas a partir do grupo que consiste em acetamida, 2-fluoracetamida, 2-cloroacetamida, propanamida, 2- cloropropanamida, 3-cloropropanamida, butanamida e 2-clorobutanamida para realizar uma detecção eletroquimioluminescente.

[132] Em outra realização preferencial, a invenção refere-se ao uso de uma amida de ácido carbônico selecionada a partir do grupo que consiste em acetamida, 2-cloroacetamida, propanamida e butanamida para realizar uma detecção eletroquimioluminescente. Em outra realização, a invenção refere-se ao uso de uma amida de ácido carbônico selecionada a partir do grupo que consiste em acetamida, propanamida e butanamida para realizar uma detecção eletroquimioluminescente.

[133] Em uma realização, a presente invenção refere-se ao uso de uma composição de reagentes, que compreende i) um composto selecionado a partir do grupo de amidas de ácido carbônico de Fórmula I e Fórmula II, ii) pelo menos um correagente, e iii) pelo menos um conservante para determinação de ECL.

[134] Em uma realização, a presente invenção refere-se ao uso de uma composição de reagentes, que compreende i) um composto selecionado a partir do grupo de amidas de ácido carbônico de Fórmula I e Fórmula II, ii) pelo menos um correagente, e iii) um conservante selecionado a partir do grupo que consiste em ácido bórico e borato para determinação de ECL.

[135] Em uma realização, a presente invenção refere-se ao uso de uma composição de reagentes, que compreende i) um composto selecionado a partir do grupo de amidas de ácido carbônico selecionadas a partir do grupo que consiste em acetamida, 2-fluoracetamida, 2-cloroacetamida, propanamida, 2- cloropropanamida, 3-cloropropanamida, butanamida e 2-clorobutanamida, ii) pelo menos um correagente, e iii) um conservante para determinar ECL.

[136] A composição de reagentes de acordo com a presente invenção é, em uma realização apropriada, para o condicionamento ou regeneração de uma célula de medição de ECL e para a determinação de um sinal de ECL. Em uma realização, a dita composição de reagentes é usada como uma solução de condicionamento. Em uma realização, a composição de reagentes de acordo com a presente invenção é usada para o condicionamento ou regeneração de uma célula de medição de ECL. Em uma realização, a dita composição de reagentes que compreende um composto selecionado a partir do grupo de amida de ácido carbônico selecionada a partir do grupo que consite em acetamida, 2-fluoracetamida, 2-cloroacetamida, propanamida, 2- cloropropanamida, 3-cloropropanamida, butanamida e 2-clorobutanamida, é usada para o condicionamento ou regeneração de células de medição de ECL.  Em outra realização, a dita composição de reagentes que compreende um composto selecionado a partir do grupo de amida de ácido carbônico selecionada a partir do grupo que consiste em acetamida, propanamida e butanamida, é usada para o condicionamento ou regeneração de células de medição de ECL.

[137] Para o uso na realização de um método de detecção eletroquimioluminescente, a composição de reagentes pode ser misturada com compostos adicionais, por exemplo, uma amostra a ser investigada, pelo menos um reagente de detecção com um grupo eletroquimioluminescente, bem como outros componentes mencionados abaixo que suportam o método para que forma uma mistura de reagentes.

[138] Em uma realização, a presente invenção refere-se ao uso de uma mistura de reagentes, que compreende uma composição de reagentes a) que compreende i) um composto selecionado a partir do grupo de amidas de ácido carbônico de Fórmula I e Fórmula II, ii) pelo menos um correagente, e iii) um conservante, b) uma amostra a ser investigada, e c) pelo menos um reagente de detecção marcado com um grupo eletroquimioluminescente na determinação de ECL.

[139] A presente invenção refere-se ao uso de uma mistura de reagentes, que compreende uma composição de reagentes para determinação ECL, a) que compreende i) um composto selecionado a partir do grupo de amidas de ácido carbônico de Fórmula I e Fórmula II, ii) pelo menos um correagente, e iii) um conservante selecionado a partir do grupo que consiste em ácido bórico e borato, b) uma amostra a ser investigada, e c) pelo menos um reagente de detecção marcado com um grupo eletroquimioluminescente na determinação de ECL.

[140] Em uma realização adicional, a invenção refere-se ao uso de ácido bórico ou borato para realizar uma detecção eletroquimioluminescente. Além disso, em uma realização, a presente invenção também se refere ao uso de um conservante selecionado a partir do grupo que consiste em ácido bórico e borato para realizar um procedimento do método de detecção eletroquimioluminescente.

[141] Em uma realização, a presente invenção refere-se ao uso de uma mistura de reagentes, que compreende a) uma composição de reagentes para determinar ECL, que compreende i) um conservante selecionado a partir do grupo de ácido bórico e borato, e ii) pelo menos um correagente, b) uma amostra a ser investigada, e c) pelo menos um reagente de detecção marcado com um grupo eletroquimioluminescente na determinação de ECL.

[142] Além disso, a mistura de reagentes usada para determinar ECL pode compreender componentes selecionados a partir do grupo que consiste em um detergente e um agente tamponante para controle de pH. Opcionalmente, a mistura de reagentes usada pode compreender um sal e/ou um agente antiespumante. Outros componentes de teste na mistura de reagentes são selecionados a partir do grupo que consiste em reagentes específicos de analito não marcado, homólogos de analito, revestimentos de fase sólida e substâncias que reduzem interferência.

KIT

[143] Um aspecto da invenção refere-se aos kits que compreendem, em um ou mais recipientes, um ou mais componentes da composição de reagentes da invenção. Esses componentes podem ser combinados, opcionalmente, com reagentes adicionais para formar a composição de reagentes da invenção. Os kits também podem compreender em uma realização adicional ensaios relacionados aos componentes, como marcadores de ECL, reagentes de ensaio marcados com ECL, diluentes, soluções de lavagem, reagentes de desnaturação de proteínas, enzimas, reagentes de ligação, placas de ensaio, materiais descartáveis, etc.

[144] Em uma realização, a composição de reagentes está contida em um ou mais recipientes de vidro ou plástico, apropriadamente etiquetados com informação a respeito dos conteúdos da composição de reagentes e instruções a respeito do armazenamento e uso apropriados. Informações a respeito dos conteúdos da composição de reagentes, número do lote, data de fabricação, data de vencimento, instruções a respeito de armazenamento e uso apropriados também podem estar armazenados no chip RFID colocado nos recipientes de vidro ou de plástico. A informação armazenada nesse chip RFID pode ser lida por uma antena conectada em um dispositivo de leitura RFID e, além disso, processado em um meio de controle.

[145] Em uma realização, alguns ou todos os componentes da composição de reagentes podem ser armazenados, em uma realização, em um estado líquido ou seco.

[146] Em uma realização, a presente invenção refere-se a um kit para medir ECL, que contém uma composição de reagentes para determinar ECL, que compreende i) um composto selecionado a partir do grupo de amidas de ácido carbônico de Fórmula I e Fórmula II, e ii) pelo menos um correagente.

[147] Em uma realização preferencial, a presente invenção refere- se a um kit para medir ECL, que contém uma composição de reagentes para determinar ECL, que compreende i) uma amida de ácido carbônico selecionada a partir do grupo que consiste em acetamida, 2-fluoracetamida, 2-cloroacetamida, propanamida, 2-cloropropanamida, 3-cloropropanamida, butanamida e 2- clorobutanamida, e ii) pelo menos um correagente.

[148] Em outra realização preferencial, a presente invenção refere- se a um kit para medir ECL, que contém uma composição de reagentes para determinar ECL, que compreende i) uma amida de ácido carbônico selecionada a partir do grupo que consiste em acetamida, 2-cloroacetamida, propanamida e butanamida, e ii) pelo menos um correagente.

[149] Em uma realização, a presente invenção refere-se a um kit para medir ECL, que contém uma composição de reagentes para determinar ECL, que compreende i) um composto selecionado a partir do grupo de amidas de ácido carbônico de Fórmula I e Fórmula II, ii) pelo menos um correagente, e iii) um conservante.

[150] Em uma realização preferencial, a presente invenção refere- se a um kit para medir ECL, que contém uma composição de reagentes para determinar ECL, que compreende i) um composto selecionado a partir do grupo de amidas de ácido carbônico de Fórmula I e Fórmula II, ii) pelo menos um correagente, e iii) um conservante selecionado a partir do grupo que consiste em ácido bórico e borato.

[151] Em outra realização preferencial, a presente invenção refere- se a um kit para medir ECL, que contém uma composição de reagentes para determinar ECL, que compreende i) uma amida de ácido carbônico selecionada a partir do grupo que consiste em acetamida, 2-fluoracetamida, 2-cloroacetamida, propanamida, 2-cloropropanamida, 3-cloropropanamida, butanamida e 2- clorobutanamida, e ii) pelo menos um correagente, e iii) um conservante selecionado a partir do grupo que consiste em ácido bórico e borato.

[152] Em outra realização preferencial, a presente invenção refere- se a um kit para medir ECL, que contém uma composição de reagentes para determinar ECL, que compreende i) uma amida de ácido carbônico selecionada a partir do grupo que consiste em acetamida, 2-cloroacetamida, propanamida e butanamida, ii) pelo menos um correagente, e iii) um conservante selecionado a partir do grupo que consiste em ácido bórico e borato.

[153] Em uma realização, a presente invenção refere-se a um kit para medir ECL, que contém uma composição de reagentes para determinar ECL, que compreende i) um conservante selecionado a partir do grupo que consiste em ácido bórico e borato, e ii) pelo menos um correagente.

[154] As medidas supracitadas, por si mesmas, já melhoram significativamente os procedimentos conhecidos. Além disso, é possível ainda aumentar significativamente a sensibilidade e/ou faixa de medição dinâmica de um ensaio de detecção de analito por combinação dessas medidas.

[155] Os exemplos e figuras a seguir são fornecidos para auxiliar o entendimento da presente invenção, o verdadeiro escopo do que é apresentado nas reivindicações anexas. Entende-se que modificações podem ser feitas nos procedimentos apresentados sem se afastar do espírito da invenção.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[156] Figura 1 Resultados de medição com concentrações de propanamida de 0,001 M a 0,25 M (eixo X); taxa de recuperação relativa (% de Referência) da medição de ensaio ΔArtificial (ensaio artificial - ensaio de tampão de fundo), ensaio de tampão de fundo e ensaio de marcador livre são mostrados (eixo Y). Consulte o Exemplo 1 para detalhes.

[157] Figura 2 Resultados de medição com concentrações de 2- cloroacetamida de 0,001 M a 1M (eixo X); taxa de recuperação relativa (% de Referência) da medição de ensaio ΔArtificial (ensaio artificial - ensaio de tampão de fundo), ensaio de tampão de fundo e ensaio de marcador livre são mostrados (eixo Y). Consulte o Exemplo 1 para detalhes.

[158] Figura 3 Resultados de medição com concentrações de butanamida de 0,001 M a 1 M (eixo X); taxa de recuperação relativa (% de Referência) da medição de ensaio ΔArtificial (ensaio artificial - ensaio de tampão de fundo), ensaio de tampão de fundo e ensaio de marcador livre são mostrados (eixo Y). Consulte o Exemplo 1 para detalhes.

[159] Figura 4 Resultados de medição com concentrações de acetamida de 0,001 M a 1 M (eixo X); taxa de recuperação relativa (% de Referência) da medição de ensaio ΔArtificial (ensaio artificial - ensaio de tampão de fundo), ensaio de tampão de fundo e ensaio de marcador livre são mostrados (eixo Y). Consulte o Exemplo 1 para detalhes.

[160] Figura 5 Resultados de medição com concentrações de ácido bórico de 0 a 5% (eixo X); o ensaio artificial foi usado como um exemplo para um sinal específico alto; o calibrador 1 de TSH como um calibrador de nível baixo fornece um sinal de fundo (TSH Cal 1); o calibrador 2 de TSH fornece um sinal a um nível de detecção alto (TSH Cal 2). Os resultados são plotados como % da composição de reagentes de referência sem adição de ácido bórico. Consulte o Exemplo 2 para detalhes.

EXEMPLO 1 MEDIÇÕES DE ECL COM O USO DE TAMPÕES DE ENSAIO (COMPOSIÇÕES DE REAGENTES) COM AMIDAS DE ÁCIDO CARBÔNICO

[161] As medições de ECL foram realizadas com o uso do dispositivo Roche Elecsys®2010, usando protocolos disponíveis para os ensaios mencionados abaixo.

[162] Várias concentrações de compostos selecionados a partir do grupo de amidas de ácido carbônico, como indicado nas tabelas 2, 3 e 4, foram adicionadas ao tampão de ensaio a seguir: Tripropilamida (TPA) 180 mM Polidocanol 0,1% Tampão fosfato 300 mM

[163] O pH final foi ajustado para pH 6,8 com o uso de KOH/H3PO4. O tampão de ensaio também foi usado como valor em branco.

[164] Os compostos selecionados a partir do grupo de amidas de ácido carbônico (fórmulas químicas de amidas de ácido carbônico são mostrados na Tabela 1) foram adicionados ao tampão de ensaio (composição de reagentes) nas concentrações indicadas. Os resultados são relatados como recuperação de sinal em relação às medições com o uso de um tampão de ensaio desprovido desses compostos.

[165] As medidas de ensaio de tampão de fundo com um tampão de ensaio que contém as amidas de ácido carbônico na concentração mostrada na Tabela 2 foram realizadas. Valores abaixo de 100% indicam um sinal de fundo de ECL reduzido por adição da amida de ácido carbônico nas concentrações indicadas. A redução de eletroquimioluminescência de fundo na ausência de marcadores de ECL é uma vantagem, particularmente, a níveis de detecção baixos, em que o aumento de sinal em relação à razão de fundo (= relação sinal- ruído) melhora muito a sensibilidade de um ensaio. TABELA 2

n.d. = não determinado

[166] Em um experimento análogo, os sinais de marcadores livres foram determinados. O valor de marcador livre representa o sinal gerado por uma solução que contém um marcador de ECL livre na ausência de micropartículas (RuBpy 10 nM no tampão de ensaio). Esse valor é estabelecido na Tabela 3 em relação ao tampão de ensaio sem qualquer composto adicional em %. Esse formato de ensaio é também conhecido como uma medição homogênea ou formato de ensaio homogêneo. Valores acima de 100% indicam um sinal de ECL aprimorado por adição da amida de ácido carbônico selecionada na concentração selecionada. Os resultados são mostrados na Tabela 3. TABELA 3

n.d. = não determinado

[167] Adicionalmente, os valores com uso de um ensaio simplificado incluindo microesferas foram determinados. Esse ensaio artificial é um ensaio incluindo micropartículas marcadas com RuBpy para um sinal específico alto. Esse formato de ensaio é também conhecido como uma medição heterogênea ou formato de ensaio heterogêneo. A diferença entre o sinal de ensaio artificial específico e o sinal de fundo (ensaio de tampão de fundo) com o uso do tampão de ensaio, conforme descrito acima, com os compostos adicionais, conforme indicado, como ensaio ΔArtificial em % em relação a tampões de ensaio sem qualquer composto adicional. Valores acima de 100% indicam um sinal de ECL aprimorado por adição da amida de ácido carbônico selecionada na concentração selecionada. Os resultados são mostrados na Tabela 4. TABELA 4

n.d. = não determinado

[168] Na Figura 1 é apresentado um gráfico contendo os resultados para propanamida, conforme mostrado nas Tabelas 2, 3 e 4. Na Figura 2 é apresentado um gráfico contendo os resultados para 2-cloroacetamida, conforme mostrado nas Tabelas 2, 3 e 4. Na Figura 3 é apresentado um gráfico contendo os resultados para butanamida, conforme mostrado nas Tabelas 2, 3 e 4. Na Figura 1 é apresentado um gráfico contendo os resultados para acetamida, conforme mostrado nas Tabelas 2, 3 e 4.

EXEMPLO 2 ÁCIDO BÓRICO COMO UM CONSERVANTE APRIMORADOR DE SINAL

[169] As medições de ECL foram realizadas com o uso do dispositivo Roche Elecsys®2010 usando os protocolos recomendados para os ensaios mencionados abaixo.

[170] O tampão de ensaio de ECL a seguir foi usado para determinar o valor em branco: Tripropilamida (TPA) 180 mM Polidocanol 0,1% Oxaban A 0,1% Tampão fosfato 300 mM

[171] Para esse tampão de ensaio quantidades crescente de ácido bórico foram adicionadas conforme indicado. O pH final foi ajustado para pH 6,8 com o uso de KOH/H3PO4.

[172] As medições de ensaio de tampão de fundo com um tampão de ensaio que contém ácido bórico nas concentrações mostradas na Tabela 5 foram realizadas. O valor de marcador livre representa o sinal gerado por uma solução que contém um marcador de ECL livre na ausência de micropartículas (RuBpy 10 nM no tampão de ensaio, medição homogênea) em relação ao tampão de ensaio sem qualquer composto adicional em %. O ensaio artificial é um ensaio incluindo micropartículas marcadas com RuBpy para um sinal específico alto. Como um ensaio diagnóstico in vitro comercial, o ensaio de TSH Elecsys® (ensaio de tirotropina para Elecsys®; Pedido N°: 11731459) foi usado para determinar ΔTSH. O calibrador 1 de TSH 1 (conjunto TSH Cal; Pedido N°: 11731459) como um calibrador de nível baixo (analito não presente) foi usado no ensaio de TSH fornecendo um sinal de fundo (TSH Cal 1); o calibrador 2 de TSH 2 foi usado no ensaio de TSH para fornecer um valor de sinal alto (TSH Cal 2).

[173] Os resultados para o ensaio artificial, TSH Cal 1 e TSH Cal 2 são plotados na Figura 5 como a recuperação relativa em % do tampão de ensaio de referência sem adição de ácido bórico.

[174] Em particular, as seguintes medições foram realizadas: TABELA 5

[175] A adição de ácido bórico como um conservante em um tampão de ensaio melhora o sinal heterogêneo específico, especialmente no ensaio artificial e na determinação de TSH Cal 2.

EXEMPLO 3 EFEITO DE TAMPÕES DE ENSAIO QUE CONTÊM PROPANAMIDA E ÁCIDO BÓRICO NO LIMITE MAIS BAIXO DE DETECÇÃO DE ENSAIOS ELECSYS®

[176] O limite mais baixo de detecção com vários ensaios diagnósticos in vitrocomerciais (HBeAg: Roche Pedido N°: 11820583, Anti-TSHR: Roche Pedido N°: 04388780, TNThs: Roche Pedido N°: 05092744) foi determinado para comparar duas preparações de tampão de ensaio.

TAMPÃO DE ENSAIO A

[177] TPA 180 mM, polidocanol 0,1%, tampão fosfato 300 mM, Oxaban A 0,1%

TAMPÃO DE ENSAIO B

[178] TPA 180 mM, polidocanol 0,1%, propanamida 50 mM, tampão fosfato 300 mM, ácido bórico 1%

[179] O pH final de ambos os tampões de ensaio A e B foi ajustado para pH 6,8 com o uso de KOH/H3PO4.

[180] Os três ensaios comercialmente disponíveis mencionados acima foram analisados para mostrar o efeito da amida de ácido carbônico propanamida e do conservante ácido bórico no desempenho do ensaio, detectando concentrações muito baixas de analito.

[181] Os ensaios foram medidos em um analisador Roche Elecsys® e calibrados, conforme descrito em suas bulas. Para calcular o limite mais baixo de detecção, foram determinados os sinais de uma amostra sem analito (HBeAg, anti- TSHR) ou com uma concentração de analito muito baixa (TNThs). O desvio padrão da determinação de 21 vezes foi calculado, multiplicado por 2 (2SD) ou por 3 (3SD), e adicionado (HBeAg, TNThs) ou subtraído (antiTSHR, ensaio competitivo) para a média do sinal. A concentração correspondente dos sinais calculados foi então determinada com o uso da curva de calibração para cada ensaio. Para amostras com uma concentração de analito baixa (TNThs), a concentração de analito da amostra foi subtraída a partir dessas concentrações calculadas.

[182] Os três ensaios beneficiaram-se da composição de reagentes melhorada contendo uma amida de ácido carbônico, de acordo com a presente invenção, bem como contendo ácido bórico, que também tem uma função de conservante. Os resultados para os ensaios de HBeAg, anti-TSHR e TNThs são mostrados nas Tabelas 6, 7 e 8, respectivamente. TABELA 6

TABELA 7

TABELA 8

Claims (15)

1. MÉTODO PARA MEDIR UM ANALITO, em uma amostra através de detecção eletroquimioluminescente, caracterizado por compreender as etapas de: a) incubar a amostra com um reagente de detecção marcado com um grupo eletroquimioluminescente, b) separar o analito ligado e analito livre marcado com reagente de detecção, c) incubar o reagente de detecção separado marcado com uma composição reagente que compreende: i) pelo menos um correagente, e ii) pelo menos um composto selecionado a partir do grupo de amidas de ácido carbônico de Fórmula I e Fórmula II, □

com R1 = CH3, CH2F, CH2Cl, CH2CH3, CHClCH3, CH2CH2Cl, C(CH3)2CH3, CH2CH2CH3, CClHCH2CH3 ou CH2CH2CH2CH3, com R2 = H, e com R3 = H,

d) acionar eletroquimicamente a liberação de luminescência, e e) determinar o sinal de eletroquimioluminescência (ECL), medindo, assim, o analito.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela medição de um analito em uma amostra que usa ECL ser realizada em uma solução aquosa.

3. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pela amida de ácido carbônico ser selecionada a partir do grupo que consiste em acetamida, 2-fluoracetamida, 2-cloroacetamida, propanamida, 2-cloropropanamida, 3-cloropropanamida, butanamida e 2- clorobutanamida.

4. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pela composição reagente compreender uma amida de ácido carbônico a uma concentração de 0,01 M a 0,25M.

5. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pela composição reagente da etapa 1c) compreender um conservante.

6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pela composição reagente da etapa 1c) compreender um conservante a uma concentração de 0,1% a 5%.

7. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 6, caracterizado pela composição reagente da etapa 1c) compreender um conservante selecionado a partir do grupo que consiste em ácido bórico e borato.

8. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pela composição reagente da etapa 1c) compreender um detergente e um agente tamponante.

9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pela composição reagente da etapa 1c) compreender, ainda, um sal e/ou um agente antiespumante.

10. COMPOSIÇÃO REAGENTE, para determinar ECL, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada por compreender: i) um composto selecionado a partir do grupo de amidas de ácido carbônico de Fórmula I e Fórmula II, e ii) pelo menos um correagente, em que o correagente é selecionado a partir do grupo que consiste em aminas terciárias (por exemplo, tripropilamina (TPA)), oxalato e persulfato.

11. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pela composição reagente ainda conter um conservante selecionado a partir do grupo que consiste em ácido bórico e borato.

12. MISTURA REAGENTE, para determinar ECL, caracterizada por compreender uma composição reagente, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 10 a 11, uma amostra a ser investigada e pelo menos um reagente de detecção marcado com um grupo eletroquimioluminescente.

13. USO DE UMA COMPOSIÇÃO REAGENTE, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 10 a 11, caracterizado por ser na determinação de ECL.

14. USO DE UMA AMIDA DE ÁCIDO CARBÔNICO, selecionada a partir do grupo de Fórmula I e Fórmula II, caracterizado por ser na realização de um procedimento de detecção eletroquimioluminescente, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9.

15. KIT, para medir ECL, caracterizado por conter uma composição reagente, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 10 a 11.

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