-
-
Beschreibung
-
Immunoassayverfahren und Reagens zu seiner Durchführung Bei herkömmlichen
Immunoassayverfahren unter Verwendung von Mikrokapseln geht man so vor, daß man
die Mikrokapseln, von denen jede entweder ein Antigen oder einen Antikörper an die
Oberfläche gebunden enthält, mit einer Probe vermischt, die den zugehörigen Antikörper
oder das zugehörige Antigen enthältxund und ein Komplement durch die Antigen/Antikörper-Reaktion
aktiviert. Das aktivierte Komplement zerstört die Membran jeder Mikrokapsel unter
Freisetzung deren Inhalt, wobei die durch das freigesetzte Material hervorgerufene
Reaktion photometrisch gemessen wird. Auf diese Weise lassen sich die Konzentrationen
der in der Probe enthaltenen zugehörigen Antikörper bzw.
-
zugehörigen Antigene bestimmen.
-
In der US-PS 4 342 826 ist ein Immunoassayverfahren beschrieben, bei
dem Mikrokapseln Verwendung finden, die jeweils ein Liposom mit einer Lipidmembran
und außerdem ein Enzym enthalten. Bei einem Komplement handelt es sich um einen
Proteinkomplex, der aus 11 Komponenten besteht. Handelsübliche Komplemente sind
teuer, da sie aus Serums gewonnen werden. Darüber hinaus verursacht eine ungenügende
Reinigung des Serums gewisse Verunreinigungen, die wiederum zu gewissen Qualitätsschwankungen
der Komplemente führen, die für Immunoassays verwendet werden
sollen.
Schließlich handelt es sich bei einem Komplement um ein Protein, das somit nicht
bei Raumtemperatur gelagert werden kann. Dies alles hat zur Folge, daß aus einem
derartigen Komplement Reagentien stabiler Qualität ohne erhebliche Unterschiede
zwischen den einzelnen Chargen kaum hergestellt werden können.
-
Eine Aufgabe der Erfindung besteht somit darin, ein Immunoassayverfahren
zur Verfügung zu stellen, das nicht auf ein Komplement instabiler Qualität angewiesen
ist.
-
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Immunoassayreagens
mit stabiler Qualität zur Verfügung zu stellen, das längere Zeit lagerfähig ist.
-
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Immunoassayverfahren gemäß
Patentanspruch 1 sowie ein Immunoassayreagens zur Durchführung dieses Verfahrens
gemäß Patentanspruch 4.
-
Das Immunoassayverfahren der Erfindung besteht darin, daß man ein
Material, das bei seiner Freisetzung in einer Probelösung eine optische Änderung
hervorruft, Mikrokapseln einverleibt, die jeweils entweder mit einem Antigen oder
einem Antikörper markiert sind, diese Mikrokapseln und ein besonderes Metallion
zusammen mit der Probelösung vermischt, die Mikrokapseln mit Fortschreiten der Antigen/Antikörper-Reaktion
aufbricht, und die Reaktionslösung einer photometrischen Messung unterwirft, wodurch
die in der Probe enthaltenen zugehörigen Antikörper bzw. zugehörigen Antigene bestimmt
werden können.
-
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Magnesium-
oder Calciumionen als spezielle Metallionen verwendet. Diese Metallionen besitzen
die Fähigkeit Membranen aufzubrechen, ähnlich derjenigen herkömmlicher Komplemente,
in einer Konzentration von 2 mMol
oder darüber in der Reaktionslösung.
Aus diesem Grund kann der Inhalt ihrer Mikrokapsel erfindungsgemäß in Abwesenheit
jeglichen Komplements freigesetzt werden.
-
Zum Immunoassayreagens der Erfindung gehören Mikrokapseln, die jeweils
entweder mit einem Antigen oder einem Antikörper auf der Oberfläche markiert sind,
und ein spezielles Metallion bzw. Metallsalz.
-
Bei dem den Mikrokapseln einverleibten Material handelt es sich um
einen Stoff, der von sich aus besondere optische Eigenschaften besitzt, eine Vorstufe
dieses Stoffes mit besonderen optischen Eigenschaften oder um einen Stoff, der einen
anderen Stoff in einen weiteren Stoff mit besonderen optischen Eigenschaften umzusetzen
vermag.
-
Bei dem Immunoassayreagens kann es sich z.B. um ein festes Gemisch
aus Mikrokapseln und einem Metallsalz oder um eine Lösung des Metallsalzes handeln,
in der die Mikrokapseln dispergiert sind.
-
Es wurde gefunden, daß bei der Reaktion von Mikrokapseln, von denen
jede eine Membran mit entweder einem Antigen oder einem Antikörper enthält, die
an deren Oberfläche gebunden sind, mit entweder einem Antikörper oder einem Antigen
in einer Probe, d.h. beim Ablauf einer immunologischen Reaktion, ein besonderes
Metallion einen spezifischen Effekt auf die Antigen/Antikörper-Reaktion unter Aufbrechen
der Mikrokapseln ausübt. Das Metallion vermag somit ein herkömmliches Komplement
zu ersetzen.
-
Die erfindungsgemäß verwendeten Mikrokapseln können z.B.
-
Schaferythrozyten oder Liposomen enthalten. Die Liposomen besitzen
vorzugsweise eine Teilchengröße von 0,2 bis 1 mm. Zur Bestimmung eines Antigens
wird die Membran jeder Mikrokapsel mit dem zugehörigen Antikörper markiert.
-
Umgekehrt erfolgt zur Bestimmung eines Antikörpers die
Markierung
mit dem zugehörigen Antigen.
-
Die Herstellung der Mikrokapseln kann z.B. nach einem Verfahren erfolgen,
das in "Methods in Enzymology" 74 152 - 161 (1981) beschrieben ist. Hierzu werden
Sphinogomyelin, Cholesterin, Dicetylphosphat und Thyroxin (T4) in Methanol gelöst.
Das Lösemittel der erhaltenen Lösung wird im Vakuum auf einer Glasplatte verdampft,
wobei auf dieser eine trockene Lipidmembran entsteht.
-
Dann wird die mit Thyroxin - einem Antigen - markierte Membran durch
Rühren in einem Mixer mit einer Lösung vermischt, die ein in bestimmter Konzentration
einzuverleibendes Material enthält. Auf diese Weise wird das Lipid emulgiert und
das Material jedem Teilchen einverleibt. Die Lipidmembran bildet dann ein Teilchen
mit einer hydrophilen äußeren Oberfläche. Die so erhaltenen Liposomteilchen werden
durch Waschen gereinigt.
-
Die so erhaltenen Mikrokapseln können getrocknet und als Immunoassayreagens
in Form von Granulat oder Tabletten gelagert werden. Alternativ kann man zur Herstellung
eines Immunoassayreagens die Liposomen auch in einer Pufferlösung mit entsprechend
eingestelltem pH-Wert suspendieren, wobei eine lagerfähige Suspension erhalten wird.
-
Die Erfindung eignet sich zum Nachweis zahlreicher Antigen/Antikörper-Reaktionen.
Typische Beispiele für Antigene sind T4, T3, Globulin und IGG. Durch die Antigen/Antikörper-Reaktion
kommt es auf der Oberfläche jeder Mikrokapsel zur Bildung eines Antigen/Antikörper-Komplexes.
Mit fortschreitender immunologischer Reaktion bewirken die Magnesium- oder Calciumionen
ein Aufbrechen der Membran jeder Mikrokapsel unter Freisetzung des hierin enthaltenen
Materials. Die erhaltene Reaktionslösung, die auch noch nicht reagierte Mikrokapseln
enthält, wird
einer photometrischen Auswertung zur Bestimmung der
in der Probe enthaltenen Antigene bzw. Antikörper unterworfen.
-
Die photometrische Auswertung kann z.B. mittels Absorptions-, Fluoreszenz-
oder Emissionsspektrophotometrie erfolgen. Es sind zahlreiche Möglichkeiten gegeben.
Es ist z.B. ein Reagens möglich, das eine Vorstufe eines Materials mit besonderen
optischen Eigenschaften außerhalb der Mikrokapseln enthält, während ein anderes
Material, das die Vorstufe in das Material mit besonderen optischen Eigenschaften
über verschiedene Reaktionsstufen umzuwandeln vermag, den Mikrokapseln einverleibt
wird. Es ist auch ein Reagens möglich, das ein Apoenzym innerhalb der Mikrokapseln
und ein Coenzym außerhalb der Mikrokapseln enthält. Weiterhin lassen sich Mikrokapseln
verwenden, die ein Enzym, ein fluoreszierendes Material, ein Coenzym oder einen
Chelatbildner mit einer enzymatischen Aktivität per se enthalten.
-
Im folgenden wird die Erfindung anhand der Zeichnungen beschrieben.
Ee zeigen: Fig. 1 das Ergebnis eines Experiments, das zum Nachweis der Auswirkung
von Magnesiumionen auf das Aufbrechen von Mikrokapseln durchgeführt wurde, Fig.
2 eine Eichkurve des in Beispiel 1 verwendeten Antigens T4, Fig. 3 eine Eichkurve
des in Beispiel 2 verwendeten Anti-T4-Antikörpers, Fig. 4 eine Eichkurve des in
Beispiel 3 verwendeten Anti-T4-Antikörpers, und
Fig. 5 eine Eichkurve
des in Beispiel 4 verwendeten Anti-T4-Antikörpers.
-
Anhand von Fig. 1 wird nun der Einfluß eines bestimmten Metallions
auf die Löslichkeit von Mikrokapseln beschrieben. Als Mikrokapseln dienen Schaferythrozyten,
denen Eosin als fluoreszierender Stoff einverleibt wird. Die Oberfläche jeder Mikrokapsel
wird zuvor in üblicher Weise mit Anti-T4-Antikörper markiert. Magnesiumchlorid dient
als Magnesiumionen lieferndes Salz. Fig. 1 zeigt die Abhängigkeit der aufgebrochenen
(lysierten) Mikrokapseln von der Konzentration des Magnesiumions. Die T4-Konzentration
bei diesem Versuch beträgt 20 ug/dl, wobei eine 50 mM KH2PO4-Pufferlösung (pH 7,4)
als Verdünnungsmittel dient. Die Fluoreszenzintensität wird 20 min nach Einleitung
der Reaktion bestimmt.
-
Fig. 1 zeigt, daß die Mikrokapseln bei einer Magnesiumionenkonzentration
in der Reaktionsflüssigkeit von 3 mMol oder darüber stabil gelöst werden, und daß
eine Magnesiumkonzentration von 2 mMol oder darüber einen merklichen Einfluß auf
die Auflösung der Mikrokapseln ausübt.
-
Die Mikrokapseln zeigen eine signifikante Löslichkeit bei einer Magnesiumkonzentration
von 20 mM oder darüber im Reaktionsmilieu. Calciumionen zeigen eine ähnliche Tendenz
wie Magnesiumionen.
-
Beispiel 1 Die Oberfläche jeder Mikrokapsel, der fluoreszierendes
Eosin einverleibt worden ist, wird^Antithyroxin-Antikörper markiert. Nachdem eine
Magnesiumchloridlösung mit einer Endkonzentration von 500 mMol hergestellt worden
ist, werden die markierten Mikrokapseln in dieser Lösung unter Erhalt einer Immunoassay-Reagenslösung
dispergiert.
-
10 ul einer Probe, die Thyroxin (T4) enthält, werden in eine Reaktionsküvette
eines automatischen Klinik-Analysegerätes eingebracht. Nachdem die Küvette in die
Reagens-Abgabestellung transportiert worden ist, werden 20 ul des vorgenannten Reagens,
gefolgt von 970 ul einer 50 mM KH2PO4-Pufferlösung (pH 7,4) zugesetzt. Eine ganze
Reihe Küvetten wird dann während des Transport 20 min bebrütet. Nach Erreichen eines
Fluoreszenzbereiches jeder Küvette erfolgt Bestrahlung mit einer Anregungsstrahlung
von 522 nm, worauf die Fluoreszenzintensität bei einer Wellenlänge von 560 nm gemessen
wird. Die Verarbeitung der Meßergebnisse erfolgt in einer Prozessoreinheit des automatischen
Klinik-Analysegerätes auf der Grundlage der Eichkurve von T4, wie in Fig. 2 dargetellt,
worauf Ausdruck der Konzentration an T4 in der Probe erfolgt.
-
Beispiel 2 In diesem Beispiel wird 2-5-Brom-2-pyridylazo-5-N-propyl-N-sulfopropylaminoanilin
(nachfolgend als 5-Br-PAPS bezeichnet) Mikrokapseln einverleibt. Dieser Chelatbildner
wird auf eine Konzentration von 10 mMol/l eingestellt.
-
Ein Lipid wird in dieser Lösung dispergiert unter Bildung einer Anzahl
von Liposomen, die jeweils den Chelatbildner in sich enthalten. Nach Isolierung
der Liposomen erfolgt Waschen der äußeren Oberflächen. Hierauf wird jedes Liposom
markiert durch Binden von Thyroxin (T4)-Antigen an seine Oberfläche.
-
1 ml der markierten Liposomen werden in einer NaCl-Lösung (0,15 Mol/l)
dispergiert. Dann wird der erhaltenen Lösung MgCl2 bis zum Erreichen einer Konzentration
von 3 mMol/l in der immunologischen Reaktion zugesetzt.
-
Nachdem man ZnCl2, zur Umsetzung mit dem Chelatbildner, bis zu einer
Konzentration von 0,1 mMol/l in der immunologischen Reaktion zugesetzt hat, wird
bis zum
Erreichen eines Gesamtvolumens von 100 ml aufgefüllt. Die
so erhaltene Immunoassayreagenslösung wird in einem Behälter aufbewahrt.
-
Die Probegefäße eines automatischen Klinik-Analysengerätes werden
mit Serumproben beschickt. Eine Serie Reaktionsbehälter des Analysengerätes wird
bei 37 "C gehalten und intermittierend geladen. Entlang des Ladeweges befinden sich
ein Proben-Pipettiersystem, ein Reagens-Zugabesystem, ein Multiwellenlängenphotometer
und ein Waschsystem.
-
5 ul des Serums in jedem Probengefäß werden jedem Reaktionsbehälter
mittels des Proben-Pipettiersystems zugegegeben. Hierauf erfolgt Zugabe von 800
ul der Immunoassay-Reagenslösung, wie vorstehend beschrieben, zu dem Reaktionsbehälter
bei der Reagens-Zugabeposition. Dann wird eine Serie Reaktionsbehälter unter Bebrütung
geladen. Nach 30 min erreicht jeder die Reaktionsflüssigkeit enthaltende Reaktionsbehälter
den photometrischen Meßbereich, in dem die Reaktionsflüssigkeit mit weißem Licht
bestrahlt wird, worauf das Licht mit einer Wellenlänge von 552 nm im durchgehenden
Licht zur Bestimmung der Absorption gemessen wird. Der erhaltene Absorptionswert
wird mit der Eichkurve von Fig. 3 in einer Prozessoreinheit verglichen, worauf Ausdruck
der Konzentration an in Antlder Serumprobe enthaltenen^T4-Antikörper erfolgt. Die
in Fig. 3 gezeigte Eichkurve wird durch Herstellung einer Standardprobe erhalten,
wobei Anti-T4-Antikörper in bestimmter Konzentration antikörperfreiem Serum zugesetzt
und diese Standardprobe mit der obengenannten Reagenslösung umgesetzt wird.
-
Beispiel 3 Zunächst erfolgt die Herstellung einer Glukoselösung mit
einer
Konzentration von 50 mMol/l. Dann werden Mikrokapseln, die die vorgenannte Lösung
einverleibt enthalten, in gleicher Weise, wie vorstehend für Beispiel 2 beschrieben,
hergestellt. Hierbei erhält mit T4 markierte Liposomen. Nachdem man 1 ml dieser
Liposomen einer 0,15 Mol/l enthaltenden isotonischen Kochsalzlösung zugesetzt hat,
erfolgt Zugabe von Glukoseoxidase und -peroxidase, jeweils in einer Konzentration
von 1 mg/l. Nach Zugabe von Calciumionen zu der Lösung bis zu einer Konzentration
von 3 mMol/l im immunologischen Reaktionsmilieu, wird bis zu einem Gesamtvolumen
von 100 ml aufgefüllt. Die so erhaltene Lösung wird als Reagens 1 bezeichnet.
-
Phenol und 4-Aminoantipyrin werden getrennt einer Phospatpufferlösung
in Konzentrationen von lmMol/l bzw.
-
0,1 mMol/l zugesetzt. Die erhaltene Lösung wird als Reagens 2 bezeichnet.
-
Nachdem man 100 ul Reagens 1 mit 10 ul Serum vermischt hat, läßt man
das Gemisch bei 30 "C 10 min reagieren.
-
Unmittelbar nach Zugabe von 500 ul Reagens 2 wird die Absorption des
Gemisches bei 547 nm bestimmt, die als Blindwert bezeichnet wird. Nachdem man das
Gemisch bei 30 "C 20 min reagieren gelassen hat, wird erneut die Absorption bet
547 nm unter Erhalt eines Reaktionswertes bestimmt. Die Konzentration des Anti-T4-Antikörpers
im Serum wird durch Subtraktion des Blindwertes vom Reaktionswert berechnet.
-
Fig. 4 zeigt eine Eichkurve, die durch Zugabe der Reagentien 1 und
2, eines Anti-T4-Antikörper-freien Serums und desyAnti-T4-Antikörper in bestimmter
Konzentration enthaltenden Serums erhalten wurde.
-
Beispiel 4 Es wird eine 1 mMol/l Biotin - ein Coemzym - enthaltende
Lösung hergestellt. Diese Lösung wird Mikrokapseln, in gleicher Weise wie in Beispiel
2 beschrieben, einverleibt.
-
1 ml der Mikrokapseln, die jeweils mit T4-Antigen markiert sind, werden
in einer isotonischen Kochsalzlösung dispergiert. Hierauf erfolgt Zugabe von HCO3
, ATP und Propionyl-CoA-carboxylase - ein Apoenzym - in Konzentrationen von 2 mMol/l,
80 nMol/l bzw. 1 mg/l. Nach Zugabe von MgCl2 wird bis zu einem Gesamtvolumen von
100 ml aufgefüllt. Die Zugabe von MgCl2 erfolgt bis zu einer Konzentration von 3
mMol/l im immunologischen Reaktionsmilieu. Die so erhaltene Lösung wird als Reagens
1 bezeichnet.
-
Eine Lösung zur Bestimmung von anorganischem Phosphor, die Molybdänsäure
und p-Methylaminophenolsulfat enthält, wird als Reagens 2 bezeichnet.
-
100 ul Reagens 1 werden mit 10 ul einer Serumprobe in einer Reaktionsküvette
vermischt, die 5 min bei 30 "C bebrütet wird. Unmittelbar nach Zugabe von 500 ul
Reagens 2 wird die Absorption der Reaktionsflüssigkeit bei 700 nm bestimmt, wobei
man einen Blindwert erhält. Nachdem man die Reaktionsflüssigkeit 5 min bei 30 "C
reagieren gelassen hat, wird die Absorption erneut bei 700 nm bestimmt. Der Reaktionswert
wird durch Subtraktion des Blindwertes vom gemessenen Wert berechnet. Die Konzentration
an Anti-T4-Antikörper im Serum wird durch Vergleich des Reaktionswertes mit der
Eichkurve bestimmt.
-
Fig. 5 zeigt eine Eichkurve, die durch Auftragung der Absorptionen,
gemessen nach Zugabe der Reagentien 1 und 2zu Standardproben, erhalten wurde. Die
Standardproben wurden hergestellt durch Zugabe von Anti-T4-Antikörper.in bestimmten
Konzetrationen zu Anti-T4-Antikörper-freiem Serum unter Auslösung einer immunologischen
Reaktion.