DE2811228A1

DE2811228A1 - Assay zur quantitativen bestimmung von immonogenen und antikoerpern

Info

Publication number: DE2811228A1
Application number: DE19782811228
Authority: DE
Inventors: Mirjam Halmann; Tamar Seri; Baruch Velan
Original assignee: Israel Institute for Biological Research
Current assignee: Israel Institute for Biological Research
Priority date: 1977-03-16
Filing date: 1978-03-15
Publication date: 1978-09-28
Also published as: GB1603001A; US4302534A; IL51668A; IL51668A0; CA1104928A

Description

PATENTANWÄLTE

DR. WALTER KRAUS DiPLOMCHEMIKER · DR.-INS. ANNEKÄTE WEISERT D1PL.-ING. FACHRICHTUNG CHEMIE IRMGARDSTRASSE 15 · D-8OOO MÜNCHEN 71 · TELEFON 089/79 70 77-79 70 78 ■ TELEX O5-212156 kpat d

TELEGRAMM KRAUSPATENT

- 5-

1835 WK/rm

ISRAEL INSTITUTE FOR BIOLOGICAL RESEARCH Ness-Ziona / Israel

Assay zur quantitativen Bestimmung von Immonogenen und

Antikörpern

- f " 2811223

Beschreibung

Es sind bereits viele Methoden zur Bestimmung von kleinen Mengen von biologischen Substanzen, wie Proteinen, Peptiden, Polysacchariden, Lipiden, Steroiden, Hormonen, Viren, Enzymen, Bakterien und dergleichen, bekannt.

Ein Reaktionstyp, der in den letzten Jahren eine erhebliche Bedeutung erlangt hat, ist der Immunoassay, der viele Variationen aufweist. Jede Substanz mit antigenen Eigenschaften oder eine solche Substanz, die - wenn sie in geeigneter Weise mit einer anderen Substanz verknüpft wird - ein Antigen bilden kann, kann für solche quantitative Bestimmungen verwendet werden.

In Immunoassays werden im allgemeinen die quantitativen Messungen entweder direkt nach der Immunoreaktion durchgeführt oder in der Weise, daß man eine »Markierung" mißt, die an eine der Komponenten des Immunokomplexes, d.h. das Antigen oder den Antikörper, angefügt ist. Die Markierungen können gefärbt sein oder sie können nach der Reaktion eine Färbung erzeugen. Weiterhin können sie beispielsweise auch fluoreszierend oder radioaktiv sein. Auch große Teilchen, wie Latex oder rote Blutzellen, die leicht unterscheidbare Aggregate bilden, können ebenfalls verwendet werden. Die letzteren gehören zu den empfindlichsten Methoden, die derzeit bekannt sind.

Ein spezifischer Typ eines Immunoassays, bei dem spektrophotometrische Messungen vorgenommen werden, ist der enzymverknüpfte Immunoassay, der mit Enzymen, wie Peroxidase, alkalischer Phosphatase und ß-Galactosidase als "Markierungen" vor~ genommen wird.

Die Erfindung betrifft eine neue Methode zur quantitativen Bestimmung von biologischen Substanzen. Die hierin verwendete Bezeichnung "biologische Substanzen" soll Immunogene und Antikörper, d.h. Substanzen, wie Proteine, Peptide, Glucopeptide, Polysaccharide, Lipoproteine, Lipide, Steroide, Viren, Bakterien, Toxine etc., einschließen. Das erfindungsgemäße Verfahren kann allgemein zur quantitativen Bestimmung von jeder beliebigen Verbindung oder Gruppe, die bei der Injektion in ein Tier eine Antikörperbildung hervorruft oder die an andere Substanzen gebunden werden kann, \robei das auf diese Weise erhaltene Konjugat beim Injizieren in ein Tier eine Antikörperbildung hervorruft, verwendet werden. Das erfindungsgemäße Verfahren baut sich auf der Verwendung einer enzymatischen Markierung, auf der enzymatischen Oxidation einer phenolischen Verbindung, wie z.B. von Pyrogallol, Resorcin, Phloroglucin, Hydroxyhydrochinon, aktiven Derivaten davon oder cyclischen oder anderen chemolumineszierenden Verbindungen, die Substrate für Peroxidasen darstellen, iyelche bei der Oxidation Licht aussenden, und auf der Messung der Photonen, die während der enzymatischen Oxidation freigesetzt werden, auf. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die quantitative Bestimmung von sehr geringen Mengen von Substanzen und Gebilden, wie oben definiert. Die Empfindlichkeit des Verfahrens ist besser als diejenige von enzymverknüpften Immunoreaktionen mit Peroxidase unter Verwendung von farbbildenden Reaktionen und von spektrophotometrischen Messungen, die in der gleichen Größenordnung der Zeit durchgeführt werden können. Die Empfindlichkeit des neuen Assays ist etwa die gleiche wie diejenige von Radioimmunoassays und von umgekehrten Hämaglutinierungstests. Das erfindungsgemäße Verfahren ist jedoch von einigen Nachteilen dieser Methoden frei. So kann es beispielsweise durch beliebige Personen in allen Laboratorien durchgeführt werden, ohne daß zusätzliche Vorsichtsmaßregeln

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getroffen werden müssen, wie es beispielsweise bei Verwendung von J¹²⁵ der Fall ist.

Die Erfindiong betrifft auch Zusammenstellungen, spezielle Lichtmeßvorrichtungen und andere Einrichtungen und Komponenten, die für den neuen Assay verwendet werden können.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur quantitativen Bestimmung von biologischen Materialien umfaßt die folgenden Stufen:

a) Markierung,

b) Immunoreaktion,

c) enzymatische Reaktion,

d) Messung der Lichtemission.

Die verwendete Markierung ist eine geeignete Peroxidase. Unter geeigneten Peroxidasen können Meerrettichperoxidase, Lactoperoxidase, Rübenperoxidase etc. genannt werden.

Meerrettichperoxidase wird in der Cytologie und Cytochemie im weiten Umfang für mikroskopische und elektronenmikroskopische Anfärbungen verwendet. Das Enzym kann an Antikörper angefügt werden, gegen die die Substanz bestimmt werden soll. Nach der Immunoreaktion zwischen diesem Konjugat und der Substanz kann letztere durch einen Niederschlag festgestellt v/erden, der um den Enzym-Antigen-Antikörper-Komplex herum gebildet wird, wenn das Enzym die Oxidation von Diaminobenzidin durch Hydroperoxid katalysiert. Es gibt zwar bereits andere peroxidaseverknüpfte Immunoassays, doch wird bei allen diesen Assays das Enzym durch spektrophotometrische Messung der Farbe bestimmt, die während oder nach der Reaktion mit einem geeigneten Reduktionsmittel und mit Hydroperoxid gebildet wird.

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Markierung von Antikörpern mit Peroxidase:

Hierzu sind verschiedene Techniken bekannt. Von Nakane et al. "J. Histo. Chem. Cytochem.", 14, 929 (1966) wurde die Konjugierung mit 4,4'-Difluor-3,3'-dinitrodiphenylsulfon entwickelt. Von Avrameas "Immunochem.", 6, 43 (1969) v/urde die Konjugierung mit Glutaraldehyd entwickelt. Avrameas et al "Immunochem.", 8, 1175 (1971) haben eine zweistufige Konjugierung mit Glutaraldehyd entwickelt. Von Nakane et al. "J. Histochem. Cytochem.", 22, 1084 (1974) wurde eine Methode zur Verknüpfung von Peroxidase mittels ihrer Zuckergruppe mit Globulin entwickelt. Von Sternberger et al. "J. Histochem. Cytochem.", 18, 315 (1970) wurde schließlich eine nicht-markierte Antikörpermethode ausgearbeitet.

Das Antikörperhomologe des getesteten Antigens kann auch in seiner ursprünglichen Form verwendet werden und die Peroxidase kann mit einem Antikörper gegenüber Globulin des Tieres verknüpft werden, in dem der erste Antikörper hergestellt wurde. Zwei aufeinanderfolgende Immunoreaktionen werden durchgeführt. Peroxidase kann mit Staphylococcusprotein A verknüpft v/erden, das eine hohe Affinität gegenüber dem Fc-Bereich von )f-Globulinen hat. Auch in diesem Falle müssen zwei Immunoreaktionen durchgeführt werden.

Markierung von A'ntigenen mit Peroxidase;

Die Konjugierungsmethode, die angewendet wird, hängt von den verfügbaren funktioneilen Gruppen ab. Wenn Aminogruppen verwendet werden können, dann kann auf das Verfahren zurückgegriffen werden, das sich auf der Verwendung von Difluordinitrophenylsulfon aufbaut. In diesem Falle können auch Methoden verwendet werden, die sich auf der Verwendung von Glutar-

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aldehyd aufbauen, Wenn eine Zuckergruppe verfügbar ist, dann kann die Methode von Hakane et al. verwendet werden. Es wird ersichtlich, daß die Bindung auf dem Wege über solche Gruppen vorgenommen werden sollte, daß die antigenen und enzymatischen Eigenschaften des Konjugats nicht wesentlich verschlechtert werden.

Die folgenden Beispiele beschreiben einige der Prinzipien dieses Assays:

Immunoreaktion:

a) Direkte Bestimmung der Substanz mit homologem Antikörper, der mit Peroxidase konjugiert ist:

Es kann eine Vielzahl von Verfahrensweisen angewendet werden, die sich auf der Immunoreaktion und' der Abtrennung von überschüssigem Konjugat aufbauen. Wenn sich an die Immunoreaktion eine Ausfällung des Komplexes anschließt, dann kann der Niederschlag bestimmt werden. Wenn keine Ausfällung stattfindet, dann kann der homologe Antikörper markiert werden und ein zweiter Antikörper gegen das Globulin des Tiers, das als erster Antikörper verv/endet wird, fällt den gesamten Komplex aus (Doppelantikörpermethode). Der auf diese Weise erhaltene Niederschlag wird wie im ersten Falle gewaschen und zentrifugiert.

Es ist möglich, den Antikörper an einen Film mit einer niedrigen nicht-spezifischen Adsorption, wie Aclar (T.M.) oder Mylar (T.M.) zu fixieren. Die Fixierung kann beispielsweise durch Aceton, Methanol, Erhitzen etc. bewirkt werden, wobei die angewendeten Bedingungen die Antigeneigenschaften nicht wesentlich verschlechtern. Der markierte Antikörper wird zugesetzt und nach dem Inkubieren und Waschen des Films wird

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er auf den Peroxidasegehalt getestet. Die Doppelantikörpermethode, die Methode mit löslichem Peroxidase-Antiperoxidase-Komplex oder mit konjugierter Protein-A-Peroxidase kann angewöndet werden.

b) Konkurrierende Assays, die Radioimmunoassays entsprechen, können mit einem homologen Antikörper, der kovalent an Sepharose, Sephadex, Cellulose, Enzacryl, Carboxymethylcellulose oder dergleichen angefügt ist, durchgeführt werden. Das Antigen-Peroxidase-Konjugat konkurriert mit der unbekannten Antigenlösung um den fixierten Antikörper.

c) Festphasenimmunoassays können auf zwei Wegen durchgeführt werden, nämlich

erstens durch Adsorption eines spezifischen Antikörpers an einen festen Träger (Polystyrol, Polyvinylchlorid etc.), Immunoreaktion des Antigens mit dem fixierten Antikörper und Bestimmung des Antigens durch mit Peroxidase markiertem Antikörper;

zweitens unter Verwendung von konkurrierenden Assays, wobei entweder markiertes Antigen mit dem unbekannten Antigen um den fixierten Antikörper konkurriert oder wobei der zweite Antikörper - der markiert ist - die Konkurrenz zwischen dem Antikörper, der an die feste Phase gebunden ist, und dem unbekannten Antigen, das sich in Lösung befindet, mißt.

d) Bei einer anderen Form kann das Antigen an den festen Träger gebunden werden und die Reaktion kann in umgekehrter Form bewirkt werden.

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Alle obengenannten Reaktionstypen können auch in umgekehrter Weise zur Bestimmung des Antikörpers durchgeführt werden.

Die Zeitspanne, die für die Immunoreaktionen erforderlich ist, variiert und beträgt im allgemeinen 1 min bis 2 h. Andere Bedingungen, beispielsweise die Temperatur, die Voradsorption mit normalem Serum, die Waschlösungen etc., sind die herkömmlichen Bedingungen von Immunoreaktionen.

Enzymatische Reaktion:

Die Chemolumineszenz während der Oxidation von Pyrogallol wurde von Lenard et al. "Ann.Phys. und Chemie", 34 (1888) 918, beschrieben. Die Katalyse dieser Reaktion durch Meerrettichperoxidase wurde von Ahnstrom et al. "Acta Chem. Scan.", 15 (1967) 1417, Nilsson in«Acta Chem. Scan.», 18 (1964) 389, Ahnström in "Acta.,* Chem. Scan." 19 (1965) 300 und Ahnström et al. "Acta. Chem. Scan." 19 (1965) 313, beschrieben. In der letzten dieser Arbeiten heißt es auch, daß Resorcin eine feststellbare Lumineszenz ergibt.

Gemäß der Erfindung wird eine verbesserte Methode zur quantitativen Bestimmung von kleinen Mengen von Peroxidase (in der

«IC

Gegend von so wenig wie 10 ^J Mol) zur Verfügung gestellt, die sich in günstiger Weise mit bekannten Methoden vergleicht. Von Halmann et al. "App. Environ. Microbiol." 34 (1977) 473, Velan et al. "Immunoehem." (1978) im Druck durchgeführte Untersuchungen haben Vierte für die Lichtemission und ihre Messung bei geeigneten Bedingungen ergeben. Verschiedene phenolartige Verbindungen können als Reduktionsmittel verwendet werden. Unter anderem wurden Pyrogallol, Resorcin, Phloroglucin und Hydroxyhydrοchinon als geeignet gefunden.

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Geeignete Peroxidasen sind z.B. Meerrettichperoxidase, Rübenperoxidase, Süßkartoffelperoxidase sowie andere Pflanzenperoxidasen und Lactoperoxidase etc.

Oxidationsmittel, die für die Reaktion geeignet sind, sind z.B. zusätzlich zu Hydroperoxid Permethanol, Peräthanol und Harnstoff hydroperoxid.

Die Bestimmungsprobe wird nach der Immunoreaktion und nach dem Verwerfen von überschüssigem Reagens in ein kleines Reagensglas eingebracht. Typischerweise werden 50ul einer 0,2%igen Lösung von Pyrogallol in 0,18M-Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 6,5 zugesetzt und die Reaktion wird durch Zugabe von 50 ill 0,25%igem Hydroperoxid gestartet.

Messung der Lichtemission:

Das Maximum der Lichtemission tritt im allgemeinen zwischen und 90 see nach Start der Reaktion auf. Die Zeitspanne hängt im Einzelfall von der Menge und Natur des vorhandenen Enzyms ab.

Dem Grunde nach kann jedes beliebige System mit angemessener Empfindlichkeit verwendet werden, das entweder das Maximum der Lichtintensität bei der Chemolumineszenzreaktion oder die Gesamtmenge des bei einer solchen Reaktion emittierten Lichts mißt.

Vorrichtungen, die zum Messen des während der erfindungsgemäßen Reaktion emittierten Lichts verwendet werden können, enthalten eine Einrichtung zur Aufnahme eines geeigneten Reaktionsgefäßes, eine Einrichtung zur Verstärkung des emittierten Lichts und ein Ablese- oder Aufzeichnungssystem.

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Durch eine Modifizierung der obigen Vorrichtung kann die Menge des emittierten Lichts integriert v/erden. Nach einer weiteren Modifizierung ist eine Einrichtung vorgesehen, um die Rate der Veränderung der Lichtintensität während der Reaktion zu messen und das Maximum der Rate der Veränderung zu bestimmen.

Das Maximum der Lichtemissionsintensität kann ebenfalls gemessen und als BeStimmungswert verwendet werden. Die Ergebnisse können von Eichkurven abgelesen werden, vgl. z.B. Velan et al. "Immunoehem." (1978) im Druck.

Die geeignetste Methode zur Messung der Chemolumineszenz wird bestimmt. Hierdurch werden sehr empfindliche Assays oder eine hohe Genauigkeit ermöglicht.

Die Methode kann in praktisch kontinuierlicher Weise durchgeführt werden. Bei einem kontinuierlichen Testverfahren verwendet man einen Vorrat eines Bands aus einem federnden inerten Material, z.B. einem Kunststoffband, das mittels einer geeigneten mechanischen Vorrichtung in kontinuierlicher Weise oder stufenweise nach einem vorausbestimmten Programm bewegt wird.

Das Band läuft zuerst durch eine Probeaufnahmeeinrichtung, v/o die Testprobe auf eine bestimmte Stelle des Bands aufgebracht wird. Die Fixierung kann mittels Wärme, Methanol oder anderer herkömmlicher Maßnahmen bewirkt werden. Das Band wird in die nächste Stufe, nämlich durch eine Voradsorptionslösung, z.B. von normalem Serum und Tris-Puffer, bewegt. In der nächsten Stufe wird es durch eine Immunoreaktionslösung (an Antikörper verknüpfte Peroxidase) geleitet. In der nächsten Stufe wird es durch eine Waschlösung, beispielsweise eine Kochsalz-

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• AS-

lösung, iond von hier aus in die Vorrichtung zur Bestimmung der Chemolumineszenz der Peroxidase geleitet. Dort wird das Reaktionsgemisch zu der Probe gegeben und die Lichtemission wird gemessen. Die Reihenfolge der Bewegung oder ihre Geschwindigkeit ist so, daß einzelne Proben in der Vorrichtung gemessen werden. Dies wird am besten in der Weise bewirkt, daß man die Lichtemission bis zu einem Maximum von etwa 90 see aufzeichnet oder indem man das maximale Inkrement der Lichtemission mißt. Zahlenwerte v/erden durch Vergleich mit einer Eichkurve erhalten.

Die Vorrichtung zur Messung der Chemolumineszenz enthält im wesentlichen eine lichtdichte Umhüllung, in der sich das Reaktionsgefäß befindet. Es ist ein Spiegel vorgesehen, um ein Maximum des emittierten Lichts auf eine Photovervielfachungseinrichtung zu konzentrieren, die in dem gleichen Gehäuse angeordnet ist. Die Photovervielfachungseinrichtung ist in herkömmlicher Weise mit einem Verstärker zur Aufzeichnung oder zur Ablesung verbunden. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird entweder die maximale Lumineszenz bis zu etwa 90 see gemessen oder das maximale Inkrement der Lichtemission während der Chemolumineszenzreaktion der Peroxidase wird gemessen. Das Reaktionsgefäß ist vorteilhafterweise eine kleine Küvette, die die Probe enthält, wobei eine Einrichtung vorgesehen ist, um eine vorgewählte Menge des Reaktionsgemisches zuzugeben, um die Chemolumineszenzreaktion zu starten.

Der Assay' wird allgemein durch Vergleich einer Standardprobe mit der zu untersuchenden Probe durchgeführt. Auf diese Weise ergibt das Meßverfahren Werte, die verläßlich sind und der korrekten Menge des zu bestimmenden Objekts entsprechen.

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Empfindlichkeit der Methode:

ρ -τ.
Es war möglich, 10 bis 10 Mikroorganismen zu erfassen und zu bestimmen, was etwa die 10-mal kleinere Menge ist als die-

125 jenige, die durch einen Immunoradioassay mit J erfaßbar ist.

1 25 Mit dem gleichen Antikörper, der mit 1 oder 2 Atomen 3 pro Molekül markiert ist, konnten nur 10 Bakterien erfaßt werden. Unter Verwendung eines Konkurrenzassays mit einem an Sepharose angeknüpften Antikörper wurde 1 Nanogramm Enterotoxin B erfaßt. Dies ist auch die untere Grenze der Empfindlichkeit

125 eines Radioimmunoassays mit Protein, das mit 3 J -Atomen pro Molekül markiert ist. Die umgekehrte Hämaglutinierung mit

den gleichen Reagentien lieferte ähnliche Ergebnisse. Peroxids A

dase kann auch direkt im Maßstab von 10^ bis 10 bestimmt werden, ohne daß es notwendig ist, auf Verdünnungen zurückzugreifen.

Die Lagerungsbeständigkeit von Peroxidasekonjugaten und des löslichen Peroxidase-Antiperoxidase-Komplexes liegt in der Gegend von einigen Jahren. Dies ist eine erhebliche Verbesserung gegenüber der Lagerungsbeständigkeit von etwa 1 Monat von J¹²-*-jodierten Reagentien, die bei Radioimmunoassays eingesetzt werden.

Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert.

Beispiel 1 Bestimmung von Serratia marcescens

Serratia marcescens wurde über Nacht bei Raumtemperatur auf Schrägkulturen von 2% Tryptose (Difco), O,5?6 NaCl, verfestigt mit 1,5^ Bacto-Agar, gezüchtet. Die Produkte wurden

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in Kochsalzlösung suspendiert und zu einer optischen Dichte von 0,200 verdünnt, was etwa 10 Zellen/ml entspricht.

Anti-Serratia-Serum vrarde hergestellt, indem Ratten wöchentlich durch i.v.-Injektionen von 1 ml steigender Konzentrationen von S. 'marcescens (5 χ 10 bis 10 Zellen) immunisiert wurden. Nach 7 Wochen wurden die Tiere geschlachtet und das Serum wurde abgetrennt.

Anti-Serratia-y-Globulin wurde hergestellt, indem 10 ml Anti-Serratia-Serum gegen 1 1 Veränderungen von Phosphatpuffer, pH 3,0, 0,03M dialysiert wurden, und indem eine Chromatographie auf einer Säule aus DEAE-Cellulose, 2,5 x 15 cm, die mit dem gleichen Puffer ins Gleichgewicht gebracht worden war, durchgeführt wurde. Die erste Fraktion des Proteins, die durch die Säule nicht absorbiert wurde, wurde gesammelt»

Anti-Serratia-Peroxidasekon.jugat wurde nach dem zvjeistufigen Verfahren von Avrameas "Immunoehern»", 8, 1175 (197I)₅, hergestellt. Das Konjugat wurde jedoch von der überschüssigen Per» oxidase nicht abgetrennt. Die freie Peroxidase erhöht die Blindprobe der Bakterienbestimmung nicht.

10 mg Peroxidase (Sigma RZ 3_s0) wurden in 0_s2 ml eines 0_s1M-Phosphatpuffers mit einem pH-Wert von 6,8, der 1₉25% Glutaraldehyd (Sigma) enthielt, aufgelöst» Nach 24 h bei 4⁰C wurde das Reaktionsgemisch durch eine Sephadex-G~25~Säule₉ 0_s8 χ 15 cm, die mit Kochsalzlösung ins Gleichgewicht gebracht worden war, geleitet» Die das Enzym enthaltende Fraktion wurde gesammelt. Anti-Serratia-^-Globulinlösung mit einem Gehalt von 5 mg Protein aind 0,1 ml eines 1M-Carbonatpuffers mit einem pH-Wert von 9_S5 wurden zu dem Enzym gegeben» Nach 24 h bei 4°C wurden 0,1 ml O,2M-Lysin zugesetzt und nach 2 h wurde

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gegen 4x11 Kochsalzlösung dialysiert. Das so erhaltene Konjugat wurde bei 4° C gelagert.

Test auf Serratia

Eine Serienverdünnung von Bakterien in Kochsalzlösung, enthaltend 3 x 10⁷, 10⁷, 3 x 10⁶, 10⁶ und 3 x 10⁵ Zellen/ml, wurde hergestellt. Aliqμote Teile mit 1 ul von Kochsalzlösung und von steigenden Konzentrationen der Bakteriensuspensionen wurden auf einen Aclar-33-Streifen (von Allied Chemical Co.) mit den Abmessungen 3,5 x 45 mm in einer Menge von 6 Tropfen pro Streifen aufgebracht. Die Streifen wurden in eine Kunststoff-Petri-Schale gegeben und mittels eines Temperaturgradienten von heißem Wasser unter der Schale und Trockeneis auf dem Deckel getrocknet. 5-ul-Tropfen von Methanol wurden zu jedem Bakterienflecken gegeben, der aufgrund des vorhandenen Natriumchlorids festgestellt werden konnte. Die Streifen wurden trocknen gelassen. Die Streifen mit den darauf fixierten Bakterien wurden in kleine Reagensgläser eingegeben und mit O,O5M-Tris-HCl, pH-¥ert 7,6 in Kochsalzlösung, gewaschen. Um eine nicht-spezifische Adsorption zu vermeiden, wurden 0,8 ml Tris-Kochsalzlösung-Überstand von Salmonella-Suspension und normalem Ziegenserum im Verhältnis von 10: 4 : 2 zugesetzt. Nach 10-minütiger Bebrütung wurden 50ul Anti-Serratia-Peroxidasekonjugat zu der Ausfällungslösung zugesetzt und es wurde leicht durchgemischt. Das Gemisch wurde 10 min bei Raumtemperatur und 5 min bei O⁰C stehen gelassen. Die Streifen wurden sodann dreimal mit Tris-Kochsalzlösung gewaschen.

Die Streifen wurden entsprechend den Bakterienflecken, die zuvor auf Millimeter-Papier markiert worden \tfaren, zerschnitten. Jedes Stück wurde getrennt in eine Reaktionsküvette mit den Abmessungen 9 χ 50 mm eingeführt. In jede Küvette wurden 50 ul

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0,2^ Pyrogallol (Merck Co.) in 0,18M-Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 6,5 eingegeben. Die Küvette wurde in eine Lichtmeßvorrichtung eingeführt. 50ul O,25?6iges Hydroperoxid (Perhydrol, Merck) in 0,18M-Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 6,5 wurden zugegeben. Die Lichtemission wurde gemessen.

In Tabelle I sind die Vierte zusammengestellt, die bei Verwendung von 50ul Konjugat erhalten wurden. Die Lichtraeßvorrichtung war ein Dupont-Lumineszenz-Biometer. Es war auf eine Grobempfindlichkeit von 8 mit einer exponenten Skala mit einem Minimalwert von 3 eingestellt. Die Lichtintensitätsmessungen erfolgten in Intervallen von 3 see bis zu dem Maximalwert.

Tabelle I

Bestimmung von S. marcescens mit Anti-Serratia-Peroxidasekon-

jugat

Anzahl der Bakterien Ablesungen (doppelt)

0 2,3 x 10² - 2,9 x 10²

300 6,8 χ 10² - 5_S3 x 10²

1000 1,6 χ 10³ - 2,5 x 10³

3000 3,6 χ 10³ - 7,4 χ 10³

10000 1,1 χ 10⁴ - 1,6 χ 10⁴

30000 3,5 x 10^ - 4,1 χ 10^

Beispiel 2

Bestimmung von Staphylococcus-Enterotoxin B (SEB)

Diese Bestimmung baut sich auf der Konkurrenz der unbekannten Probe mit einer bekannten Menge von an Peroxidase'geknüpftem SEB bezüglich des an Sepharose angefügten homologen Antikörpers auf.

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Herstellung des Antikörpers gegen SEB

SEB wurde nach der Methode von Schantz et al. "Biochemistry", 4, 1011 (1965) gereinigt. Kaninchen wurden durch 5 subkutane Injektionen von 1, 2, 5, 10 und 20 mg SEB mit Adjuvans in Intervallen von 10 Tagen immunisiert. Die Tiere wurden 2 Wochen nach der letzten Injektion geschlachtet. Das erhaltene Serum enthielt 8 mg Anti-SEB-Globulin/ml. Die Globulinfraktion des Serums wurde mit 17?6 Natriumsulfat bei Raumtemperatur ausgefällt und in PBS aufgelöst, wodurch eine Konzentration von 20 mg Protein/ml erhalten wurde.

Bindung von Globulin an Sepharose

5 mg Globulin wurden an 0,5 g (Trockengev/icht) CN-Br-aktivierte Sepharose 4B (Pharmacia) angefügt. Die Ausbeute betrug mehr als 90%. Das Verfahren wurde in Ο,ΙΝ-Natriumbicarbonat bei Raumtemperatur über einen Zeitraum von 18h durchgeführt. Die Gelteilchen wurden gewaschen und die auf der Sepharose verbliebenen aktiven Gruppen wurden mit 1H-Äthanolamin, pH 8, neutralisiert. Nicht an die Sepharose gebundenes Protein wurde durch wiederholtes Waschen mit O,5M-Acetatpuffer, pH 4, und 0,5M-Natriumbicarbonat, pH 8, entfernt. Sepharose-Perlen mit niedriger Konzentration an Anti-SEB wurden mit einem Gemisch von Anti-SEB und Globulin von normalen Kaninchen in variierbaren Verhältnissen hergestellt.

Verknüpfung der Peroxidase mit SEB;

Dies wurde nach Avrameas, vgl. Beispiel 1, durchgeführt. Das erhaltene Konjugat wurde von freier Peroxidase und freiem SEB durch isoelektrische Fokussierung im pH-Bereich von 6 bis 9 abgetrennt. Das Konjugat hatte drei Peaks mit pH-Werten

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von 7,0, 7,4 bzw. 7,8. Es zeigte sich, daß die Substanz beim pH-Peak von 7,0 zur Verwendung als Reagens am meisten geeignet war.

Standard-Assayverfahrensweise;

0,2 ml der Testlösung, 0,1 ml 0,06M-Phosphat, pH 7,2, in Kochsalzlösung, enthaltend 2 mg/ml BSA, 5 Ug SEB-Peroxidasekonjugat, 0,05 ml einer Suspension von Anti-SEB-Sepharose (etwa 1 mg Trockengewicht) wurden in Reagensgläser mit den Abmessungen von 5 x 50 mm eingebracht.

Die Reagensgläser wurden auf einen leicht schrägen Träger aufgebracht und reziprok parallel zur Länge der Küvette geschwenkt. Die Küvette rollte nach vorwärts und nach rückwärts mit einem Abstand von 1,5 cm etwa 100-mal pro min. Nach 2-stündiger Bebrütung wurde die Sepharose durch 1-minütiges Zentrifugieren mit 800 g abgetrennt. Der Überstand wurde verworren und das Sediment wurde zweimal mit 0,18M-Phosphatpuffer, pH 6,5, gewaschen. Die an die Sepharose gebundene Peroxidase wurde entsprechend dem Licht bestimmt, das emittiert wurde, als 0,05 ml 2% Pyrogallol und 0,05 ml 0,25%iges Hydroperoxid in 0,18M-Phosphatpuffer, pH 6,5, zugesetzt worden waren.

Nach dieser Methode ist es möglich, quantitativ etwa 0,001 Mikrogramm ibis 20 Mikrogramm SEB, je nach der Konzentration des Anti-SEB auf der Sepharose, und der Menge des verwendeten SEB-Peroxidasekonjugats zu bestimmen. In der folgenden Tabelle sind die Bestimmungsbereiche von SEB zusammengestellt.

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Tabelle II
Bestimmung von SEB

Anti-SEB SEB-Peroxidase Bereich von

Anti-SEB/g Sepharose-Anti-SEB/Assay Konjugat SEB-Bestim-

mung

10 mg 10 u 0,5 Jig 0,2 - 20 ug

0,5 mg 0,5 u 0,05 ug 0,02 - 0,2 U|

0,05 mg 0,05 Vl 0,005 ug 0,001 -

¹ ' 0,02 yag

Die Ergebnisse können aus Eichkurven abgelesen werden, vgl. z.B. Velan et al. "Immunoehem.", 1978 (im Druck).

Beispiel 3

Bestimmung von Staphylococcus-Enterotoxin-B (SEB) durch Festpha s enimmuno a s s ay

Diese Bestimmung baut sich auf der nicht-spezifischen Adsorption von Antikörper auf Polyvinylchlorid-Mikrotitrierplatten auf. Dieser Antikörper ist dazu imstande, das homologe Antigen von einer Lösung anzufügen. Das angefügte Antigen kann durch eine Lösung des gleichen an Peroxidase konjugierten Antikörpers bestimmt werden.

SEB und Anti-SEB-Antikörper waren die gleichen Produkte, wie im Beispiel 2 beschrieben. Das Anti-SEB-Peroxidasekonjugat wurde in der gleichen Weise hergestellt wie das Anti-Serratia-Peroxidasekonjugat, das im Beispiel 1 beschrieben wurde.

Adsorption von Antikörper auf PYC-Mikroplatten;

Aliquote Teile von 50ul einer 50 ug/ml Lösung von Anti-

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- te -

SEB-J^Globulin werden in die Vertiefungen einer Standard-Mikrotitrationsplatte (Cooke) einpipettiert. Nach 1 h bei 4°C wurde die Lösung entnommen und die Platte wird mit Tris-Kochsalzlösung gewaschen. Aliquote Teile mit 100 11I einer Lösung von 1mg/ml BSA werden in die Vertiefungen gegeben. Auf diese Weise hergestellte Platten können über eine Anzahl von Tagen gelagert werden.

Reaktion von SEB mit Anti-SEB auf PVC:

Die BSA-Lösung wird entnommen und die Vertiefungen werden mit 0,05M-TrIs-Cl,'pH 7, in Kochsalzlösung (Tris-Kochsalzlösung) gewaschen. Aliquote Teile von 50ul von Puffer oder Lösungen mit steigender Konzentration von SEB werden in die Vertiefungen gegeben. Nach 2 h bei Raumtemperatur v/erden die Vertiefungen mit Tris-Kochsalzlösung gewaschen.

Reaktion mit Anti-SEB-Peroxidasekonjugat:

Aliquote Teile mit 50ul einer Lösung mit einem Gehalt von 20 ul/ml Konöugat werden in die Vertiefungen gegeben. Nach' 2 h bei Raumtemperatur v/erden die Vertiefungen mit Tris-Kochsalzlösung gewaschen.

Chemolumineszenzbestimmung der Peroxidase:

Die Böden der Vertiefungen werden herausgeschnitten und in Küvetten eingeführt. Die Lichtemission wird, wie im Beispiel 1 beschrieben, unter Verwendung von Pyrogallol und Hydroperoxid bestimmt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammenge s teilt:

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Tabelle III

SEB SEB Ablesungen (Doppelwerte) ( u g/ml) Nanogramm im Test

0 0 0,19 x 10³ - 0,31 x 10³

30 1,5 2,6 χ 10³ - 1,58 χ 10³

100 5 1,58 χ 10* - 8,87 x 10³

300 15 3,79 x 10* - 4,39 x 10*

1000 50 5,97 x 10* - 3,05 x 10*

3000 150 6,46 χ 10* - 5,9 x 10*

Ende der Beschreibung.

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Claims

KRAUS aWE'SERT

PATENTANWÄLTE

DR. WALTER KRAUS DIPLOMCHEMrKER . DR.-IN G. ANN EKÄTE WEISERT DIPL-ING. FACHRICHTUNG CHEMIE IRMGARDSTRASSE 15 · D-SOOO MÜNCHEN 71 · TELEFON 089/79 7077-79 70 78 ■ TELEX O5-212156 kpat d

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Patentansprüche

1. Assay zur quantitativen Bestimmung von Immunogenen und Antikörpern, dadurch gekennzeichnet , daß man

a) Antikörper herstellt, die gegenüber dem zu bestimmenden Objekt spezifisch sind,

b) ein Antigen-Peroxidasekonjugat oder ein Antikörper»Peroxidasekonjugat herstellt, das gegenüber dem genannten Objekt spezifisch ist,

c) ein System herstellt, das eine Menge von mit Peroxidase markiertem Antigen oder mit Peroxidase markiertem Antikörper enthält, welche der Menge des zu bestimmenden Objekts proportional ist,

d) eine geeignete phenolische Verbindung, die Licht emittiert, wenn sie einer enzymatischen Oxidation unterworfen wird, mittels einer Peroxyverbindung in Gegenwart der markierten Substanz oxidiert, und daß man

e) das emittierte Licht mißt und auf diese Weise die Menge des genannten Objekts bestimmt.

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2. Assay nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als phenolische Verbindung Pyrogallol, Resorcin, Hydroxyhydrochinon, Phloroglucin, oder ein beliebiges Derivat dieser Verbindungen, das bei einer enzymatischen Oxidation eine Chemolumineszenz zeigt, verwendet.

3. Assay nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Peroxyverbindung Hydroperoxid, Permethanol, Peräthanol oder -harnstoff verwendet.

4. Assay nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das zu bestimmende Objekt aus der Gruppe Enzyme, Steroide, Proteine, Vitamine, Hormone, Bakterien, Viren und Toxinen ausgewählt ist.

5. Assay nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet , daß man als Peroxidase Meerrettichperoxidase, Rübenperoxidase, Süßkartoffelperoxidase oder Lactoperoxidase verwendet.

6. Zusammenstellung zur quantitativen Bestimmung von Haptenen, Bakterien, Viren und Toxinen, gekennzeichnet durch eines oder mehrere der folgenden Elemente: Standardfilmproben, mit Peroxidase markierte spezifische Antikörper, standardisierte Verdünnungsmittel, Puffer und Behälter.

7. Zusammenstellung zur quantitativen Bestimmung von spezifischen Immunogenen, wie Haptenen, Toxinen, Bakterien, Hormonen oder Viren, gekennzeichnet durch ein spezifisches Antikörper-Peroxidase-Konjugat in Dosiseinheitsform, einer Filmträgereinrichtung und standardisiertem Verdünnungsmittel und/oder Puffer in Dosiseinheitsform oder in standardisierter Lösung.

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β. Zusammenstellung zur Bestimmung von spezifischen Immunogenen aus der Gruppe Haptene, Toxine, Bakterien, Hormone und Viren, gekennzeichnet, durch ein spezifisches Antikörper-Peroxidasekonjugat in Dosiseinheitsform, einen Antikörper oder ein Antigen, der bzw. das an einen festen inerten Träger gebunden ist, und ein flüssiges Medium aus der Gruppe standardisiertes Verdünnungsmittel in Dosiseinheitsform, standardisierter Puffer in Dosiseinheitsform und standardisierte Lösungen.

9. Vorrichtung zur quantitativen Bestimmung von Immunogenen und Antikörpern nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, gekennzeichnet durch eine Einrichtung zur Aufnahme eines lichtdurchlässigen Behälters der Probe, eine Einrichtung zur Verstärkung des bei der Chemolumineszenzreaktion emittierten Lichtes und eine Einrichtung zur quantitativen Bestimmung des emittierten Lichtes.

10. Vorrichtung nach Anspruch 9, gekennzeichnet durch eine Einrichtung zur Messung des Maximums der Lichtintensität während der Reaktion.

11. Vorrichtung nach Anspruch 9, gekennzeichnet durch eine Einrichtung zur Integrierung des während der Reaktion emittierten Lichts.

12. Vorrichtung nach Anspruch 9» gekennzeichnet durch eine Einrichtung zur Messung der Lichtemission bis zu einer Verminderung der Lichtintensität auf die Hälfte des Maximalwertes.

13. Vorrichtung nach Anspruch 9, gekennzeichnet durch eine Einrichtung zur Messung und Ausbildung

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des Maximalen Inkrements der Lichtintensität während der Reaktion.

14. Vorrichtung nach Anspruch 9» gekennzeichnet durch ein flexibles inertes Band, das als Träger für die Probe dient, eine Einrichtung zur Bewegung des Bandes mit vorgewählter Geschwindigkeit oder in stufenweise Reihenfolge, einer Einrichtung zur Aufbringung von einzelnen Proben darauf, einer Einrichtung zur Behandlung dieser Proben, wie es für den Assay erforderlich ist, und zur Messung des bei der enzymatischen Oxidation emittierten Lichts.

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