DE3429377C2

DE3429377C2 -

Info

Publication number: DE3429377C2
Application number: DE3429377A
Authority: DE
Inventors: Daizo Tokinaga; Teruaki Hachioji Jp Kobayashi; Kazumichi Kokubunji Jp Imai
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 1983-09-09
Filing date: 1984-08-09
Publication date: 1987-10-01
Also published as: JPS6057257A; DE3429377A1; US4628035A

Description

Die Erfindung betrifft einen Immunoassay zur quantitativen Messung der Konzentration eines Antigens oder eines Antikörpers in einer Probe.

Yalow et al. (Nature, Vd. 184, 1959, S. 1948) beschreiben ein Verfahren zur Messung von geringen Insulinmengen unter Verwendung eines speziellen, mit einem Radioisotop markierten Antikörpers. Seit dieser Zeit wird diese als Radioimmunoassay bezeichnete Meßtechnik zur quantitativen Messung von verschiedenen biologischen Materialien und Arzneistoffen eingesetzt. Aufgrund der Verwendung von radioaktiven Isotopen sind jedoch bei der Durchführung derartiger Tests besondere Vorsichtsmaßnahmen erforderlich. Aus diesem Grund wurden verschiedene Immunoassaytechniken unter Verwendung von nicht-radioaktiven Markern, wie Enzymen, Enzymsubstraten, fluoreszierenden und chemilumineszierenden Matierialien, untersucht. Insbesondere sind Verfahren unter Verwendung von Enzymen oder fluoreszierenden Materialien als Markern bis zur Praxisreife entwickelt worden. Jedoch sind derartige Verfahren und Radioimmunoassays wegen des für das gesamte Verfahren hohen Arbeits- und Zeitaufwands schwierig zu automatisieren.

In der US-PS 38 52 157 ist ein vereinfachtes Verfahren beschrieben, wobei jedoch die Analyten auf Haptene mit niedrigem Molekulargewicht beschränkt sind. Dieses Verfahren ist insofern vereinfacht, als eine Trennung des Antigen-Antikörper-Komplexes von freien Antigenen oder Antikörpern nicht erforderlich ist. Auf der anderen Seite wurde auch versucht, den Trennvorgang zu vereinfachen. Bei diesem sogenannten Festphasenverfahren wird ein Antikörper oder ein Antigen vorher an einen unlöslichen Träger gebunden. Die Antigen-Antikörper-Reaktion wird dann auch auf diesem Träger durchgeführt. Die feien Antigene oder Antikörper lassen sich von den jeweiligen gebundenen Formen leicht durch Waschen des Trägers mit Wasser entfernen.

Zwar lassen sich Immunoassays durch dieses Festphasenverfahren vereinfachen, diese Verfahren lassen aber im Hinblick auf eine Automation des Gesamtverfahrens noch in vielen Punkten zu wünschen übrig. Für eine Automation von Immunoassays ist es wesentlich, den Zeitbedarf für das Gesamtverfahren zu verringern. Bei Immunoassays erfordert die Antigen-Antikörper-Reaktion die meiste Zeit. Üblicherweise werden dafür mehrere Stunden bis 1 Tag benötigt. Im allgemeinen wird die hierfür erforderliche Zeit umso länger, je geringer die Konzentration des durch den Immunoassay zu bestimmenden Materials ist.

Um die Reaktionszeit zu verkürzen, wurde ein Verfahren vorgeschlagen bei dem eine Säule mit Microkristallen oder feinen Teilchen, an die ein Antikörper (oder Antigen) gebunden ist, gefüllt wird und ein Analyt zwangsweise durch die Säule geleitet wird. Dabei gelangt eine den Analyten enthaltende Flüssigkeit in einen Bereich oder eine Schicht des Trägers, in dem ein Antikörper oder dergleichen immobilisiert worden ist.

Ein weiteres elektrophoretisches Verfahren ist in der japanischen Patentveröffentlichung 132946/80 beschrieben. Dabei wird ein mit Polyacrylamidgel gefülltes Röhrchen für die Disk-Elektrophorese bereitgestellt. Eine Antikörperlösung oder Antigenlösung wird auf ein Ende des Gelröhrchens aufgesetzt. Anschließend wird die Elektrophorese durchgeführt. Dabei bildet sich eine mit dem Antikörper oder Antigen angereicherte Schicht. In dieser angereicherten Schicht findet die Antigen-Antikörper-Reaktion statt, wenn die Antigenlösung oder Antikörperlösung der Elektrophorese unterworfen wird. Es wurde auch versucht, die Bildung dieser angereicherten Schicht durch Einsetzen einer proteinundurchlässigen Membran, d. h. einer Dialysemembran, in einen Bereich des Gels zu unterstützen. Dabei werden die Antikörper oder auch das Antigen nicht in der Trägermatrix für Elektrophoresezwecke immobilisiert, sondern liegen im freien Zustand in der Reaktionsschicht vor. Aufgrund der Tatsache, daß diese Bestandteile in der Reaktionsschicht in freiem Zustand vorliegen, kann die Reaktionsschicht selbst nicht direkt mit einer Elektrolytlösung auf der anodischen oder kathodischen Seite der Elektrophorese in Kontakt gebracht werden.

Bei allen Antigen-Antikörper-Verfahren, bei denen die beiden vorerwähnten elektrophoretischen Methoden angewandt werden, muß eine Trägermatrix für die Elektrophorese (d. h. ein von Antikörper oder Antigen freier Bereich) außerhalb des Reaktionsbereichs oder der Reaktionsschicht bereitgestellt werden. Somit ist man gezwungen, das Antigen oder den Antikörper dem Reaktionsbereich oder der Reaktionsschicht durch die Trägermatrix für die Elektrophorese zuzuführen. Demgemäß werden der Elektrophoreseweg und die für die Elektrophorese erforderliche Zeit länger. Außerdem müssen zur Durchführung von Immunoassays nach diesen Methoden Inhibitoren (z. B. überschüssiger markierter Antikörper, der an der Reaktion nicht teilnimmt), die dem Reaktionsbereich oder der Reaktionsschicht zugeführt werden, aus diesem Bereich oder dieser Schicht entfernt werden. Für diese Entfernung bei derartigen elektrophoretischen Verfahren muß die Elektrophorese fortgesetzt werden, so daß ein zusätzlicher Zeitbedarf für die Wartung des Inhibitors durch die Trägermatrix für Elektrophoresezwecke außerhalb des Reaktionsbereichs oder der Reaktionsschicht entsteht.

Aus der DS-AS 24 06 959 ist ein Verfahren zur Bestimmung von Antigenen bekannt, bei dem der Antikörper in der Trägermatrix eingebettet ist, d. h. nicht in chemisch gebundener Form vorliegt.

Schließlich ist aus der US-PS 39 66 897 ein Verfahren gemäß Oberbegriff des Patentanspruchs 1 bekannt, bei dem der Antkörper jedoch nur in Teilbereichen der Elektrophorese-Trägermatrix vorhanden ist.

Aufgabe der Erfindung ist es, einen verbesserten Immunoassay bereitzustellen, bei dem die Reaktionszeit der Antigen-Antikörper-Reaktion verkürzt ist und sich leicht automatisieren läßt.

Gegenstand der Erfindung ist nun ein Immunoassay zur Messung der Konzentration eines Antigens in einer Probe durch Fixieren des Antigens mit einem immobilisierten Antikörper durch Antigen-Antikörper-Reaktion, wobei die Antigen-Antikörper-Reaktion mit dem immobilisierten Antikörper im Verlauf einer elektrophoretischen Wanderung durch eine Trägermatrix des Antigens der zu messenden Probe unter Fixierung des Antigens erfolgt, wobei markierter Antikörper elektrophoretisch zum fixierten Antigen wandert und dort eine Umsetzung mit dem Antigen erfährt, oder markiertes Antigen elektrophoretisch in einen nicht umgesetzten Bereich des immobilisierten Antikörpers wandert und dort eine Umsetzung mit dem Antikörper erfährt und wobei die Konzentration des markierten Antikörpers oder markierten Antigens in der Probe gemessen wird, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Elektrophorese-Trägermatrix verwendet, bei der der Antikörper im gesamten Bereich der Trägermatrix immobilisiert ist.

Der hier in den Patentansprüchen verwendete Begriff "Immobilisierung" bedeutet nicht ein einfaches Eingießen oder Einbetten des Antikörpers, wie bei dem Verfahren der vorgenannten DE-AS 24 06 959, sondern eine Immobilisierung durch chemische Bindung, wie beim Verfahren der vorgenannten US-PS 39 66 897, bei dem Bromcyanid für die chemische Bindung des Antikörpers an die Matrix Verwendung findet. Gemäß einer besonderen Ausführungsform der Erfindung wird die Immobilisierung des Antikörpers in der Matrix so durchgeführt, daß man zunächst Acrolein and den Antikörper bindet, worauf der erhaltene Antikörper/Acrolein-Zwischenprodukt einer vernetzenden Polymerisation mit einem Acrylamidmonomeren und einem N,N′- Methylen-bis-acrylamidmonomeren unterworfen wird.

Beim Verfahren der Erfindung stehen an jeder Stelle der elektrophoretischen Trägermatrix Antikörper zur Verfügung, die zur Bildung eines Antikörper-/Antigenkomplexes befähigt sind. Hierdurch entfallen Transportwege, die ein Antigen oder ein Antikörper während der elektrophoretischen Wanderung erst überwinden muß, um zu einer reaktionsfähigen Stelle zu gelangen. Der Wegfall solcher Transportwege ergibt unmittelbar einen entsprechenden Zeitgewinn, d. h. eine Verkürzung der Analysendauer.

Beispiele für geeignete Markierungsstoffe für die Antikörper bzw. Antigene sind Enzyme, fluoreszierende Substanzen und Luminol ( α-Aminophthalsäurehydrazid).

Bei der Elektrophorese des Antigens, des markierten Antikörpers oder des markierten Antigens werden z. B. Spannungen von 50 bis 1000 Volt angewendet.

Im folgenden ist die Erfindung anhand der Zeichnungen beschrieben. Es zeigt

Fig. 1 eine schematische Darstellung einer Elektrophoresevorrichtung zur Durchführung der Antigen-Antikörper-Reaktion;

Fig. 2, 3 und 4 nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Eichkurven für Human-IgG, Human-Albumin und Human-Choriongonadotropin;

Fig. 5 eine bevorzugte Ausführungsform einer Haltevorrichtung für die Reaktionsmembran zur Durchführung des erfindungsgemäßen Immunoassays; und

Fig. 6 und 7 nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gemessene Eichkurven für Human-Albumin.

Bei den vorerwähnten beiden elektrophoretischen Verfahren müssen das Antigen und der Antikörper in der Trägermatrix für die Elektrophorese so weit wandern, bis sie den Reaktionsbereich oder die Reaktionsschicht erreichen, was zeitraubend ist. Ferner entsteht ein zusätzlicher Zeitbedarf für die Entfernung von nicht umgesetzten Material aus der Nähe des Reaktionsbereichs und der Rektionsschicht. Die Entfernung des Bereichs, in dem keine Umsetzung stattgefunden hat, kann unterbleiben, wenn der Reaktionsbereich nach Beendigung der Reaktion entnommen wird und anschließend die weitere Bearbeitung durchgeführt wird. Dies ermöglicht zwar eine zeitliche Verkürzung des Verfahrens, bringt aber das Problem mit sich, daß sich ein derartiger Arbeitsschritt nicht für die Automation eignet.

Erfindungsgemäß besteht die Trägermatrix für die Elektrophorese im wesentlichen nur aus dem Reaktionsbereich. Dies bedeutet, daß praktisch der gesamte Bereich der Trägermatrix den Reaktionsbereich darstellt, in dem der Antikörper oder das Antigen immobilisiert worden ist. Dieser Bereich steht direkt mit einer Elektrolytlösung an der Anodenseite und einer Elektrolytlösung an der Kathodenseite in Berührung. Dabei ist es zur Erzielung einer zeitlichen Verkürzung vorteilhaft, daß der Reaktionsbereich in Form einer Membran vorliegt und der Reaktant, d. h. das Antigen oder der Antikörper, durch Elektrophorese in vertikaler Richtung zur Membranoberfläche wandert.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird unter pH-Bedingungen durchgeführt, bei denen der Analyt in einer spezifischen Umgebung in entsprechender Weise geladen ist. Zur praktischen Durchführung des erfindungsgemäßen Immunoassays können fast sämtliche Techniken, bei denen die Festphasenreaktion erfolgt, wie das Sandwich-Verfahren und der Immunosorptionsmittel-Assay, angewandt werden.

Nachstehend wird die Erfindung anhand von Beispielen näher erläutert.

Beispiel 1

Eine Celluloseacetatmembran mit immobilisiertem anti-human-IgG-Antikörper wird hergestellt, indem man eine Celluloseacetatmembran (mit einer Dicke von etwa 120 µm) für Elektrophoresezwecke etwa 1 Stunde in eine Lösung von anti-human-IgG-Antikörper (Kaninchen) eintaucht und anschließend die erhaltene Membran 30 Minuten in eine mit PBS (0,1 m Phosphatpufferlösung mit einem Gehalt an ¹/₁₅ m NaCl, pH-Wert=7,4) verdünnte 2,5prozentige Glutaraldehydlösung eintaucht. Diese Arbeitsgänge werden dreimal wiederholt. Anschließend wird die erhaltene Membran etwa 1 Stunde in eine Lösung von anti-human-IgG-Antikörper getaucht und sodann ausreichend mit PBS gewaschen. Aus der erhaltenen Membran wird ein rundes Membranstück mit einem Durchmesser von 8 mm ausgeschnitten. Ein Immunoassay wird unter Verwendung dieser runden Membran als Reaktionsmembran nach dem Sandwich-Verfahren durchgeführt, wobei human-IgG als Analyt verwendet wird.

Die Antigen-Antikörper-Reaktion wird unter Verwendung der in Fig. 1 dargestellten Vorrichtung durchgeführt. Die Reaktionsmembran 1 wird von einer Kugelverbindung aus Glas mit einem Innendurchmesser von 4 mm gehalten. Oberer Elektrolyt 4 und unterer Elektrolyt 6, die jeweils aus Tris-Glycin-Pufferlösung (pH-Wert 8,6) bestehen, werden in das obere Elektrolytgefäß 3 bzw. in das untere Elektrolytgefäß 5 gegeben. Die Bezugszeichen 7 und 8 stellen Platinelektroden, 9 eine Gleichstromquelle und 10 eine Dialysemembran dar.

Zunächst werden 10 µl mit einer 40prozentigen Saccharoselösung auf das doppelte Volumen verdünnten Standardprobe vorsichtig unter Verwendung einer Mikrospritze auf den oberen Teil Reaktionsmembran aufgesetzt. Dabei werden gleichzeitig drei verschiedene Proben auf drei Membranen aufgetragen. Anschließend wird die Elektrophorese 15 Minuten bei einer Spannung von 50 V durchgeführt. Sodann werden 10 µl einer handelsüblichen Lösung von mit alkalischer Phosphatase markiertem anti-human-IgG-Antikörper (Ziege) (Miles Lab.), die mit 40prozentiger Saccharoselösung auf das doppelte Volumen verdünnt ist, auf den oberen Teil der Reaktionsmembran aufgesetzt. Anschließend wird die Elektrophorese 15 Minuten bei einer Spannung von 50 V durchgeführt. Sodann wird die Reaktionsmembran entnommen und lediglich mit PBS gespült. Die Farbentwicklung aufgrund der enzymatischen Aktivität der in der Reaktionsmembran erhaltenen alkalischen Phosphatase erfolgt durch 30minütiges Eintauchen in eine Flüssigkeit der in Tabelle I angegebenen Zusammensetzung. Nach der Farbentwicklung wird die Reaktionsmembran mit Wasser gewaschen, getrocknet und anschließend in Decalin getaucht, um sie durchsichtig zu machen. Das Ausmaß der Farbentwicklung wird kolorimetrisch bei einer Wellenlänge von 600 nm bestimmt. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 zusammengestellt. Die Ordinate dieser Figur zeigt die Absorptionsdifferenzen bei den einzelnen Proben nach der Farbentwicklung. Bei einer Standardprobe, die vollständig frei von human-IgG ist, ergibt sich keine Absorptionsänderung.

Tabelle I

Natriumnaphtol-AS-BI-phosphat10 mg p-Diazodimethylanilin-chlorid-Zinkchlorid30 mg 10prozentige wäßrige Magnesiumchloridlösung2 Tropfen 0,1 m Tris-HCL-Pufferlösung (pH-Wert=8,6)50 ml

Beispiel 2

Eine Membran aus Polyacrylamidgel (mit einer Dicke von etwa 300 µm) mit immobilisiertem anti-human-Albumin-Antikörper (Kaninchen) wird folgendermaßen hergestellt: 25 µl einer 2,5prozentigen wäßrigen Acroleinlösung werden zu 0,5 ml einer IgG-Fraktion von anti-human-Albumin-Antiserum (mit einem Gehalt an 2,4 mg/ml aktivem Antikörper) gegeben. Das Gemisch wird unter Eiskühlung 30 Minuten stehengelassen und sodann gegen PBS dialysiert. 1,5 ml einer Lösung von Acrylamid mit einem Gehalt an 0,32 g/ml, 1,5 ml einer Lösung von N,N′-Methylen-bis-acrylamid mit einem Gehalt an 0,016 g/ml, 1,25 ml einer wäßrigen Lösung von N,N,N′,N′-Tetramethylendiamin mit einem Gehalt an 4,6 µl/ml und 5,75 ml einer Lösung von Ammoniumpersulfat mit einem Gehalt an 1,2 mg/ml werden zum erhaltenen Gemisch gegeben. Sodann wird das Gemisch gerührt und anschließend in eine Membranbildungsvorrichtung aus Glas gegossen und stehengelassen. Aus der erhaltenen Membran wird ein rundes Membranstück mit einem Durchmesser von 9 mm ausgeschnitten. Dieses Membranstück wird in entsprechender Weise wie in Beispiel 1 eingesetzt. In diesem Fall wird jedoch wegen der Brüchigkeit der Polyacrylamidgelmembran mit dem immobilisierten Antikörper ein Polyesternetz mit einer Dicke von 200 µm in die Reaktionsmembran eingesetzt. Entsprechend wie in Beispiel 1 wird die mit Saccharoselösung verdünnte Humanalbumin-Standardprobe auf die Membran aufgesetzt. Anschließend wird die Elektrophorese 30 Minuten bei einer Spannung von 250 V durchgeführt. Sodann wird in entsprechender Weise mit Fluoreszein markiertes anti-human Albumin-Antiserum (Kaninchen), das gemäß dem Verfahren von M. Goldman hergestellt worden ist, aufgesetzt. Die Elektrophorese wird 20 Minuten bei einer Spannung von 250 V durchgeführt. Sodann wird die Reaktionsmembran entnommen und lediglich mit PBS gespült. Die Fluoreszensintensität der Membran wird unter Verwendung eines Fluorimeters gemessen. Die Anregungswellenlänge beträgt 485 nm und die Meßwellenlänge 520 nm. Das Ergebnis ist in Fig. 3 wiedergegeben.

Beispiel 3

Eine Polyacrylamidgelmembran (mit einer Dicke von etwa 300 µm) mit einem Gehalt an einer immobilisierten IgG-Fraktion, die gemäß Beispiel 2 aus anti-human-Choriongonadotropin- Antiserum (Kaninchen) erhalten worden ist, wird als Reaktionsmembran verwendet. Die Standardprobe wird in entsprechender Weise wie in Beispiel 2 aufgesetzt. Ferner wird in entsprechender Weise eine mit Luminol markierte Antikörperlösung auf die Membran aufgesetzt und 30 Minuten bei 250 V der Elektrophorese unterworfen. Sodann wird die Reaktionsmembran entnommen, 30 Minuten in eine 0,85prozentige NaCl- Lösung getaucht und sodann auf den Boden der quadratischen 1 cm-Quarzküvette mit einem durchsichtigen Bodenfenster gebracht. Hierauf werden in die Küvette von oben 100 µl einer 0,1 m wäßrigen H₂O₂-Lösung und 200 µl einer 10millimolaren Natriumhypochloritlösung in 0,1 n wäßriger NaOH-Lösung zugesetzt, wodurch eine oxidative Lumineszenz des Luminols auf der Reaktionsmembran hervorgerufen wird. Die Lumineszenzintensität wird mittels eines Photonenzählers, dessen Lichtaufnahmeteil sich an der Unterseite der Quarzküvette befindet, gemessen. Das Ergebnis ist in Fig. 4 dargestellt.

Beispiel 4

Die Reaktionsmembran von Beispiel 3 wird in einen Membranhalter aus Acrylharz, wie er in Fig. 5 dargestellt ist, gebracht. Die Wanderung der Standardprobe und des mit Luminol markierten Antikörpers erfolgt gemäß Beispiel 3. Jedoch wird in diesem Beispiel der Elektrolyt während der Elektrophorese kontinuierlich ausgetauscht, indem man nach und nach in das obere Elektrolytgefäß frischen Elektrolyt zusetzt und nicht umgesetztes Material und überschüssige markierte Antikörper, die in der Reaktionsmembran nicht zur Umsetzung gebracht worden sind, entfernt. Das Bezugszeichen 14 bezeichnet eine Einlaßöffnung und das Bezugszeichen 15 eine Auslaßöffnung für die Elektrolyten. Nach der Elektrophorese des mit Luminol markierten Antikörpers werden der obere Elektrolyt im oberen Elektrolytgefäß, der Membranhalter und der untere Elektrolyt im unteren Elektrolytgefäß entfernt. Sodann wird gemäß Beispiel 3 wäßrige H₂O₂-Lösung und Natriumhypochloritlösung auf den Membranhalter aufgebracht, wodurch die Lumineszenz des Luminols hervorgerufen wird. Die Lumineszenzintensität wird mit einem Photonenzähler, dessen Lichtempfangsteil 12 auf der Unterseite des Elektrolytgefäßes angeordnet ist, gemessen. Ähnlich wie in Beispiel 3 erhält man eine Eichkurve, die proportional zur zugesetzten Menge an Antigen, nämlich human-Choriongonadotropin, verläuft.

Beispiel 5

Die gemäß Beispiel 2 hergestellte Lösung von Acrolein-anti- human-Albumin-Antikörper-Konjugat wird mit PBS auf das 100fache Volumen verdünnt. Mit 0,5 ml der erhaltenen Lösung wird gemäß Beispiel 2 eine Polyacrylamidgelmembran mit immobilisiertem Antikörper hergestellt. Daraus wird ein rundes Membranstück mit einem Durchmesser von 9 mm ausgeschnitten und als Reaktionsmembran verwendet. Die Reaktionsmembran wird in die Vorrichtung von Beispiel 2 gelegt. Nach Aufsetzen einer Standardprobe von Humanalbumin wird 45 Minuten eine Eletrophorese bei einer Spannung von 100 V durchgeführt. Anschließend wird eine gemäß dem Verfahren von M. Goldman hergestellte Lösung von mit Fluorescein markiertem Humanalbumin, die mit einem gleichen Volumen an 40prozentiger Saccharoselösung verdünnt worden ist, aufgesetzt. Dann wird die Elektrophorese 45 Minuten bei 100 V durchgeführt. Anschließend wird die Reaktionsmembran entnommen und 5 Minuten in PBS getaucht. Die Fluoreszenzintensität wird gemäß Beispiel 2 mittels eines Fluorimeters gemessen. Das Ergebnis ist in Fig. 6 dargestellt.

Beispiel 6

Verschieden dicke Polyacrylamidgelmembranen mit anti-human- Albuminantikörper werden durch Variation der Bedingungen bei der Membranbildung hergestellt. Die Zusammensetzung des Gels entspricht der von Beispiel 2. Die Dicken der erhaltenen Gelmembranen betragen 20 bis 200 µm. Es werden jeweils runde Membranstücke von 9 mm Durchmesser aus dem Gelmembran ausgeschnitten und in die Vorrichtung von Beispiel 1 eingesetzt. Anschließend werden 10 µl der Lösung von mit Fluorescein markiertem anti-human-Albumin-Antiserum, die mit einer gleichen Menge an 40prozentiger Saccharoselösung verdünnt worden ist, aufgesetzt. Die Elektrophorese wird 1 Stunde bei einer Spannung von 250 V durchgeführt. Sodann wird die erhaltene Membran entnommen und kurz mit PBS gespült. Die Menge an mit Fluorescein markiertem Antikörper wird fluorimetrisch gemessen. Es ergibt sich, daß die verbleibende Fluoreszenz an Membranen mit einer Dicke von mehr als 1000 µm ermittelt werden kann, wobei aber die Entfernung von Fluoreszenz hervorrufenden Bestandteilen nur bei Membranen mit einer Dicke von 1000 µm oder weniger besonders gut abläuft. Ferner sind Membranen mir einer Dicke unter 100 µm brüchig und schwer handzuhaben. Somit beträgt die Dicke der Polyacrylamidgelmembran mit immobilisiertem Antikörper vorzugsweise 100 bis 1000 µm.

Beispiel 7

Man verfährt hinsichtlich der Reaktionsmembran, der Vorrichtung, der Reagentien und des Meßverfahrens wie in Beispiel 2, variiert aber die Spannung bei der Elektrophorese in geeigneter Weise von 20 bis 1500 V. Übersteigt die Spannung 1000 V, ergibt sich eine geringe Fluoreszenzintensität, und eine günstige Eichkurve läßt sich nicht aufstellen. Andererseits erhält man auch bei einer Spannung unter 50 V keine günstige Eichkurve, da die Restmenge an Fluoreszenz hervorrufenden Bestandteilen groß ist und somit ein starker Hintergrund entsteht. Im Bereich von 50 bis 1000 V lassen sich gute Eichkurven aufstellen, bei denen sich die Fluoreszenzintensität proportional zur Konzentration an zugesetztem Humanalbumin ist.

Beispiel 8

Gemäß Beispiel 5 wird eine Reaktionsmembran aus einer Polyacrylamidgelmembran mit immobilisiertem anti-human-Albumin-Antikörper hergestellt. Der Immunoassay auf Humanalbumin wird nach der Kompetitivmethode durchgeführt.

Eine Probe, die durch Zusatz einer gleichen Menge an mit Fluorescein markiertem Albumin zur Humanalbumin-Standardprobe hergestellt worden ist, wird gemäß Beispiel 5 45 Minuten der Elektrophorese bei einer Spannung von 100 V unterworfen. Die Markierung mit Fluorescein erfolgt dabei gemäß dem Verfahren von M. Goldman. Nach der Elektrophorese wird die Reaktionsmembran entnommen und lediglich mit PBS gespült. Die Fluoreszenzintensität der Membran wird fluorimetrisch gemessen. Die übrigen Meßbedingungen entsprechen denen von Beispiel 2. Die Ergebnisse sind in Fig. 7 zusammengestellt.

Wie vorstehend erläutert, kann gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren die Reaktionszeit, die bei Antigen-Antikörper- Reaktionen von herkömmlichen Immunoassays 3 oder 4 Stunden bis zu 1 Tag beträgt, auf eine Stunde verkürzt werden. Selbstverständlich hängt beim erfindungsgemäßen Verfahren die erforderliche Reaktionszeit von der Art der Reaktionsmembran, der Dicke der Reaktionsmembran, der Wasserstoffionenkonzentration und der Ionenstärke der bei der Elektrophorese verwendeten Elektrolyten, der angelegten Spannung und dergleichen ab. Beispielsweise beträgt die Dicke der Polyacrylamidgelmembran mit immobilisiertem Antikörper in Beispiel 2 etwa 300 µm. Bei Verwendung von entsprechenden dünneren Membranen kann die erforderliche Reaktionszeit bei gleicher Spannung weiter verkürzt werden.

Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß sich im Vergleich zu herkömmlichen Immunoassays eine weitere Vereinfachung ergibt. Erfindungsgemäß wandern nicht umgesetztes Material und überschüssiger markierter Antikörper durch die Reaktionsmembran in das untere Elektrolytgefäß. Daher kann ein Waschvorgang mit Wasser, der bei herkömmlichen, auf einer Festphasenreaktion beruhenden Immunoassays erforderlich ist, entfallen.

Die vorstehend geschilderten beiden Vorteile ermöglichen die Bereitstellung von vollkommen automatisierten Vorrichtungen zur Durchführung von Immunoassays. Schwierigkeiten, die sich aufgrund langer Reaktionszeiten und schwieriger Verfahrensdurchführung ergeben und die bei herkömmlichen Immunoassays als Hinderungsgründe für eine Automatisierung angesehen werden, lassen sich erfindungsgemäß gleichzeitig beseitigen.

Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß die erforderliche Menge an markiertem Antigen 10 µl oder weniger beträgt, was zu einer Senkung der Analysenkosten beiträgt.

Claims

1. Immunoassay zur Messung der Konzentration eines Antigens in einer Probe durch Fixieren des Antigens mit einem immobilisierten Antikörper durch Antigen-Antikörper-Reaktion, wobei die Antigen-Antikörper-Reaktion mit dem immobilisierten Antikörper im Verlauf einer elektrophoretischen Wanderung des Antigens der zu messenden Probe durch eine Trägermatrix unter Fixierung des Antigens erfolgt, wobei markierter Antikörper elektrophoretisch zum fixierten Antigen wandert und dort eine Umsetzung mit dem Antigen erfährt, oder markiertes Antigen elektrophoretisch in einen nicht umgesetzten Bereich des immobilisierten Antikörpers wandert und dort eine Umsetzung mit dem Antikörper erfährt und wobei die Konzentration des markierten Antikörpers oder markierten Antigens in der Probe gemessen wird, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Elektrophorese-Trägermatrix verwendet, bei der der Antikörper im gesamten Bereich der Trägermatrix immobilisiert ist.

2. Immunoassay nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Träger für den immobilisierten Antikörper eine membranähnliche Trägermatrix verwendet.

3. Immunoassay nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man eine poröse Celluloseacetatmembran verwendet.

4. Immunoassay nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Polyacrylamidgelmembran verwendet.

5. Immunoassay nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Polyacrylamidgelmembran mit einem immobilisierten Antikörper durch vernetzende Polymerisation von Acrolein, an das vorher ein Antikörper gebunden worden ist, mit einem Acrylamidmonomeren und einem N,N′-Methyl-bis-acryl-amidmonomeren erhalten worden ist.

6. Immunoassay nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Potentialgradienten in vertikaler Richtung zur Oberfläche der den immobilisierten Antikörper tragenden Matrixmembran anlegt und das Antigen, den markierten Antikörper und das markierte Antigen der Elektrophorese in dieser Richtung unterwirft.

7. Immunoassay nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Polyacrylamidgelmembran mit einer Dicke von 100 bis 1000 µm verwendet.

8. Immunoassay nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man den Elektrolyt in der Elektrophoreserichtung kontinuierlich bei der Stufe der Durchführung der Antigen-Antikörper-Reaktion während der Durchführung der Elektrophorese austauscht.