DE3908918A1

DE3908918A1 - Verfahren zur bestimmung von terbium oder europium enthaltenden chemischen komponenten

Info

Publication number: DE3908918A1
Application number: DE19893908918
Authority: DE
Inventors: Jouko Juhani Kankare; Keijo Ensio Haapakka
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1988-03-21
Filing date: 1989-03-18
Publication date: 1989-10-05
Anticipated expiration: 2009-03-19
Also published as: FR2628838A1; SE8801011D0; GB2217007B; GB2217007A; FR2628838B1; JPH01302144A; JPH0750032B2; SE461117B; GB8906408D0; DE3908918C2; SE8801011L

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins und/oder der Menge einer Terbium oder Europium enthaltenden chemischen Komponente.

Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren, durch das eine lumineszierende Substanz in wäßriger oder nicht wäßriger Lösung durch einen elektrischen Puls entweder direkt durch Elektronentransfer von einer Elektrode oder indirekt über dazwischengeschaltete, elektrochemisch induzierte Reaktionen angeregt wird. Die Lichtemission der Verbindung wird nach Beendigung des Anregungspulses gemessen.

Die neue Methode kann in solchen Bereichen Anwendung finden, wo sehr niedrige Nachweisgrenzen gefordert werden, zum Beispiel in den analytischen Verfahren, die auf Bindungsprozesse einschließenden Assays basieren, wie zum Beispiel Immuno-Assays und Nukleinsäure-Hybridisierungs-Assays.

Analytische Methoden, die auf Lumineszenz-Erscheinungen in ihren verschiedensten Formen basieren, sind allgemein für ihre Empfindlichkeit bekannt, haben jedoch jeweils ihre Nachteile bei sehr geringen Konzentrationen der emittierenden Spezies. Die Empfindlichkeit der Fluoreszenz wird sowohl durch Rayleigh- und Raman-Streuungsphänomene limitiert als auch durch fluoreszierende Verunreinigungen, die eine unspezifische Hintergrundemission verstärken. Die Phosphoreszenz ist hauptsächlich auf den festen Zustand beschränkt und die Emission solcher weniger Verbindungen, die bei Raumtemperatur Phosphoreszenz in Lösung zeigen, ist im allgemeinen extrem sauerstoffempfindlich, was deren praktische Anwendung beschränkt. Die verzögerte Fluoreszenz einiger Lanthaniden-Chelate wurde als Grundlage eines Immuno- Assay-Verfahrens verwendet und erlaubt sehr geringe Nachweisgrenzen. Die Verfahren, die auf der normalen Fluoreszenz- und Phosphoreszenz-Technik beruhen, die eine Anregung durch Licht verwenden, benötigen entsprechende Lichtquellen und optische Vorrichtungen. Die Verfahren, die auf Chemilumineszenz (CL) basieren, benötigen keine Anregungsoptik und die notwendigen Geräte sind im allgemeinen sehr einfach. Jedoch tauchen bei den CL-Verfahren häufig ernsthafte chemische Probleme auf.

Das erfindungsgemäß vorgeschlagene Verfahren umgeht verschiedene Nachteile von anderen Lumineszenz-Verfahren. Es wird keine Anregungsoptik benötigt und die elektronische Ausrüstung, die für die Pulsanregung über einen elektrischen Strom benötigt wird, kann sehr einfach hergestellt werden. Das Ergebnis des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, daß die unspezifische Hintergrundemission vollständig durch die Verwendung entsprechender Lumineszenz-Verbindungen mit langlebiger Lumineszenz eliminiert wird und durch die Messung der Lichtemission einige Zeit nach dem Ende des Anregungspulses.

Elektrisch erzeugte Chemilumineszenz (ECL) ist schon seit langer Zeit bekannt. Ihre Verwendung in Immuno-Assays wurde von Bard et al. (D. Ege, W. Becker und A. Bard, Anal. Chem. 56 [1984] 2413, PCT Int. Anm. WO 86/02734) vorgeschlagen. Sie schlagen die Verwendung einer Ruthenium oder Osmium enthaltenden Verbindung als Labels in Bindungs-Assays vor. Platin und glasartiger Kohlenstoff wurden als Materialien für die Arbeitselektrode in dem gegebenen Beispiel verwendet und die Lichtemission der Elektrode wurde während des Spannungspulses gemessen.

Die gegenwärtigen Erfinder konnten zeigen, daß elektrisch erzeugte Lumineszenz an oxidisch überzogenen Aluminium- oder Tantal-Elektroden durch zahlreiche anorganische Ionen (K. Haapakka et al., Anal. Chim. Acta 171 [1985] 259) und fluoreszierende organische Verbindungen (K. Haapakka et al., Anal. Chim. Acta 207 [1988] 195) in Gegenwart von geeigneten Oxidationsmitteln erzeugt werden kann. Bei diesen Untersuchungen wurde die Lichtemission an der Elektrode ebenfalls während der Anwendung des Spannungspulses auf die Elektrode gemessen.

Von großem Vorteil wäre ein Verfahren, das kostengünstige, vorzugsweise wegwerfbare Elektroden einzusetzen erlaubt und welche Verbindungen verwendet, die eine langlebige Lumineszenz aufweisen, die relativ frei von Beeinflussungen ist. Ein solches Verfahren könnte Verwendung finden beispielsweise in Bindungs-Assays, wie zum Beispiel die homogenen und heterogenen Immuno-Assays, die somit eine ziemlich einfache und kostengünstige Geräteausstattung ermöglichen. Im Immuno-Assay, oder allgemeiner in Bindungs-Assays, reagieren zwei Komponenten spezifisch miteinander und das Produkt wird durch eine geeignete, hochempfindliche Methode quantitativ erfaßt. Falls es notwendig ist, das Produkt vor seiner Bestimmung abzutrennen, wird die Methode heterogen genannt und homogen, falls keine Trennungsstufe notwendig ist. Wegen der einfacheren Vorgehensweise wird der homogene Assay bevorzugt, jedoch bieten bis heute die heterogenen Assays niedrigere Nachweisgrenzen. Typischerweise wird bei diesem Verfahren die Gegenwart einer Verbindung durch Markierung mit einer chemischen Komponente, beispielsweise radioaktive Isotope, Enzyme, fluoreszierende Verbindungen und ähnlichem, nachgewiesen, welche mit hoher Empfindlichkeit nachgewiesen werden kann. Besonders vorteilhaft ist das Verfahren des Markierens mit einer fluoreszierenden Verbindung, die eine langsame Zerfallgeschwindigkeit des angeregten Zustands aufweist. Die meisten der Proben, die einem Immuno-Assay unterworfen werden, enthalten natürliche fluoreszierende Spezies, die die Hintergrundemission verstärken und demzufolge die Nachweisgrenze in der konventionellen fluorometrischen Nachweismethode beeinträchtigen. Chelate von Europium und Terbium haben Fluoreszenzlebensdauern im Millisekundenbereich, das heißt mehrere Größenanordnungen länger als die "natürliche" Fluoreszenz von organischen Verbindungen biologischen Ursprungs.

Der homogene Assay, der auf Lumineszenz basiert, kann dann durchgeführt werden, falls der Antikörper-Antigen-Komplex, der an der Oberfläche adsorbiert ist, selektiv angeregt werden kann, ohne daß die Anregung von markierten Verbindungen in der Lösung erfolgt. Dies wurde bereits früher in der US-PS 39 39 350 durch die Verwendung von markierten Antigenen erreicht, die an an Quarzscheiben gekoppelte Antikörper gebunden waren. Die Probe wurde von einer anderen Seite der Quarzscheibe her angeregt, wobei der Strahl eine Totalreflexion an der anderen Seite der Scheibenoberfläche erfuhr. Bei dieser Meßmethode wird nur die an der festen Phase gebundene Fraktion angeregt, so daß auf diese Weise die Trennstufe vermieden wurde. Das Verfahren stellt strikte optische Qualitätsansprüche an das Probenglas, weshalb ihre Verwendung in Routine-Assays beschränkt ist. Außerdem verbleiben die Streuung und die Hintergrund-Fluoreszenz als ernsthafte Probleme. Bevorzugt kann eine Anregung lumineszierender Verbindungen auf der Oberfläche oder ihrer unmittelbaren Nachbarschaft technisch einfacher erreicht werden, indem elektrisch angeregte Lumineszenz verwendet wird und der Einfluß der Hintergrund-Fluoreszenz läßt sich durch Markierungen minimieren, die eine verzögerte Elektrolumineszenz zeigen.

Die Erfindung betrifft eine Methode zur Bestimmung der Gegenwart und/oder der Menge einer chemischen Komponente, die Terbium oder Europium enthält, durch die Anwendung eines elektrischen Pulses auf eine in eine Lösung eintauchende Elektrode, welche die Komponente gelöst und/oder auf der Oberfläche der Elektrode adsorbiert enthält und durch die Messung der verzögerten Lichtemission einige Zeit nach dem Ende des Pulses. Die gemessene Lichtemission wird als Maß für die Menge der chemischen Komponente verwendet, die in der Nähe der Elektrode vorhanden ist. Die Erscheinung, die gemessen wird, wird im folgenden verzögerte Elektrolumineszenz oder DEL in der Abkürzung genannt.

Die chemische Komponente kann die allgemeine Struktur

(M-Z)_n-L_m-Y_p

aufweisen, wobei M Terbium oder Europium ist, n eine ganze Zahl gleich oder größer 1, m und p ganze Zahlen gleich oder größer Null, Z ein mehrzähniger Ligand, L eine Kopplungsgruppe und Y eine im folgenden noch zu beschreibende Verbindung ist. Z, L und Y besitzen eine solche Zusammensetzung, daß die chemische Komponente zu einer Lichtemission angeregt werden kann, wenn sie den Bedingungen für eine verzögerte Elektrolumineszenz unterworfen ist.

Im einfachsten Fall sind m und p beide Null und n ist 1. In diesem Fall Stellt M-Z ein Chelat von Terbium oder Europium dar. Eine bevorzugte Struktur von Z ist

Das Verfahren kann zum Beispiel für eine hochempfindliche Bestimmung von Terbium verwendet werden, wie dies im Beispiel I beschrieben wird.

In einem etwas komplizierteren Fall ist n, m1 und p1. Die Verbindung Y ist dann durch ein DEL-Label markiert. Geeignete Verbindungen Y umfassen biologische Verbindungen, wie zum Beispiel ganze Zellen, subcelluläre Teilchen, Viren, Nukleinsäuren, Nukleotide, Oligonukleotide, Polynukleotide, Polysaccharide, Proteine, Polypeptide, Enzyme, celluläre Stoffwechselprodukte, Hormone, pharmazeutische Agentien, Alkaloide, Steroide, Vitamine, Aminosäuren, Kohlenhydrate, aus Serum gewonnene oder monoklonale Antikörper. Mit in den Bereich der Erfindung fällt ebenfalls die Einbeziehung synthetischer Verbindungen, wie zum Beispiel Arzneimittel, synthetischer Nukleinsäuren und synthetischer Polypeptide. Die Verbindung Y ist über Kopplungsgruppen L an die Chelate M-Z gebunden. Die Kopplungsgruppen können solche bivalente Radikale sein, wie sie allgemein für die Markierung von zu analysierenden Molekülen durch Testmoleküle verwendet werden und für den Durchschnittsfachmann gut bekannt sind. Diese bivalenten Kopplungsgruppen umfassen Karbamido-, Thiokarbamido, Amidgruppen, wie zum Beispiel -CONH-, -CONMe-; Thioethergruppen, wie zum Beispiel -S-, -S-S-; Sulfonamide, wie zum Beispiel -SO₂NH-, -SO₂NMe-. Die Kopplungsgruppe L kann ebenso eine molekulare Kette mit variabler Länge und Zusammensetzung, Spacer genannt, enthalten. Diese Spacer werden verwendet, um den Chelatteil und die Verbindung Y auf einem geeigneten Abstand voneinander zu halten und es können die zuvor erwähnten bivalenten Kopplungsgruppen als Seitengruppen verwendet werden. Ein Teil dieser Seiten- oder Endgruppen sind an die mehrzähnigen Liganden Z gebunden, das andere Ende an die Verbindungen Y. Der mehrzähnige Ligand Z kann eine aromatische Verbindung mit Chelat-bildenden Seitengruppen, wie zum Beispiel -CH₂N(NH₂COOH)₂ sein. Eine bevorzugte Struktur der Chelate ist:

Die Erfindung kann ebenfalls im Zusammenhang mit markierten interessierenden Komponenten verwendet werden, um die markierten Komponenten zur Bestimmung von Analysenbestandteilen zu verwenden oder um markierte Analoge der Analysenbestandteile zu verwenden, um die Analysenbestandteile sowohl in einem kompetitiven als auch nicht kompetitivem Bindungs-Assay zu bestimmen. Diese Bindungs-Assays können heterogen oder homogen durchgeführt werden. Analog-Bindungs-Assays werden ebenfalls in der Nukleinsäure-Hybridisierungstechnik verwendet, wo die DEL-Labels ebenfalls Verwendung finden können, wie zum Beispiel in Dot-Blot- und Sandwich-Hybridisierungs-Assays, als auch in der auf Affinitäts-Chromatographie basierenden und der PCR-Technik (polymerase chain reaction).

Beispielsweise wird in einem kompetitiven Immuno-Assay ein Antikörper auf der Elektrodenoberfläche angebracht und ein Antigen konkurriert mit einem Antigen mit einem DEL-Label um das aktive Zentrum des Antikörpers. Das Antigen korrespondiert nun mit der Verbindung Y und kann zu einem der oben beschriebenen Typen gehören. Die Menge des Antikörper-Antigen-Komplexes an der Elektrodenoberfläche ist quantitativ durch DEL-, entweder direkt nach der Immuno-Reaktion oder nach einem Spülschritt und nach Zugabe einer geeigneten Elektrolyt-Lösung, die beispielsweise Peroxydisulfat enthält, meßbar. Alternativ hierzu kann ein homogener, nicht kompetitiver Immuno-Assay durch die Fixierung eines "Fang"-Antikörpers auf der Elektrodenoberfläche erreicht werden. Das Probenantigen, das durch solche Antikörper gefangen wird, ist quantitativ durch DEL-markierte Antikörper, die an einem zweiten aktiven Zentrum des Antigens angelagert werden, meßbar. In diesem Fall können die Antigene Verbindungen der oben genannten Art in Verbindung mit der Definition von Y sein.

Zum besseren Verständnis der Meßmethode wird eine ins einzelne gehende Beschreibung der Vorrichtung gegeben. Die Meßvorrichtung setzt sich aus einem Pulsgenerator, einem Potentiostaten, einer Probenzelle mit zwei oder drei Elektroden, gegebenenfalls einem Lichtfilter oder Monochromator, einem Licht-Detektor und einem synchronisierten (Fenster-)Integrator oder Photonenzähler zusammen. Als Pulsgenerator kann jeder Generator verwendet werden, der frei programmierbare Pulsketten mit einstellbarer Amplitude erzeugen kann.

Der Potentiostat kann ein herkömmlicher Drei-Elektroden-Potentiostat sein oder, falls nur zwei Elektroden benutzt werden, ein einfacher Leistungsverstärker, der in der Lage ist, einige Zehn Milliampere Strom zu liefern.

Die Probenzelle und der Lichtdetektor sind in derselben lichtdichten Kammer eingeschlossen. Die Zelle umfaßt zwei oder drei Elektroden, die in eine Elektrolytlösung eintauchen. Im Falle von drei Elektroden stellt eine Elektrode eine Referenzelektrode dar, eine ist eine Hilfselektrode und eine ist die Arbeitselektrode. Diese sind mit dem Potentiostaten in üblicher Weise verbunden. Die Lichtemission wird an der Arbeitselektrode gemessen, die aus beliebigem, leitfähigem Material hergestellt sein kann. Bevorzugte Materialien sind oxydüberzogene Metalle, wie zum Beispiel Aluminium, Tantal, Zirkon oder Hafnium. Die Referenzelektrode kann eine herkömmliche Referenzelektrode sein, wie zum Beispiel die Kalomel-Elektrode oder die Silber- Silberchlorid-Elektrode. Die Hilfselektrode kann aus beliebigem, leitfähigem Material hergestellt sein, meistens aus Platin. Falls nur zwei Elektroden verwendet werden, können die beiden Elektroden aus demselben Material hergestellt sein, zum Beispiel aus Aluminium, wobei dann das Licht von beiden Elektroden aus emittiert wird, oder die Elektroden können aus verschiedenem Material hergestellt sein. Alternativ kann der Probenbehälter selbst aus Aluminium hergestellt sein und in diesem Fall als Arbeitselektrode dienen, von der Licht emittiert wird.

Die Lichtintensität der Arbeitselektrode wird mit einem Fotoelektronenvervielfacher oder einer Fotodiode, gegebenenfalls mit einem dazwischengeschalteten Filter oder Monochromator, gemessen und das elektrische Signal des Lichtdetektors wird auf einen Fester-synchronisierten Integrator oder einen synchronisierten Photonenzähler gegeben. Die Synchronisierung oder das Gating erfolgt bezüglich der Pulse des Pulsgenerators mit einer geeigneten Verzögerung erzeugt werden.

Im folgenden wird das erfindungsgemäße Verfahren beschrieben:

Die Probe, deren DEL gemessen werden soll, ist eine Verbindung, die in einer Lösung vorgelegt oder auf der Oberfläche der Arbeitselektrode adsorbiert ist. Die Verbindung sollte eine niedrige Zerfallsrate ihrer Elektrolumineszenz aufweisen. Bevorzugte Verbindungen sind lumineszierende Lanthaniden-Komplexe, vorzugsweise Chelate von Tb³⁺ oder Eu³⁺, die im Millisekundenbereich zerfallen. Die Verbindungen können als solche gemessen werden oder sie können als Label an das zu untersuchende Material gebunden sein. Zusätzlich zu der zu bestimmenden Verbindung enthält die Elektrolytlösung in der Probenzelle etwas Elektrolyt, vorzugsweise Sulfate oder Azetate, um die Leitfähigkeit zu erhöhen. Ein Oxidationsmittel, wie zum Beispiel Peroxydisulfat, Wasserstoffperoxyd oder gelöster Sauerstoff, können in der Lösung vorhanden sein. Die Aufgabe der Oxidationsmittel ist, hochreaktive Radikale durch eine direkte oder mittelbare elektrolytische Reduktion zur Verfügung zu stellen, wie zum Beispiel durch die Reaktion

S₂O₈^2- + e^- → SO₄^2- + SO₄^-

Diese Radikale reagieren mit der lumineszierenden Verbindung unter Aussendung von Licht. Folgerichtung wird die Elektrolumineszenz nach einem kathodischen Puls auf die Arbeitselektrode beobachtet. Anodische Pulse können bei bestimmten Typen von Lanthanidenverbindungen verwendet werden.

Eine Reihe von kathodischen Pulsen mit einer ausreichenden Dauer und Wiederholungsrate, in Abhängigkeit von der lumineszierenden Verbindung, wird auf die Arbeitselektrode gegeben. Die sich daraus ergebende Lichtemission wird nach dem Ende der kathodischen Pulse mit einer geeigneten Zeitfensterbreite und Verzögerung gemessen. Für die bevorzugten Terbium-Komplexe kann die Länge der kathodischen Pulse von 0,2 ms bis 5 ms variieren, die Verzögerung nach dem Puls beträgt 0,1 ms bis 0,5 ms und die Zeitfensterbreite von 2 ms bis 10 ms. Für die Europium-Komplexe sind diese Zeiten zirka viermal kürzer. Das während des offenen Zeitfensters integrierte Signal wird gemittelt für soviele Perioden wie nötig, um das notwendige Signal-Rausch-Verhältnis zu erreichen.

Beispiel I Standardkurve für Terbium durch Elektrolumineszenz

Die Probenlösung in diesem Beispiel enthält 0,3 M Natriumsulfat, 0,001 M Kaliumperoxydisulfat und 10^-5 M 3,6-bis-[N, N-bis (Carboxymethyl)aminomethyl]-4-bezoylphenol ist auf einen pH-Wert von 11,2 mit 5×10^-4 M TRIS und NaOH eingestellt. Die DEL-Messungen werden in wegwerfbaren Behältern aus Aluminiumfolie mit 0,3 mm Dicke und 99,9%iger Reinheit durchgeführt. Die andere Elektrode war ein kurzer Platindraht. Ansteigende Anteile Terbiumchlorid wurden zugegeben und die verzögerte Elektrolumineszenz wurde unter Verwendung von kathodischen Pulsen mit einer 1 ms Dauer, einer 8,5 Volt Amplitude und einem 4% Tastverhältnis gemessen. Das von dem Aluminiumbehälter emittierte Licht wurde mittels eines Photoelektrodenvervielfachers und einem Zwei-Kanal-Photonenzähler (Stanford Research, Model SR400) gemessen. Das Fenster des einen Kanals war offen im Zeitraum von 0,2 bis 10 ms nach dem Ende des kathodischen Pulses und der andere Kanal zählte die Dunkelstrom-Photonen im Zeitbereich von 10,2 bis 20 ms. Nach 100 Sekunden Zähldauer wurden die Inhalte der beiden Zählregister voneinander subtrahiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 und Fig. 1 gezeigt.

Terbium Mol/l
Photonen/100 s
10^-13
1 200
10^-12	11 000
10^-11	40 800
10^-10	316 000
10^-9	1 750 000
10^-8	15 824 000
10^-7	112 000 000
10^-6	565 000 000

Beispiel II Herstellung einer Markierungsverbindung Schema Synthese von 4-(3-Nitrobenzoyl)-2,6-bis[N,N-bis(methoxy carbonylmethyl)aminomethyl]phenol (1)

Zu einer 37%igen wäßrigen Formaldehyd-Lösung (0,81 g, 10 mMol) in Methanol (20 ml) wurde Dimethyl-iminodiacetat (1,61 g, 10 mMol) zugegeben. Die Lösung wurde im Vakuum konzentriert. Ein weiterer Teil Methanol (25 ml) wurde zu dem Rest zugegeben und die Lösung wurde im Vakuum konzentriert. Zu dem Rückstand wurde 4-Hydroxy-3′-nitrobenzophenon (1,22 g, 5 mMol) zugegeben und die Mischung wurde unter Rühren auf 110°C für 20 Stunden erwärmt. Das Produkt wurde durch Chromatographie auf Silika Gel gereinigt, wobei Chloroform als Elutionsmittel verwendet wurde. Die Ausbeute eines gelblichen Öls betrug 1,76 g (60%). ¹H-NMR (CDCl₃): δ 3,48 (1H, s), 3,58 (8H, s), 3,71 (12H, s), 4,08 (4H, s), 7,73 (2H, s), 7,56-8,58 (4H, m).

Synthese von 4-(3-Aminobenzoyl)-2,6-bis[N,N-bis(methoxy carbonylmethyl)aminomethyl]phenol (2)

Die Verbindung 1 (0,89 g, 1,5 mMol) wurde für eine Stunde in Methanol (50 ml) gerührt, zusammen mit 10%igem Pd/C (90 mg) unter einem Wasserstoffdruck von ca. 3,45 bar (50 psi). Die Mischung wurde filtriert und im Vakuum eingedampft. Das Produkt wurde chromatografisch auf Silika Gel gereinigt, unter Verwendung von leicht siedendem Petroleum (Siedepunkt 50-70°C)/Äthylacetat (2 : 5) als Elutionsmittel. Die Ausbeute eines gelben Öls betrug 0,40 g (48%). ¹H-NMR (CDCl₃): k 3,56 (1H, s), 3,59 (8H, s), 3,71 (12H, s), 4,01 (6H, breit s), 7,05-7,14 (4H, m), 7,70 (2H, s).

Synthese des Terbium-Komplexes 4-(3-Isothiocyanatobenzoyl)- 2,6-bis[N,N-bis(carboxymethyl)aminomethyl]phenol (3)

Die Verbindung 2 (0,40 g, 0,71 mMol) wurde während drei Stunden in 0,5 M KOH-Ethanol (20 ml) und Wasser (5 ml) gerührt. Die Mischung wurde mit 1 M HCL neutralisiert und im Vakuum eingedampft. Es wurden Wasser (15 ml) und Terbiumchlorid (0,27 g, 0,72 mMol) zugegeben, der pH-Wert wurde auf 8,0 eingestellt und die Mischung filtriert. Wenige Milliliter Aceton wurden zu dem Filtrat zugegeben und der Terbium-Komplex abfiltriert. Ein geringer Teil des Komplexes (68 mg) wurde in Wasser (3 ml) tropfenweise zu einer Mischung aus Thiophosgen (31 l, 0,4 mMol) und NaHCO₃ (42 mg, 0,5 mMol) in CHCl₃ zugegeben. Nach einstündigem Rühren wurde die Wasserschicht abgetrennt und mit Chloroform gewaschen. Nach der Zugabe einiger Milliliter Aceton wurde der Niederschlag abfiltriert und chromatographisch auf Silika Gel gereinigt, wobei CH₃CN/H₂O (4 : 1) als Elutionsmittel verwendet wurde. Die Ausbeute betrug 15 mg (38%; bezogen auf 2).

Beispiel III Heterogener Sandwich-Immuno-Assay mit Human-Pankreas-Phospholipase A2 Markierung von Schaf-Anti-Human PLA₂ Antiserum

Der 4-(3-Isothiocyanatobenzoyl)-2,6-bis[N,N-bis(carboxymethyl)- aminomethyl]phenol-Terbium-Komplex (3, Beispiel II) wurde in einem sechzigfachen molaren Überschluß mit dem Antikörper bei einem pH von 9,5 über Nacht reagieren gelassen. Der markierte Antikörper wurde von überschüssigem, freiem Terbium-Komplex auf einer mit Sephadex G-50 (1×5,5 cm) und Sepharose 6 B (1 × 5,2 cm) gefüllten Säule befreit unter Verwendung eines 0,1 M Natriumkarbonat-Puffers mit pH 9,3, der 9 g/l Natriumchlorid und 0,05% NaN₃ enthielt, als Elutionsmittel.

Beschichtung der Aluminium-Behälter

Die Aluminium-Behälter (hergestellt aus 99,9%iger Aluminiumfolie mit 0,3 mm Dicke) wurden mit Anti-Human-PLA₂ Antiserum durch physikalische Adsorption in 0,05 M Tris-HCl-Puffer, pH 7,5, der 9 g/l Natriumchlorid und 0,05% NaN₃ (TSA-Puffer) enthielt, über Nacht bei Raumtemperatur beschichtet. Nach der Beschichtung wurden die Behälter mit einer Waschlösung (Natriumchlorid 9 g/l, NaN₃ 0,01% und Tween 20 0,2 g/l) gewaschen und mit 0,1% Bovine-Serum-Albumin (BSA) über Nacht gesättigt und in feuchtem Zustand bei 4°C aufbewahrt.

Immuno-Assay

Die Aluminium-Behälter wurden einmal mit 500 µl der Waschlösung gewaschen. Dann wurden 25 µl eines Standards, der 0, 9, 54 und 324 ng/ml der Phospholipase A₂ in TSA-Puffer (0,1% BSA) enthielt, in die Becher zugegeben, gefolgt von 175 µl mit Tb-markierten Anti-PLA₂-Antikörpern (570 ng/ml) in 0,05 M Tris-H₂SO₄-Puffer, pH 7,8, der BSA mit 5 g/l, und NaN₃ 0,5 g/l enthielt. Nach einer dreistündigen Inkubation während kontinuierlichem Schütteln wurden die Behälter sechsmal mit der Waschlösung gewaschen. Die Elektrolumineszenz wurde in den Behältern nach Zugabe von 450 µl eines 0,001 M Tris-H₂SO₄-Puffers, pH 8,7, der 0,3 Mol/l Na₂SO₄ und 0,001 Mol/l K₂S₂O₈ enthielt, gemessen, wie dies im Beispiel I beschrieben ist, mit der Ausnahme, daß die Photonenzähldauer lediglich 3 Sekunden betrug.

Das Ergebnis dieses Assays ist in Tabelle 2 und Fig. 2 gezeigt.

Tabelle 2

Beispiel IV Homogener Sandwich-Immuno-Assay von Human-Pankreas PLA₂ in Serum

Die Beschichtung der Behälter und die Markierung des Schaf-Anti-Human PLA₂-Antiserums wurden durchgeführt wie in Beispiel III.

Immuno-Assay

Die Aluminium-Behälter wurden einmal mit 500 µl der Waschlösung gewaschen. Dann wurden 25 µl der Standards enthaltenden 0, 9, 54 und 324 ng/ml der Phospholipase A₂ in Human-Serum in die Becher gegeben, gefolgt von 425 µl von Tb-markierten Anti-PLA₂ Antikörpern (235 ng/ml) in 0,05 M Tris-H₂SO₄-Puffer, pH 8,7, der BSA in 5 g/l, NaN₃ in 0,5 g/l, 0,3 Mol/l Na₂SO₄ und 0,001 Mol/l K₂S₂O₈ enthielt. Nach einer dreistündigen Inkubation unter kontinuierlichem Schütteln wurde die Elektrolumineszenz direkt in den Behältern wie in Beispiel I gemessen, mit der Ausnahme, daß die Zähldauer lediglich 3 Sekunden betrug.

Die Ergebnisse dieses Assays sind in Tabelle 3 und Fig. 3 gezeigt.

Tabelle 3

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins und/oder der Menge einer Terbium oder Europium enthaltenden chemischen Komponente durch die Anwendung eines elektrischen Pulses auf eine in eine Lösung eintauchende Elektrode und durch die Messung einer verzögerten Emission von Licht einige Zeit nach dem Ende des Pulses, wobei die chemische Komponente an die Elektrode gebunden und/oder in der Lösung vorhanden ist und wobei das emittierte Licht als Maß für die vorhandene Menge der chemischen Komponente in der Nähe der Elektrode verwendet wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die chemische Komponente die allgemeine Formel (M-Z)_n-L_m-Y_paufweist, wobei:
M Terbium oder Europium ist;
Z ein mehrzähniger Ligand von M ist;
L eine Kopplungsgruppe ist, wie z. B. eine Karbamido-, Thiokarbamido-; eine Amdiogruppe, wie z. B. -CONH-, -CONMe-; eine Thioethergruppe, wie z. B. -S-, -S-S-; eine Sulfonamidgruppe, wie z. B. -SO₂NH-, -SO₂NMe-; oder wobei L eine Molekülkette variabler Länge und Zusammensetzung ist, welche an einem Ende mit dem mehrzähnigen Liganden Z durch eine der zuvorgenannten bivalenten Gruppen und am anderen Ende an den Rest Y gebunden ist;
Y ein Rest ist, welcher durch eine oder mehrere der Kopplungsgruppen L mit Z verbunden ist;
n eine ganze Zahl gleich oder größer 1 ist;
p eine ganze Zahl gleich oder größer Null ist;
m eine ganze Zahl gleich oder größer Null ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Komponente mit einem chemischen Agens verknüpfbar ist.

4. Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins eines bestimmten Analysenbestandteiles mittels einer kompetitiven Bindung des Analysenbestandteils und einer chemischen Komponente an ein chemisches Material, wobei die chemische Komponente die allgemeine Formel (M-Z)_n-L_m-Y_paufweist, wobei:
M Terbium oder Europium ist;
Z ein mehrzähniger Ligand von M ist;
L eine Kopplungsgruppe ist, wie z. B. eine Karbamido-, Thiokarbamido; eine Amidogruppe, wie z. B. -CONH-, -CONMe-; eine Thioethergruppe, wie z. B. -S-, -S-S-; eine Sulfonamidgruppe, wie z. B. -SO₂NH-, -SO₂NMe-; oder wobei L eine Molekülkette variabler Länge und Zusammensetzung ist, welche an einem Ende mit dem mehrzähnigen Liganden Z durch eine der zuvorgenannten bivalenten Gruppen und am anderen Ende an den Rest Y gebunden ist;
Y ein Rest ist, welcher durch eine oder mehrere der Kopplungsgruppen L mit Z verbunden ist;
n eine ganze Zahl gleich oder größer 1 ist;
p eine ganze Zahl gleich oder größer 1 ist;
m eine ganze Zahl gleich oder größer 1 ist,
wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt:

a) Zusammenbringen des Materials, der chemischen Komponente und des Analysenbestandteils unter geeigneten Bedingungen, so daß eine Reagenzmischung erhalten wird;
b) Anregen der chemischen Komponente zur Lichtemission durch das Anwenden eines elektrischen Pulses auf eine in eine Lösung eintauchende Elektrode;
c) Messen des emittierten Lichts einige Zeit nach dem elektrischen Puls und Bestimmung des interessierenden Analysenbestandteils hieraus.

5. Verfahren nach Anspruch 2, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß Y eine ganze Zelle, ein subcelluläres Teilchen, ein Virus, eine Nucleinsäure, ein Polysaccharid, ein Protein, ein Polypeptid, ein Enzym, ein celluläres Stoffwechselprodukt, ein Hormon, ein pharmazeutisches Agens, ein Medikament, ein Alkaloid, ein Steroid, ein Vitamin, eine Aminosäure oder ein Kohlenhydrat ist.

6. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß Y ein Nucleotid, ein Oligonucleotid oder ein Polynucleotid ist.

7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß Y ein Antikörper ist.

8. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das chemische Agens eine ganze Zelle, ein subcelluläres Teilchen, ein Virus, eine Nucleinsäure, ein Polysaccharid, ein Protein, ein Polypeptid, ein Enzym, ein celluläres Stoffwechselprodukt, ein Hormon, ein pharmazeutisches Agens, ein Medikament, ein Alkaloid, ein Steroid, ein Vitamin, eine Aminosäure oder ein Kohlenhydrat ist.

9. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das chemische Agens an der Oberfläche von mindestens einer Elektrode gebunden ist.

10. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das chemische Agens ein Antikörper ist.

11. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Analysenbestandteil eine ganze Zelle, ein subcelluläres Teilchen, ein Virus, eine Nucleinsäure, ein Nucleotid, ein Oligonucleotid, ein Polynucleotid, ein Polysaccharid, ein Protein, ein Polypeptid, ein Enzym, ein celluläres Stoffwechselprodukt, ein Hormon, ein pharmazeutisches Agens, ein Medikament, ein Alkaloid, ein Steroid, ein Vitamin, eine Aminosäure oder ein Kohlenhydrat ist.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Analysenbestandteil ein Antikörper ist.

13. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das chemische Material ein Antikörper ist.

14. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das chemische Agens ein für den Analysenbestandteil spezifischer Antikörper ist, welcher an der Elektrodenoberfläche fixiert ist, daß Y ein Antikörper für verschiedene oder identische determinierte Gruppen (Epitope) des Analysenbestandteils ist, und daß der Analysenbestandteil durch die Antikörper gebunden ist, wobei das Verfahren ein nichtkompetitiver Assay ist.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Analysenbestandteil eine ganze Zelle, ein subcelluläres Teilchen, ein Virus, eine Nucleinsäure, ein Oligonucleotid, ein Polynucleotid, ein Polysaccharid, ein Protein, ein Polypeptid, ein Enzym, ein celluläres Stoffwechselprodukt, ein Hormon, ein pharmazeutisches Agens, ein Alkaloid oder ein Kohlenhydrat ist.

16. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 3, 4, 14 oder 15, wobei das Verfahren ein homogenes Verfahren ist und die geeigneten Bedingungen so gewählt sind, daß die gebundene und die ungebundene chemische Komponente nicht vor der Beobachtung der durch den elektrischen Puls verursachten Lichtemission getrennt werden.

17. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 3, 4, 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren ein heterogenes Verfahren ist, und daß die geeigneten Bedingungen eine Trennung von gebundener und ungebundener chemischer Komponente vor der Anwendung elektrischer Pulse auf die Elektrode und der Messung des emittierten Lichtes umfassen.

18. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine der Elektroden aus Aluminium hergestellt ist.