DE3908918A1 - Verfahren zur bestimmung von terbium oder europium enthaltenden chemischen komponenten - Google Patents
Verfahren zur bestimmung von terbium oder europium enthaltenden chemischen komponentenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins
und/oder der Menge einer Terbium oder Europium enthaltenden
chemischen Komponente.
Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren, durch das
eine lumineszierende Substanz in wäßriger oder nicht wäßriger
Lösung durch einen elektrischen Puls entweder direkt durch
Elektronentransfer von einer Elektrode oder indirekt über
dazwischengeschaltete, elektrochemisch induzierte Reaktionen
angeregt wird. Die Lichtemission der Verbindung wird nach Beendigung
des Anregungspulses gemessen.
Die neue Methode kann in solchen Bereichen Anwendung finden, wo
sehr niedrige Nachweisgrenzen gefordert werden, zum Beispiel in
den analytischen Verfahren, die auf Bindungsprozesse einschließenden
Assays basieren, wie zum Beispiel Immuno-Assays
und Nukleinsäure-Hybridisierungs-Assays.
Analytische Methoden, die auf Lumineszenz-Erscheinungen in
ihren verschiedensten Formen basieren, sind allgemein für ihre
Empfindlichkeit bekannt, haben jedoch jeweils ihre Nachteile
bei sehr geringen Konzentrationen der emittierenden Spezies.
Die Empfindlichkeit der Fluoreszenz wird sowohl durch Rayleigh-
und Raman-Streuungsphänomene limitiert als auch durch fluoreszierende
Verunreinigungen, die eine unspezifische Hintergrundemission
verstärken. Die Phosphoreszenz ist hauptsächlich auf
den festen Zustand beschränkt und die Emission solcher weniger
Verbindungen, die bei Raumtemperatur Phosphoreszenz in Lösung
zeigen, ist im allgemeinen extrem sauerstoffempfindlich, was
deren praktische Anwendung beschränkt. Die verzögerte Fluoreszenz
einiger Lanthaniden-Chelate wurde als Grundlage eines Immuno-
Assay-Verfahrens verwendet und erlaubt sehr geringe Nachweisgrenzen.
Die Verfahren, die auf der normalen Fluoreszenz-
und Phosphoreszenz-Technik beruhen, die eine Anregung durch
Licht verwenden, benötigen entsprechende Lichtquellen und optische
Vorrichtungen. Die Verfahren, die auf Chemilumineszenz
(CL) basieren, benötigen keine Anregungsoptik und die notwendigen
Geräte sind im allgemeinen sehr einfach. Jedoch tauchen
bei den CL-Verfahren häufig ernsthafte chemische Probleme auf.
Das erfindungsgemäß vorgeschlagene Verfahren umgeht verschiedene
Nachteile von anderen Lumineszenz-Verfahren. Es wird keine
Anregungsoptik benötigt und die elektronische Ausrüstung, die
für die Pulsanregung über einen elektrischen Strom benötigt
wird, kann sehr einfach hergestellt werden. Das Ergebnis des
erfindungsgemäßen Verfahrens ist, daß die unspezifische Hintergrundemission
vollständig durch die Verwendung entsprechender
Lumineszenz-Verbindungen mit langlebiger Lumineszenz eliminiert
wird und durch die Messung der Lichtemission einige Zeit nach
dem Ende des Anregungspulses.
Elektrisch erzeugte Chemilumineszenz (ECL) ist schon seit
langer Zeit bekannt. Ihre Verwendung in Immuno-Assays wurde von
Bard et al. (D. Ege, W. Becker und A. Bard, Anal. Chem. 56
[1984] 2413, PCT Int. Anm. WO 86/02734) vorgeschlagen. Sie
schlagen die Verwendung einer Ruthenium oder Osmium enthaltenden
Verbindung als Labels in Bindungs-Assays vor. Platin und
glasartiger Kohlenstoff wurden als Materialien für die Arbeitselektrode
in dem gegebenen Beispiel verwendet und die Lichtemission
der Elektrode wurde während des Spannungspulses gemessen.
Die gegenwärtigen Erfinder konnten zeigen, daß elektrisch erzeugte
Lumineszenz an oxidisch überzogenen Aluminium- oder Tantal-Elektroden
durch zahlreiche anorganische Ionen (K. Haapakka
et al., Anal. Chim. Acta 171 [1985] 259) und fluoreszierende
organische Verbindungen (K. Haapakka et al., Anal. Chim. Acta
207 [1988] 195) in Gegenwart von geeigneten Oxidationsmitteln
erzeugt werden kann. Bei diesen Untersuchungen wurde die Lichtemission
an der Elektrode ebenfalls während der Anwendung des
Spannungspulses auf die Elektrode gemessen.
Von großem Vorteil wäre ein Verfahren, das kostengünstige, vorzugsweise
wegwerfbare Elektroden einzusetzen erlaubt und welche
Verbindungen verwendet, die eine langlebige Lumineszenz aufweisen,
die relativ frei von Beeinflussungen ist. Ein solches Verfahren
könnte Verwendung finden beispielsweise in Bindungs-Assays,
wie zum Beispiel die homogenen und heterogenen Immuno-Assays,
die somit eine ziemlich einfache und kostengünstige
Geräteausstattung ermöglichen. Im Immuno-Assay, oder allgemeiner
in Bindungs-Assays, reagieren zwei Komponenten spezifisch
miteinander und das Produkt wird durch eine geeignete, hochempfindliche
Methode quantitativ erfaßt. Falls es notwendig
ist, das Produkt vor seiner Bestimmung abzutrennen, wird die
Methode heterogen genannt und homogen, falls keine Trennungsstufe
notwendig ist. Wegen der einfacheren Vorgehensweise
wird der homogene Assay bevorzugt, jedoch bieten bis heute die
heterogenen Assays niedrigere Nachweisgrenzen. Typischerweise
wird bei diesem Verfahren die Gegenwart einer Verbindung durch
Markierung mit einer chemischen Komponente, beispielsweise radioaktive
Isotope, Enzyme, fluoreszierende Verbindungen und
ähnlichem, nachgewiesen, welche mit hoher Empfindlichkeit nachgewiesen
werden kann. Besonders vorteilhaft ist das Verfahren
des Markierens mit einer fluoreszierenden Verbindung, die eine
langsame Zerfallgeschwindigkeit des angeregten Zustands aufweist.
Die meisten der Proben, die einem Immuno-Assay unterworfen
werden, enthalten natürliche fluoreszierende Spezies, die
die Hintergrundemission verstärken und demzufolge die Nachweisgrenze
in der konventionellen fluorometrischen Nachweismethode
beeinträchtigen. Chelate von Europium und Terbium haben
Fluoreszenzlebensdauern im Millisekundenbereich, das heißt
mehrere Größenanordnungen länger als die "natürliche" Fluoreszenz
von organischen Verbindungen biologischen Ursprungs.
Der homogene Assay, der auf Lumineszenz basiert, kann dann
durchgeführt werden, falls der Antikörper-Antigen-Komplex, der
an der Oberfläche adsorbiert ist, selektiv angeregt werden
kann, ohne daß die Anregung von markierten Verbindungen in der
Lösung erfolgt. Dies wurde bereits früher in der US-PS
39 39 350 durch die Verwendung von markierten Antigenen erreicht,
die an an Quarzscheiben gekoppelte Antikörper gebunden
waren. Die Probe wurde von einer anderen Seite der Quarzscheibe
her angeregt, wobei der Strahl eine Totalreflexion an der anderen
Seite der Scheibenoberfläche erfuhr. Bei dieser Meßmethode
wird nur die an der festen Phase gebundene Fraktion angeregt,
so daß auf diese Weise die Trennstufe vermieden wurde.
Das Verfahren stellt strikte optische Qualitätsansprüche an das
Probenglas, weshalb ihre Verwendung in Routine-Assays beschränkt
ist. Außerdem verbleiben die Streuung und die Hintergrund-Fluoreszenz
als ernsthafte Probleme. Bevorzugt kann eine
Anregung lumineszierender Verbindungen auf der Oberfläche oder
ihrer unmittelbaren Nachbarschaft technisch einfacher erreicht
werden, indem elektrisch angeregte Lumineszenz verwendet wird
und der Einfluß der Hintergrund-Fluoreszenz läßt sich durch
Markierungen minimieren, die eine verzögerte Elektrolumineszenz
zeigen.
Die Erfindung betrifft eine Methode zur Bestimmung der Gegenwart
und/oder der Menge einer chemischen Komponente, die Terbium
oder Europium enthält, durch die Anwendung eines elektrischen
Pulses auf eine in eine Lösung eintauchende Elektrode,
welche die Komponente gelöst und/oder auf der Oberfläche der
Elektrode adsorbiert enthält und durch die Messung der verzögerten
Lichtemission einige Zeit nach dem Ende des Pulses. Die
gemessene Lichtemission wird als Maß für die Menge der chemischen
Komponente verwendet, die in der Nähe der Elektrode vorhanden
ist. Die Erscheinung, die gemessen wird, wird im folgenden
verzögerte Elektrolumineszenz oder DEL in der Abkürzung genannt.
Die chemische Komponente kann die allgemeine Struktur
(M-Z) n -L m -Y p
aufweisen, wobei M Terbium oder Europium ist, n eine ganze Zahl
gleich oder größer 1, m und p ganze Zahlen gleich oder größer
Null, Z ein mehrzähniger Ligand, L eine Kopplungsgruppe und Y
eine im folgenden noch zu beschreibende Verbindung ist. Z, L
und Y besitzen eine solche Zusammensetzung, daß die chemische
Komponente zu einer Lichtemission angeregt werden kann, wenn
sie den Bedingungen für eine verzögerte Elektrolumineszenz
unterworfen ist.
Im einfachsten Fall sind m und p beide Null und n ist 1. In
diesem Fall Stellt M-Z ein Chelat von Terbium oder Europium
dar. Eine bevorzugte Struktur von Z ist
Das Verfahren kann zum Beispiel für eine hochempfindliche Bestimmung
von Terbium verwendet werden, wie dies im Beispiel I
beschrieben wird.
In einem etwas komplizierteren Fall ist n, m1 und p1. Die
Verbindung Y ist dann durch ein DEL-Label markiert. Geeignete
Verbindungen Y umfassen biologische Verbindungen, wie zum Beispiel
ganze Zellen, subcelluläre Teilchen, Viren, Nukleinsäuren,
Nukleotide, Oligonukleotide, Polynukleotide, Polysaccharide,
Proteine, Polypeptide, Enzyme, celluläre Stoffwechselprodukte,
Hormone, pharmazeutische Agentien, Alkaloide, Steroide,
Vitamine, Aminosäuren, Kohlenhydrate, aus Serum gewonnene oder
monoklonale Antikörper. Mit in den Bereich der Erfindung fällt
ebenfalls die Einbeziehung synthetischer Verbindungen, wie zum
Beispiel Arzneimittel, synthetischer Nukleinsäuren und synthetischer
Polypeptide. Die Verbindung Y ist über Kopplungsgruppen
L an die Chelate M-Z gebunden. Die Kopplungsgruppen können
solche bivalente Radikale sein, wie sie allgemein für die Markierung
von zu analysierenden Molekülen durch Testmoleküle verwendet
werden und für den Durchschnittsfachmann gut bekannt
sind. Diese bivalenten Kopplungsgruppen umfassen Karbamido-,
Thiokarbamido, Amidgruppen, wie zum Beispiel -CONH-, -CONMe-;
Thioethergruppen, wie zum Beispiel -S-, -S-S-; Sulfonamide,
wie zum Beispiel -SO₂NH-, -SO₂NMe-. Die Kopplungsgruppe L
kann ebenso eine molekulare Kette mit variabler Länge und Zusammensetzung,
Spacer genannt, enthalten. Diese Spacer werden
verwendet, um den Chelatteil und die Verbindung Y auf einem
geeigneten Abstand voneinander zu halten und es können die zuvor
erwähnten bivalenten Kopplungsgruppen als Seitengruppen
verwendet werden. Ein Teil dieser Seiten- oder Endgruppen sind
an die mehrzähnigen Liganden Z gebunden, das andere Ende an die
Verbindungen Y. Der mehrzähnige Ligand Z kann eine aromatische
Verbindung mit Chelat-bildenden Seitengruppen, wie zum Beispiel
-CH₂N(NH₂COOH)₂ sein. Eine bevorzugte Struktur der Chelate ist:
Die Erfindung kann ebenfalls im Zusammenhang mit markierten interessierenden
Komponenten verwendet werden, um die markierten
Komponenten zur Bestimmung von Analysenbestandteilen zu verwenden
oder um markierte Analoge der Analysenbestandteile zu verwenden,
um die Analysenbestandteile sowohl in einem kompetitiven
als auch nicht kompetitivem Bindungs-Assay zu bestimmen.
Diese Bindungs-Assays können heterogen oder homogen durchgeführt
werden. Analog-Bindungs-Assays werden ebenfalls in der
Nukleinsäure-Hybridisierungstechnik verwendet, wo die DEL-Labels
ebenfalls Verwendung finden können, wie zum Beispiel in
Dot-Blot- und Sandwich-Hybridisierungs-Assays, als auch in der
auf Affinitäts-Chromatographie basierenden und der PCR-Technik
(polymerase chain reaction).
Beispielsweise wird in einem kompetitiven Immuno-Assay ein Antikörper
auf der Elektrodenoberfläche angebracht und ein Antigen
konkurriert mit einem Antigen mit einem DEL-Label um das
aktive Zentrum des Antikörpers. Das Antigen korrespondiert nun
mit der Verbindung Y und kann zu einem der oben beschriebenen
Typen gehören. Die Menge des Antikörper-Antigen-Komplexes an
der Elektrodenoberfläche ist quantitativ durch DEL-, entweder
direkt nach der Immuno-Reaktion oder nach einem Spülschritt und
nach Zugabe einer geeigneten Elektrolyt-Lösung, die beispielsweise
Peroxydisulfat enthält, meßbar. Alternativ hierzu kann
ein homogener, nicht kompetitiver Immuno-Assay durch die
Fixierung eines "Fang"-Antikörpers auf der Elektrodenoberfläche
erreicht werden. Das Probenantigen, das durch solche Antikörper
gefangen wird, ist quantitativ durch DEL-markierte Antikörper,
die an einem zweiten aktiven Zentrum des Antigens angelagert
werden, meßbar. In diesem Fall können die Antigene Verbindungen
der oben genannten Art in Verbindung mit der Definition von Y
sein.
Zum besseren Verständnis der Meßmethode wird eine ins einzelne
gehende Beschreibung der Vorrichtung gegeben. Die Meßvorrichtung
setzt sich aus einem Pulsgenerator, einem Potentiostaten,
einer Probenzelle mit zwei oder drei Elektroden, gegebenenfalls
einem Lichtfilter oder Monochromator, einem Licht-Detektor und
einem synchronisierten (Fenster-)Integrator oder Photonenzähler
zusammen. Als Pulsgenerator kann jeder Generator verwendet werden,
der frei programmierbare Pulsketten mit einstellbarer
Amplitude erzeugen kann.
Der Potentiostat kann ein herkömmlicher Drei-Elektroden-Potentiostat
sein oder, falls nur zwei Elektroden benutzt werden,
ein einfacher Leistungsverstärker, der in der Lage ist,
einige Zehn Milliampere Strom zu liefern.
Die Probenzelle und der Lichtdetektor sind in derselben lichtdichten
Kammer eingeschlossen. Die Zelle umfaßt zwei oder drei
Elektroden, die in eine Elektrolytlösung eintauchen. Im Falle
von drei Elektroden stellt eine Elektrode eine Referenzelektrode
dar, eine ist eine Hilfselektrode und eine ist die Arbeitselektrode.
Diese sind mit dem Potentiostaten in üblicher Weise
verbunden. Die Lichtemission wird an der Arbeitselektrode gemessen,
die aus beliebigem, leitfähigem Material hergestellt
sein kann. Bevorzugte Materialien sind oxydüberzogene Metalle,
wie zum Beispiel Aluminium, Tantal, Zirkon oder Hafnium. Die
Referenzelektrode kann eine herkömmliche Referenzelektrode
sein, wie zum Beispiel die Kalomel-Elektrode oder die Silber-
Silberchlorid-Elektrode. Die Hilfselektrode kann aus beliebigem,
leitfähigem Material hergestellt sein, meistens aus Platin.
Falls nur zwei Elektroden verwendet werden, können die
beiden Elektroden aus demselben Material hergestellt sein, zum
Beispiel aus Aluminium, wobei dann das Licht von beiden
Elektroden aus emittiert wird, oder die Elektroden können aus
verschiedenem Material hergestellt sein. Alternativ kann der
Probenbehälter selbst aus Aluminium hergestellt sein und in
diesem Fall als Arbeitselektrode dienen, von der Licht
emittiert wird.
Die Lichtintensität der Arbeitselektrode wird mit einem Fotoelektronenvervielfacher
oder einer Fotodiode, gegebenenfalls
mit einem dazwischengeschalteten Filter oder Monochromator, gemessen
und das elektrische Signal des Lichtdetektors wird auf
einen Fester-synchronisierten Integrator oder einen synchronisierten
Photonenzähler gegeben. Die Synchronisierung oder das
Gating erfolgt bezüglich der Pulse des Pulsgenerators mit einer
geeigneten Verzögerung erzeugt werden.
Im folgenden wird das erfindungsgemäße Verfahren beschrieben:
Die Probe, deren DEL gemessen werden soll, ist eine Verbindung,
die in einer Lösung vorgelegt oder auf der Oberfläche der Arbeitselektrode
adsorbiert ist. Die Verbindung sollte eine niedrige
Zerfallsrate ihrer Elektrolumineszenz aufweisen. Bevorzugte
Verbindungen sind lumineszierende Lanthaniden-Komplexe,
vorzugsweise Chelate von Tb3+ oder Eu3+, die im Millisekundenbereich
zerfallen. Die Verbindungen können als solche gemessen
werden oder sie können als Label an das zu untersuchende Material
gebunden sein. Zusätzlich zu der zu bestimmenden Verbindung
enthält die Elektrolytlösung in der Probenzelle etwas
Elektrolyt, vorzugsweise Sulfate oder Azetate, um die Leitfähigkeit
zu erhöhen. Ein Oxidationsmittel, wie zum Beispiel
Peroxydisulfat, Wasserstoffperoxyd oder gelöster Sauerstoff,
können in der Lösung vorhanden sein. Die Aufgabe der
Oxidationsmittel ist, hochreaktive Radikale durch eine direkte
oder mittelbare elektrolytische Reduktion zur Verfügung zu
stellen, wie zum Beispiel durch die Reaktion
S₂O₈2- + e- → SO₄2- + SO₄-
Diese Radikale reagieren mit der lumineszierenden Verbindung
unter Aussendung von Licht. Folgerichtung wird die Elektrolumineszenz
nach einem kathodischen Puls auf die Arbeitselektrode
beobachtet. Anodische Pulse können bei bestimmten Typen von
Lanthanidenverbindungen verwendet werden.
Eine Reihe von kathodischen Pulsen mit einer ausreichenden
Dauer und Wiederholungsrate, in Abhängigkeit von der lumineszierenden
Verbindung, wird auf die Arbeitselektrode gegeben.
Die sich daraus ergebende Lichtemission wird nach dem Ende der
kathodischen Pulse mit einer geeigneten Zeitfensterbreite und
Verzögerung gemessen. Für die bevorzugten Terbium-Komplexe kann
die Länge der kathodischen Pulse von 0,2 ms bis 5 ms variieren,
die Verzögerung nach dem Puls beträgt 0,1 ms bis 0,5 ms und die
Zeitfensterbreite von 2 ms bis 10 ms. Für die Europium-Komplexe
sind diese Zeiten zirka viermal kürzer. Das während des offenen
Zeitfensters integrierte Signal wird gemittelt für soviele
Perioden wie nötig, um das notwendige Signal-Rausch-Verhältnis
zu erreichen.
Die Probenlösung in diesem Beispiel enthält 0,3 M Natriumsulfat,
0,001 M Kaliumperoxydisulfat und 10-5 M 3,6-bis-[N, N-bis
(Carboxymethyl)aminomethyl]-4-bezoylphenol ist auf einen pH-Wert
von 11,2 mit 5×10-4 M TRIS und NaOH eingestellt. Die
DEL-Messungen werden in wegwerfbaren Behältern aus Aluminiumfolie
mit 0,3 mm Dicke und 99,9%iger Reinheit durchgeführt.
Die andere Elektrode war ein kurzer Platindraht. Ansteigende
Anteile Terbiumchlorid wurden zugegeben und die verzögerte
Elektrolumineszenz wurde unter Verwendung von kathodischen Pulsen
mit einer 1 ms Dauer, einer 8,5 Volt Amplitude und einem
4% Tastverhältnis gemessen. Das von dem Aluminiumbehälter
emittierte Licht wurde mittels eines Photoelektrodenvervielfachers
und einem Zwei-Kanal-Photonenzähler (Stanford Research,
Model SR400) gemessen. Das Fenster des einen Kanals war offen
im Zeitraum von 0,2 bis 10 ms nach dem Ende des kathodischen
Pulses und der andere Kanal zählte die Dunkelstrom-Photonen
im Zeitbereich von 10,2 bis 20 ms. Nach 100 Sekunden Zähldauer
wurden die Inhalte der beiden Zählregister voneinander subtrahiert.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 und Fig. 1 gezeigt.
Terbium Mol/l | |
Photonen/100 s | |
10-13 | |
1 200 | |
10-12 | 11 000 |
10-11 | 40 800 |
10-10 | 316 000 |
10-9 | 1 750 000 |
10-8 | 15 824 000 |
10-7 | 112 000 000 |
10-6 | 565 000 000 |
Zu einer 37%igen wäßrigen Formaldehyd-Lösung (0,81 g, 10 mMol)
in Methanol (20 ml) wurde Dimethyl-iminodiacetat (1,61 g,
10 mMol) zugegeben. Die Lösung wurde im Vakuum konzentriert.
Ein weiterer Teil Methanol (25 ml) wurde zu dem Rest zugegeben
und die Lösung wurde im Vakuum konzentriert. Zu dem Rückstand
wurde 4-Hydroxy-3′-nitrobenzophenon (1,22 g, 5 mMol) zugegeben
und die Mischung wurde unter Rühren auf 110°C für 20 Stunden
erwärmt. Das Produkt wurde durch Chromatographie auf Silika Gel
gereinigt, wobei Chloroform als Elutionsmittel verwendet wurde.
Die Ausbeute eines gelblichen Öls betrug 1,76 g (60%). ¹H-NMR
(CDCl₃): δ 3,48 (1H, s), 3,58 (8H, s), 3,71 (12H, s), 4,08 (4H,
s), 7,73 (2H, s), 7,56-8,58 (4H, m).
Die Verbindung 1 (0,89 g, 1,5 mMol) wurde für eine Stunde in
Methanol (50 ml) gerührt, zusammen mit 10%igem Pd/C (90 mg)
unter einem Wasserstoffdruck von ca. 3,45 bar (50 psi). Die
Mischung wurde filtriert und im Vakuum eingedampft. Das Produkt
wurde chromatografisch auf Silika Gel gereinigt, unter Verwendung
von leicht siedendem Petroleum (Siedepunkt 50-70°C)/Äthylacetat
(2 : 5) als Elutionsmittel. Die Ausbeute eines gelben
Öls betrug 0,40 g (48%). ¹H-NMR (CDCl₃): k 3,56 (1H, s), 3,59
(8H, s), 3,71 (12H, s), 4,01 (6H, breit s), 7,05-7,14 (4H, m),
7,70 (2H, s).
Die Verbindung 2 (0,40 g, 0,71 mMol) wurde während drei Stunden
in 0,5 M KOH-Ethanol (20 ml) und Wasser (5 ml) gerührt. Die
Mischung wurde mit 1 M HCL neutralisiert und im Vakuum eingedampft.
Es wurden Wasser (15 ml) und Terbiumchlorid (0,27 g,
0,72 mMol) zugegeben, der pH-Wert wurde auf 8,0 eingestellt und
die Mischung filtriert. Wenige Milliliter Aceton wurden zu dem
Filtrat zugegeben und der Terbium-Komplex abfiltriert. Ein geringer
Teil des Komplexes (68 mg) wurde in Wasser (3 ml)
tropfenweise zu einer Mischung aus Thiophosgen (31 l, 0,4 mMol)
und NaHCO₃ (42 mg, 0,5 mMol) in CHCl₃ zugegeben. Nach
einstündigem Rühren wurde die Wasserschicht abgetrennt und mit
Chloroform gewaschen. Nach der Zugabe einiger Milliliter Aceton
wurde der Niederschlag abfiltriert und chromatographisch auf
Silika Gel gereinigt, wobei CH₃CN/H₂O (4 : 1) als Elutionsmittel
verwendet wurde. Die Ausbeute betrug 15 mg (38%; bezogen
auf 2).
Der 4-(3-Isothiocyanatobenzoyl)-2,6-bis[N,N-bis(carboxymethyl)-
aminomethyl]phenol-Terbium-Komplex (3, Beispiel II) wurde in
einem sechzigfachen molaren Überschluß mit dem Antikörper bei
einem pH von 9,5 über Nacht reagieren gelassen. Der markierte
Antikörper wurde von überschüssigem, freiem Terbium-Komplex auf
einer mit Sephadex G-50 (1×5,5 cm) und Sepharose 6 B (1 × 5,2 cm)
gefüllten Säule befreit unter Verwendung eines 0,1 M Natriumkarbonat-Puffers
mit pH 9,3, der 9 g/l Natriumchlorid und
0,05% NaN₃ enthielt, als Elutionsmittel.
Die Aluminium-Behälter (hergestellt aus 99,9%iger Aluminiumfolie
mit 0,3 mm Dicke) wurden mit Anti-Human-PLA₂ Antiserum
durch physikalische Adsorption in 0,05 M Tris-HCl-Puffer, pH 7,5,
der 9 g/l Natriumchlorid und 0,05% NaN₃ (TSA-Puffer)
enthielt, über Nacht bei Raumtemperatur beschichtet. Nach der
Beschichtung wurden die Behälter mit einer Waschlösung (Natriumchlorid
9 g/l, NaN₃ 0,01% und Tween 20 0,2 g/l) gewaschen
und mit 0,1% Bovine-Serum-Albumin (BSA) über Nacht gesättigt
und in feuchtem Zustand bei 4°C aufbewahrt.
Die Aluminium-Behälter wurden einmal mit 500 µl der Waschlösung
gewaschen. Dann wurden 25 µl eines Standards, der 0, 9, 54 und
324 ng/ml der Phospholipase A₂ in TSA-Puffer (0,1% BSA) enthielt,
in die Becher zugegeben, gefolgt von 175 µl mit Tb-markierten
Anti-PLA₂-Antikörpern (570 ng/ml) in 0,05 M Tris-H₂SO₄-Puffer,
pH 7,8, der BSA mit 5 g/l, und NaN₃ 0,5 g/l enthielt.
Nach einer dreistündigen Inkubation während kontinuierlichem
Schütteln wurden die Behälter sechsmal mit der Waschlösung gewaschen.
Die Elektrolumineszenz wurde in den Behältern nach Zugabe
von 450 µl eines 0,001 M Tris-H₂SO₄-Puffers, pH 8,7, der
0,3 Mol/l Na₂SO₄ und 0,001 Mol/l K₂S₂O₈ enthielt, gemessen, wie
dies im Beispiel I beschrieben ist, mit der Ausnahme, daß die
Photonenzähldauer lediglich 3 Sekunden betrug.
Das Ergebnis dieses Assays ist in Tabelle 2 und Fig. 2 gezeigt.
Die Beschichtung der Behälter und die Markierung des Schaf-Anti-Human
PLA₂-Antiserums wurden durchgeführt wie in Beispiel
III.
Die Aluminium-Behälter wurden einmal mit 500 µl der Waschlösung
gewaschen. Dann wurden 25 µl der Standards enthaltenden 0, 9,
54 und 324 ng/ml der Phospholipase A₂ in Human-Serum in die
Becher gegeben, gefolgt von 425 µl von Tb-markierten Anti-PLA₂
Antikörpern (235 ng/ml) in 0,05 M Tris-H₂SO₄-Puffer, pH 8,7,
der BSA in 5 g/l, NaN₃ in 0,5 g/l, 0,3 Mol/l Na₂SO₄ und 0,001 Mol/l
K₂S₂O₈ enthielt. Nach einer dreistündigen Inkubation
unter kontinuierlichem Schütteln wurde die Elektrolumineszenz
direkt in den Behältern wie in Beispiel I gemessen, mit der
Ausnahme, daß die Zähldauer lediglich 3 Sekunden betrug.
Die Ergebnisse dieses Assays sind in Tabelle 3 und Fig. 3 gezeigt.
Claims (18)
1. Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins und/oder der
Menge einer Terbium oder Europium enthaltenden chemischen
Komponente durch die Anwendung eines elektrischen Pulses
auf eine in eine Lösung eintauchende Elektrode und durch
die Messung einer verzögerten Emission von Licht einige
Zeit nach dem Ende des Pulses, wobei die chemische Komponente
an die Elektrode gebunden und/oder in der Lösung vorhanden
ist und wobei das emittierte Licht als Maß für die
vorhandene Menge der chemischen Komponente in der Nähe der
Elektrode verwendet wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die
chemische Komponente die allgemeine Formel
(M-Z) n -L m -Y p aufweist, wobei:
M Terbium oder Europium ist;
Z ein mehrzähniger Ligand von M ist;
L eine Kopplungsgruppe ist, wie z. B. eine Karbamido-, Thiokarbamido-; eine Amdiogruppe, wie z. B. -CONH-, -CONMe-; eine Thioethergruppe, wie z. B. -S-, -S-S-; eine Sulfonamidgruppe, wie z. B. -SO₂NH-, -SO₂NMe-; oder wobei L eine Molekülkette variabler Länge und Zusammensetzung ist, welche an einem Ende mit dem mehrzähnigen Liganden Z durch eine der zuvorgenannten bivalenten Gruppen und am anderen Ende an den Rest Y gebunden ist;
Y ein Rest ist, welcher durch eine oder mehrere der Kopplungsgruppen L mit Z verbunden ist;
n eine ganze Zahl gleich oder größer 1 ist;
p eine ganze Zahl gleich oder größer Null ist;
m eine ganze Zahl gleich oder größer Null ist.
M Terbium oder Europium ist;
Z ein mehrzähniger Ligand von M ist;
L eine Kopplungsgruppe ist, wie z. B. eine Karbamido-, Thiokarbamido-; eine Amdiogruppe, wie z. B. -CONH-, -CONMe-; eine Thioethergruppe, wie z. B. -S-, -S-S-; eine Sulfonamidgruppe, wie z. B. -SO₂NH-, -SO₂NMe-; oder wobei L eine Molekülkette variabler Länge und Zusammensetzung ist, welche an einem Ende mit dem mehrzähnigen Liganden Z durch eine der zuvorgenannten bivalenten Gruppen und am anderen Ende an den Rest Y gebunden ist;
Y ein Rest ist, welcher durch eine oder mehrere der Kopplungsgruppen L mit Z verbunden ist;
n eine ganze Zahl gleich oder größer 1 ist;
p eine ganze Zahl gleich oder größer Null ist;
m eine ganze Zahl gleich oder größer Null ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,
daß die Komponente mit einem chemischen Agens verknüpfbar
ist.
4. Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins eines bestimmten
Analysenbestandteiles mittels einer kompetitiven Bindung
des Analysenbestandteils und einer chemischen Komponente
an ein chemisches Material, wobei die chemische Komponente
die allgemeine Formel
(M-Z) n -L m -Y p aufweist, wobei:
M Terbium oder Europium ist;
Z ein mehrzähniger Ligand von M ist;
L eine Kopplungsgruppe ist, wie z. B. eine Karbamido-, Thiokarbamido; eine Amidogruppe, wie z. B. -CONH-, -CONMe-; eine Thioethergruppe, wie z. B. -S-, -S-S-; eine Sulfonamidgruppe, wie z. B. -SO₂NH-, -SO₂NMe-; oder wobei L eine Molekülkette variabler Länge und Zusammensetzung ist, welche an einem Ende mit dem mehrzähnigen Liganden Z durch eine der zuvorgenannten bivalenten Gruppen und am anderen Ende an den Rest Y gebunden ist;
Y ein Rest ist, welcher durch eine oder mehrere der Kopplungsgruppen L mit Z verbunden ist;
n eine ganze Zahl gleich oder größer 1 ist;
p eine ganze Zahl gleich oder größer 1 ist;
m eine ganze Zahl gleich oder größer 1 ist,
wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt:
M Terbium oder Europium ist;
Z ein mehrzähniger Ligand von M ist;
L eine Kopplungsgruppe ist, wie z. B. eine Karbamido-, Thiokarbamido; eine Amidogruppe, wie z. B. -CONH-, -CONMe-; eine Thioethergruppe, wie z. B. -S-, -S-S-; eine Sulfonamidgruppe, wie z. B. -SO₂NH-, -SO₂NMe-; oder wobei L eine Molekülkette variabler Länge und Zusammensetzung ist, welche an einem Ende mit dem mehrzähnigen Liganden Z durch eine der zuvorgenannten bivalenten Gruppen und am anderen Ende an den Rest Y gebunden ist;
Y ein Rest ist, welcher durch eine oder mehrere der Kopplungsgruppen L mit Z verbunden ist;
n eine ganze Zahl gleich oder größer 1 ist;
p eine ganze Zahl gleich oder größer 1 ist;
m eine ganze Zahl gleich oder größer 1 ist,
wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt:
- a) Zusammenbringen des Materials, der chemischen Komponente und des Analysenbestandteils unter geeigneten Bedingungen, so daß eine Reagenzmischung erhalten wird;
- b) Anregen der chemischen Komponente zur Lichtemission durch das Anwenden eines elektrischen Pulses auf eine in eine Lösung eintauchende Elektrode;
- c) Messen des emittierten Lichts einige Zeit nach dem elektrischen Puls und Bestimmung des interessierenden Analysenbestandteils hieraus.
5. Verfahren nach Anspruch 2, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet,
daß Y eine ganze Zelle, ein subcelluläres Teilchen,
ein Virus, eine Nucleinsäure, ein Polysaccharid, ein Protein,
ein Polypeptid, ein Enzym, ein celluläres Stoffwechselprodukt,
ein Hormon, ein pharmazeutisches Agens, ein Medikament,
ein Alkaloid, ein Steroid, ein Vitamin, eine Aminosäure
oder ein Kohlenhydrat ist.
6. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß Y
ein Nucleotid, ein Oligonucleotid oder ein Polynucleotid
ist.
7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß Y
ein Antikörper ist.
8. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das
chemische Agens eine ganze Zelle, ein subcelluläres Teilchen,
ein Virus, eine Nucleinsäure, ein Polysaccharid, ein
Protein, ein Polypeptid, ein Enzym, ein celluläres Stoffwechselprodukt,
ein Hormon, ein pharmazeutisches Agens, ein
Medikament, ein Alkaloid, ein Steroid, ein Vitamin, eine
Aminosäure oder ein Kohlenhydrat ist.
9. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das
chemische Agens an der Oberfläche von mindestens einer
Elektrode gebunden ist.
10. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das
chemische Agens ein Antikörper ist.
11. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der
Analysenbestandteil eine ganze Zelle, ein subcelluläres
Teilchen, ein Virus, eine Nucleinsäure, ein Nucleotid, ein
Oligonucleotid, ein Polynucleotid, ein Polysaccharid, ein
Protein, ein Polypeptid, ein Enzym, ein celluläres Stoffwechselprodukt,
ein Hormon, ein pharmazeutisches Agens, ein
Medikament, ein Alkaloid, ein Steroid, ein Vitamin, eine
Aminosäure oder ein Kohlenhydrat ist.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der
Analysenbestandteil ein Antikörper ist.
13. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das
chemische Material ein Antikörper ist.
14. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das
chemische Agens ein für den Analysenbestandteil spezifischer
Antikörper ist, welcher an der Elektrodenoberfläche
fixiert ist, daß Y ein Antikörper für verschiedene oder
identische determinierte Gruppen (Epitope) des Analysenbestandteils
ist, und daß der Analysenbestandteil durch die
Antikörper gebunden ist, wobei das Verfahren ein nichtkompetitiver
Assay ist.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß der
Analysenbestandteil eine ganze Zelle, ein subcelluläres
Teilchen, ein Virus, eine Nucleinsäure, ein Oligonucleotid,
ein Polynucleotid, ein Polysaccharid, ein Protein, ein
Polypeptid, ein Enzym, ein celluläres Stoffwechselprodukt,
ein Hormon, ein pharmazeutisches Agens, ein Alkaloid oder
ein Kohlenhydrat ist.
16. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 3, 4, 14
oder 15, wobei das Verfahren ein homogenes Verfahren ist
und die geeigneten Bedingungen so gewählt sind, daß die gebundene
und die ungebundene chemische Komponente nicht vor
der Beobachtung der durch den elektrischen Puls verursachten
Lichtemission getrennt werden.
17. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 3, 4, 14
oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren ein heterogenes
Verfahren ist, und daß die geeigneten Bedingungen
eine Trennung von gebundener und ungebundener chemischer
Komponente vor der Anwendung elektrischer Pulse auf die
Elektrode und der Messung des emittierten Lichtes umfassen.
18. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens
eine der Elektroden aus Aluminium hergestellt ist.
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