DE19541033C1

DE19541033C1 - Elektrochemisches Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Bindungsproteinen

Info

Publication number: DE19541033C1
Application number: DE1995141033
Authority: DE
Inventors: Rainer Feldbruegge
Original assignee: Institut fuer Chemo und Biosensorik Muenster eV ICB
Current assignee: Institut fuer Chemo und Biosensorik Muenster eV ICB
Priority date: 1995-11-03
Filing date: 1995-11-03
Publication date: 1997-06-26
Anticipated expiration: 2015-11-04
Also published as: WO1997016712A2; WO1997016712A3

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum immunolo gisch/enzymatischen Nachweis von Bindungsproteinen in wäßrigen Medien sowie eine Vorrichtung zur Durchfüh rung dieses Verfahrens.

Die Bestimmung von Bindungsproteinen besitzt in der klinischen Diagnostik eine besondere Relevanz. Bei spielhaft hierbei sei die Bestimmung von kardialen humanen Fettsäurebindungsproteinen (H-FABP) genannt. Insbesondere die Bestimmung von FABP besitzt in der Diagnostik besondere Bedeutung, da im Falle von Herz muskelschädigungen kardiales FABP (H-FABP) aus dem Herzmuskel austritt und nach wenigen Stunden im Blut nachweisbar ist. Aus diesem Grund ist auch FABP als Herzinfarktmarker anzusehen. Einem schnellen und ge nauen Verfahren zum Nachweis von FABP kommt deshalb besondere Bedeutung zu. Klassische Methoden der FABP-Bestimmung beruhen auf ELISA- oder RIA-Verfahren.

Aus der WO 95 24 641 ist ein elektrochemisches Ver fahren zur quantitativen Bestimmung von Proteinen bekannt, bei dem das Protein Bestandteil eines auf einer Elektrode aufgebrachten Antikörper/Konjugat system ist. Dieses Dokument enthält jedoch keinerlei Hinweise auf die spezielle Bestimmung von Bindungs proteinen. In der US 4,997,526 ist eine Vorrichtung zur Bestimmung von Serotonin beschrieben. Aber auch dieses Dokument enthält keinerlei Hinweise dahinge hend, wie und mit welcher Vorrichtung quantitativ Proteine bestimmt werden können.

Neben diesen klassischen Methoden ist weiterhin in Spener, P. et al., Dechema Biotechnol. Conf. 5 VCH 1992 ein amperometrisches Verfahren zur Bestimmung von FABP bekannt. Das Verfahren beruht auf einer Im mobilisierung von Fänger-Antikörpern auf einer Mem bran und einer Konkurrenzreaktion zwischen FABP der Probe und zugesetztem Katalase gelabelten FABP. Nach teilig bei diesem Konkurrenzverfahren ist jedoch die Anzahl der nötigen Verfahrensschritte, die aufwendige Präparation der Antikörpermembranen, die sehr langen Analysezeiten, die nicht ausreichende Empfindlich keit, der bedingte Einsatz in reinem Plasma oder Blut und die Höhe der unspezifischen Meßwerte.

Ausgehend hiervon, ist es die Aufgabe der vorliegen den Erfindung ein empfindliches, schnelles, sicheres, einfaches und wirtschaftliches Verfahren zur Bestim mung von Bindungsproteinen, insbesondere zur Bestim mung von FABP, anzugeben sowie eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens.

Die Aufgabe in bezug auf das Verfahren wird durch die kennzeichnenden Merkmale des Anspruches 1, in bezug auf die Vorrichtung durch die kennzeichnenden Merkma le des Anspruches 15 gelöst. Die Unteransprüche zei gen vorteilhafte Weiterbildungen auf.

Das erfindungsgemäße Verfahren beruht somit auf einer Kombination von drei Verfahrensschritten. In einem ersten Schritt wird eine spezielle Elektrode, nämlich eine Einmalgraphitelektrode mit einem gegen das Bindungsprotein gerichteten Antikörper (Fänger-Anti körper) immobilisiert. In einem zweiten Schritt wird dann ein Sandwich aus Antikörper, Bindungsprotein und Konjugat auf der Elektrode erzeugt und letztlich mit einer so hergestellten Elektrode die Messung durchge führt, indem eine empfindliche amperometrische Detek tion des Spaltungsproduktes des aromatischen Phos phatesters vorgenommen wird.

Wesentlich beim anmeldungsgemäßen Verfahren ist die Verwendung einer Einmalgraphitelektrode und die Immo bilisierung des Antikörpers direkt auf der Elektro den-Oberfläche. Dadurch steht eine Elektrode zur Ver fügung, die in einfacher Weise für das erfindungsge mäße Meßverfahren eingesetzt werden kann. Besonders hervorzuheben ist, daß, wenn die mit Antikörpern im mobilisierte Elektrode z. B. mit einer BSA-Lösung be handelt und getrocknet wird, über eine längere Zeit problemlos gelagert werden kann. Es hat sich dabei gezeigt, daß die so präparierten Graphitelektroden selbst über mehrere Wochen bei 4°C stabil sind. Be sonders bevorzugt ist es, wenn als Einmalelektrode eine auf einem Trägermaterial mit Siebdruck aufge brachte Graphitschicht eingesetzt wird. Als Trägerma terial ist hierbei besonders eine Laminierfolie be vorzugt. Verfahrensmäßig wird dabei so vorgegangen, daß z. B. ein Leit-C-Spezialkleber für die Elektronen mikroskopie mit einem Siebdrucköl versetzt und durch eine Schablone oder durch ein Sieb mit entsprechender Elektrodenform auf eine Laminierfolie aufgebracht wird. In entsprechender Weise kann auch die Referen zelektrode hergestellt werden, indem z. B. eine Sil ber/Silberchloridpaste auf eine weitere Laminierfolie aufgebracht oder zusammen mit der Graphitelektrode auf eine Folie aufgebracht wird. Es ist auch möglich, zur Versteifung die Elektrodenableitungen mit einer zweiten Laminierfolie zu verschweißen.

Eine wie vorstehend beschriebene Einmalgraphitelek trode kann nun in verschiedener Weise für das erfin dungsgemäße Verfahren eingesetzt werden. So kann zum einen das Bindungsprotein und das Konjugat auf die Graphitelektrode pipettiert werden, so daß dann der Sandwich aus Antikörper, Bindungsprotein und Konjugat entsteht. Erfindungsgemäß wird dabei unter einem Kon jugat ein Phosphatase markierter Antikörper gegen das Bindungsprotein verstanden.

Alternativ dazu kann aber auch das Bindungsprotein vor dem Aufbringen auf die Elektrode mit dem Konjugat vermischt werden und dann die so hergestellte Mi schung auf die Elektrode aufgebracht werden.

Eine dritte besonders bevorzugte Verfahrensvariante sieht nun vor, daß die mit Antikörper beschichtete Einmalgraphitelektrode zuerst mit Konjugat beschich tet wird. Hierbei wird so vorgegangen, daß das Kon jugat auf die Elektrode aufgebracht und getrocknet wird. Die so präparierte Elektrode ist dann nur noch kurz vor der Messung mit der Probe zu versetzen. Die se letzte Variante hat den Vorteil, daß das Mischen von Konjugat und Bindungsprotein vor der Messung ent fällt und somit ein Pipettierschritt eingespart wird. Die mit Konjugat und Antikörper beschichteten Elek troden sind im übrigen mehrere Wochen stabil.

Die Durchführung der Messung ist in sehr einfacher Weise möglich. Die in Abhängigkeit zur Konzentration an Bindungsprotein bindet nämlich in der alkalischen Phosphatase Bindungsprotein-Antikörper und der immo bilisierte Bindungsprotein-Antikörper an das Bin dungsprotein. Das proportional zur Bindungsprotein-Kon zentration fixierte Enzym erzeugt dann bei Zugabe von aromatischem Phosphatester das elektrochemisch umzusetzende Spaltungsprodukt.

Besonders bevorzugt beim vorstehend beschriebenen Verfahren ist es, wenn als Bindungsprotein H-FABP eingesetzt wird. Als vorteilhaft hat es sich hierbei herausgestellt, wenn beim Konjugat alkalische Phos phatase und beim aromatischen Phosphatester p-Amino phenylphosphat verwendet wird.

Die Erfindung betrifft weiterhin eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens. Die Vorrichtung zeichnet sich besonders dadurch aus, daß in einem Gehäuse min destens eine Reihe mit zwei bis sechs mit Puffern und Substrat befüllbaren Gefäßen vorgesehen ist. Die Vor richtung ist dabei so ausgelegt, daß die Elektroden über eine geeignete Vorrichtung in die Gefäße ein führbar sind. Dadurch, daß mindestens zwei Gefäße vorgesehen sind, kann sowohl eine Referenzelektrode als auch eine Meßelektrode gleichzeitig vermessen werden.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand eines Ausfüh rungsbeispieles und Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 die Kalibrierkurven von FABP in Plasma und einen Vergleich mit dem ELISA-Verfahren;

Fig. 2 erfindungsgemäß hergestellte Elektroden;

Fig. 3 im Querschnitt eine Vorrichtung zur Durch führung des Verfahrens, und

Fig. 4 die Vorrichtung in der Draufsicht.

Beispiel Messung von FABP als Bindungsprotein Herstellung der Elektroden

Ein Leit-C-Spezialkleber für die Elektronenmikrosko pie (Neubauer Chemikalien) wird mit einem Siebdrucköl versetzt und durch eine Schablone oder durch ein Sieb mit entsprechender Elektrodenform auf eine Laminier folie aufgebracht. Fig. 1 zeigt hier drei verschiede ne Ausführungsformen, wie eine derartige Elektrode aufgebaut sein kann. Die Elektrode 1 besteht aus ei ner Laminierfolie und einer aufgebrachten Graphit schicht in Form eines Steges und eines sich anschlie ßenden Körpers. Bei der Elektrode 2 ist zusätzlich eine zweite Laminierfolie über den Steg gelegt, um eine Versteifung zu erreichen. Der Kopf der Elektrode bleibt hier frei. Bei der Elektrode 3 ist die zweite Laminierfolie auch über dem Kopf angeordnet, wobei dann in der zweiten Laminierfolie im Bereich des Ele ktrodenkopfes eine entsprechende Durchbrechung (z. B. Lochung) der zweiten Laminierfolie vorliegt, um einen Kontakt mit der Elektrode herzustellen. Die Elektrode hat üblicherweise einen Durchmesser von 5 mm und ei nen ca. 30 mm langen Steg zur Ableitung und zum Ab griff des Stroms. Die Referenzelektrode wird entweder in gleicher Form mit Silber/Silberchloridpaste auf eine zweite Folie aufgebracht oder zusammen mit der Graphitelektrode auf eine Folie.

Präparation der biochemischen Komponente

Der Fänger-Antikörper (1 µg) wird auf die Graphit elektrode, wie vorstehend beschrieben hergestellt, aufgebracht und ca. 15 min adsorptiv immobilisiert. Anschließend wird die Oberfläche ca. 15 min mit einer 2%igen BSA-Lösung behandelt. Die Elektrode kann nun für eine Messung verwendet werden oder nach Trocknung bei 4°C gelagert werden. Als Variante kann nach dem Blockieren der Elektrode mit BSA eine Beschichtung mit Konjugat und anschließender Trocknung durchge führt werden. Mit der letzten Variante entfällt das Mischen von Konjugat und Probe vor der Messung und erspart einen Pipettierschritt. Die mit Konjugat und Antikörper beschichteten Elektroden sind ebenfalls mehrere Wochen stabil.

Vorbereitung zur Messung von FABP

Auf die Graphitelektrode wird dazu ca. 10 µl Patien tenplasma und 1 µl Konjugat pipettiert. Alternativ dazu kann das Patientenplasma vorher mit Konjugat versetzt werden. Die Inkubationszeit beträgt 15 min. Handelt es sich um die mit Konjugat beschichteten Elektroden, kann das Patientenplasma auch direkt auf getragen werden. Anschließend wird die Elektrode kurz mit TBS-Puffer abgespült, die Elektroden sind dann für die Messung vorbereitet.

Die Messung wird mit einer Vorrichtung gemäß Fig. 2 und 3 durchgeführt.

Fig. 2 zeigt im Querschnitt schematisch den Aufbau der Vorrichtung. Die Vorrichtung besteht aus einem Gehäuse 4, in das Potentiostaten 5 und ein Rührmotor 6 eingebaut sind. Bei der Ausführungsform nach Fig. 2 sind in einer Reihe 12 (Meßpuffer-Well) vier Gefäße 14-17 zur Aufnahme der Pufferlösung und des Substra tes angeordnet. In diese Gefäße 14-17 sind die Elek troden 7, 8, 9, 10 einführbar. Die Elektroden sind dabei über eine Leitung 11 mit dem Potentiostaten 5 verbunden, der seinerseits wiederum zur Auswertung an einen PC angeschlossen ist.

Fig. 3 zeigt die in Fig. 2 beschriebene Vorrichtung in der Draufsicht. Wie Fig. 3 zeigt, ist es mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung auch möglich, die Elek troden 7 bis 10 nacheinander in verschiedene Meßpuf fer-Wells einzutauchen. Dies kann durch eine automa tische Steuerung übernommen werden. Die Elektroden tauchen dabei in einen 0,1 M Carbonatpuffer pH 9,4 0,1 M KCl 1 µg/ml p-Aminophenylphosphat. Das ampero metrische Stromsignal entwickelt sich in ca. 10 bis 20 sec bei 300 mV gegen Silber/Silberchlorid und wird entsprechend der Kalibrationskurve in die Konzentra tion von FABP umgerechnet. Die dabei immunologisch und enzymatisch ablaufende Reaktion ist in den fol genden Gleichungen 1.a bis 1.d wiedergegeben.

Fig. 4 zeigt die bei der Messung erzielten Ergebnisse in bezug auf die Kalibrierung und den Vergleich mit der ELISA-Methode. Fig. 4 macht deutlich, daß mit dem erfindungsgemäßen Meßverfahren in einer einfachen und schnellen Weise Ergebnisse erreicht werden, die mit denen der ELISA-Methode vergleichbar sind.

Claims

1. Elektrochemisches Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Bindungsproteinen, bei dem das Bindungsprotein Bestandteil eines auf einer Elektrode aufgebrachten Antikörper/Konjugat systems ist, dadurch gekennzeichnet, daß

a) auf eine Einmalgraphitelektrode der Anti körper immobilisiert,
b) das Bindungsprotein und ein Phosphatase und Antikörper enthaltendes Konjugat so auf der Elektrode aufgebracht wird, daß es zu einem Sandwich aus Antikörper-Bindungsprotein-Kon jugat bindet, und
c) diese Elektrode mit einer gepufferten Lö sung eines aromatischen Phosphatesters ver setzt und das Spaltungsprodukt des aromati schen Phosphatesters amperometrisch gemes sen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß beim Verfahrens schritt b) zuerst das Konjugat aufgebracht, dann die Elektrode getrocknet wird, so daß die so behandelte Elektrode lagerfähig ist, und daß dann vor der eigentlichen Messung (Verfahrens schritt c) das Bindungsprotein aufgegeben wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß beim Verfahrens schritt b) das Konjugat und das Bindungsprotein gemischt und dann unmittelbar vor der Messung (Verfahrensschritt c) auf die Elektrode aufgege ben wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß beim Verfahrens schritt b) das Konjugat und das Bindungsprotein auf die Elektrode aufgegeben wird und dann un mittelbar die Messung (Verfahrensschritt c) er folgt.

5. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Einmalelektrode eine auf ein Trägermaterial mittels Siebdruck aufgebrachte Graphitschicht eingesetzt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Trägermaterial eine Laminierfolie eingesetzt wird.

7. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Bindungsproteine H-FABP eingesetzt wird.

8. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß beim Konjugat alka lische Phosphatase eingesetzt wird.

9. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß als aromatisches Phosphat p-Aminophenyolphosphat eingesetzt wird.

10. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß nach der Immobili sierung des Antikörpers auf der Graphitelektrode die Oberfläche mit einer BSA-Lösung behandelt wird.

11. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Ausbildung des Sandwiches zwischen Antikörper, Bindungskom ponente und Konjugat eine Inkubationszeit von 5 min bis 60 min, bevorzugt 10 bis 20 min, ein gehalten wird.

12. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß mit einer gepuffer ten aromatischen Phosphatester Lösung gearbeitet wird.

13. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß als Referenzelektro de eine auf ein Trägermaterial mittels Siebdruck aufgebrachte Silber/Silberchloridelektrode ein gesetzt wird.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß als Trägermaterial eine Laminierfolie eingesetzt wird.

15. Vorrichtung zur Durchführung der Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß in einem Gehäuse (4) mindestens eine Reihe (12) mit zwei bis sechs mit Puffern und Substrat befüllbaren Gefäßen (14 bis 17) angeordnet ist, wobei in die Gefäße (14 bis 17) einer Reihe Elektroden (7 bis 10) einführbar sind, und daß die Elektroden (7 bis 10) mit einem Poten tiostaten (5) verbunden sind.

16. Vorrichtung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß zwei bis sechs Rei hen (13, 18, 19, 20, 21) vorhanden sind.