DE3022426A1

DE3022426A1 - Elektrochemilumineszenz-immunoassay

Info

Publication number: DE3022426A1
Application number: DE19803022426
Authority: DE
Inventors: Bruce J Oberhardt; Neil Wotherspoon
Original assignee: Technicon Instruments Corp
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1979-06-18
Filing date: 1980-06-14
Publication date: 1981-01-08
Also published as: JPS566162A; CA1132903A; DE3022426C2; GB2052046A; FR2459481A1; FR2459481B1; GB2052046B; US4280815A; JPS632063B2; IT1130345B; IT8021755A0

Description

TECHNICON INSTRUMENTS CORPORATION, Tarrytown, N.Y., VStA

Elektrο chemilumine s ζ enz-Immunoas s ay

Die Erfindung betrifft Chemilumineszenz-Immunoassays und insbesondere die Anwendung von Festphasen-Techniken zur Verbesserung der Empfindlichkeit und Genauigkeit dieser Assays.

Bei Chemilumineszenz-Immunoassays wird allgemein ein reaktionsfähiges Gemisch aus einer bekannten Menge an einem Antikörper einerseits und einer biologischen Probe mit einem unbekannten Gehalt an einem zu bestimmenden Antigen andererseits oder umgekehrt gebildet. Dieses reaktionsfähige Gemisch wird mit einer bekannten Menge an einem konkurrierenden Immunoreagenz versetzt, das aufgrund von Chemilumineszenz markiert ist. Das reaktionsfähige Gemisch wird bebrütet, und das markierte Immunoreagenz konkurriert mit dem Immunoreagenz in der Probe um die bekannte Menge an dem komplementären Reagenz, wie dies wohlbekannt ist.

Nach der Bebrütung wird der Überschuß an nicht gebundenem, markiertem Immunoreagenz normalerweise von dem reaktionsfähigen Gemisch abgetrennt, und es wird ein Oxydationsmittel zugesetzt, um die Chemilumineszenz des gebundenen, markierten Immunoreagenzes auszulösen. Die gemessene Stärke der Chemilumineszenz ist für die Menge an Antigen in der biologischen Probe kennzeichnend.

Chemilumineszenz-Immunoassays erfordern die Verwendung sehr genauer Mengen der verschiedenen Reagenzien und bzw. oder Reaktionsteilnehmer, weil das Immunoreagenz in der Probe im allgemeinen in niedrigen Konzentrationen vor-

^liegt* 030062/0 752

Eines der Ziele der Erfindung ist es, die Menge an zur Auslösung der Chemolumineszenz verwendetem Oxydationsmittel genau zu steuern sowie das Oxydationsmittel den gebundenen Chemilumineszenz-Immunoreagenzien genau und gleichmäßig zuzuführen, um einen empfindlicheren, knapperen und genaueren Immunoassay zu erhalten.

Außerdem lehrt die Erfindung ein Verfahren zur Durchführung von Chemilumineszenz-Immunoassays, bei dem die Abtrennungsstufe, ein normalerweise unpraktischer und zeitraubender Verfahrensschritt, weggelassen wird.

Schließlich betrifft die Erfindung die Erhaltung oder Wiederverwendung einiger der Reagenzien oder Reaktionsteilnehmer für nachfolgende Immunoassays, da viele der verwendeten Reagenzien kostspielig sind.

Die Erfindung betrifft, wie bereits eingangs erwähnt, die Anwendung von Festphasentechniken zur Durchführung von Chemilumineszenz-Immunoassays. In einem ersten Schritt bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird eine biologische Probe, die das zu bestimmende Immunoreagenz enthält, mit einem konkurrierenden Immunoreagenz vermischt, das eine Chemilumineszenz-Markierung trägt. Dieses Gemisch wird zwischen zwei Elektroden geführt, deren Oberflächen einander nahe benachbart sind. Auf oder nahe einer der Elektrodenoberflächen, im allgemeinen der Anode, ist ein Immunoreagenz immobilisiert, das den Immunoreagenzien der Lösung gegenüber komplementär ist. Das komplementäre Immunoreagenz kann in dehydratisierter Form vorliegen, so daß es vor seiner Verwendung eine lange Aufbewahrbarkeitsdauer besitzt, und kann durch die Lösung mit den Immunoreagenzien erneut hydratisiert werden.

Das Gemisch aus den konkurrierenden Immunoreagenzien wird anschließend bebrütet, um eine kompetitive Bindung

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eintreten zu lassen. Nach einer geeigneten Bebrütungsdauer können die überschüssigen oder nicht gebundenen Immunoreagenzien abgetrennt werden, wobei die an die Elektrode gebundenen Immunoreagenzien zurückbleiben.

Das Oxydationsmittel, das benötigt wird, um die Chemilumineszenz auszulösen, normalerweise Peroxid oder einatomiger Sauerstoff, wird anschließend an einer der Elektrodenoberflächen durch Anlegen einer gesteuerten Spannung über die Elektroden erzeugt. Die Chemilumineszenz, die durch die Oxydation der Chemilumineszenz-Markierung entsteht, wird gemessen und damit die Menge an in der Probe zu bestimmendem Immunoreagenz gemessen.

Das beschriebene Verfahren verbessert die Empfindlichkeit und Genauigkeit der Chemilumineszenz-Immunoassays durch reproduzierbares Erzeugen und gleichmäßiges Abgeben einer genauen Menge an Oxydationsmittel an die gebundenen Immunoreagenzien dadurch, daß die Spannung, die an die Elektroden angelegt wird, gesteuert wird.

Die Immunoreagenzien, die an die das Oxydationsmittel erzeugende Elektrode (Anode) gebunden sind, stehen in unmittelbarem Kontakt mit dem Oxydationsmittel, wenn dieses an der Elektrodenoberfläche erzeugt wird. Die erzeugte Chemilumineszenz ist auf ein sehr kleines Gebiet zwischen den beiden benachbarten Elektrodenoberflächen begrenzt, wodurch der geometrische Verlust an Lichtsignal verringert und die Genauigkeit und Zuverlässigkeit der Messung verbessert werden.

Eine der oder beide Elektroden können durchsichtig sein, so daß die Chemilumineszenzlichtemission unmittelbar am Ort der Reaktion meßbar sein kann. Außerdem kann eine der Elektroden als integrierender Teil eines optischen Detektors ausgebildet sein, um den Lichtverlust auf ein Minimum her ab zudrücken. 030062 / 0 7 ζ !?

— y —

Die Abtrennungsstufe gemäß den bisher bekannten Verfahren kann eliminiert werden, indem man eine geringe Menge Oxydationsmittel zu Beginn des Bebrütungszyklus erzeugt. Dies erfolgt zu dem Zweck, um den Rauschpegel (background level) von ungebundenem, markiertem Immunoreagenz zu bestimmen, das sich so nahe an der das Oxydationsmittel erzeugenden Elektrode befindet, daß es chemiluminesziert. Durch Subtrahieren des Signals, das von ungebundenen Komponenten erzeugt wird, von dem Gesamtreaktionssignal wird die Notwendigkeit beseitigt, eine Abtrennungs- oder Waschstufe vorzusehen. Eine weitere Technik zur Eliminierung der Abtrennungsstufe kann auf der Zeitanalyse des Signals beruhen, das als Antwort auf die elektrische Auslösung der Chemilumineszenz erzeugt wird. Aufgrund von Chemilumineszenz markierte Teilchen, die an komplementäre immunoreaktive Teilchen gebunden sind, sind nämlich näher an der Stelle der Erzeugung des Oxydationsmittel angeordnet und erzeugen daher früher ein erfaßbares Signal als die ungebundenen chemilumineszierenden Teilchen, die weiter weg von der Anode angeordnet sind, so daß die unterschiedlichen Signale aufgrund des Zeitpunktes ihrer Erzeugung voneinander unterschieden werden können.

Die immunoreaktiven Reagenzien sind kostspielig, und es ist daher zweckmäßig, sie wiederzuverwenden. Gemäß der Erfindung kann das immobilisierte, auf der Elektrode befindliche Immunoreagenz wiederverwendet werden, indem man nach jedem Assay die an sie gebundenen Immunoreagenzien entfernt und somit das auf der Elektrode gehaltene Immunoreagenz für seine Wiederverwendung freimacht. Dies kann dadurch erfolgen, daß man beispielsweise die umgesetzten Antigene von dem an die Elektrode gebundenen Antikörper dissoziiert.

Aufgabe der Erfindung ist somit die Schaffung eines verbesserten Chemilumineszenz-Immunoassays, ferner die Schaffung eines Verfahrens und einer Vorrichtung zur Durch-

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führung eines Festphasen-Chemilumineszenz-Immunoassays und insbesondere eines solchen, der empfindlicher, knapper und genauer ist als die bisherigen, indem man die Menge, Gleichmäßigkeit und den Zeitablauf der Abgabe des zur Auslösung der Chemilumineszenz erforderlichen Oxydationsmittels sorgfältig steuert.

Aufgabe der Erfindung ist weiterhin die Schaffung eines Verfahrens und einer Vorrichtung zur Durchführung eines zweckmäßigen und kostengünstigen Chemilumineszenz-Immunoas says.

Die Erfindung wird im folgenden an Hand von Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:

F i g . 1 eine schematische Darstellung der Vorrichtung, die für den Festphasen-Chemilumineszenz-Immunoassay gemäß der Erfindung verwendet wird;

Fig . 1a eine schematische Darstellung des Vermischens der Probelösung mit der Lösung mit dem markierten Immunoreagenz sowie der nachfolgenden Einführung des Lösungsgemisches zwischen die Elektroden der in Fig. 1 gezeigten Vorrichtung zur Bildung eines reaktionsfähigen Gemisches;

Fig. 1b eine schematische Darstellung des zwischen den Elektroden der in Fig. 1 gezeigten Anordnung gebildeten reaktionsfähigen Gemisches;

Fig. 1c eine schematische Darstellung des reaktionsfähigen Gemisches gemäß Fig. 1b nach erfolgter Bebrütung;

Fig. 1d eine schematische Darstellung des bebrüteten Gemisches gemäß Fig. 1c, aus dem die nicht umgesetzten oder ungebundenen Immunoreagenzien aus dem Raum zwischen den Elektroden herausgewaschen werden;

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Fig . 1e eine schematische Darstellung der bebrüteten und gewaschenen Immunoreagenzien gemäß Fig. 1d, der nachfolgenden Erzeugung von Oxydationsmittel zur Erzielung der Chemilumineszenz der reaktiven Produkte sowie der Messung des Chemilumineszenzpegels;

F i g . 2a bis 2g schematische Darstellungen, aus denen zu ersehen ist, wie die Vorrichtung gemäß Fig. 1 verwendet werden kann, um einen Chemilumineszenz-Assay durchzuführen, bei dem keine Wasch- oder Abtrennungsstufe erforderlich ist;

Fig. 2a die Bildung des Reaktionsgemisches zwischen den Elektroden;

F i g . 2b einen elektrischen Impuls, der an die Anode gemäß Fig. 2a angelegt wird;

F i g . 2c eine grafische Darstellung der Lichtausbeute, die durch den Impuls gemäß Fig. 2b hervorgerufen worden ist;

Fig. 2d das Gemisch gemäß Fig. 2a nach der Bebrütung;

F i g . 2e einen elektrischen Impuls, der an die Anode gemäß Fig. 2d angelegt wird;

F i g . 2f eine grafische Darstellung der Lichtausbeute, die durch den Impuls gemäß Fig. 2e hervorgerufen worden ist;

F i g . 2g eine grafische Darstellung der Nettolichtausbeute;

Fig. 3a bis 3f eine schematische Darstellung einer alternativen Durchführungsform des in den Fig. 2a bis 2g dargestellten Verfahrens;

Fig. 3a ein reaktionsfähiges Gemisch, das zwischen ein Paar modifizierter Elektroden eingeführt wird, die ähnlich den in Fig. 1 und 2a dargestellten Elektroden sind;

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F i g . 3b einen elektrischen Impuls, der an die Elektroden gemäß Fig. 3a angelegt wird;

Fig. 3c eine grafische Darstellung der Lichtausbeute, die durch den Impuls gemäß Fig. 3b hervorgerufen worden ist;

Fig. 3d das reaktionsfähige Gemisch gemäß Fig. 3a nach erfolgter Bebrütung;

Fig. 3e einen elektrischen Impuls, der an die Anode gemäß Fig. 3d angelegt wird;

Fig. 3f eine grafische Darstellung der Lichtausbeute, die durch den Impuls gemäß Fig. 3e hervorgerufen worden ist;

F i g . 4a und 4b Seitenansicht und Draufsicht einer Ausführungsform der Vorrichtung gemäß Fig. 1 für kontinuierlichen Durchflußbetrieb; und

F i g . 5 eine Draufsicht einer weiteren Ausführungsform der Vorrichtung gemäß Fig. 1, bei der eine Vielzahl von Umsetzungen gleichzeitig durchgeführt werden kann.

Ganz allgemein betrifft die Erfindung, wie bereits erwähnt, die Anwendung von Festphasentechniken zur Durchführung eines Chemilumineszenz-Immunoassays. Zur Vereinfachung wird im folgenden eine Umsetzung zugrundegelegt, bei der markierte Antigene mit Probenantigenen um komplementäre Antikörper konkurrieren. Jedoch ist in diesem Zusammenhang selbstverständlich, daß die Erfindung auch leicht auf ein Verfahren angewandt werden kann, bei dem Probenantikörper mit markierten Antikörpern um komplementäre Antigene konkurrieren.

Gemäß Fig. 1, in der eine schematische Darstellung der Vorrichtung gemäß der Erfindung gezeigt ist, besteht diese Vorrichtung ganz allgemein aus zwei benachbarten Elektroden 10 und 11. Die Elektrode 10 ist die Anode, die

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Elektrode 11 aufgrund der Polarität der Gleichstromquelle 12, mit der die Kathoden über Schalter 13 verbunden werden können, die Kathode.

Antikörper 14 werden auf der Anode 10 festgehalten oder immobilisiert. Die Antikörper können an die Anode 10 nach bekannten Methoden gebunden werden, beispielsweise:

(1) Antikörper können an eine Metall- oder Metalloxidoberfläche, die einen Teil der Oberfläche der Anode 10 bildet, kovalent gebunden werden. Methoden zur Durchführung dieser Bindung, wurden von der General Electric Company entwickelt und sind in den folgenden Literaturstellen beschrieben: I. Giaever, Visual Detection of Carcinoembryonic Antigen on Surfaces, Reprint Nr. 7891 und J.I. Treu, Mie Scattering, Maxwell Garnett Theory, and the Giaever Immunology Slide, Reprint Nr. 8018, General Electric Company, Corporate Research and Development, P.O. Box 43_r Schenectady, New York 12301 USA.

(2) Ein dünnes Gelmaterial (nicht dargestellt), wie beispielsweise Agarose, das auf der Oberfläche der Anode 10 ausgebreitet sein kann, kann mit Antikörpern 14 imprägniert werden. Verfahren zur Kupplung an Gele können in der Affinitätschromatographieliteratur gefunden werden, beispielsweise in folgenden Literaturstellen: Cuatrecasas, P.,

J. Biol. Chem., 245, 2059 (1970); Cuatrecasa, P., Anfinsen, C.B., Methods Enzymol., 22, 345 (1971); Cuatrecasa, P., J. Biol. Chem., 245, 3059 (1970); Cuatrecasa, P., Wilchek, M., Anfinsen, C.B., Proc. Nat. Acad. Sciences USA, 61_, 636 (1968); Lang, T., Suckling, CJ., Wood H.C.S., J. Chem. Soc, 19.t 2189 (1977).

(3) Eine dünne Membran (nicht dargestellt), die über die Oberfläche 16 der Anode 10 ausgebreitet sein kann, kann mit Antikörpern 14 imprägniert oder die Antikörper 14 können an diese Membran angebunden werden. Diese Technik ist in

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folgenden Literaturstellen beschrieben: Axon, R., Porath, J., Ernback, S., Nature, 214, 1302 (1967); Hirata, A.A. und Brandrics, M.W., J. of Immunology, 100, 641 (1968).

Die Kathode 11 ist vorzugsweise transparent ausgeführt, so daß das Licht, das durch die Chemolumineszenz des Assays erzeugt wird, auf eine Vervielfacherzelle 15 auftreffen gelassen wird. Beispielsweise kann die Kathode 11 aus Glas bestehen, das mit einer dünnen, transparenten Schicht aus elektrisch leitfähigem Material, wie beispielsweise Gold oder Zinnoxid, das auf der Glasoberfläche der Kathode 11 abgeschieden ist, überzogen ist.

In einer anderen Ausführungsform kann die Kathode einstückig mit der Vervielfacherzelle 15 ausgeführt sein, indem man die Glasoberfläche von Zelle 15 mit dem leitfähigen Material (siehe Fig. 5) beschichtet.

In einer weiteren Ausführungsform kann die Kathode in Form eines (nicht dargestellten) Drahtnetzes oder -Siebes ausgeführt sein.

In den Fig. 1a bis 1e ist das Verfahren gemäß der Erfindung der Reihe nach dargestellt. Die Fig. 1a zeigt eine biologische Probe 20, die eine unbekannte Menge Antigene 21 enthält, die bestimmt werden soll. Die Probelösung 20 wird mit einer bekannten Menge an durch Chemolumineszenz markiertem Antigen 21a versetzt, wobei das Antigen 21a vom gleichen Typ ist wie das der Lösung 20. Dabei wird die Lösung 20a erhalten. Die Markierung der Immunoreagenzien mit chemilumineszierenden Substanzen ist aus der folgenden Literaturstelle bekannt: Schroeder, H.R. und Yeager, F.M., Analytical Chemistry, 5j0, 1114 (1978). Die Lösung 20a wird zwischen die Elektroden 10 und 11 der Vorrichtung gemäß Fig. 1 eingeführt, wie dargestellt, wobei das reaktionsfähige Gemisch 23 erhalten wird, das in Fig. 1b

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dargestellt ist. Das reaktionsfähige Gemisch 23 besteht (summarisch) aus einer unbekannten Menge an Probenantigen 21, die bestimmt werden soll, einer bekannten Menge aus konkurrierendem, durch Chemilumineszenz markiertem Antigen 21a sowie einer bekannten Menge an komplementären Antikörpern 14, die auf der Oberfläche 16 der Anode 10 immobilisiert sind.

Fig. 1c zeigt das reaktionsfähige Gemisch 23 nach erfolgter Bebrütung. Aus der Darstellung ergibt sich, daß die meisten der Antigene 21 bzw. 21a sich an die Antikörper 14 kompetitiv gebunden haben.

Gemäß Fig. 1d werden überschüssige oder nicht gebundene Antigene 21 bzw. 21a von dem Raum zwischen den Elektroden 10 und 11, wie durch die Pfeile 24 dargestellt ist, durch eine Waschlösung aus wäßrigem Elektrolyten ausgewaschen, wobei von der Waschlösung ein Teil zwischen den Elektroden 10 und 11 zurückbleibt.

Fig. 1e erläutert die Vorrichtung gemäß Fig. 1, auf der das bebrütete und ausgewaschene Gemisch 23, das in der Elektrolytlösung angeordnet ist, wobei sich alles zwischen den Elektroden 10 und 11 befindet. Nunmehr kann ein Chemilumineszenz-Immunoassay durchgeführt werden.

Der Schalter 13 wird für eine vorgegebene Zeitdauer geschlossen, damit zwischen den Elektroden 10 und 11 ein Potential angelegt werden kann. Das elektrische Potential reicht aus, um oxydierende Teilchen an der Oberfläche 16 der Elektrode 10 zu erzeugen, wie beispielsweise Wasserstoffperoxid (HpOp) und bzw. oder einatomigen Sauerstoff (0). Die Erzeugung von Oxydationsmittel an der Oberfläche 16 badet die markierten Antigene 21a dadurch, daß es durch die Zwischenräume 25 in den Antikörpern 14, die an die Elektrodenoberfläche 16 gebunden sind, hindurchtritt und

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auf diese ¥e.i^o die· Chemolumineszenz verursacht*

Die Erzeugung eines Oxydationsmittels in dem Elektrolyten kann durch Elektrolyse an der Anode 10 gemäß der folgenden Reaktionsgleichung bewirkt werden:

30H" - 2e~ 3 E H₂O + HO₂"

Dies ist eine Situation, in der nicht notwendigerweise gasförmiges O₂ in Freiheit gesetzt wird, sondern Peroxid und bzw. oder einatomiger Sauerstoff an der Elektrodenoberfläche erzeugt werden. Wenngleich unsicher ist, welche Art von Teilchen dafür verantwortlich ist, wird ein oxydierendes Teilchen nach dem Anlegen von Spannung in Freiheit gesetzt, das die chemilumineszierende Markierung oxydiert und sie zur Erzeugung von Licht veranlaßt.

Die Chemilumineszenz der markierten Antigene 21a

wird durch die Vervielfacherzelle 15 gemessen, die die

emittierten Photonen empfängt, wie durch Pfeile 27 dargestellt.

Die Erzeugung und die Abgabe des Oxydationsmittels läßt sich insofern genau steuern, als das an die Elektroden 10 und 11 angelegte Potential genau über eine vorgegebene Zeitdauer aufrecht erhalten wird und das erzeugte Oxydationsmittel unmittelbar auf die gebundenen, durch chemilumineszierende Bestandteile markierten Antigene 21a einwirken gelassen wird.

Die Chemilumineszenz, die durch die genaue Auslösung (Oxydation) der chemilumineszierenden Markierung hervorgerufen wird, die an die Antigene 21a gebunden ist, läßt sich genau messen, weil die gesamte Umsetzung zwischen den Elektrodenoberflächen 16 und 17 stattfindet. Die Elektroden 10 und 11 sind vorzugsweise ringförmig, damit sie der Form der

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Vervielfacherzelle 15 entsprechen; die entsprechenden Durchmesser der Elektroden 10 und 11 sind viel größer als die Entfernung zwischen den Elektroden. Auf diese Weise geht an der Peripherie der Elektroden 10 und 11 nur eine äußerst geringe Lichtenergiemenge verloren, und Photonen -werden über einen weiten Feststoffwinkel (large solid angle) erfaßt.

In den Fig. 2a bis 2g wird eine Vorrichtung zur Durchführung eines Immunoassays erläutert, bei dem keine Waschoder Abtrennungsstufe erforderlich ist. Fig. 2a zeigt die Vorrichtung, die ähnlich derjenigen von Fig. 1 (Teilansicht) ist und die zu Anfang die immunoreaktionsfähige Lösung 23 vor deren Bebrütung aufnimmt, ähnlich wie für die Fig. 1b beschrieben. Wenn Schalter 13 für kurze Zeit geschlossen wird, erhalten die Elektroden 10 und 11 einen kurzen Stromimpuls, wie in Fig. 2b gezeigt. Die immunologische Bindung muß noch stattfinden, so daß keine Lichtausbeute aus markierten Antigenen 21a, die an Antikörper 14 gebunden sind, erzeugbar sein dürfte. Jedoch sind einige markierte Antigene 21a vielleicht so nahe an die Oberfläche 16 der Anode 11 gelangt, daß sie aufgrund des an der Oberfläche 16 erzeugten Oxydationsmittels eine Lichtausbeute ergeben. Eine derartige Lichtausbeute wird durch die Vervielfacherzeile 15 (Fig. 1) in ein elektrisches Signal umgewandelt, wie in Fig. 2c dargestellt, und festgehalten; sie stellt den Rauschpegel an Licht dar, der auf die freien markierten Antigene 21a in der Lösung 23 zurückzuführen ist.

Fig. 2d erläutert die Vorrichtung gemäß Fig. 2a nach erfolgter Bebrütung und nach Vervollständigung der kompetitiven Bindungsreaktion. Dementsprechend sind Antigene 21 und 21a an die Antikörper 14 gebunden, wie dargestellt, während einige freie Antigene 21 und 21a sich in der Lösung 23 befinden. Nunmehr wird ein kurzer Eingabestromimpuls auf die Elektroden 10 und 11 gegeben, wie in Fig. 2e

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dargestellt, indem der Schalter 13 (Fig. 1) nach einer gegebenen Zeit, die zur Erzeugung des. Oxydationsmittels erforderlich ist, geschlossen wird. Die markierten Antigene 21a, die an die Antikörper 14 gebunden sind, verursachen eine Lichtausbeute aufgrund des an der Oberfläche 16 der Anode 10 erzeugten Oxydationsmittels zusammen mit freien, markierten Antigenen 21a in der Lösung 23, die sich in nächster Nachbarschaft zur Oberfläche 16 befinden. Diese kombinierte Lichtausbeute ist schematisch in Fig. 2f dargestellt.

Die Lichtausbeuten gemäß Fig. 2c und 2f werden von der Vervielfacherzelle 15 in elektrische Signale umgewandelt und festgehalten. Die Differenz Δ S zwischen den Ausbeuten, wie in Fig. 2g dargestellt, wird durch herkömmliche Vergleichstechniken erhalten. Die Differenz Δ S ist das Maß, das aus der Umsetzung minus den Hintergrund- oder Rauscheffekten ohne Anwendung einer Abtrennungsstufe erhalten wird.

Die Fig. 3a bis 3f erläutern eine weitere Ausführungsform der Erfindung, die eine Wasch- oder Abtrennungsstufe ebenfalls überflüssig macht. Die Oberfläche 17 von Elektrode 11 enthält immobilisierte Antikörper 14a, die gegenüber den Antigenen 21 und 21a in der Lösung 23 nicht spezifisch sind. Jedoch sind die Antikörper 14a so ausgewählt, daß sie den Antigenen 21 und 21a in Lösung 23 ein ähnliches Oberflächenprofil zeigen, wie es die Antikörper 14 auf der Oberfläche 16 der Elektrode 10 tun. Außerdem ist der Schalter 13 gemäß Fig. 1 so modifiziert, daß er die Richtung des Stromes zwischen den Elektroden 10 und 11 umkehrt (Doppelpolschalter),

Bei der Vorrichtung gemäß Fig. 3a wird von der Annahme ausgegangen, daß es nicht immer möglich ist, die Lösung 23 zwischen die Elektroden 10 und 11 zu bringen und ein anfängliches Lichtausbeutensignal aufgrund von lediglich

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freien, markierten Antigenen 21a zu erhalten, d.h., daß nach Einführung der Lösung eine gewisse Bindung stattgefunden haben kann. Daher wird gemäß den Fig. 3a bis 3f ein trennstufenfreier Immunoassay ermöglicht, der ein Rauschsignal oder Hintergrundsignal erhält, obwohl eine gewisse anfängliche Bindung zwischen den Antigenen 21a und den Antikörpern 14 stattgefunden hat.

Gemäß den Fig. 3a bis 3f wird die Lösung 23 zwischen die modifizierte Elektrode 11 und die Elektrode 10 eingeführt, wie in Fig. 3a gezeigt. Der modifizierte Schalter 13 (nicht dargestellt) wird während einer Zeit At,,, wie durch den Impuls 30 (Fig. 3b) dargestellt, in einer ersten Stellung gehalten, so daß die Elektrode 11 positiv aufgeladen und auf diese Weise an der Oberfläche 17 ein Oxydationsmittel erzeugt wird. Eine Lichtausbeute 31 (Fig. 3c), die von dem ersten Impuls 30 (Fig. 3b· Zeitdauer A L) erhalten wird, ist lediglich von Rausch- oder Hintergrundantigen 21a hervorgerufen worden, d.h. keine Lichtausbeute wurde von gebundenen Antigenen 21a und Antikörpern 14a erzeugt. Dies ist so, weil die Antikörper 14a sich nicht an die Antigene 21a binden, d.h. sie sind nicht spezifisch für dieses Antigen. Daher ist die Lichtausbeute 31 gänzlich auf freies, markiertes Antigen 21a zurückzuführen, das so nahe an die Oberfläche 17 der Elektrode 11 gewandert ist, daß es von dem erzeugten Oxydationsmittel oxydiert worden ist.

Danach wird der Schalter 13 in eine zweite, nicht dargestellte Stellung umgelegt, um einen positiven Impuls 32 der Zeitdauer Δ. t~ auf die Elektrode 10 zu geben. Die Zeitdauer Δ tp des Impulses 32 ist gleich der Zeitdauer At^ von Impuls 30, wodurch gleiche Mengen an Oxydationsmittel an der Oberfläche 16 der Elektrode 10 erzeugt werden. Das Ausgabesignal 33 (Fig. 3c) ist etwas größer als das Ausgabesignal 31, weil eine gewisse anfängliche Bindung zwischen den Antigenen 21a und den Antikörpern 14 erfolgt

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ist. Das Ausgatreslgnal 31 wird von dem Ausgabesignal 33
nach herkömmlichen Verfahren subtrahiert, und man erhält
ein Maß für jegliche anfängliche Bindung minus dem Hintergrundrauschen .

Die letzten drei Stufen des vorliegenden Verfahrens sind in den Fig. 3d bis 3f erläutert. Gemäß Fig. 3d ist
die Lösung 23 bebrütet worden, wodurch die Antigene 21 und 21a mit den Antikörpern 14 auf der Oberfläche 16 der Elektrode 10 eine kompetitive Bindung eingegangen sind. Der
Schalter 13 wird geschlossen, um einen positiven Impuls 3^· auf die Elektrode 10 zu geben, wie in Fig. 3e dargestellt. Das erhaltene Lichtausbeutensignal 35, das in Fig. 3f dargestellt ist, ist ein Maß für die kompetitive Bindungsreaktion, die während der Bebrütungszeit (Fig. 3d) stattgefunden hat, sowie für jegliches Hintergrundrauschen aufgrund von freien, markierten Antigenen 21a in der Lösung

Um das wahre Maß für die Menge an Antigen zu erhalten, wird das Signal 31 von dem Signal 35 nach herkömmlichen Verfahren abgezogen. Außerdem wird eine kinetische Messung durch Subtrahieren des Signals 31 von dem Signal 33 für die erste Ablesung (zu einem frühen Zeitpunkt) und weiterhin durch
Subtrahieren des Signals 33 vom Signal 35 (für eine Ablesung zu einem späteren Zeitpunkt) erzielt.

Ein Beispiel für zwei Antikörper, die ähnliche molekulare Profile besitzen, jedoch nicht für dieselben Antigene spezifisch sind, sind Albumin- und Digoxinantikörper. Bei dem obigen Verfahren werden Antikörper mit ähnlichen molekularen Strukturen (oder Profilen) gewählt, so daß das subtrahierte Hintergrundsignal 31, das an der Elektrodenoberfläche 17 erzeugt worden ist," in jeder Hinsicht dem Signal 33, das an der Elektrodenoberfläche 16 erzeugt worden ist, analog ist, abzüglich jedoch jeglicher möglicher Ausbeute
durch Bindung, die durch die anfängliche Reaktion zwischen

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den Antigenen 21a und Antiköi ^em 14 erfolgt ist.

In den Fig. 4a und 4b werden eine partielle Seitenansicht sowie eine partielle Draufsicht einer Ausführungsform gemäß der Erfindung, die nach dem Prinzip des kontinuierlichen Durchflusses arbeitet, dargestellt. Die Ausführungsform nach dem Prinzip des kontinuierlichen Durchflusses umfaßt eine Anode 40 und eine Kathode, die mit einer Vervielfacherzelle 41 kombiniert ist. Die Oberfläche 42 der Vervielfacherzelle 41 ist mit einem dünnen, lichtdurchlässigen, leitfähigen Metall 43 beschichtet, das über den Kontakt 44 mit einer der Klemmen der Spannungsquelle 12 (Fig. 1) verbunden ist, so daß eine Elektroden/ Detektor-Kombination, wie oben beschrieben, erhalten wird.

Zwischen den Elektroden 40 und 41 ist eine Schlange aus einem durchströmten Rohr angeordnet, wie in der Draufsicht der Fig. 4b dargestellt. Die Schlange 45 besteht aus einem Rohr 47, das sich dem Mittelpunkt 53 zu spiralförmig erstreckt und sich am Punkt 54 um sich selbst herum zurückverdoppelt, so daß der Einlaßteil 48 neben dam Auslaßteil zu liegen kommt. Die Oberwand 50 des Rohres 47 wird durch die Metalloberfläche 43 der Vervielfacherzelle 41 definiert, so daß die Schlange 45 ein integrierender Bestandteil der Vervielfacherzelle 41 ist. Die untere Wand 51 der Schlange 45 ist durch die Oberfläche 46 von Elektrode 40 definiert, so daß die Schlange außerdem ein integrierender Bestandteil der Elektrode 40 ist.

Ein Gemisch aus Antigenen 21 und 21a sowie Antikörpern 14 (die Antikörper liegen nunmehr frei in Lösung vor) wird in dem Rohr 47 mittels nicht dargestellter Pumpen entlangströmen gelassen. Das Gemisch wird am Einlaß 48 eingeführt und füllt das gesamte Rohr 47 aus, bis es am Auslaß wieder hervortritt. Danach wird die Strömung beendet. An den Elektroden 40 und 41 wird eine Spannung angelegt, und

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die Stärke der Chemolumineszenz wird durch die Vervielfacherzelle gemessen. Das reaktionsfähige Gemisch, das gemessen worden ist, wird anschließend durch den Auslaß 49 ausgebracht und verworfen, während neues reaktionsfähiges Gemisch in den Einlaß 48 zur Untersuchung eingebracht wird. Die aufeinanderfolgenden reaktionsfähigen Gemische können vor ihrer im einzelnen erfolgenden Einführung den Einlaß 48 vermischt und bebrütet werden.

In Übereinstimmung mit den obigen Lehren kann auch eine kinetische Messung mit den in den Fig. 2a bis 2g und 3a bis 3f dargestellten Vorrichtungen durchgeführt werden. Die konkurrierenden Immunoreagenzien werden vermischt (eines von ihnen besitzt eine chemilumineszierende Markierung) und zwischen die Elektroden 10 und 11 geführt. Die Elektroden 10 und 11 werden periodisch, wie beschrieben, während der Bebrütung mit Impulsen beaufschlagt, um Oxydationsmittel zu erzeugen. Auf diese Weise wird die Umsetzung kontinuierlich messend verfolgt, um Chemilumineszenz-Licht-Werte zu erzielen, die für die kinetische Geschwindigkeit der Reaktion des Imniunoassays, wie beschrieben, kennzeichnend sind.

In Fig. 5 ist eine weitere Ausführungsform der Erfindung dargestellt, bei der das Rohr 47, das zwischen den Elektroden 40 und 41 angeordnet ist, unterteilt ist, so daß eine Reihe von Reaktionskammern, beispielsweise 1a bis 10a gebildet wird. Jede Kammer besitzt entsprechende Einlasse 1b bis 10b und entsprechende Auslässe 1c bis 10c, wie dargestellt. Eine derartige Struktur wird analog derjenigen gemäß den Fig. 4a und 4b betrieben. Jede Kammer 1a bis 10a kann ein anderes reaktionsfähiges Gemisch enthalten, d.h. in jeder Kammer können andere Immunoassays durchgeführt werden, und jede Kammer ist mit ihrem eigenen Paar Elektroden ausgestattet. Die Kammern 1a bis 10a sind elektrisch"isoliert, so daß jede Kammer individuell mit einem Impuls versehen wer-

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- 23 den kann, um eine Messung zu erzielen.

Die Kammern 1a bis 10a gemäß Fig. 5 werden vorzugsweise nacheinander betrieben, so daß bei den Messungen kein Durcheinander entsteht. Jedoch kann jede Kammer 1a bis 10a sowohl gemeinsam mit den anderen als auch nacheinander gefüllt und geleert werden.

Gemäß der Erfindung werden die Antikörper 14, die an der Oberfläche 16 der Elektrode 10 immobilisiert sind, wiederverwendet. Nach der oben erwähnten Bebrütung und Messung gemäß den Fig. 1a bis 1e, 2a bis 2g und 3a bis 3f können die Antigene 21 und 21a, die an die Antikörper 14 der Elektrode 10 gebunden sind, lysiert oder auf andere Weise von den Antikörpern 14 entfernt werden, so daß die Antikörper 14 für einen nachfolgenden Immunoassay zur Verfügung stehen.

Das Lysieren oder das Entfernen der gebundenen Antigene kann auf verschiedene Weise erfolgen:

(1) Ein Ablösemittel kann der Elektrode 10 zugeführt werden. Das Ablösemittel kann ein chaotropes Mittel, ein Detergens, Magnesiumchlorid, ein lösliches Thiocyanat oder ein lösliches Citrat sein;

(2) Elektrischer Strom von hinreichendem Potential, um eine Ablösung der gebundenen Antigene zu verursachen, kann an die Elektrode 10 angelegt werden; und

(3) Eine Ablösung der Antigene kann auch durch Veränderung des Charakters der Lösung erzielt werden, wie beispielsweise durch Veränderung ihres pH-Wertes, ihres Tonus (tonicity) oder ihrer Temperatur.

Die Erfindung ist nicht auf die beschriebenen einzelnen Ausführungs- bzw. Durchführungsformen beschränkt, sondern diese Ausführungs- bzw. Durchführungsformen können auch in geeigneter Weise modifiziert werden.

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Claims

TECHNICON INSTRUMENTS CORPORATION, Tarrytown, N.Y., VStA

Patentansprüche

Verfahren zur Durchführung eines Immune-as says einer Probe, die ein Immunoreagenz enthält, dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) ein Umsetzungsgemisch aus dem Probenimmunoreagenz, einem komplementären Immunoreagenz und einem hinsichtlich .des Probenimmunoreagenz kompetitiven Immunoreagenz bildet, wobei das kompetitive Immunoreagenz eine chemilumineszierende Markierung gebunden enthält;

(b) das Reaktionsgemisch zur Bildung eines Reaktionsproduktes bebrütet,

(c) ein Oxydationsmittel zur chemischen Auslösung des chemilumineszierend markierten Immunoreagenzes in dem Reaktionsprodukt elektrisch erzeugt und

(d) die Chemilumineszenz des ausgelösten chemilumineszierend markierten Immunoreagenzes mißt.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1,

dadurch gekennzeichnet, daß man außerdem

(e) das Umsetzungsgemisch zwischen einem Paar Elektroden anordnet und

(f) eine gesteuerte Spannung an das Elektrodenpaar zur Erzeugung des Oxydationsmittels anlegt.
3. Verfahren gemäß Anspruch 2,

dadurch gekennzeichnet, daß man außerdem

(e) die Spannung während einer gesteuerten Zeitdauer an das Elektrodenpaar anlegt.

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4. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man in Stufe (f) gesteuerte Spannungen von vorher bestimmter Größe an das Elektrodenpaar vor und bzw. oder während der Stufe (b) anlegt und in Stufe (d) die Chemilumineszenz während der Einwirkung dieser gesteuerten Spannungen mißt.
5. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man außerdem den komplementären Antikörper an der Oberfläche einer der Elektroden immobilisiert.
6. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man das immobilisierte Immunoreagenz dehydratisiert und daß man außerdem

(f) das immobilisierte Immunoreagenz vor der Bebrütungsstufe (b) erneut hydratisiert.
7. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das komplementäre Immunoreagenz an eine Membran bindet, die sich angrenzend an eine der Elektrodenoberflächen befindet.
8. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das komplementäre Immunoreagenz in einer Gelschicht hält, die angrenzend an die Oberfläche einer der Elektroden angeordnet ist.
9. Verfahren gemäß Anspruch 2,

dadurch gekennzeichnet, daß man

(f) jegliches überschüssiges Immunoreagenz aus dem Raum zwischen dem Elektrodenpaar nach der Bebrütungs stufe (b) und vor der Meßstufe (d) wegwäscht.

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10. Verfahren gemäß Anspruch 2,

dadurch gekennzeichnet, daß man außerdem

(f) jegliches gebundene chemilumineszierend markierte Immunoreagenz von seinem komplementären Immunoreagenz nach der Meßstufe (d) ablöst.
11. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man das Ablösen durch Veränderung des pH-Wertes des Gemisches bewirkt.
12. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man das Ablösen durch Veränderung des Tonus des Gemisches bewirkt.
13. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man das Ablösen durch Veränderung der Temperatur des Gemisches bewirkt.
14. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man das Ablösen elektrochemisch bewirkt.
15. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Durchführung des Ablöseschrittes (f) außerdem

(g) ein Ablösemittel in das Gemisch einführt.
16. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ablösemittel ein chaotropes Mittel verwendet.
17. Verfahren gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ablösemittel ein Detergens verwendet.

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18. Verfahren gemäß Anspruch 16,
dadurch gekennzeichnet, daß man als Ablösemittel Magnesiumchlorid, ein lösliches Thiocyanat oder ein lösliches Citrat verwendet.
19. Vorrichtung zur Durchführung eines Immunoassays, bestehend aus

einem Paar metallischer Elektroden mit zwei benachbarten Oberflächen (10, 11; 40, 41), von denen mindestens eine ein erstes Immunoreagenz (14) trägt und von denen mindestens eine lichtdurchlässig ist;

Mitteln (45) zur Einführung einer reaktionsfähigen Lösung (23) zwischen die Oberflächen der Elektroden (10, 11; 40, 41), bestehend aus mindestens einem zweiten (21a) und einem dritten (21) Immunoreagenz, wobei das zweite Immunoreagenz (21a) mit dem dritten Immunoreagenz (21) hinsichtlich seiner Bindung an das erste Immunoreagenz (14) konkurriert und das zweite Immunoreagenz (21a) mit einer chemilumineszierenden Substanz markiert ist;

Mitteln (12, 13) zum Anlegen eines elektrischen Potentials an die Elektroden zur Oxydierung der chemilumineszierenden Substanz und

Mitteln (15) zum Messen der Chemilumineszenz der chemilumineszierenden Substanz.
20. Vorrichtung gemäß Anspruch 19,
dadurch gekennzeichnet, daß die eine Elektrode eine Membran aufweist, an die das erste Immunoreagenz (14) gebunden ist.
21. Vorrichtung gemäß Anspruch 19,
dadurch gekennzeichnet, daß die eine Elektrode eine Gelschicht, die das Immunoreagenz (14) enthält, aufweist.

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22. Vorrichtung gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel (15) zum Messen einen Detektor umfassen, der der lichtdurchlässigen Elektrode benachbart angeordnet ist.
23. Vorrichtung gemäß Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß die lichtdurchlässige Elektrode einstückig mit dem Detektor ausgeführt ist.
24. Vorrichtung gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die lichtdurchlässige Elektrode ein durchsichtiges Substrat enthält, das einen dünnen, durchsichtigen Film aus elektrisch leitfähigem Material trägt.
25· Vorrichtung gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel (45) zum Einführen ein Rohr (47) umfassen, das zwischen dem Elektrodenpaar (40, 41) angeordnet ist.
26. Vorrichtung gemäß Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß das Rohr (47) spiralförmig ist.

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