DE4401577A1 - Elektrochemilumineszenzverfahren - Google Patents
ElektrochemilumineszenzverfahrenInfo
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Description
Gegenstand der Erfindung sind Verfahren zur Messung elek
trochemilumineszenter Phänomene, Verfahren zum Nachweis
eines Analyten mittels solcher Verfahren, Reagenzlösungen,
die in diesen Verfahren eingesetzt werden können und ein
für die Durchführung des Verfahrens besonders geeigneter
Apparat.
Verfahren zur Messung elektrochemilumineszenter Phänomene
sind seit einigen Jahren bekannt. Bei solchen Verfahren
wird die Fähigkeit von speziellen Metallkomplexen ausge
nutzt, durch Oxidation in einen Zustand zu gelangen, von
dem aus sie unter Abgabe von elektromagnetischer Strahlung
in einen Grundzustand zurückfallen. Solche Verfahren und
dafür geeignete Metallkomplexe sind beispielsweise in der
WO 86/02734 beschrieben.
Diese Technologie wurde immer weiter verfeinert. In der
WO 90/05296 wird der Testzusammensetzung ein Amin zuge
setzt, bevorzugt Tripropylamin, das in oxidierter Form ein
starkes Reduktionsmittel darstellt. Die elektrochemische
Reaktion findet in einem Elektrolyten statt, in dem der
Elektrochemilumineszenz (ECL)-Rest, d. h. der zur Abgabe
von elektromagnetischer Strahlung befähigte Metallkomplex,
und das Amin oxidiert werden können. Als geeigneter
Elektrolyt in wäßriger Lösung wird Phosphatpuffer bei
einem pH von 6-9, bevorzugt 7-7,5, beschrieben. In der
WO 90/05302 wird zu dieser Testzusammensetzung zur Erhöhung
der elektromagnetischen Strahlung das Detergenz Triton X-
100 oder Triton N-401 zugesetzt. In der WO 90/05411 wird
eine Verbesserung des Apparates zur Messung von ECL be
schrieben.
Ferner gelang es, die Technologie zum Nachweis von Analyten
einzusetzen, indem Elektrochemilumineszenzmarkierungen an
Analyten, Analytanaloge oder analytspezifische Substanzen
gekoppelt wurden. Die Elektrochemilumineszenz wurde zur Be
stimmung der Menge des anwesenden Analyten verwendet. Ins
besondere wurden Immunoassays beschrieben, bei denen die
üblichen Markierungen durch elektrochemilumineszente
Markierungen ersetzt sind.
Weitere Verbesserungen und Anwendungen der Technologie sind
in WO 87/06706, WO 89/04392, WO 89/10552, WO 89/10551,
WO 90/05301 und WO 90/11511 beschrieben. Die Offenbarungen
in den genannten Publikationen werden im folgenden voraus
gesetzt.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, die vorbekannten
Verfahren zu verbessern, insbesondere im Hinblick auf die
Empfindlichkeit der Analytnachweise, die mit der Elektro
chemilumineszenztechnologie möglich sind.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Messung
elektrochemilumineszenter Phänomene in einer Lösung oder an
einer an eine Lösung angrenzenden festen Phase, wobei die
Messung der Elektrochemilumineszenz bei einer Temperatur
der Lösung oder/und der festen Phase durchgeführt wird, die
über dem Gefrierpunkt der Lösung liegt, aber niedriger als
25°C ist.
Ferner ist Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur
Messung elektrochemilumineszenter Phänomene durch Anregung
von Elektrochemilumineszenz durch Anlegen einer Spannung an
eine Arbeitselektrode, wobei vor Anregen der Elektrochemi
lumineszenz an die Arbeitselektrode ein Potential zwischen
+400 und -400 mV verglichen mit einer Ag/AgCl-Referenz
elektrode angelegt wird.
Ferner ist Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur
Messung elektrochemilumineszenter Phänomene durch Anregung
von Elektrochemilumineszenz durch Anlegen einer Spannung an
eine Arbeitselektrode, wobei die Elektrochemilumineszenz
durch Anlegen einer Spannung zwischen dem Redoxpotential
des elektrolumineszenten Systems und +800 mV darüber ange
regt wird.
Ferner ist Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur
Messung elektrochemischer Phänomene in einer Lösung oder an
einer an eine Lösung angrenzende feste Phase, wobei die
Lösung ein Detergenz ausgewählt aus der Gruppe Thesit,
C14-E09, Genapol, C8-E09, Plantaren oder Octylglucosid oder
Gemische hiervon enthält.
Ferner ist Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zum Nach
weis eines Analyten mit Hilfe dieser Verfahren, geeignete
Reagenzien und ein Apparat zur Durchführung des erstge
nannten Verfahrens.
Bei dem Erfindungsgegenstand handelt es sich um eine Lehre,
die auf dem oben genannten Stand der Technik aufbaut. Die
allgemeinen Grundlagen elektrochemilumineszenter Verfahren
sind in diesem Stand der Technik ausführlich beschrieben.
Geräte zur Durchführung von Messungen der Elektrochemi
lumineszenz enthalten eine Meßeinheit mit einem Behälter
für eine Reagenzlösung, mindestens zwei Elektroden (eine
Arbeits- und eine Gegenelektrode), die während der Messung
mit der Reagenzlösung in Kontakt stehen und einen Detektor
zur Messung des durch die Elektrochemilumineszenz erzeugten
Lichtes. Generell wird bei diesen Verfahren zunächst an die
Lösung eine Ausgangsspannung (Präpolarisation) angelegt.
Anschließend wird diese Spannung über das Redoxpotential
einer in der Lösung enthaltenen Substanz, z. B. einem Amin,
erhöht. Über die dadurch oxidierte Substanz wird ein zur
Chemilumineszenz fähiges Material, z. B. bestimmte
Ruthenium-Komplexe zur Aussendung von Licht angeregt. Das
innerhalb einer bestimmten Zeit vom Detektor aufgefangene
Licht ist ein Maß für die Anwesenheit der Menge des
elektrochemilumineszenten Materials. Sofern es sich bei dem
elektrochemilumineszenten Material um eine Markierung für
einen Analyten, einen Analytanalogen oder eine analytspezi
fische Substanz, z. B. in einem Immunoassay, handelt, ist
das empfangene Licht ein Maß für die Anwesenheit des
Analyten.
Während die bisherigen elektrochemilumineszenten Verfahren
bei Temperaturen größer oder gleich 28°C arbeiteten, wurde
nun gefunden, daß bei Verwendung einer Rampenspannung mit
sinkenden Temperaturen zwar die in der Zeiteinheit ge
messene Signalstärke abnimmt, jedoch die Empfindlichkeit
überraschenderweise erheblich zunimmt. Diese Verbesserung
scheint auf eine erhebliche Verringerung der unspezifischen
Bindung von ECL-markierten Konjugaten z. B. an Elektroden
zurückzuführen zu sein. Bei einer Temperatur von 10°C ist
der Beitrag der unspezifischen Bindung nicht mehr von dem
von der Reagenzlösung herrührenden Anteils des Hintergrunds
zu unterscheiden. Es hat sich herausgestellt, daß Tempera
turen zwischen 5-20°C bevorzugt und von 9-11°C be
sonders bevorzugt sind. Die Erreichung solcher Temperaturen
ist entweder möglich durch Kühlung der Reagenzlösung, bevor
sie mit der Meßeinheit in Kontakt gebracht wird, oder/und
durch Kühlung in der Meßeinheit selbst.
Ferner hat es sich als vorteilhaft erwiesen, die an die
Arbeitselektrode angelegte Endspannung (verglichen mit
Ag/AgCl) auf einen Maximalwert zwischen dem Redox-Potential
der oxidierbaren Substanz und 2,0 Volt zu begrenzen. Beson
ders bevorzugt ist eine Spannung zwischen 1,2-1,7 Volt.
Besonders bevorzugt sind 1,6 Volt. Diese Werte gelten für
die Verwendung eines Platin-Elektrodenpaars.
Eine weitere Verbesserung der Empfindlichkeit kann erreicht
werden, indem an die Meßeinheit eine Spannung angelegt
wird, deren Verlauf über die Zeit rechteckig ist. Dies be
deutet, daß ausgehend von der Ausgangsspannung ein un
mittelbarer Anstieg der Spannung (innerhalb maximal 0,4
Sekunden) auf die oben genannte Endspannung vorgenommen
wird. Für die oben genannte Anregungszeit wird diese
Spannung im wesentlichen konstant gehalten. Nach dieser
Zeit wird die Spannung wieder unmittelbar auf eine Spannung
unter dem Redoxpotential des Systems zurückgeführt. Durch
diese Maßnahme ergibt sich außerdem eine Verbreiterung des
dynamischen Meßbereiches, das heißt, des Bereiches, inner
halb dem Analytkonzentrationen eines festgelegten Immuno
assays gemessen werden können. Für den Fall niedriger
Temperaturen ist es bevorzugt, die angelegte Rechteck
spannung für eine gegenüber bei höheren Temperaturen ver
längerte Anregungszeit aufrecht zu erhalten. Es hat sich
nämlich herausgestellt, daß auch die bis zu einer Zeit von
ca. 5 Sekunden nach Anlegen der Spannung gemessene Intensi
vität einen erheblichen Beitrag zum Signal liefert.
Eine Erhöhung der Empfindlichkeit bzw. unteren Nachweis
grenze für einen Analyten läßt sich, allein oder in Kombi
nation mit den anderen genannten Maßnahmen erreichen, wenn
die während der Durchführung der Elektrochemilumineszenz-
Messung in der Meßeinheit enthaltene Reagenzlösung ein
Alkalichlorid in einer Konzentration von 0,1 mmol/l bis
0,5 mol/l zugegeben ist. Bevorzugt ist dieses Alkalichlorid
Natriumchlorid. Die Konzentration ist für Natriumchlorid
besonders bevorzugt 0,05 mol/l bis 0,45 mol/l, besonders
bevorzugt 0,35 mol/l. Darüberhinaus hat sich herausge
stellt, daß die erfindungsgemäße Verwendung von Natrium
chlorid zu einer Verkürzung der Meßzeit ausgenutzt werden
kann. Der Stromfluß in der Zelle wird außerdem erhöht.
Überraschenderweise konnte auch eine Erhöhung des Signals
erreicht werden, indem die Ausgangsspannung vor Anregung
der Elektrochemilumineszenz an der Arbeitselektrode
zwischen +400 und -400 mV, verglichen mit einer Ag/AgCl-
Elektrode, betrug. Besonders bevorzugt ist ein Wert
zwischen +50 mV und -50 mV, besonders bevorzugt 0 mV.
Auch hier gelten die Werte für die Verwendung eines Platin
elektrodenpaars. Die Potentiale für andere Elektroden
materialien können leicht errechnet werden.
Ebenfalls eine Steigerung des Signals läßt sich erreichen
durch Einstellung eines pH-Wertes zwischen 6,8 - 9,0, be
vorzugt zwischen 7,0-8,0, besonders bevorzugt zwischen
7,25 und 7,5. Dies geschieht zweckmäßigerweise durch Ein
satz eines für den Bereich geeigneten pH-Puffers.
Es hat sich gezeigt, daß das aus der WO 90/05302 bekannte
und bisher üblicherweise zugesetzte Detergenz Triton X-100,
das in der Praxis immer in Kombination mit dem Detergenz
Tween 20 eingesetzt wurde, nicht optimal ist. Einerseits
ist Triton X-100 schlecht abbaubar und damit nicht umwelt
verträglich. Zum anderen wurde überraschenderweise gezeigt,
daß ganz bestimmte andere Detergenzien im Vergleich zu
Triton X-100 zur Verbesserung das ECL-Verfahrens führen.
Mit diesen speziellen Detergenzien wird eine erhöhte
Signalausbeute, ein besseres Signal/Rausch-Verhältnis und
damit eine erhöhte Sensitivität des Nachweisverfahrens und
eine Erniedrigung der unteren Nachweisgrenze sowie eine
bessere Präzision erreicht.
Als geeignet haben sich die Detergenzien ausgewählt aus der
Gruppe der Fettalkoholethoxylate, worunter zum Beispiel
Polidocanol (Dodecylpoly-(ethylenglycolether)n), C14-E09
(Poly(ethylenglycolether)n), Genapol (Isotridecyl
poly(ethylenglycolether)n), C8-E09 (Octylalkohol
poly(ethylenglycolether)n) zu verstehen sind, Plantaren
(Alkylpolyglucosid) und Octylglucosid (Octyl-beta-D-
glucopyranosid) oder ein Gemisch hiervon erwiesen. Die
Detergenzien werden in Konzentrationen von 0,001 bis 1,0%
eingesetzt. Die am besten geeignetste Konzentration kann
für jedes Detergenz leicht ermittelt werden.
Konzentrationen von 0,1 bis 0,5% haben sich am
geeignetsten erwiesen.
Zur Konservierung wurde bisher der Testzusammensetzung
Natriumazid üblicherweise in einer Konzentration von 5-
10 mM zugesetzt. Es hat sich gezeigt, daß dieses umwelt
schädliche Agens durch Bioban oder Oxaban ersetzt werden
kann, die weitaus umweltverträglicher als Azid sind. Über
raschenderweise hat sich gezeigt, daß diese Konservierungs
mittel einen weiteren positiven Effekt auf das ECL-Ver
fahren ausüben. Im Vergleich zu Azid wird eine Erhöhung des
Messignals beobachtet. Oxaban und Bioban werden dabei in
Konzentrationen von 0,01 bis 1%, bevorzugt 0,1 bis 0,5%
eingesetzt.
Die oben genannten Maßnahmen führen alleine schon zu erheb
lichen Verbesserungen der bekannten Verfahren. Darüber
hinaus jedoch kann die Empfindlichkeit oder/und der
dynamische Meßbereich von Analytnachweisen durch eine
Kombination der Maßnahmen in besonders großem Umfang ge
steigert werden.
Eine weitere Erniedrigung der Nachweisgrenze konnte durch
Deoxigenierung erreicht werden, z. B. durch Entgasung der
Reagenzlösung unter Vakuum (z. B. < 50 mbar, 2-4 h Raum
temperatur).
Die Steigerung der Nachweissensitivität von Analyten, bei
spielsweise in Immunoassays, wie nach dem Sandwich- oder
kompetitiven Verfahren erlaubt weitere Vereinfachungen des
Verfahrens oder der verwendeten Apparate. Beispielsweise
ist es nun möglich, als Detektor eine Photodiode zu ver
wenden, die Systemkalibration zu vereinfachen, wegen der
geringeren Meßzeit bei erhöhtem Signal die Anzahl von
durchgeführten Tests in der Zeiteinheit zu erhöhen oder die
Probenvolumina zu verringern.
Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist eine Reagenzlösung
zur Messung elektrochemischer Phänomene und insbesondere
zum Nachweis von Analyten, enthaltend ein elektrochemisch
oxidierbares Amin, das im oxidierten Zustand ein starkes
Reduktionsmittel darstellt, welche ein Alkalichlorid,
bevorzugt Natriumchlorid, in einer Konzentration von
0,1 mmol/l bis 0,5 mol/l enthält und/oder deren pH-Wert
zwischen 7,0-8,0 liegt. Zusätzlich kann noch ein
Detergenz ausgewählt aus der Gruppe Fettalkoholethoxylate,
Plantaren® und Octylglucosid oder ein Gemisch hiervon
enthalten sein.
Die Reagenzlösung wird bevorzugt mit Bioban oder Oxaban
konserviert.
Ein Apparat zur Durchführung von Nachweisen mittels
Elektrochemilumineszenz ist beispielsweise in Beispiel 1
der WO 90/05302 ausführlich beschrieben. Ein erfindungsge
mäßer Apparat enthält darüber hinaus ein Mittel zur Kühlung
der Meßeinheit oder/und eines Flüssigkeitsbehälters auf
Temperaturen zwischen 0-25°C. Als Meßeinheit soll hier
die Zelle verstanden werden, in der die Messung der
Elektrolumineszenz vorgenommen wird. Unter Flüssigkeitsbe
hälter kann ein Vorratsgefäß oder aber eine Zuführung,
z. B. Schlauch, für die während der Messung in der Meßein
heit befindlichen Reagenzlösung verstanden werden.
Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum
Nachweis eines Analyten über eine Elektrochemilumineszenz
markierung, wobei eines der oben genannten Verfahren zur
Messung elektrochemilumineszenter Phänomene verwendet
wird.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher er
läutern:
Thyroid-stimulierendes Hormon (TSH) wurde über einen
Sandwich-Immunoassay bestimmt. Zur Ausführung kam hierbei
ein Apparat, wie er in Beispiel 1 der WO 90/05302 beschrie
ben ist, welcher ferner in der Meßzelle einen Permanent
magneten enthielt (Origen 1.0 von IGEN, Rockville, USA oder
Magnalyser®) Dieses Instrument enthält ferner einen Photo
multiplier, einen Potentiostaten, eine elektrochemische
Durchflußzelle, Flüssigkeitstransfermittel und einen 50-
Tube Probenrotor. Zum Nachweis wurden vereinigt:
Die streptavidinüberzogenen Magnetpartikel wurden von der
Firma Deutsche Dynal GmbH, Deutschland bezogen (Dynabeads
M-280 Streptavidin).
Dieses Gemisch wurde 16 Minuten bei Raumtemperatur (21°C)
inkubiert und anschließend in die auf die gewünschte Meß
temperatur gebrachte Meßzelle überführt, die immobili
sierten Partikel mit Reagenzlösung BMG1 gewaschen und in
BMG1 vermessen.
BMG1 hat folgende Zusammensetzung:
Reagenz | |
pH 7,5 g per l | |
KH₂PO₄ * 2 H₂O | |
27,19 | |
H₃PO₄ | - |
Polidocanol | 1,0 |
Oxaban A | 1,0 |
TPA (Tripropylamin) | 14,33 |
KOH | 3,6 |
Die Auswirkung der Zelltemperatur auf die
Signalwiederfindung und die Standardkurve für den Fall
einer Rampenspannung wurde an dem Beispiel dieses TSH-
Immunoassays ermittelt.
Die Standards a-e hatten TSH-Konzentrationen von:
a: 0 µU/ml
b: 0,39 µU/ml
c: 3,54 µU/ml
d: 12,40 µU/ml
e: 44,30 µU/ml
b: 0,39 µU/ml
c: 3,54 µU/ml
d: 12,40 µU/ml
e: 44,30 µU/ml
Die Auswirkung der Zelltemperatur auf die Standardkurve ist
in Fig. 1 gezeigt. Aufgetragen ist die detektierte Chemi
lumineszenz gegen die Konzentration von 5 Standards
a-e mit unterschiedlicher TSH-Konzentration in µIU/ml.
Es wird klar, daß die Lichtausbeute bei Rampenspannung bei
niedrigen Temperaturen steigt.
Für unterschiedliche Temperaturen zwischen 10 und 42°C
wurde der Temperatureffekt auf die Bestimmung von TSH nach
Beispiel 1 in einem Puffer (BMG1) bei einer TSH-
Konzentration des Standards e gemessen. Hierbei wurde der
Spannungsverlauf einer sogenannten Rampenspannung benutzt,
bei dem das Potential ausgehend von einer Ausgangsspannung
von 565 mV über einen Zeitraum von ca. 1 Sekunde bis auf
3 V anstieg und anschließend mit dem gleichen Gefälle auf
1 V abfiel. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 dargestellt. Es
wird deutlich, daß bei Verwendung einer Rampenspannung die
Signalintensität von 42 nach 21°C hin zunimmt und dann bei
10°C wieder abfällt.
Bei den Temperaturen von 10 und 28°C wurde der Effekt auf
das Test-spezifische Hintergrundsignal, d. h. das Signal,
das in Abwesenheit des biotinylierten Antikörpers allein
vom TAG-Analyt-Komplex generiert wird, in dem Puffer BMG1
bestimmt. Hierbei wurde eine Rampenspannung wie in Beispiel
2 beschrieben angelegt. Die Ergebnisse sind in der Fig. 3
dargestellt. Es wird deutlich, daß die Test-spezifische
unspezifische Bindung des TAG-Analyt-Komplexes mit
fallender Temperatur abnimmt.
Für eine TSH-Bestimmung nach Beispiel 1 mit der
Konzentration des Standards e und Puffer BMG1 wurde bei
10°C und rechteckigem Spannungsverlauf, startend von
565 mV, der zeitliche Verlauf der Menge des detektierten
Lichtes gemessen. Das Ergebnis ist in Fig. 4
wiedergegeben. Es ist ersichtlich, daß ein Großteil der
Strahlungsintensität bei relativ späten Zeitpunkten
gemessen werden muß. Es muß angenommen werden, daß die
Intensität, welche nach 0,8 Sekunden gemessen wurde, bisher
entweder nicht gemessen werden konnte oder nicht gemessen
wurde.
Die Nachweisgrenze bei Verwendung des rechteckigen
Spannungsverlaufs gegenüber Rampenspannung konnte für TSH
von 0,03 µIU/ml auf 0,006 µIU/ml gesenkt werden. Der
dynamische Bereich wurde von 55 auf 104 verbessert. Diese
Quotienten stellen die Signalintensität des Standards mit
höchster Konzentration (e) zu Signalintensität des
Standards mit niedrigster Konzentration (a) dar.
In einer Reihe von Versuchen wurde der Einfluß der Größe
der für die Anregung der Elektrochemilumineszenz angelegten
Endspannung auf die Signalintensität untersucht (Rechteck
spannung). Das Ergebnis ist in Fig. 5a dargestellt.
Spannungen zwischen 1,6 und 2,0 V lieferten gute
Ergebnisse. Eine Spannung von 1,6 V erwies sich als
optimal.
In der Fig. 5b sind die Signalamplituden der Magnet
partikel (HP) dargestellt, die in der Fig. 5a als Signal
verläufe dargestellt wurden. Gleichzeitig wird das
Background-Signal (ab) und das Verhältnis der Signal
amplituden der Magnetpartikel zum Background (HP/ab)
dargestellt. Wesentlich für die Wahl der zu verwendenden
Spannung ist das Signal-Rausch-Verhältnis, also HP/ab. Aus
der Fig. 5b geht hervor, daß dieses für 1,6 V am höchsten
ist.
Zur Vermessung kam eine Suspension von Magnetpartikeln, die
folgendermaßen mit Elektrochemilumineszenzmarkierung
beladen wurden:
Mit Streptavidin gecoatete Magnetpartikel (Dynal, 2.8 µm Durchmesser) wurden mit einem Konjugat aus einem biotiny lierten polyklonalen Antikörper (IgG) gegen T4, der mit Ruthenium-bis-pyridyl-N-Hydroxy-succinimidester (IGEN, Her stellerangaben) markiert ist in einem Puffer (50 mM HEPES pH 7.4; 3% Saccharose; 2% Rinderserumalbumin; 0.01% Methylisothiazolon; 0,1% Oxypyrion®) für 1 h bei 21°C in einem Rollmixer inkubiert (20 ng Konjugat/1 mg Partikel).
Mit Streptavidin gecoatete Magnetpartikel (Dynal, 2.8 µm Durchmesser) wurden mit einem Konjugat aus einem biotiny lierten polyklonalen Antikörper (IgG) gegen T4, der mit Ruthenium-bis-pyridyl-N-Hydroxy-succinimidester (IGEN, Her stellerangaben) markiert ist in einem Puffer (50 mM HEPES pH 7.4; 3% Saccharose; 2% Rinderserumalbumin; 0.01% Methylisothiazolon; 0,1% Oxypyrion®) für 1 h bei 21°C in einem Rollmixer inkubiert (20 ng Konjugat/1 mg Partikel).
Die Partikel wurden mit unmarkierten Dynal-Partikeln so
verdünnt, daß sich eine Konzentration ergab, die 50.000
Einheiten auf dem ECL-Meßgerät (Magnalyser, IGEN) liefert.
Bis zum Gebrauch wurden die Partikel lyophilisiert. Zum Ge
brauch wurden die Partikel in 4 ml Puffer (BMG1) suspen
diert, um eine Konzentration von 600 µg/ml zu erreichen.
Die Partikel wurden in Magnalyser Testtubes als 50 µl
Suspension zusammen mit weiteren 500 µl Puffer (BMG1) über
führt und vermessen.
In einer Versuchsreihe wurde am Beispiel des TSH-Testes
nach Beispiel 1 untersucht, welchen Einfluß die
Konzentration von Natriumchlorid/Kaliumchlorid auf das ECL-
Signal hat. Hierbei wurde TSH-Standard e benutzt. Es wurde
eine Rechteck-Spannung von 1,6 V angelegt. Ausgangsspannung
war 565 mV. Der Puffer war BMG1. Die Temperatur betrug
10°C.
Es wird klar ersichtlich, daß die Testergebnisse ohne
Natriumchlorid sehr schlecht sind, während die Integrale
bei den Konzentrationen 0,1 mol/1 und 0,25 mol/l deutlich
erhöht sind. Auch bei Kaliumchlorid ergab sich ein, wenn
auch nicht so großer, Signalhub.
Die Ergebnisse sind in Fig. 6 wiedergegeben.
In einer Versuchsreihe wurde der Einfluß der Ausgangs
spannung (Vorpolarisation der Arbeitselektrode) bei 10°C
mit Puffer BMG1 für mit TAG markierten Dynalpartikeln ge
messen. Die ECL-Spannung betrug 1,6 V (Rechteck). Aus der
Zeichnung in Fig. 7 wird erkenntlich, daß die ECL-Intensi
tät bei Annäherung der Ausgangsspannung an 0 mV gegen
Ag/Agcl gegen ein Maximum strebt.
In einem TSH-Test mit Standard e nach Beispiel 1 wurde der
Einfluß des pHs in der Reagenzlösung gemessen. Weitere
Parameter waren:
Rechteck-Spannungsverlauf | |
1,6 V (Maximum) | |
Ausgangsspannung | 565 mV |
Temperatur | 10°C |
Es wird hier klar erkenntlich, daß bei pH 7,5 die Signal
intensität im gemessenen Zeitraum deutlich erhöht ist
gegenüber pH 6,8, beziehungsweise den im Stand der Technik
beschriebenen Puffern (Igen-AB).
Puffer BMG2 hat folgende Zusammensetzung:
Reagenz | |
pH 6,8 g per l | |
KH₂PO₄ * 2 H₂O | |
- | |
H₃PO₄ | 16,4 |
Polidocanol | 1,0 |
Oxaban A | 1,0 |
TPA (Tripropylamin) | 22,93 |
KOH | 5,7 |
Die Ergebnisse sind in Fig. 8 dargestellt. Die integrierte
Intensität beträgt bei pH 6,8 : 112 000 und bei pH 7,5:
399 000.
Die hier durchgeführte Versuchsreihe am Beispiel eines TSH-
Testes nach Beispiel 1 zeigt, daß durch Kombination der
erfindungsgemäßen Maßnahmen nochmals eine erhebliche
Erhöhung des ECL-Signals in einem relativ frühen Zeitraum
erreicht werden kann. Die fünf abgebildeten Kurven wurden
bei 10°C und einer Elektrochemilumineszenzspannung von
1,6 V (Rechteckspannung) gemessen.
Kurve 1: BMG2, pH 6,8, Ausgangsspannung 565 mV
Kurve 2: BMG1, pH 7,5, Ausgangsspannung 565 mV
Kurve 3: BMG2, pH 7,5, Ausgangsspannung 565 mV
Kurve 4: BMG2, pH 7,5, Ausgangsspannung 0 mV
Kurve 5: BMG2, pH 7,5, 0,25 M NaCl, Ausgangsspannung 0 mV
Kurve 2: BMG1, pH 7,5, Ausgangsspannung 565 mV
Kurve 3: BMG2, pH 7,5, Ausgangsspannung 565 mV
Kurve 4: BMG2, pH 7,5, Ausgangsspannung 0 mV
Kurve 5: BMG2, pH 7,5, 0,25 M NaCl, Ausgangsspannung 0 mV
Das Ergebnis der Versuche ist in Fig. 9 gezeigt.
In Fig. 10 sind Standardkurven für eine Bestimmung von
TSH nach Beispiel 1 bei 10°C dargestellt. Kurve 1 zeigt
die Standardkurve unter Verwendung der Rampenspannung (wie
Fig. 2), während Kurve 2 die Standardkurve unter
Verwendung einer Rechteckspannung kombiniert mit
optimierten pH, Ionenstärke- und
Präpolarisationsbedingungen wiedergibt. Dies zeigt, daß bei
Verwendung niedriger Temperaturen die Signalintensität
durch Anwendung eines rechteckigen Spannungsverlaufs noch
gesteigert werden kann.
Die Nachweisgrenze von TSH konnte durch Kombination der
Maßnahmen auf ca. 0,0028 µIU/ml gesenkt werden. Der
dynamische Bereich wurde auf ca. 280
(Standard e/Standard a) verbessert.
In weiteren Versuchen wurde bestätigt, daß sich der erfin
dungsgemäße Effekt auch für andere Analyten verifizieren
läßt. In Fig. 11 sind die Standardkurven für eine Bestim
mung von Östradiol (E2) unter den Bedingungen des Standes
Technik (Ramp) und den erfindungsgemäßen Bedingungen
(10°C, Rechteckspannung 1,6 V) verglichen. Die Empfind
lichkeit (untere Nachweisgrenze) kann um den Faktor 20 (bis
herunter auf ca. 1,5 pg/ml) gesteigert werden.
Für den Nachweis von E2 wurden folgende Komponenten mitein
ander inkubiert:
1. Schritt:
25 µl Puffer BMG1
50 µl Lösung von biotinyliertem (DSS) polyklonalem Antikörper (FAB′) gegen E2
50 µl Probe bzw. Standard (enthaltend 0,1% Polidocanol, 0,3% Rinderserumalbumin)
50 mg/ml Dihydroxytestosteron
25 µl Puffer BMG1
50 µl Lösung von biotinyliertem (DSS) polyklonalem Antikörper (FAB′) gegen E2
50 µl Probe bzw. Standard (enthaltend 0,1% Polidocanol, 0,3% Rinderserumalbumin)
50 mg/ml Dihydroxytestosteron
Danach wurde 15 min inkubiert.
2. Schritt: Zugabe von
25 µl Puffer BMG1
50 µl Magnetpartikellösung aus Beispiel 1
50 µl Lösung von TAG:
300 mg/ml FAB-Fragment gegen E2, markiert mit Ru(bpy)₃ 2+-NHS-Ester von IGEN.
25 µl Puffer BMG1
50 µl Magnetpartikellösung aus Beispiel 1
50 µl Lösung von TAG:
300 mg/ml FAB-Fragment gegen E2, markiert mit Ru(bpy)₃ 2+-NHS-Ester von IGEN.
Auch danach wurde 15 min inkubiert. Dann wurden 100 µl
BMG1 zugegeben, die Suspension in den Magnalyzer über
führt, die immobilisierten Magnetpartikel mit 1500 µl BMG1
gewaschen und in BMG1 für folgende Standards vermessen:
a 0 pg/ml
b 72 pg/ml
c 229 pg/ml
d 529 pg/ml
e 1709 pg/ml
f 5032 pg/ml
b 72 pg/ml
c 229 pg/ml
d 529 pg/ml
e 1709 pg/ml
f 5032 pg/ml
In einer Versuchsreihe wurde der alleinige Effekt der er
findungsgemäß eingesetzten Detergenzien ermittelt. Um den
Einfluß der Detergenzien auf die Signalerzeugung möglichst
unabhängig von einzelnen Testparametern, d. h. zu be
stimmten Analyten bestimmen zu können, wurden streptavidin
überzogene Magnetpartikel, an denen ein biotinylierter und
gleichzeitig ruthenylierter Antikörper eingesetzt (HSAP:
"hot-Streptavidin-Partikel").
Zum Nachweis wurden in einem Tube vereinigt:
HSAP (lyophilisierte HSAP wurden in einem Tris/Polidocanol-Puffer (100 mM; 0,1%) pH 9,0 gelöst, so daß eine Arbeitslösung von 600 µg/ml vorlag)|50 µl | |
PBS-Puffer (50 mM KH₂PO₄-Puffer; 100 mM NaCl; 0,1% RSA; pH 7,0) | 200 µl |
Reagenzlösung (200 mM KH₂PO₄-Puffer; 100 mM TPA; pH 7,5; jeweilig getestetes Reagenz) |
Dieses Gemisch wurde in ein Meßtube pipettiert und
anschließend in die Meßzelle überführt. Die HSAP wurden mit
dem Puffer AB gewaschen und in diesem Puffer die
Signalausbeute vermessen.
Die verwendeten Antikörper wurden mit Biotin-DDs (Biotinyl
amino-3,6-dioxaoctanoyl-aminocarbonyl-heptansäure-N-
hydroxysuccinimidester) biotinyliert. (Tris) (2,2′-
Bipyridyl) Rutheniumchloridhexahydrat wurde mit DSS
(isuccinylsuberat) an die Antikörper gebunden.
Es wurden Dynabeads M-280 Streptavidin der Firma Deutsche
Dynal GmbH, Deutschland benutzt.
Der Puffer (AB), der bei der Messung verwendet wurde, hatte
folgende Zusammensetzung:
KH₂PO₄ * 2 H₂O|0,2 M | |
KOH | 0,076 M |
NaCl | 0,05 mM |
TPA (Tripropylamin) | 0,1 M |
Detergenz | in den in der Tabelle angegebenen Konzentrationen |
Oxaban/Bioban | 0,1/0,3% |
pH | 7,5 |
Als Kontrolle wurden die bisher üblichen Detergenzien
Tween 20 und Triton X-100 jeweils in einer Konzentration
von 0,05% eingesetzt. Zum Vergleich wurde in der Tabelle 2
die mit diesem Detergenz erhaltene Signalausbeute als 100%
betrachtet. Als weiterer Meßwert wurde die unspezifische
Signalausbeute im Puffer (AB) bestimmt und hiermit das Ver
hältnis der Signalausbeute HSAP/AB ermittelt. Dieses Ver
hältnis zwischen der Signalausbeute mit und ohne HSAP
stellt ein gutes Indiz für die Sensitivität des Testes dar.
Aus den Ergebnissen der Tabelle 2 ist klar zu erkennen, daß
die erfindungsgemäßen Detergenzien am geeignetsten sind.
Polidocanol und C8-E09 zeigen den besten Einfluß auf das
Verhältnis HSAP/AB. Andere Detergenzien bewirken im
Vergleich zu Tween/Triton X-100 eine Verschlechterung der
Signalausbeute.
Bezeichnung der verwendeten Detergenzien | |
C8-E09: | |
Octylalkoholpoly(ethyleneglycolether)n | |
C14-E09: | Poly(ethyleneglycolether)n |
C16-E09: | Cetylpoly(ethyleneglycolether)n |
Dodecylmaltosid: | Dodecyl-β-D-glucopyranosyl(1→4)α-D-glucopyranoside |
Genapol: | Isotridecylpoly(ethyleneglycolether)n |
Octylglucosid: | Octyl-β-D-glucopyranoside |
Plantaren: | Alkylpolyglucoside (C14-C16) |
Ralufon 3-14: | n-Tetradecyl-n,n-dimethyl-3-amino-1-propansulfonat |
SDS: | Sodiumlaurylsulfate |
Polidocanol: | Dodecylpoly(ethyleneglycolether)n |
Triton X-100: | Octylphenolpoly(ethyleneglycolether)n |
Tween: | Poly(oxyethylene)n-sorbitane-monolaurate |
Claims (16)
1. Verfahren zur Messung elektrochemilumineszenter
Phänomene in einer Lösung oder aus einer an die Lösung
angrenzenden festen Phase, dadurch gekennzeichnet, daß
die Messung der Elektrochemilumineszenz bei einer
Temperatur der Lösung und/oder der festen Phase durch
geführt wird, die über dem Gefrierpunkt der Lösung
liegt, aber niedriger als 25°C ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
die Temperatur zwischen 5°C und 20°C liegt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
die Lösung ein Detergenz ausgewählt aus der Gruppe
Fettalkoholethoxylate, Plantaren und Octylglucosid
oder ein Gemisch hiervon enthält.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
die Lösung ein oder mehrere Alkali- oder Erdalkali
halogenide enthält.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
der pH der Lösung zwischen 6,8 und 9,0 liegt.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
die Elektrochemilumineszenz durch Anlegen einer
Spannung von maximal 2,0 Volt angeregt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
der Spannungsverlauf über die Zeit rechteckig ist.
8. Reagenzlösung zur Messung elektrochemischer Phänomene
enthaltend ein elektrochemisch oxidierbares Amin, das
im oxidierten Zustand ein starkes Reduktionsmittel
darstellt, dadurch gekennzeichnet, daß sie zusätzlich
ein Alkalichlorid in einer Konzentration von
0,1 mmol/l bis 0,5 mol/l enthält.
9. Reagenzlösung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet,
daß das Alkalichlorid Natriumchlorid ist.
10. Reagenz nach Anspruch 8 oder 9, dadurch
gekennzeichnet, daß das Chlorid in einer Konzentration
von 0,05 mol/l bis 0,45 mol/l enthalten ist.
11. Reagenzlösung zur Messung elektrochemischer Phänomene,
enthaltend ein elektrochemisch oxidierbares Amin, da
durch gekennzeichnet, daß sie einen pH zwischen 7,0
und 8,0 aufweist.
12. Reagenzlösung nach Ansprüchen 8 bis 11, dadurch
gekennzeichnet, daß ein Detergenz ausgewählt aus der
Gruppe Fettalkoholethoxylate, Plantaren und
Octylglucosid oder ein Gemisch hiervon enthalten ist.
13. Verfahren zur Messung elektrochemilumineszenter Phäno
mene durch Anregung von Elektrochemilumineszenz durch
Anlegen einer Spannung an eine Arbeitselektrode, da
durch gekennzeichnet, daß vor Anregung der Elektro
chemilumineszenz an die Arbeitselektrode ein Potential
zwischen +400 und -400 mV verglichen mit einer
Ag/AgCl-Elektrode angelegt wird.
14. Verfahren zur Messung elektrochemilumineszenter Phäno
mene durch Anregung von Elektrochemilumineszenz durch
Anlegen einer Spannung, dadurch gekennzeichnet, daß
die Elektrochemilumineszenz zwischen dem Redox
potential des elektrolumineszenten Systems und
+800 mV darüber angeregt wird.
15. Apparat zur Messung elektrochemilumineszenter Phäno
mene, enthaltend eine Meßeinheit und einen Flüssig
keitsbehälter, dadurch gekennzeichnet, daß er ein
Mittel zur Kühlung der Meßeinheit oder/und des
Flüssigkeitsbehälters auf Temperaturen zwischen 0 und
25°C aufweist.
16. Verfahren zum Nachweis eines Analyten über eine
Elektrochemilumineszenzmarkierung, dadurch gekenn
zeichnet, daß zur Messung der Elektrochemilumineszenz
ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-7 ver
wendet wird.
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