DE19950785C2 - Verfahren zur Durchführung eines Elektrochemischen Enzymimmunoassays - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Enzymimmunoassay, beispielsweise ein EIA oder ELISA (enzymgekoppelter Immunoassay). Derartige Enzymim­ munoassays werden in der medizinischen Diagnostik und zahlreichen anderen Bereichen der biomedizinischen Erforschung, in der Mikrobiologie und zur wissen­ schaftlichen Analytik eingesetzt. Sie dienen im wesentlichen der Bestimmung und Quantifizierung von jeglicher Art von Antigenen, Haptenen oder Antikör­ pern.

Herkömmliche Enzymimmunoassays beruhen auf der Verwendung von Enzymen, z. B. Peroxidase, alkalische Phosphatase oder Galaktosidase etc. und den entspre­ chenden Substraten als Detektionssysteme. Dabei wird das Enzym an einen der Reaktionspartner, beispiels­ weise einen Antikörper gekoppelt und damit die Spezifität von immunologischen Reaktionen mit einer enzymatischen Reaktion kombiniert. Der enzymgekop­ pelte Reaktionspartner bindet beispielsweise spezi­ fisch dicht oder über weitere Mediatoren, beispiels­ weise Antikörper, an das zu erfassende Antigen, Hapten oder den zu erfassenden Antikörper und wird dadurch immobilisiert. Nach Auswaschen der nichtim­ mobilisierten Reaktionspartner wird Substrat zugegeben, so daß die enzymatische Reaktion gestartet wird, wobei in herkömmlicher Weise aus dem Substrat mittels der enzymatischen Reaktion ein photometrisch oder fluorometrisch nachzuweisendes Reaktionsprodukt erzeugt wird.

Als Reaktionspartner werden dabei häufig monoklonale Antikörper eingesetzt, die hochspezifisch für die nachzuweisende Substanz oder den nachzuweisenden Organismus sind. Enzymimmunoassays können dabei als kompetitive und nichtkompetitive Tests in den ver­ schiedensten Kombinationen durchgeführt werden.

Üblich ist es heutzutage, Enzymimmunoassays als Fest­ phasen-Immunotests durchzuführen, beispielsweise als ELISA.

Die vorliegende Erfindung geht dabei aus von herkömm­ lichen Enzymimmunoassays (EIA) oder enzymgekoppelten Immunoassays (ELISA), bei denen ein Farbnachweis zur Quantifizierung oder Erfassung eines Analyten in einer Probe angewendet wird. Dieser Farbnachweis wird gewöhnlicherweise mit einem optischen Detektor durch­ geführt.

Fig. 1 zeigt ein Beispiel für den Aufbau und die Durchführung eines derartigen EIA. Als erstes wird ein Antigen Ag an einer Mikrotiterplatte 1 immobi­ lisiert, das spezifisch einen gesuchten Antikörper Ab binden kann. Daraufhin wird auf die Mikrotiterplatte 1 eine zu untersuchende Probe gegeben, die gegeben­ enfalls Antikörper Ab als Analyt enthält. Dieser bin­ det dann an das immobilisierte Antigen Ag und wird dadurch selbst immobilisiert. Die Probe wird darauf­ hin ausgewaschen, so daß nur die immobilisierten An­ tigene Ag und Antikörper Ab auf der Mikrotiterplatte verbleiben. In einem dritten Schritt wird ein weite­ rer Antikörper Ab-Enz auf die Mikrotiterplatte gege­ ben, der seinerseits spezifisch an den Antikörper Ab bindet und an den ein Enzym gekoppelt ist. Dieses En­ zym ist dabei so gewählt, daß es bei Zugabe eines be­ stimmten Substrates eine Farbreaktion auslöst. Die Intensität der Farbreaktion hängt dabei proportional von der Menge an immobilisiertem Enzym ab, die wie­ derum der Menge an Antikörper Ab entspricht. Als En­ zyme kommen dabei beispielsweise herkömmlicherweise alkalische Phosphatase oder Wasserstoffperoxidase zum Einsatz. Für diese Enzyme sind aus der Literatur ver­ schiedenste Substrate bekannt.

Um die Farbreaktion der Enzyme zu stoppen, wird ge­ wöhnlich nach einer gewissen Reaktionszeit nach der Zugabe von Substrat die Farbreaktion mittels einer stark sauren oder basischen Lösung gestoppt. Darauf­ hin kann die optische Dichte bei bestimmten Wellen­ längen, die Absorptionsbanden des Substrates bzw. des Produktes entsprechen, gemessen werden und so die Menge an Antikörper Ab bestimmt werden.

Es sind auch elektrochemische Immunoassays bekannt, bei denen Einmal-Elektroden mit hierfür speziellen Enzymen und Meditatoren als Einheit kombiniert wer­ den. Nachteilig daran ist, daß nach jedem Test die gesamten Elektroden zu entsorgen sind.

Die WO 86/03837 offenbart einen biochemischen Assay, bei dem ein Enzym an ein Substrat gebunden wird in Abhängigkeit von der Menge eines Analyten, wobei das Enzym die Erzeugung einer Triggersubstanz für eine zyklische Reaktion oder eine Kettenreaktion kataly­ siert. Die Menge an gebundenem Enzym wird dann be­ stimmt, indem eine so verursachte Redoxreaktion elek­ trochemisch erfaßt wird.

Die US 4 613 420 offenbart eine Vorrichtung zur Mes­ sung von Ionenaktivitäten. Dabei wird die Potential­ differenz gemessen, die der ionischen Aktivität zu­ mindest eines Tons zwischen einer Referenz und der Probenlösung entspricht.

Die WO 92/21959 offenbart einen enzymgekoppelten Im­ munoassay in einem flüssigen Substrat. Dabei wird das Enzymkonjugat verwendet, um die nachzuweisende biolo­ gische Substanz zu veranlassen, Ionen freizusetzen. Diese Freisetzung verursacht eine Änderung des Wider­ standes des Substrates, der erfaßt und analysiert wird.

Die US 4 230 983 zeigt ein Verfahren zur Analyse von Eigenschaften von Saatmaterial. Hierzu werden die Sa­ men in deionisiertes Wasser eingelegt und nach einer gewissen Zeit die Leitfähigkeit des Wassers bestimmt. Dies ermöglicht eine Aussage über die Qualität oder Schaden des Saatmaterials.

Die DE 196 02 078 A1 offenbart einen amperometri­ schen, kompetitiven homogenen Enzymimmunoassay. Dabei wird ein elektrochemisches Signal erfaßt, das der Konzentration des Analyten proportional ist.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es nunmehr ausgehend von den herkömmlichen Enzymimmunoassays, bei denen eine Farbreaktion optisch detektiert wird, ein Verfahren anzugeben, bei denen unter Verwendung dieser herkömmlichen Enzymimmunoassays auf nichtop­ tische Weise ein Analyt in einer Probe erfaßt und quantifiziert werden kann.

Diese Aufgabe wird durch das Verfahren durch Anspruch 1 gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen des erfin­ dungsgemäßen Verfahrens werden in den abhängigen An­ sprüchen gegeben.

Ausgehend von den oben beschriebenen herkömmlichen Enzymimmunoassays, die ein Enzym einsetzen, das unter Zugabe eines Substrates eine Farbreaktion auslöst, wurden diese Enzymimmunoassays erfindungsgemäß da­ durch weiterentwickelt, daß Elektroden in die Probe eingebracht werden und die Probe elektrochemisch ver­ messen wird. Grundlage für diese Möglichkeit ist da­ bei die Erkenntnis, daß der Schritt, mit dem die En­ zymtätigkeit beendet wird (Zugabe einer sauren oder basischen Lösung) lediglich die Enzyme deaktiviert, jedoch die bereits eingefärbten Substrate (reduziert bzw. oxidiert) nicht zerstört. Dadurch kann deren Re­ dox-Zustand zur Messung verwendet werden.

Denn die quantitative Farbentwicklung erfolgt auf­ grund eines Elektronentransfers zwischen den Substra­ ten. Dies bedeutet, daß die Farbreaktion durch das Enzym mittels Oxidations- und Reduktionsreaktionen der Substrate erfolgt. Abweichend von herkömmlichen Enzymimmunoassays kann nunmehr jedoch die Menge an oxidiertem und reduziertem Substrat elektrochemisch bestimmt werden. Diese Menge an oxidiertem und reduziertem Substrat ist proportional der optischen Dich­ te bei der entwickelten Farbe der Enzymreaktion. Es ist daher bei herkömmlichen Farb-Enzymimmunoassays nicht nur möglich, die Farbreaktion des Enzyms op­ tisch zu erfassen sondern auch erfindungsgemäß durch ein elektrochemisches Verfahren den Analyten zu er­ fassen und quantitativ zu bestimmen.

Vorteilhaft ist dabei insbesondere, daß die herkömm­ lichen, bereits zur Verfügung stehenden optischen En­ zymimmunoassays eingesetzt werden können, jedoch die Vermessung und Auswertung nicht optisch sondern elek­ trochemisch erfolgt. So können sämtliche bereits er­ hältlichen Enzymimmunoassays (EIA und ELISA) prob­ lemlos eingesetzt werden. Insbesondere profitiert das elektrochemische Verfahren nach der Erfindung von der bereits weitgehenden Automatisierung (z. B. Mikroti­ terplatten) herkömmlicher optischer Enzymimmunoas­ says.

Eine zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfah­ rens geeignete Vorrichtung weist mindestens eine Elektrodeneinheit mit mindestens einer Arbeitselek­ trode und mindestens einer Referenzelektrode auf so­ wie einen Potentiostaten zur Konstanthaltung des elektrischen Potentiales zwischen der Arbeitselektro­ de und der Referenzelektrode und zur Erzeugung eines elektrischen Ausgangssignales. Weiterhin weist diese Vorrichtung eine Spannungsversorgung für die Elektro­ deneinheit auf.

Im Falle eines Enzymimmunotestes, der auf einer Mi­ krotiterplatte durchgeführt wird, können entweder die Elektrodeneinheiten oder auch die Mikrotiterplatte selbst verschiebbar sein, um jeweils die Arbeitselek­ troden in die einzelnen Näpfchen der Mikrotiterplatte einzubringen und die Messung durch­ zuführen. Alternativ können auch für jedes einzelne Näpfchen eine eigene Arbeitselektrode und eine Refe­ renzelektrode in der Näpfchenanordnung einer Mikroti­ terplatte entsprechenden Abstanden zur Verfügung ge­ stellt werden.

Die Auswertung der Signale des Potentiostaten er­ folgt, nach Wandlung in digitale Signale, vorzugs­ weise mittels eines Mikroprozessors.

Im folgenden wird beispielhaft ein erfindungsgemäßes Verfahren sowie eine hierzu geeignete Vorrichtung be­ schrieben.

Fig. 2 zeigt eine Vorrichtung mit einer Elektroden­ einheit 2, die in ein Näpfchen einer Mikrotiterplatte paßt. Weiterhin weist diese Vorrichtung einen Poten­ tiostaten 3 zur Erzeugung des Reduktions/Oxidations­ potentiales und zur Erzeugung eines Ausgangssignales, eine Spannungsversorgung 4 für den Potentiostaten, ei­ nen Analog/Digitalwandler 5 sowie einen Mikroprozes­ sor 6 auf.

Zur Messung werden nun die Elektroden der Elektroden­ einheit in ein Näpfchen einer Mikrotiterplatte einge­ führt und der bei einem konstanten Reduktions/Oxi­ dations-Potential erzeugte Strom gemessen. Dieser ist proportional zu der Menge an oxidiertem bzw. redu­ ziertem Farb-Substrat und damit proportional zu der Menge an zu erfassendem Analyten. Diese amperometri­ sche Analyse wird ebenfalls, wie bei der optischen Erfassung, unmittelbar nach der Beendigung der enzy­ matischen Reaktion mittels einer sauren bzw. alkali­ schen Lösung durchgeführt.

Der Potentiostat 3 erzeugt analoge Signale und gibt diese an den Analog/Digital-Wandler 5 aus, der die analogen Signale in digitale Signale wandelt und diese an den Mikroprozessor 6 ausgibt, wo eine Auswertung und Darstellung der Daten erfolgt.

Fig. 3 zeigt ein typisches Signal einer amperomet­ rischen Messung wie oben beschrieben. Dieses Signal wurde mit einer Mikrotiterplatte gemessen, die mit einer Meerrettich-Peroxidase beschichtet war. Es handelt sich daher nicht um ein eigentliches enzymge­ koppeltes Immunoassaysystem, zeigt jedoch die Anwend­ barkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens für Enzym­ immunoassaysysteme.

Für die Messungen aus Fig. 3 wurden Proben mit unter­ schiedlichen optischen Dichten hergestellt. Hierzu wurde eine Mikrotiterplatte mit verschiedenen Konzentrationen einer Meerrettichperoxidase beschich­ tet. Daraufhin wurde eine Farbreaktion mit einer Sub­ stratlösung durchgeführt, wie im folgenden beschrie­ ben:

• a) Es wurden verschiedene Konzentrationen von Meerrettichperoxidaxelösung auf einer Mikro­ titerplatte hergestellt durch Reinverdünnung mit 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7.0). Nach Inku­ bation für 30 min bei Zimmertemperatur wurde die Platte dreimal mit dem Phosphatpuffer gewaschen.
• b) Um die Farbreaktion durchzuführen wurde die mit Meerrettichperoxidase beschichtete Mikrotiter­ platte mit einer Lösung von 3,3'-, 5,5'-Tetra­ methylbenzidin (TMB) behandelt, die auf herkömm­ liche Weise hergestellt wurde. Nach Inkubation für 30 min wurde die Reaktion mit 2 M schwef­ liger Säule gestoppt. Die optische Dichte wurde bei einer Wellenlänge von 450 nm gemessen, wozu ein ELISA-Lesegerät verwendet wurde.

Nachdem die optische Dichte gemessen wurde, wurde dieselbe Probe einer elektrochemischen Messung gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren unterzogen. Das Potential zwischen der Arbeits- und der Referenz­ elektrode wurde mittels eines Potentiostaten auf 0,45 V gehalten. Wie in Fig. 3 gezeigt, wurde das Signal von den Elektroden für 100 s für jede einzelne Probe bei Zimmertemperatur bestimmt. Vor und nach jeder Messung wurde die Basislinie (BL) durch Eintau­ chen der Elektrode in TMB-Lösung bestimmt, die mit 2 M schwefliger Säule behandelt wurde. Da die Proben­ lösung auf der Elektrode die TMB-Lösung für die Grundlinienmessung kontaminieren könnte, wurde die Elektrode mehrfach mit destilliertem Wasser gespült, bevor sie in die TMB-Lösung eingetaucht wurde.

Der erste Teil (0-100 s) und der dritte Teil (200- 300 s) des Gesamtsignals entsprechen der Grundlinie, die bei einer nichtgefärbten Substratlösung gemessen wird. Der zweite Teil des Signals (100-200 s) zeigt eine signifikante Änderung gegenüber der Grundlinie, die einer Farbreaktion des Substrates entspricht. Dieser zweite Teil des Signals wurde in einer gefärb­ ten Lösung erhalten, die eine optische Dichte von 0,52 aufwies.

Nicht dargestellte Messungen ergaben, daß die elek­ trochemische Analyse der Enzymreaktion im Bereich optischer Dichten zwischen 0 und 3 elektrische Sig­ nale ergibt, die proportional zu der optischen Dichte sind. Damit eignen sich die elektrochemischen Signale in gleicher Weise wie die optischen Signale eines Enzymimmunoassays zur Bestimmung und Quantifizierung eines Analyten.

Eine derartige elektrochemische Bestimmung eines Enzymimmunoassays wird nun in Fig. 4 dargestellt. Hierzu wurde ein im Handel erhältlicher EIA-Typ Diagnostik-Kit für den HIV-Virus (AIDSDIA 1/2, hergestellt von Dong-A Pharmaceutical Co. Ltd. in Seoul, Korea) verwendet. Dabei wurden sämtliche experimentellen Schritte gemäß dem Protokoll dieses Kits durchgeführt. Eine negative und eine positive Kontrollprobe, die in dem Kit enthalten sind, wurden für den hier durchgeführten Test verwendet und es wurde eine vierfache Probenerfassung durchgeführt, d. h. n = 4.

Die Messungen in Fig. 4 wurden für die optische Dichte bei einer Wellenlänge von 450 nm durchgeführt. BL stellt in Fig. 4 die Grundline der Messung mit einer TMB-Lösung dar. Die drei Proben, die mit einer optischen Dichte von 0,05 bezeichnet sind, entspre­ chen den Negativkontrollproben, während die drei Proben mit einer optischen Dichte von 0,62, 0,62 bzw. 0,73 den Positivkontrollen entsprechen. Die durch­ schnittliche optische Dichte der Grundlinien-Proben (n = 4) entsprach genau der optischen Dichte der Negativkontrollproben.

Der Durchschnittswert der optischen Dichte gemessen bei 450 nm für die Negativkontrolle (n = 4) betrug 0,65 mit einer Standardabweichung von 0,05. Der Durchschnittswert der optischen Dichte für die Positivkontrolle (n = 4) betrug 0,05 mit einer Stan­ dardabweichung von 0. Werden die Richtlinien für die Interpretation des Ergebnisses gemäß dem verwendeten Kit berücksichtigt, so entsprechen diese Werte korrekten Ergebnissen für eine Negativkontrolle und eine Positivkontrolle.

Nach der Messung der optischen Dichte wurde die elektrochemische Messung durchgeführt. Wie in Fig. 4 dargestellt, wird bei dem entsprechenden elektro­ chemischen Signal die entsprechende gemessene optische Dichte der Probe angegeben, um den Vergleich zu erleichtern. Wie oben beschrieben, wurde die Grundlinie mittels einer TMB-Lösung bestimmt, die durch 2 M schweflige Saure gequencht wurde. Jede Messung wurde für 100 s bei Zimmertempertur durchge­ führt. Der Unterschied des elektrochemischen Signales zwischen einem negativen Signal und einem positiven Signal ist in Fig. 4 offensichtlich groß genug, um eine richtige Bestimmung des Assay-Ergebnisses durch­ zuführen. Zwischen der Grundlinie BL und dem Signal der negativen Kontrollprobe besteht nur eine geringe Differenz. Dies entspricht der Tatsache, daß die optische Dichte der Grundlinie BL identisch mit der optischen Dichte der Negativkontrolle, d. h. einer optischen Dichte von 0,05, bestimmt wurde. Die Fig. 4 zeigt also deutlich, daß eine elektrochemische Messung direkt auf herkömmliche EIA- oder ELISA-Kits angewandt werden kann.

Zusammenfassend soll noch einmal festgestellt werden, daß bisherige elektrochemische Verfahren in Immuno­ ssays im wesentlichen mit Elektroden arbeiteten, die fest gebundene Enzyme und Mediatoren aufwiesen und als Einmalelektroden bzw. Wegwerfelektroden verwech­ selt werden. Demgegenüber gibt die vorliegende Anmel­ ung ein Verfahren an, bei dem unmittelbar herkömmliche EIA oder ELISA-Systeme elektrochemisch vermessen werden können. Anders gesagt können die gefärbten Subtrate wie im Falle einer optischen Messung mittels einer elektrochemischen Methode erfaßt werden. Dies erfolgt vorteilhafterweise durch amperometrische Verfahren. Entscheidend bei dem vorgestellten Ver­ fahren ist dabei, daß herkömmliche EIA und ELISA- Systeme ohne jegliche Veränderungen angewandt werden können.

Claims (6)

1. Verfahren zur Durchführung eines Enzymimmuno­ assays (EIA, ELISA) mit einer Probe, wobei ein Reaktionspartner zu der Probe gegeben wird, an den ein Enzym gekoppelt ist, das bei Zugabe eines Substrates eine Redox-Reaktion und Farb­ reaktion des Substrates auslöst, und wobei nicht gebundene Reaktionspartner entfernt und anschließend Substrat zu der Probe gegeben wird, bei dem Elektroden in die Probe eingebracht und die Probe elektrochemisch vermessen wird.

2. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprü­ che, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentra­ tion an oxidiertem Substrat und/oder reduziertem Substrat bestimmt wird.

3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprü­ che, dadurch gekennzeichnet, daß als Enzym alka­ lische Phosphatase oder Wasserstoffperoxidase verwendet wird.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprü­ che, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren als Festphasen-Immuntest durchgeführt wird.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprü­ che, dadurch gekennzeichnet, daß ein oder meh­ rere Proben auf einer Mikrotiterplatte ange­ ordnet werden.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprü­ che, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren als Zweiseiten-Bindungstest oder Kompetitions­ test durchgeführt wird.