DE3528391C2 - Lumineszenz- oder luminometrischer Assay - Google Patents
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft einen verbesserten
Lumineszenz- oder luminometrischen Assay, insbesondere
Immunoassay, und ein diagnostisches Kit zur Verwendung
im Assay. Die Lumineszenz- und luminometrischen Assays,
mit welchen sich die vorliegende Erfindung befaßt, sind
diejenigen, die von einer chemilumineszierenden Reaktion
abhängen (einer chemischen Reaktion, die zur Emission
von Licht führt). Die Lumineszenzemission hat im allge
meinen hinreichende Dauer um den Nachweis des emittierten
Lichtes oder seine Messung zu gestatten und ermöglicht
dadurch den Nachweis oder die Quantifizierung eines zu
analysierenden Stoffes. Die Chemilumineszenzreaktion,
mit welcher sich diese Erfindung befaßt, ist diejenige
zwischen einem 2,3-Dihydro-1,4-phthalazindion (DPD),
insbesondere Luminol oder Isoluminol, mit einem Oxidations
mittel, insbesondere Wasserstoffperoxid, und einem Per
oxidaseenzym, das die Oxidation des DPD durch das Oxi
dationsmittel katalysiert. Die Oxidation ist von Licht
emission begleitet.
Die Lumineszenz- und luminometrischen Assays, welche von
der oben erwähnten Peroxidase katalysierten Oxidation
eines DPD Anwendung machen, umfassen drei Haupttypen:
- a) Assays bei denen eine chemilumineszierende Verbindung zur direkten Markierung von Liganden, wie Proteinen, Hormonen, Haptenen, Steroiden, Nukleinsäuren, Meta boliten, Antigenen und/Antikörpern verwendet wird. Das chemilumineszierende DPD, wie Luminol oder Iso luminol, ist normalerweise an einen Liganden konju giert. Die Chemilumineszenz kann nachgewiesen werden, indem man Peroxidase und ein Oxidationsmittel zu dem umgesetzten Konjugat zufügt. Es sei z. B. verwiesen auf die GB-OS 2026690A (Miles Lab., Inc.), insbe sondere Seite 7, und GB 2008247 B (The Welsh National School of Medicine), insbesondere Seite 8, Beispiel 7.
- b) Assays, worin Katalysatoren oder Cofaktoren von Luminiszenzreaktionen als Markierungen benutzt werden und die Luminiszenzreaktion dazu benutzt wird, die Markierung nachzuweisen oder zu quantifizieren. Normalerweise ist ein Enzym, häufig HRP(Meerrettich peroxidase), an einen Liganden konjugiert. Diese Kategorie umfaßt daher Peroxidase ELISAs.
- c) Assays, worin Luminiszenzreaktionen benutzt werden, um die Produkte zu bestimmen, welche durch die Wirkung von Enzymmarkierungen außer Peroxidase auf geeigneten Substraten gebildet werden. Ein Beispiel dieser Art von Assay ist die Bestimmung von Antikörper-verknüpfter Glukoseoxidase durch Umsetzung des Enzym/Antikörper- Reagenz mit Glukose zur Bildung von Wasserstoffperoxid und anschließende Messung der gebildeten Menge an Wasserstoffperoxid durch Zugabe von Luminol und einem Peroxidasekatalysator unter gesteuerten Bedingungen um eine Luminiszenzreaktion zu initiieren.
Zu Beispielen von Assays, die nicht Immunoassays sind, je
doch von der Verwendung einer Luminiszenzreaktion Gebrauch
machen, gehören:
- a) ein Elastaseassay, der auf der Freisetzung von Peroxi dase aus einem unlöslichen Peroxidase-Elastin Präparat beruht,
- b) ein Glukoseassay, der auf coimmobilisierter Glukose oxidase und Peroxidase beruht und
- c) ein Assay eines Peroxidaseenzyms, eines 2,3-Dihydro- 1,4-phthalazindions oder eines Oxidationsmittels, wie Wasserstoffperoxid, wenn diese Materialien weder Markierungs mittel noch das Produkt von Markierungen sind.
Eine Übersicht über Lumenszenz- und luminometrische Assays
wird von T. P. Whitehead et al. in Clinical Chemistry 25,
1531-1546 (1979) gegeben.
Die Empfindlichkeit von Immunoassays wird zum Teil durch
die untere Grenze zum Nachweis der Markierung oder des
Produkts der Markierung bestimmt. Im Falle von Lumines
zenz- oder luminometrischen Immunoassays hängt ihre
Empfindlichkeit teilweise von dem in der Luminiszenz
reaktion pro Einheit an markiertem Material emittiertem
Licht ab.
Peroxidasen katalysieren die Oxidation einer großen Vielzahl
von organischen Verbindungen. Für Assayzwecke hat man
Vorteil von diesen Reaktionen gezogen, in dem man die ge
bildete Färbung, die Fluoreszenz (= durch die Einwirkung
von Licht auf das Reaktionsprodukt bewirkte Fotolumine
zenz) oder die Chemilumineszenz (durch Freisetzung von
Licht, die durch die im Dunkeln durchgeführte Reaktion
bewirkt wird), gemessen wurde.
Viele verschiedene farbbildende Substrate werden in einem
Überblick über den Stand der Technik in Research Disclosure
Nr. 16034 (anonym) 19-24 (August 1977) erwähnt. Sie um
fassen aromatische Monoamine, z. B. Anilin und seine Derivate,
Diamine, wie o- und p-Phenylendiamin und Benzidin,
Monophenole, Polyphenole, aromatische Säuren, Leucofarb
stoffe, gefärbte Farbstoffe, wie 2,6-Dichlorphenol
indophenol, verschiedene biologische Substanzen, Gummis,
verschiedene Jodide, Bilirubin und die Farbstoffe 2,2′-
Azino-di-(3-ethylbenzthiazolin)-6-sulfonat (ABTS) und
3,3′-Diaminobenzidin. Die Publikation Research Disclosure
beschreibt auch andere Farbbildner, nämlich (1) ein
Sulfonylhydrazon, das einen N-heterocyklischen Ring in
Kombination mit einem Kuppler enthält, z. B. ein Phenol
oder aromatisches Amin und (2) ein Triarylimidazol. Andere
farbbildende Substrate wurden von D. J. Capaldi et al.
in Analytical Biochemistry 129, 329-336 (1983) zusammenge
faßt. Diese Autoren beziehen sich auf die Redoxsubstrate
ABTS und o-Dianisidin (3,3′-Dimethoxybenzidin) und auf
die farbbildenden Kombinationen von Verbindungen ein
schließlich von 4-Aminoantipyrin mit einem Phenol, 3-Methyl-
2-benzthiazolinonhydrazon (MBTH) zusammen mit N,N-Di
methylanilin, 2-Hydroxy-3,5-dichlorbenzolsulfonat oder
3-(N,N-dimethylamino)-benzoesäure.
Die Verwendung von 4-Aminoantipyrin mit einem Phenolkuppler,
ist von C. C. Allain et al., Clinical Chemistry 20, 470-475
(1974) und mit N,N-Dimethylanilin als Kuppler von
T. Kikuchi et al., Chemical Abstracts 94, 1977v (1981) und
Y. Tsutomu, Chemical Abstracts 94, 79749b (1981) be
schrieben. Es sei auch verwiesen auf M. Tsudo, Chemical
Abstracts 93, 65423e (1980) und Chemical Abstracts 94,
135589k, (1981)., P. Josephy et al., J. Biol. Chem. 257,
3369-3675 (1982) beschreibt eine Untersuchung der HRP-
katalysierten Oxidation der farbbildenden Verbindung
3,5,3′,5′-Tetramethylbenzidin.
Verbindungen, die durch Oxidation mittels H₂O₂ und Per
oxidase fluoreszierende Produkte liefern, umfassen Tyramin
(4-Hydroxyphenethylamin) und Homovanillinsäure:
K. Matsuoka et al., Chem. Pharm. Bull. 27, 2345-2350 (1979), 4-Hydroxyphenylessigsäure: S. D. Lidofsky et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78, 1901-1905 (1980), ver schiedene Phenole: K. Zaitsu et al., Analytical Bio chemistry 109, 109-113 (1980) und die Aminosäure Tyrosin: J. Williams et al., Biochem. J. 121, 203-209 (1971).
K. Matsuoka et al., Chem. Pharm. Bull. 27, 2345-2350 (1979), 4-Hydroxyphenylessigsäure: S. D. Lidofsky et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78, 1901-1905 (1980), ver schiedene Phenole: K. Zaitsu et al., Analytical Bio chemistry 109, 109-113 (1980) und die Aminosäure Tyrosin: J. Williams et al., Biochem. J. 121, 203-209 (1971).
Zu lumineszenten Substraten außer den DPDs gehören Poly
phenole, wie Pyrogallol, Lophin, also 2,4,5-Triphenyl
imidazol, Acridiniumverbindungen und Diaryloxalate.
Siehe die Zusammenfassung von T. P. Whitehead et al., oben.
Eine Verstärkung von Peroxidase-katalysierten Oxidationen
verschiedener organischer Verbindungen durch verschiedene
Verstärker (die die Reaktionsgeschwindigkeit oder die
Farbintensität oder die gemessene Luminiszenz erhöhen)
ist beschrieben worden, wie in den folgenden Tabellen 1
und 2 gezeigt wird:
A J R Whitaker et al., Biochim. Biophys. Acta 62, 310-317
(1962)
B I Fridovich, J. Biol. Chem. 238, 3921-3927 (1963)
C W Straus, Journal of Histochem. Cytochem. 30, 491-493 (1982)
D US Patent 4,521,511 (Enzyme Technology Company) erteilt 4 June 1985.
E B Chance, Arch. Biochem. Biophys. 41, 389-410 (1952)
F I Yamazaki, "Free Radicals in Biology", Bd. III, Nrsg. W. A. Pryor, Academic Press,New York 1977, Kap. 5, Seite 183-218
G I Yamazaki, et al., Biochim. Biophys. Acta 77, 47-64 (1963).
H S J Klebanoff, J Biol. Chem. 234, 2437-2442 (1979)
J I Aviram, Arch. Biochem. Biophys. 212, 483-496 (1981)
K L Sasson et al., Arch. Biochem Biophys. 217, 529-535 (1982)
L L R Fox et al., Plant Physiology 43, 454-456 (1968)
M M Halmann et al., Photochemistry and Photobiology 30, 165-167 (1979)
N G Annstrom et al., Acta. Chem. Scand 19, 313-316 (1965).
B I Fridovich, J. Biol. Chem. 238, 3921-3927 (1963)
C W Straus, Journal of Histochem. Cytochem. 30, 491-493 (1982)
D US Patent 4,521,511 (Enzyme Technology Company) erteilt 4 June 1985.
E B Chance, Arch. Biochem. Biophys. 41, 389-410 (1952)
F I Yamazaki, "Free Radicals in Biology", Bd. III, Nrsg. W. A. Pryor, Academic Press,New York 1977, Kap. 5, Seite 183-218
G I Yamazaki, et al., Biochim. Biophys. Acta 77, 47-64 (1963).
H S J Klebanoff, J Biol. Chem. 234, 2437-2442 (1979)
J I Aviram, Arch. Biochem. Biophys. 212, 483-496 (1981)
K L Sasson et al., Arch. Biochem Biophys. 217, 529-535 (1982)
L L R Fox et al., Plant Physiology 43, 454-456 (1968)
M M Halmann et al., Photochemistry and Photobiology 30, 165-167 (1979)
N G Annstrom et al., Acta. Chem. Scand 19, 313-316 (1965).
Es wurde bereits früher gefunden, daß die Empfindlichkeit
der Peroxidase-katalysierten Chemilumineszenzoxidation
von DPD verstärkt werden kann, wenn man den Reagentien
einen Verstärker beifügt und zwar ein 6-Hydroxybenzo
thiazol (EP-A 0 087 959, offengelegt 7. September 1983)
und bestimmte Phenole (EP-A 0 116 454, offengelegt
22. August 1984).
Ob die Peroxidase-katalysierte Oxidation eines DPD von
einer gegebenen Verbindung verstärkt wird, läßt sich
nicht vorhersagen. Beispielsweise wurde mit Phenol selbst
keine wesentliche Verstärkung erzielt und es findet sich
ein Hinweis in der Literatur, daß Phenol ein Inhibitor
ist (siehe "Heterocyclic Compounds", Hrsg. R. C. Elderfield,
L John Wiley & Sons, Inc., Bd., 6, Kapitel 6, S. 228-230,
S. 230 mitte). Während 4-Halophenole gute Verstärker
sind, sind 4-Aminophenol, 4-Cyanophenol und 4-Methoxyphenol
es nicht. Hierfür lassen sich zahlreiche andere Beispiele
anführen.
Die vorliegende Erfindung beruht auf dem Befund, daß be
stimmte aromatische Amine die Empfindlichkeit der
Lumineszenzreaktion bei der Peroxidase-katalysierten
Oxidation von 2,3-Dihydro-1,4-phthalazindion (DPD) wesent
lich verstärken.
In der vorliegenden Beschreibung bedeutet der Begriff
"verstärkt", daß die gesamte Lichtemission der vorliegenden
Lumineszenzreaktion und/oder das Signal-Rausch Verhältnis
dieser Reaktion größer ist, als das, welches man mit dem
2,3-Dihydro-1,4-phthalazindion/Oxidans/Peroxidase-System
in Abwesenheit des Empfindlichkeitsverstärkers erreicht.
Gemäß der vorliegenden Erfindung erhält man einen Assay,
der darin besteht eine Chemilumineszenzreaktion zwischen
einem Peroxidaseenzym, einem Oxidans und einem chemo
lumineszierenden 2,3-Dihydro-1,4-phthalazindion durchzu
führen und die dabei erzeugte Chemolumineszenz zu messen
oder nachzuweisen, indem man die Reaktion in Gegenwart
eines aromatischen Amins der allgemeinen Formel
durchführt,
worin die Symbole R (d. h. R, R¹ , R² , R³, R⁴, R⁵ und R⁶) irgendeine der nachfolgend angegebenen Bedeutungen (a) bis (j) haben und alle anderen Symbole R in jeder Be deutung Wasserstoffatome sind und die kondensierten Ringe im gleichen Konfigurationssinn zu lesen sind, wie Formel 1:
worin die Symbole R (d. h. R, R¹ , R² , R³, R⁴, R⁵ und R⁶) irgendeine der nachfolgend angegebenen Bedeutungen (a) bis (j) haben und alle anderen Symbole R in jeder Be deutung Wasserstoffatome sind und die kondensierten Ringe im gleichen Konfigurationssinn zu lesen sind, wie Formel 1:
- (a) R = R¹ = CH₃;
- (b) Cyclohexyl oder Alkyl oder Alkoxy mit 1 bis 4 Kohlen stoffatomen,
- c) R², R³ und R⁴ zusammen können das folgende mehr kernige kondensierte Ringsystem bedeuten:
- d) R³ und R⁴ zusammen können den folgenden konden sierten Ring oder das kondensierte Ringsystem be deuten:
- e) R³ und R⁴ zusammen können das folgende kondensierte Ringsystem bedeuten: und R⁵ und R⁶ zusammen bedeuten den kondensierten Ring
- f) R² = NH² und
- g) R² = R⁶ = CH₃ und
- h) R³ = C₂H₅
- i) R² = R⁴ = CH₃ und
- j) R³ = R⁴ = CH₃.
Die Erfindung umfaßt auch einen Kit zur Durchführung des
Assays, der aus dem DPD, dem Peroxidaseenzym und dem
aromatischen Amin besteht.
Das chemolumineszierende 2,3-Dihydro-1,4-phthalazindion
(DPD) kann jedes freie oder konjugierte DPD sein, das in
einer Chemolumineszenzreaktion in einen angeregten Zustand
umgesetzt wird und dann unter Lichtemission in einen nicht
angeregten Zustand zurückfällt.
Vorzugsweise entspricht das 2,3-Dihydro-1,4-phthalazin
dion der allgemeinen Formel (2)
worin Z¹ eine Amino- oder substituierte Aminogruppe be
deutet und Z², Z³ und Z⁴ jeweils Wasserstoff, gegebenenfalls
substituiertes C₁-C₆ Alkyl, gegebenenfalls substituiertes
C₁-C₆ Alkenyl, Hydroxyl, C₁-C₆ Alkoxyl, Carboxyl, Amino
oder substituiertes Amino bedeutet oder Z² Amino oder
substituiertes Amino bedeutet und jeder der Reste Z¹, Z³
und Z⁴ Wasserstoff, gegebenenfalls ,substituiertes C₁-C₆
Alkyl, gegebenenfalls substituiertes, C₁-C₆ Alkenyl,
Hydroxyl, C₁-C₆ Alkoxyl, Carboxyl, Amino oder substituier
tes Amino bedeutet, oder Z¹ und Z² bedeuten zusammen ein
Amino- oder substituiertes Aminoderivat einer Benzogruppe
und jeder der Reste Z³ und Z⁴ jeweils Wasserstoff, ge
gebenenfalls substituiertes C₁-C₆ Alkyl, gegebenenfalls
substituiertes C₁-C₆ Alkenyl, Hydroxyl, C₁-C₆ Alkoxyl,
Carboxyl, Amino oder substitutiertes Amino bedeuten.
(In der vorliegenden Beschreibung umfaßt der Begriff
"substituiertes Amino" beispielsweise Alkylcarbonyl
substituierte Aminogruppen, d. h. Amido-, Aminoalkyl- und
Amidoalkyl-substituierte Aminogruppen). Besonders bevor
zugte DPD zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung
sind Luminol und Isoluminol.
Die Form, die das chemolumineszierende DPD in der Luminiszenz
reaktion gemäß der vorliegenden Erfindung annimmt, wird von
der Art des jeweiligen Assays abhängen. Im Falle von Assays,
wie Organolumineszenz und organoluminometrischen Immuno
assays, worin das Phthalazindion als Markierung (Label)
verwendet wird, wird das chemolumineszierende DPD ein
substituiertes Aminoderivat eines 2,3-Dihydro-1,4-
phthalazindions sein, worin die Aminogruppe an einen
Liganden gekoppelt ist, wie etwa ein Protein, Hormon,
Hapten, Steroid, eine Nukleinsäure, einen Metaboliten,
ein Antigen oder einen, Antikörper. Die Aminogruppe kann
an den Liganden direkt oder über eine Brücke gekoppelt
sein. Geeignete Brücken sind dem Fachmann bekannt, wie
sich aus der Diskussion dieser Technik in der englischen
Patentanmeldung 2008247A und der US-PS 4 104 029 ersehen
läßt. Bevorzugt als Brücken sind unter anderem solche,
die sich von Hemisuccinat, Hemiglutarat, Hemimaleinat
Carboxymethyl, Glucuronid, Mercaptoacetat und Carboxy
methylderivaten ableiten. Die Aminogruppe kann an den
Liganden durch jede bekannte geeignete Methode gekoppelt
werden. Verschiedene solcher Prozeduren sind wiederum in
der englischen Patentanmeldung 2008247A und der US-PS
4 104 029 diskutiert. Zu bevorzugten Kopplungsmethoden
gehört die Verwendung von gemischten Anhydriden,
Carbodiimiden und/oder aktiven Estern.
Obwohl chemolumineszierende DPD, die zur Verwendung in
diesen Assays, worin ein Phtalazindion als Label ver
wendet wird, geeignet sind, grundsätzlich jedes sub
stituierte Aminoderivat eines 2,3-Dihydro-1,4-phthalazin
dions, worin die Aminogruppe an einen Liganden gekoppelt
ist, sein kann, sind die bevorzugten Substanzen doch
5-Amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazindion (Luminol) und
6-Amino-2,3-dihydro-2,4-phthalazindion (Isoluminol), wo
bei in jedem Fall die Aminogruppe an einen Liganden,
speziell an einen Antikörper, gekoppelt ist.
Im Falle anderer Assays als derer, worin Phthalazindione
als Label verwendet werden, wird das chemolumineszierende
DPD gewöhnlich frei in Lösung oder an einer Matrix
immobilisiert vorliegen. Besonders bevorzugt als DPD
werden wiederum Luminol und Isoluminol.
Jedes der oben definierten aromatischen Amine kann in
dem hier beschriebenen Assay verwendet werden.
Es wurde jedoch gefunden, daß zahlreiche andere, nicht
innerhalb der Definition liegenden Amine, nicht in einem
beträchtlichen oder brauchbaren Ausmaß zu einer Ver
stärkung der Peroxidase katalysierten DPD-Oxidation führen.
Beispiele solcher nicht-verstärkenden oder schwach ver
stärkenden Verbindungen sind unter anderem Anilin selbst,
4-Haloaniline (Halogen = Chlor, Brom, Jod), 4-Decylanilin,
2,4-Dichloranilin, 2-Chlor-4-methylanilin, 3-Haloanilin
(Halogen = Chlor, Brom, Jod), 3-Methoxyanilin, N,N-Di
methylanilin und N-Ethylanilin, 1-Aminoanthracen und
Pyridin. 4-Aminoanilin (p-Phenylendiamin) ist tatsächlich
ein Inhibitor. (Dieses Ergebnis wurde erhalten wie folgt:
Eine Lösung des Verstärkers (1 mg/ml) in DMSO wurde her
gestellt. Verschiedene Mengen dieser Lösung (5, 10 oder
20 µl) wurden 950 µl eines Gemisches von Natriumluminol
(25 mg) in Trispuffer (0,1 mol/l, pH 8,5) (100 ml) zuge
setzt, welcher Wasserstoffperoxid (30% Gew.-Volumen)
(31 µl) und 10 µl einer 1 : 1000 Verdünnung des an Meer
rettich-Peroxidase (HRP) konjugierten Antikörpers ent
hielt, zugegeben. Die Lichtemission bei jeder Konzen
tration des Verstärkers wurde unter Verwendung eines
Luminometers der Firma Wolfson Research Laboratories auf
gezeichnet. Für jeden Verstärker wurde die Lichtemission
auch in einem Leerwert (Leerwert 1), worin das Per
oxidasekonjugat weggelassen war, und einem Leerwert
(Leerwert 2) worin das Peroxidasekonjugat und der
Verstärker weggelassen waren, aufgezeichnet.)
Hieraus ist ersichtlich, daß die Erfindung vor dem
Hintergrund einer beträchtlichen Unvorhersagbarkeit ge
macht wurde und deshalb ist die Definition der hier be
schriebenen Verstärker eng an die in Tabelle 3 der Bei
spiele vorgelegten experimentellen Ergebnisse gebunden.
Bevorzugt als aromatische Aminverstärker werden N,N,N′,N′-
Tetramethylbenzidin, 4-Benzyloxyanilin, 4-Methoxyanilin
und 3-Aminofluoranthren.
Im allgemeinen kann jedes Peroxidaseenzym (EC Nr. 1.11.1.7),
das die Lumineszenzreaktion eines 2,3-Dihydro-1,4-phthal
azendions, speziell Luminol, katalysiert in der
Lumineszenzreaktion der vorliegenden Erfindung verwendet
werden. Beispiele hierfür sind unter anderem die pflanz
lichen Peroxidasen. Vorzugsweise ist das Enzym Meer
rettichperoxidase (HRP). Jede geeignete HRP, die ohne unge
wöhnliche Reinigungsprozeduren hergestellt ist, ist zur
Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet. Bei
spielsweise sind die HRP geeignet, die für normale Assay
zwecke, z. B. zum Markieren von Antikörpern für einen
ELISA verwendet werden. Nach unserer Erfahrung gibt es
jedoch Hinweise darauf, daß saure Peroxidase-Isoenzyme,
wie die von der Firma Sigma vertriebenen Typen VII und
VIII, keine nennenswerte Verstärkung ergeben. Die unge
wöhnlichen Materialien sind um ein vielfaches teurer als
der Typ VI des von der Firma Sigma vertriebenen Enzyms,
welches eine gewöhnliche, in dieser Erfindung brauchbare
Meerrettichperoxidase darstellt.
Der Begriff "Peroxidase", wie er hier verwendet wird, be
zieht sich nicht auf Microperoxidase, Hämoglobin,
Hämatin und Myoglobin.
Die Form, welche das Peroxidaseenzym in der Lumineszenz
reaktion der vorliegenden Erfindung annimmt, wird von der
Art des Assays abhängen. Im Falle von Assays, inbesondere
Immunoassays, worin die Peroxidase als Label verwendet
wird, wird sie an einen Liganden, wie ein Protein, Hormon,
Hapten, Steroid, eine Nukleinsäure, einen Metaboliten,
ein Antigen oder einen Antikörper gekoppelt (konjugiert)
sein. Im allgemeinen wird die Peroxidase an den Liganden
über eine Brücke gekoppelt werden. Geeignete Brücken und
Kopplungsverfahren sind alle beliebigen, dem Fachmann be
kannten Verfahren.
Im Falle von anderen Assays als solchen, die Peroxidase
als Label verwenden, wird das Enzym in seiner freien Form,
entweder in Lösung oder an einer Matrix immobilisiert,
und nicht an einen Liganden gekoppelt vorliegen.
Jedes beliebige Oxidationsmittel, das mit Peroxidase und
einem DPD, insbesondere Luminol oder Isoluminol, reagiert,
wobei das DPD angeregt wird, so daß es in einer Lumineszenz
reaktion Licht emittiert, kann in der Lumineszenzreaktion
gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Besonders
als Oxidationsmittel bevorzugt werden Wasserstoffperoxid
und das Perborat-Ion.
In Assays, insbesondere Immunoassays, worin ein 2,3-
Dihydro-1,4-phthalazindion oder ein Peroxidaseenzym
als Label für einen Liganden verwendet werden, wird eine
bekannte Menge des Oxidationsmittels dem Reaktionsgemisch,
im allgemeinen in Form von Markenware aus dem Fach
handel zugesetzt werden. In gewissen anderen Assays wird
jedoch die Menge an Oxidationsmittel, im allgemeinen
Wasserstoffperoxid, die im Assay vorliegt, unbekannt sein.
Bei diesem zweiten Typ von Assay wird das Label ein Stoff,
oft ein Enzym, wie Glukoseoxidase, sein, welcher an der
Umwandlung eines Substrats in das Oxidationsmittel be
teiligt ist. Deshalb wird in diesem Fall die Lumineszenz
reaktion gemäß der vorliegenden Erfindung dazu verwendet,
die Menge des markierten Liganden durch Messung der
Oxidationsmittelkonzentration im Lumineszenzreaktiongemisch
zu bestimmen.
Die Lichtemission aus der Lumineszenzreaktion gemäß der
vorliegenden Erfindung, obwohl primär abhängig von der
Wahl von Peroxidase, Oxidationsmittel, Empfindlichkeits
verstärker und chemolumineszierendem DPD, wird auch durch
sekundäre Faktpren, wie Temperatur, pH, Reagenzienkonzen
tration, Mischungsgeschwindigkeit und der Methode der
Lichtmessung bestimmt. Um die Empfindlichkeit des vor
liegenden Systems zu maximieren, sollten diese sekundären
Faktoren so eingestellt werden, daß man die maximale
Lichtemission auf reproduzierbare und leicht meßbare Weise
erhält, wobei das Verhältnis von Signal zu Hintergrund
so groß wie möglich sein sollte.
Die gewählten Bedingungen werden in der Regel einen
Kompromiß zwischen Enzym- oder katalytischer Aktivität
der Peroxidase, der Kinetik der Reaktion, der eingesetzten
Apparatur, dem Signal/Rauschverhältnis und der erforder
lichen Empfindlichkeit sein.
Wir haben gefunden, daß zur Erreichung optimaler Ergebnisse
die Lumineszenzreaktion der vorliegenden Erfindung unter
milden Temperaturbedingungen im Bereich von 10 bis 50°C
und im pH-Bereich von 6 bis 10, meist zwischen 7 und 9,
durchgeführt werden sollte. Geeignete Puffer zur Ver
wendung im Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung sind
Phosphat, Tris(hydroxymethyl)aminomethan, 2-Amino-2-methyl-
1,3-propandiol, Acetat, Carbonat und Borat.
Im allgemeinen werden die Konzentrationen der Reagenzien
im Lumineszenzreaktionsgemisch mit Ausnahme des zu be
stimmenden Materials, konstant gehalten. Der variable
Faktor kann beispielsweise die Konzentration eines
markierten Liganden, des Produkts einer Markierung, eines
Oxidationsmittels oder der ungebundenen Peroxidase sein.
Die nachfolgend aufgeführten Reagenzienkonzentrationen
sind besonders geeignet zur Verwendung in der Lumineszenz
reaktion gemäß der vorliegenden Erfindung:
Peroxidase | |
0,1 µg - 5000 mg/l | |
Oxidationsmittel | 10 µmol - 300 mmol/l |
Chemolumineszierendes DPD | 0,5 µmol - 200 mmol/l |
Aromatischer Aminverstärker | 0,1 µmol - 100 mmol/l |
Bei der Durchführung der Lumineszenzreaktion gemäß der
vorliegenden Erfindung werden bestimmte der vier not
wendigen Reagenzien (wobei mindestens eines weggelassen
wird) in einem Probengefäß vorgelegt. Die Lumineszenz
reaktion wird dann durch Zusatz des oder der fehlenden
Reagenzien zum Probengefäß gestartet. Das emittierte
Licht kann quantifiziert werden durch eine Standardmeß
vorrichtung, wie etwa einer Photomultiplierröhre, deren
Signal einem Aufzeichnungsgerät, Oscilloskop oder
Skalar, eingegeben und dort angezeigt oder aufgezeichnet
wird. Das Licht kann in einigen Fällen auch mit dem
bloßen Auge beobachtet oder auf einer photographischen
Platte aufgezeichnet werden. Vorzugsweise wird das Licht
jedoch in einem Luminometer des in der GB-Patentanmeldung
2025609A beschriebenen Typs quantifiziert.
Die Lumineszenzreaktion gemäß vorliegender Erfindung kann
in drei Grundtypen von Immunoassays verwendet werden, die
sich in der Art des an den Liganden gebundenen Labels
unterscheiden. Die Labels sind:
- a) ein Amino oder ein substituiertes Aminoderivat eines 2,3-Dihydro-1,4-phthalzindions, worin die Aminogruppe an den Liganden gebunden ist;
- b) ein Peroxidaseenzym, sowie
- c) ein anderer Stoff als die unter a) und b) angegebenen, und im allgemeinen ein Enzym, wie Glukoseoxidase, das an der Umsetzung eines Substrats in ein Material, das durch die Lumineszenzreaktion der Erfindung bestimmt werden kann (im allgemeinen Wasserstoffper oxid oder Peroxidase) beteiligt ist.
In den oben genannten Immunoassays ist es möglich, den zu
bestimmenden Stoff oder einen Antikörper gegen diesen
Stoff zu markieren.
Abhängig von der Art der eingesetzten Markierung (Label)
kann der Assay entweder heterogen oder homogen sein. Im
ersteren Fall können komplexe Flüssigkeiten, wie etwa
Serum analysiert werden, im letzteren Fall kann jedoch
ein vorheriger Extraktions- oder Reinigungsschritt not
wendig sein.
Typische heterogene und homogene Lumineszenz- oder
luminometrische Immunoassays sind im folgenden skizziert:
Bei diesem Typ von Immunoassay wird der zu bestimmende
Stoff mit einem Antikörper gegen diesen Stoff zur Reaktion
gebracht. Der freie Antikörper wird dann vom gebundenen
Antikörper abgetrennt. Die Reaktion wird quantifiziert,
in dem man entweder den Antikörper, die zu bestimmende
Substanz oder ein anderes Molekül, das mit den freien
oder gebundenen Anteilen nach der Trennung reagiert,
markiert.
In diesem Falle wird eine unbekannte Menge der zu be
stimmenden Substanz mit einer bekannten Menge dieser
Substanz, die an ein Label gekoppelt ist, und einer be
kannten, jedoch begrenzten Menge eines Antikörpers ge
mischt. Es folgt eine kompetitive Reaktion zwischen der
markierten und der unmarkierten Substanz um den Anti
körper. Die Komplexe zwischen Antikörper und unmarkiertem
Stoff und zwischen Antikörper und markiertem Stoff werden
von den freien markierten und unmarkierten Substanz abge
trennt.
Die Menge des markierten Stoffes, die an den Antikörper
gebunden ist, wird zur zu bestimmenden Menge an un
markierter Substanz in der Lösung in Beziehung gesetzt.
Diese Mengen können bestimmt werden, in dem man entweder
die Menge des an den Antikörper gebundenen Labels oder
die verbleibende Menge der freien markierten Substanz
bestimmt. Beispiele für diese Art von Assay, worin
Peroxidase das Label ist und der Antikörper an einen
festen Träger, nämlich die Wände eines Glasreagenzröhr
chens, gebunden ist, sind in der GB-Patentanmeldung
2044927A angegeben.
Bei diesem Typ von Immunoassay wird die zu bestimmende
Substanz zunächst an einen unmarkierten Antikörper gegen
diese Substanz gebunden, der seinerseits an einen festen
Träger, wie etwa Plastik, gebunden ist. Der Komplex
zwischen Antikörper und dem Stoff wird dann mit einem
markierten Antikörper behandelt. Die Analyse des
markierten Antikörpers im enthaltenen festen Komplex
kann durchgeführt werden, in dem man einen festen Komplex
aus der Lösung abtrennt und dann die Menge des Labels
bestimmt, das entweder im abgetrennten festen Komplex
oder im in der Lösung verbleibenden gelösten markierten
Antikörpers vorliegt.
Hierunter sind Immunoassays zu verstehen, bei denen das
Label ein Amino- oder substituiertes Aminoderivat eines
2,3-Dihydro-1,4-phthalazindions ist. Der Assay basiert
darauf, daß das Licht, das von der freien markierten
Substanz von Interesse (oder einem Antikörper hiergegen)
emittiert wird, eine unterschiedliche Intensität oder
Wellenlänge im Vergleich zu dem Licht besitzt, welches
von der gebundenen markierten Substanz von Interesse
(oder dem Antikörper hiergegen) stammt.
In einem Beispiel wurde etwa gefunden, daß die Inten
sität des emittierten Lichtes aus der Reaktion eines
Progesteron-Isoluminol-Derivat-Konjugates, eines Häm
katalysators und Wasserstoffperoxid eine geringere
Intensität besitzt als wenn die gleiche Reaktion in Gegen
wart von Antiprogesteron IgG durchgeführt wird.
Infolgedessen wurde im Assay eine unbekannte Progesteron
probe zunächst mit einer bekannten Menge eines Anti
progesteron IgG inkubiert. Nach Erreichen des Gleichge
wichtes wurde eine bekannte Menge eines Progesteron-
Isoluminol-Derivat-Konjugates zugesetzt, gefolgt von
einer bekannten Menge von Häm und Wasserstoffper
oxid. Das emittierte Licht wurde gemessen und die Menge
des in der unbekannten Probe vorliegenden Progesterons
konnte hieraus aus der Standardkurve bestimmt werden
(je mehr Progesteron in der unbekannten Probe vorliegt,
um so weniger freies IgG bleibt unter Gleichgewichtsbe
dingungen übrig und um so niedriger ist die Lichtausbeute
der Lumineszenzreaktion).
Auf diese Weise kann Progesteron bestimmt werden, ohne
daß ein Trennschritt erforderlich ist.
In allen den oben ausgeführten Immunoassays kann der
Schritt zur Quantifizierung, dem Nachweis oder Lokali
sation (im strikten Sinne ist die Lokalisation eine Form
des Nachweises) die Lumineszenzreaktion gemäß der vor
liegenden Erfindung sein.
Die in den oben ausgeführten Immunoassays eingesetzten
Antikörper können im Handel erworben oder nach bekannten
immunologischen Verfahren hergestellt werden.
Die Antikörper können in Form eines komplexen Gemisches
von Antikörpern vorliegen oder sie können ein oder
mehrere monoklonale Antikörper darstellen. Im allgemeinen
ist nur ein geringes Volumen von Antikörper erforderlich
und dieses wird bei den für seine Aktivität geeigneten
Bedingungen für pH, Ionenstärke und Temperatur gehalten.
Antikörper gegen die folgende unvollständige Liste von
Stoffen können erfolgreich in Immunoassays unter Ver
wendung der Lumineszenzreaktion der vorliegenden Er
findung eingesetzt werden: Proteine wie Insulin, Alpha
fetoprotein und Ferritin, Hormone wie Wachstumshormon,
Parathormon, Follikel stimulierendes Hormon (FSH),
Luteinisierendes Hormon (LH), Tyhroidea stimulierendes
Hormon (TSH), Adrenocorticotropes Hormon (ACTH), Glukagon,
Prolactin und Calcitonin, Haptene und Steroide wie etwa
Östradiol, Progesteron und Cortisol, Pharmaka, wie
Digoxin, Antigene wie Zelloberflächenantigene und carzino
embryonales Antigen sowie Antikörper wie etwa Mumpsvirus
antikörper, humanes Immunglobulin G (IgG), Kaninchen IgG,
Schaf IgG, Meerschweinchen IgG, Esels IgG und menschliches
Immunglobulin E und M.
Die Lumineszenzreaktion gemäß der vorliegenden Erfindung
kann auch in anderen Assays als den oben beschriebenen
Immunoassays verwendet werden. Hierzu gehören:
Bei diesem Assay wird ein festes Elastin-Peroxidase
Konjugat mit verschiedenen Mengen des Enzyms Elastase
inkubiert. Nach einer vorher festgelegten Zeit wird nicht
abreagiertes Konjugat durch Zentrifugieren entfernt und
der Überstand wird auf nicht gebundene Peroxidase unter
sucht.
Die Menge der im Überstand vorliegenden nicht gebundenen
Peroxidase wird zur Elastaseaktivität in der untersuchten
Probe in Beziehung gesetzt.
Bei diesem Assay wird ein immobilisiertes synthetisches
Peptidsubstrat Affigel 10-Ala-Ala-Ala-Phe-Isoluminol,
mit verschiedenen Mengen von Proteinase behandelt. Nach
einer vorher festgelegten Reaktionszeit wird nicht ab
reagiertes Substrat durch Zentrifugation entfernt und
der Überstand wird auf Isoluminol untersucht. Die Menge
von Isoluminol im Überstand wird zur Proteinaseaktivität
in der untersuchten Probe in Beziehung gesetzt.
Bei diesem Assay werden Glukoseoxidase und Peroxidase auf
einem festen Träger, z. B. Sepharose oder Plastikröhrchen,
coimmobilisiert. Hierzu wird eine Lösung von Luminol und
einem Empfindlichkeitsverstärker zugegeben. Schließlich
wird eine Glukoselösung zugesetzt und die Lichtemission
aufgezeichnet. Die Lichtemission läßt sich direkt zur
Menge der in Lösung vorliegenden Glukose korrelieren.
Bei der mittlerweile wohlbekannten Technik der Markierung
von DNA mit Biotin kann ein geeigneter, daran bindender
Ligand, wie etwa Avidin oder Streptavidin, mit Peroxidase
markiert und die Peroxidase nach der Methode der vor
liegenden Erfindung quantifiziert werden.
Die Erfindung ist auch anwendbar auf anders mit Peroxidase
markierte DNA, hierzu siehe beispielsweise die PCT-An
meldung Nr. 84/03520 (A.D.B. Malcolm et al.).
Der Assay gemäß der vorliegenden Erfindung wird haupt
sächlich in der klinischen Chemie und in der ärztlichen
Praxis angewandt werden. In solchen Laboratorien oder
Praxen erhalt man die Materialien zur Verwendung in einem
gegebenen Nachweis für Verfahren üblicherweise in Form
eines Assaykits. Zusätzlich zu DPD, aromatischem Amin
verstärker und Peroxidase kann der Kit auch ein Oxidations
mittel umfassen, in vielen Fällen kann dieses Material
jedoch entweder seperat davon geliefert werden oder es
stellt die zu bestimmende Substanz dar.
Vorzugsweise werden Peroxidaseenzym, Oxidationsmittel,
Empfindlichkeitsverstärker und chemolumineszierendes
DPD jeweils eine der oben als bevorzugt zur Verwendung der
vorliegenden Erfindung erwähnten Substanzen sein. In einer
besonders bevorzugten Ausführungsform des Assaykits gemäß
der vorliegenden Erfindung ist mindestens eines der Be
standteile, nämlich Peroxidaseenzym und chemolumineszieren
des DPD konjugiert, beispielsweise an einen Antikörper
gegen die zu bestimmende Substanz.
Gegebenenfalls kann der Assaykit auch eine oder mehrere
Standardlösungen enthalten, die jeweils eine bekannte
Menge der zu bestimmenden Substanz enthalten, und/oder
eine oder mehrere der bevorzugten Pufferlösungen.
Praktischerweise kann der Assaykit auch ein Reaktionsge
fäß umfassen, das geeignet ist zur Verwendung in Ver
bindung mit der Vorrichtung zur Bestimmung des im Verlauf
der Durchführung des Assays emittierten Lichtes. Ferner
kann auch eine Mischvorrichtung im Assaykit enthalten
sein, die zur Sicherstellung einer ausreichenden Ver
mischung der Reagenzien verwendet wird.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Ein Meerrettichperoxidase (HRP) markiertes Kaninchen
antihumanes α-Fetoprotein Antikörperkonjugat wurde von
Dako Products, Mercia Brocades Ltd., Brocades House,
Pyrford Road, West Byfleet, Weybridge, Surrey, UK, be
zogen.
Enzymimmunoassaykits zur Bestimmung von carcinoembryonai
Antigen (CEA) wurden von Abbott Laboratories Ltd.,
Diagnostics Division, Basingstoke, UK, bezogen.
Luminol (5-Amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazindion) und
Isoluminol (6-Amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazindion) wurden
von der Firma Sigma Chemical Co., Poole, Dorset, UK, be
zogen. Das Natriumsalz von Luminol wurde hergestellt wie
bereits früher beschrieben bei Ham et al., Anal. Lett.,
12, S. 535, (1979).
7-Dimethylaminonaphthal in-1,2-dicarbonsäurehydrazid,
Formel (2) Z¹ und Z² werden zusammengenommen und stellen
eine dimethylaminosubstituierte Benzogruppe dar, Z³ = Z⁴
Wasserstoff, wurde von der Firma Boehringer Mannheim,
BRD, bezogen.
N-(6-Aminobutyl)-N-ethylisoluminol wurde von der Firma
LKB, Finnland, erhalten.
Alle aromatischen Amine wurden von der Firma Aldrich
Chemical Co., USA, bezogen.
Im Fall der Beispiele 1 bis 24 wurden die Chemolumines
zenzreaktionen in 10 mm×10 mm messenden 4 ml Einmal-
Plastikküvetten (W. Sarstedt Ltd. Leicester, LE3 1UQ, UK)
durchgeführt. Das emittierte Licht wurde quantifiziert
in einem Luminometer gemäß früherer Beschreibung (Carter
et al., GB-Patentanmeldung 2025609A), das eine Modifi
kation umfaßte, die es erlaubte, mehrere Cüvetten nach
einander exakt reproduzierbar vor der Photokathode der
Photomultiplierröhre in Position zu bringen.
Die Ergebnisse wurden auf einem schnellen potentio
metrischen Schreiber (des Typs PM 8202 der Firma Philips,
Eindhoven, Niederlande, Zeit für den vollen Skalenaus
schlag weniger als 0,25 s) aufgezeichnet.
Im Falle des Assays für carcinoembryonales Antigen wurden
die Chemolumineszenzreaktion in 55 mm×11 mm messenden
durchsichtigen Polystyrolröhrchen mit rundem Boden der
Firma LIP (Equipment and Services) Ltd., Shipley, West
Yorkshire, UK, durchgeführt. Der automatische Start der
Lumineszenzreaktionen und die Messung der Lichtemission
wurden unter Verwendung eines Autobiolumat LB 950
Luminometers der Firma Laboratorium Prof. Dr. Berthold,
Wildbad, BRD, durchgeführt. Dieses Instrument benutzt
Photonenzählung und wird von einem 48K Apple II Computer
gesteuert.
Natriumluminol (50 mg) und Wasserstoffperoxyd (62 µl,
30 Gew./Vol.-%) wurden zu 200 ml Trispuffer (0,1 mol/l,
pH 8,5) zugesetzt. Diese Lösung wurde etwa 0,5 h vor
Verwendung stehen gelassen und vor einfallendem Licht ge
schützt. Zu 10 µl Kaninchen-Anti-α-Fetoprotein-HRP-Konju
gat in 1 : 1000 Verdünnung in einer Cüvette wurden 0,9 ml
des Luminol/H₂O₂ Reagenz zugesetzt. Die resultierende
Lichtemission wurde vor dem Zusatz von 20 µl N,N,N′,N′-
Tetramethylbenzidin (4,54 mol/l in Demethylsulfoxid) zum
Reaktionsgemisch aufgezeichnet. Der verstärkte Lichtaus
stoß wurde ähnlich aufgezeichnet und die Verbesserung
des Signals wurde bestimmt. Die obige Prozedur wurde
wiederholt, wobei das Kaninchen-Anti-α-Fetcprotein-HRP-
Konjugat weggelassen wurde, um den Effekt von N,N,N′,N′-
Tetramethylbenzidin auf den Hintergrund der Reaktion zu
bestimmen. Die Verbesserung im Signal und im Signal/
Hintergrundverhältnis wurden gemessen und sind in Tabelle 3
angegeben. Die Verbesserung des Signals wird als der
signifikantere Parameter angesehen.
Das Vorgehen von Beispiel 1 wurde wiederholt, jedoch mit
der Ausnahme daß N,N,N′,N′-Tetramethylbenzidin durch
andere aromatische Amine ersetzt wurde. Die Verbesserung
im Signal/Hintergrundverhältnis wurde bestimmt und ist
in Tabelle 3 angegeben.
Das Vorgehen von Beispiel 1 wurde wiederholt, jedoch mit
der Ausnahme, daß kein Empfindlichkeitsverstärker zu dem
Lumineszenz-Reaktionsgemisch zugesetzt wurde. Die Er
gebnisse sind in Tabelle 3 aufgeführt. Die Buchstaben in
der linken Spalte setzen die Verbindungen in Beziehung
zu den Symbolen R in der obigen Formel (1).
Stammlösungen von Isoluminol (24 mg) in 100 ml Trispuffer
(0,1 mol/l, pH 8,5) und Wasserstoffperoxid (450 µl,
30 Gew.-Vol.-%) in 100 ml Trispuffer (0,1 mol/l, pH 8,5)
wurden hergestellt. Die folgenden Reagenzien wurden in
eine Cüvette gegeben: 50 µl der Isoluminol-Stammlösung,
50 µl Wasserstoffperoxid-Stammlösung, 10 µl Kaninchen-
Anti-α-Fetoprotein-HRP-Konjugat (Verdünnung 1 : 1000) und
10 µl N,N,N′,N′′-Tetramethylbenzidin (TMB) oder 4-Benzyl
oxanilin (4,54 mmol/l) in Dimethylsulfoxid). Die Reagenzien
wurden gemischt und die Reaktion durch Zusatz von 0,9 ml
Trispuffer (0,1 mol/l, pH 8,5) gestartet. Die folgende
Lichtemission wurde gemessen. In einem Kontrollexperiment
wurde die obige Prozedur wiederholt, jedoch mit der Aus
nahme, daß 10 µl DMSO das Amin ersetzten. Eine beträcht
liche Verstärkung des Signals der TMB- oder 4-Benzylox
anilin verstärkten Reaktion gegenüber der Kontrolle
wurde festgestellt.
Das Vorgehen von Beispiel 21 wurde wiederholt, jedoch mit
der Ausnahme daß Isoluminol durch N-(6-Aminobutyl)-N-ethyl
isoluminol ersetzt wurde.
Das Vorgehen von Beispiel 21 wurde wiederholt, jedoch mit
der Ausnahme, daß Isoluminol durch 7-Dimethylamino
naphthalen-1,2-dicarbonsäurehydrazid(9-dimethylamino-
2,3-dihydrobenzo(f)-phthalazin-1,4-dion) ersetzt wurde.
Das Vorgehen von Beispiel 21 wurde wiederholt, jedoch mit
der Ausnahme daß Wasserstoffperoxid durch Natriumperborat
und Isoluminol durch Luminol ersetzt wurden.
In jedem der Beispiele 22 bis 24 wurde die Verstärkung der
Lichtemission aufgrund des Zusatzes von TMB oder 4-Benzyl
oxanilin festgehalten.
Die Bestimmungen wurden gemäß der Beschreibungen in den
Herstellerinformationen durchgeführt. Standards (200 µl),
hergestellt in Natriumacetatpuffer (0,2 mol/l, pH 5,0,
enthaltend 0,01% Thiomersal-Konservierungsmittel) wurden
in die Vertiefungen einer Kunststoffreaktionsplatte ge
geben. Eine Plastikperle, die mit Meerschweinchen-Anti-
CEA-Antikörper beschichtet war, wurde in destilliertem
Wasser gespült und jeweils in eine Vertiefung gegeben.
Die Platte wurde zur Entfernung etwaiger Gasbläschen an
der Oberfläche der Perle kurz gerüttelt und 2 h in einem
Wasserbad bei 45°C inkubiert. Die Proben wurden dann ab
gesaugt und jede Probe wurde mit destilliertem Wasser
(5×2 ml) gewaschen. Ziegen-anti-human-CEA-HRP-
Konjugat (200 µl, ca. 0,05 µg/ml in Trispuffer, ent
haltend Proteinstabilisator und 0,01% Thiomersal) wurde
jeder Kugel zugesetzt und dann wurde die Platte behandelt
wie oben beschrieben und weitere 2 h bei 45°C inkubiert.
Nach Absaugen der jeweiligen Lösung wurden die Kugeln
mit destilliertem Wasser (5×2 ml) gewaschen, in 55 mm×
11 mm messende Polystyrolröhrchen überführt und dann
nochmals gewaschen (2×4 ml). Gebundenes HRP-Konjugat
wurde dann quantifiziert, wobei die Bestimmungsmethode
gemäß der vorliegenden Erfindung mit TMB als Verstärker
verwendet wurde.
Jedem Röhrchen wurden 0,5 ml Trispuffer (0,05 mol/l,
pH 8,0) zugesetzt. Die Lumineszenzreaktion wurde dann
automatisch im Autobiolumat Luminometer durch Injizieren
von 0,5 ml einer Luminol/Wasserstoffperoxyd/TMB-Lösung
gestartet. Diese Lösung wurde vorher hergestellt, in dem
man 1 ml TMB-Lösung (0,5 mg/ml in DMSO) zu 100 ml eines
Gemisches von Luminol (2,4 mmol/l), Wasserstoffperoxid
(5,4 mmol/l) in Trispuffer (0,05 mol/l, pH 8,0) zugab.
Beim Start der Lumineszenzreaktion wurde die Lichtemission
zwischen 0 und 180 s (nach dem Start) integriert und
automatisch für jede Kugel aufgezeichnet. Die Ergebnisse
sind in Tabelle 4 aufgeführt.
Die Assays nach Beispiel 25 wurden wiederholt, jedoch mit
der Ausnahme, daß die TMB-Lösung eine Konzentration von
2,5 mg/ml hatte. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 aufge
führt.
Die Assays des Beispiels 25 wurden wiederholt, jedoch mit
der Ausnahme, daß die TMB-Lösung eine Konzentration von
5,0 mg/ml hatte. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 aufge
führt.
Die Assays des Beispiels 25 wurden wiederholt, jedoch ohne
Zusatz von TMB-Lösung. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 4
aufgeführt.
Claims (9)
1. Lumineszenz- oder luminometrischer Assay mittels
Durchführung einer chemilumineszenten Reaktion zwischen einem
Peroxydaseenzym, einem Oxidationsmittel, einem chemilumines
zierenden 2,3-Dihydro-1,4-phthalazindion und Messung oder Nach
weis der dabei erzeugten Chemilumineszenz, dadurch ge
kennzeichnet, daß die Reaktion in Gegenwart eines
aromatischen Amins der folgenden allgemeinen Formel durchge
führt wird
worin die Symbole R (d. h. R, R¹, R², R³, R⁴, R⁵ und R⁶)
irgendeine der nachfolgend angegebenen Bedeutungen (a)
bis (j) haben und alle anderen Symbole R in jeder Be
deutung Wasserstoffatome sind und die kondensierten Ringe
im gleichen Konfigurationssinn zu lesen sind, wie Formel 1:
- (a) R = R¹ = CH₃;
- (b) Cyclohexyl oder Alkyl oder Alkoxy mit 1 bis 4 Kohlen stoffatomen,
- c) R², R³ und R⁴ zusammen können das folgende mehr kernige kondensierte Ringsystem bedeuten:
- d) R³ und R⁴ zusammen können den folgenden konden sierten Ring oder das kondensierte Ringsystem be deuten:
- e) R³ und R⁴ zusammen können das folgende kondensierte Ringsystem bedeuten: und R⁵ und R⁶ zusammen bedeuten den kondensierten Ring
- f) R² = NH₂ und
- g) R² = R⁶ = CH₃
- h) R³ = C₂H₅
- i) R² = R⁴ = CH₃ und
- j) R³ = R⁴ = CH₃.
2. Assay nach Anspruch 1, dadurch gekenn
zeichnet, daß das chemilumineszierende 2,3-Di
hydro-1,4-phthalazindion folgende allgemeine Formel 2
hat:
worin Z¹ Amino oder substituiertes Amino und jeder
der Reste Z², Z³ und Z⁴ Wasserstoff, gegebenenfalls
substituiertes C₁-C₆ Alkyl, gegebenenfalls substituiertes
C₁-C₆ Alkenyl, Hydroxyl, C₁-C₆ Alkoxyl, Carboxyl, Amino
oder substituiertes Amino bedeutet oder Z² Amino oder
substituiertes Amino bedeutet und jeder der Reste Z¹, Z³
und Z⁴ Wasserstoff, gegebenenfalls substituiertes C₁-C₆
Alkyl, gegebenenfalls substituiertes C₁-C₆ Alkenyl,
Hydroxyl, C₁-C₆ Alkoxyl, Carboxyl, Amino oder substituier
tes Amino bedeutet, oder Z¹ und Z² bedeuten zusammen ein
Amino- oder substituiertes Aminoderivat einer Benzogruppe
und jeder der Reste Z³ und Z⁴ bedeutet Wasserstoff, ge
gebenenfalls substituiertes C₁-C₆ Alkyl, gegebenenfalls
substituiertes C₁-C₆ Alkenyl, Hydroxyl, C₁-C₆ Alkoxyl,
Carboxyl, Amino oder substitutiertes Amino.
3. Assay nach Anspruch 2, dadurch gekenn
zeichnet, daß das chemilumineszierende 2,3-Di
hydro-1,4-phthalazindion Luminol oder Isoluminol ist.
4. Assay nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekenn
zeichnet, daß das Peroxydaseenzym Meerrettichper
oxidase ist.
5. Assay nach Anspruch 1, 2, 3 oder 4, dadurch ge
kennzeichnet, daß, die Peroxidase in einer
zu analysierenden Substanz in einer freien oder konju
gierten Form vorliegt und ihr Vorliegen oder ihre Menge
vom Nachweis bzw. der Messung der Chemilumineszenz abge
leitet wird.
6. Assay nach einem der vorhergehenden Ansprüche, da
durch gekennzeichnet, daß das aromatische
Amin N,N,N′,N′-Tetramethylbenzidin, 4-Benzyloxyanilin,
3-Aminofluoranthren oder 4-Methoxyanilin ist.
7. Kit zur Verwendung im Assay nach Anspruch 1, ent
haltend:
- - ein chemilumineszierendes 2,3-Dihydro-1,4-phthalazin dion,
- - ein Peroxidasenzym und
- - ein aromatisches Enzym nach Anspruch 1.
8. Kit nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet,
daß das chemilumineszierende 2,3-Dihydro-1,4-phthalazindion
ein solches gemäß Anspruch 2 ist.
9. Kit nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekenn
zeichnet, daß das aromatische Amin ein solches ge
mäß Anspruch 6 ist.
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