DE3528391C2

DE3528391C2 - Lumineszenz- oder luminometrischer Assay

Info

Publication number: DE3528391C2
Application number: DE3528391A
Authority: DE
Inventors: Larry Jan Kricka; Angela Marie O'toole; Gary Harold Gregory Hen Thorpe; Thomas Patterson Whitehead
Original assignee: British Technology Group Ltd
Current assignee: BTG International Ltd
Priority date: 1984-08-07
Filing date: 1985-08-07
Publication date: 1996-01-11
Anticipated expiration: 2005-08-08
Also published as: GB8519544D0; JPS6154453A; GB2162946A; GB2162946B; GB8420053D0; US4729950A; DE3528391A1; JPH0553478B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen verbesserten Lumineszenz- oder luminometrischen Assay, insbesondere Immunoassay, und ein diagnostisches Kit zur Verwendung im Assay. Die Lumineszenz- und luminometrischen Assays, mit welchen sich die vorliegende Erfindung befaßt, sind diejenigen, die von einer chemilumineszierenden Reaktion abhängen (einer chemischen Reaktion, die zur Emission von Licht führt). Die Lumineszenzemission hat im allge meinen hinreichende Dauer um den Nachweis des emittierten Lichtes oder seine Messung zu gestatten und ermöglicht dadurch den Nachweis oder die Quantifizierung eines zu analysierenden Stoffes. Die Chemilumineszenzreaktion, mit welcher sich diese Erfindung befaßt, ist diejenige zwischen einem 2,3-Dihydro-1,4-phthalazindion (DPD), insbesondere Luminol oder Isoluminol, mit einem Oxidations mittel, insbesondere Wasserstoffperoxid, und einem Per oxidaseenzym, das die Oxidation des DPD durch das Oxi dationsmittel katalysiert. Die Oxidation ist von Licht emission begleitet.

Die Lumineszenz- und luminometrischen Assays, welche von der oben erwähnten Peroxidase katalysierten Oxidation eines DPD Anwendung machen, umfassen drei Haupttypen:

a) Assays bei denen eine chemilumineszierende Verbindung zur direkten Markierung von Liganden, wie Proteinen, Hormonen, Haptenen, Steroiden, Nukleinsäuren, Meta boliten, Antigenen und/Antikörpern verwendet wird. Das chemilumineszierende DPD, wie Luminol oder Iso luminol, ist normalerweise an einen Liganden konju giert. Die Chemilumineszenz kann nachgewiesen werden, indem man Peroxidase und ein Oxidationsmittel zu dem umgesetzten Konjugat zufügt. Es sei z. B. verwiesen auf die GB-OS 2026690A (Miles Lab., Inc.), insbe sondere Seite 7, und GB 2008247 B (The Welsh National School of Medicine), insbesondere Seite 8, Beispiel 7.
b) Assays, worin Katalysatoren oder Cofaktoren von Luminiszenzreaktionen als Markierungen benutzt werden und die Luminiszenzreaktion dazu benutzt wird, die Markierung nachzuweisen oder zu quantifizieren. Normalerweise ist ein Enzym, häufig HRP(Meerrettich peroxidase), an einen Liganden konjugiert. Diese Kategorie umfaßt daher Peroxidase ELISAs.
c) Assays, worin Luminiszenzreaktionen benutzt werden, um die Produkte zu bestimmen, welche durch die Wirkung von Enzymmarkierungen außer Peroxidase auf geeigneten Substraten gebildet werden. Ein Beispiel dieser Art von Assay ist die Bestimmung von Antikörper-verknüpfter Glukoseoxidase durch Umsetzung des Enzym/Antikörper- Reagenz mit Glukose zur Bildung von Wasserstoffperoxid und anschließende Messung der gebildeten Menge an Wasserstoffperoxid durch Zugabe von Luminol und einem Peroxidasekatalysator unter gesteuerten Bedingungen um eine Luminiszenzreaktion zu initiieren.

Zu Beispielen von Assays, die nicht Immunoassays sind, je doch von der Verwendung einer Luminiszenzreaktion Gebrauch machen, gehören:

a) ein Elastaseassay, der auf der Freisetzung von Peroxi dase aus einem unlöslichen Peroxidase-Elastin Präparat beruht,
b) ein Glukoseassay, der auf coimmobilisierter Glukose oxidase und Peroxidase beruht und
c) ein Assay eines Peroxidaseenzyms, eines 2,3-Dihydro- 1,4-phthalazindions oder eines Oxidationsmittels, wie Wasserstoffperoxid, wenn diese Materialien weder Markierungs mittel noch das Produkt von Markierungen sind.

Eine Übersicht über Lumenszenz- und luminometrische Assays wird von T. P. Whitehead et al. in Clinical Chemistry 25, 1531-1546 (1979) gegeben.

Die Empfindlichkeit von Immunoassays wird zum Teil durch die untere Grenze zum Nachweis der Markierung oder des Produkts der Markierung bestimmt. Im Falle von Lumines zenz- oder luminometrischen Immunoassays hängt ihre Empfindlichkeit teilweise von dem in der Luminiszenz reaktion pro Einheit an markiertem Material emittiertem Licht ab.

Peroxidasen katalysieren die Oxidation einer großen Vielzahl von organischen Verbindungen. Für Assayzwecke hat man Vorteil von diesen Reaktionen gezogen, in dem man die ge bildete Färbung, die Fluoreszenz (= durch die Einwirkung von Licht auf das Reaktionsprodukt bewirkte Fotolumine zenz) oder die Chemilumineszenz (durch Freisetzung von Licht, die durch die im Dunkeln durchgeführte Reaktion bewirkt wird), gemessen wurde.

Viele verschiedene farbbildende Substrate werden in einem Überblick über den Stand der Technik in Research Disclosure Nr. 16034 (anonym) 19-24 (August 1977) erwähnt. Sie um fassen aromatische Monoamine, z. B. Anilin und seine Derivate, Diamine, wie o- und p-Phenylendiamin und Benzidin, Monophenole, Polyphenole, aromatische Säuren, Leucofarb stoffe, gefärbte Farbstoffe, wie 2,6-Dichlorphenol indophenol, verschiedene biologische Substanzen, Gummis, verschiedene Jodide, Bilirubin und die Farbstoffe 2,2′- Azino-di-(3-ethylbenzthiazolin)-6-sulfonat (ABTS) und 3,3′-Diaminobenzidin. Die Publikation Research Disclosure beschreibt auch andere Farbbildner, nämlich (1) ein Sulfonylhydrazon, das einen N-heterocyklischen Ring in Kombination mit einem Kuppler enthält, z. B. ein Phenol oder aromatisches Amin und (2) ein Triarylimidazol. Andere farbbildende Substrate wurden von D. J. Capaldi et al. in Analytical Biochemistry 129, 329-336 (1983) zusammenge faßt. Diese Autoren beziehen sich auf die Redoxsubstrate ABTS und o-Dianisidin (3,3′-Dimethoxybenzidin) und auf die farbbildenden Kombinationen von Verbindungen ein schließlich von 4-Aminoantipyrin mit einem Phenol, 3-Methyl- 2-benzthiazolinonhydrazon (MBTH) zusammen mit N,N-Di methylanilin, 2-Hydroxy-3,5-dichlorbenzolsulfonat oder 3-(N,N-dimethylamino)-benzoesäure.

Die Verwendung von 4-Aminoantipyrin mit einem Phenolkuppler, ist von C. C. Allain et al., Clinical Chemistry 20, 470-475 (1974) und mit N,N-Dimethylanilin als Kuppler von T. Kikuchi et al., Chemical Abstracts 94, 1977v (1981) und Y. Tsutomu, Chemical Abstracts 94, 79749b (1981) be schrieben. Es sei auch verwiesen auf M. Tsudo, Chemical Abstracts 93, 65423e (1980) und Chemical Abstracts 94, 135589k, (1981)., P. Josephy et al., J. Biol. Chem. 257, 3369-3675 (1982) beschreibt eine Untersuchung der HRP- katalysierten Oxidation der farbbildenden Verbindung 3,5,3′,5′-Tetramethylbenzidin.

Verbindungen, die durch Oxidation mittels H₂O₂ und Per oxidase fluoreszierende Produkte liefern, umfassen Tyramin (4-Hydroxyphenethylamin) und Homovanillinsäure:
K. Matsuoka et al., Chem. Pharm. Bull. 27, 2345-2350 (1979), 4-Hydroxyphenylessigsäure: S. D. Lidofsky et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78, 1901-1905 (1980), ver schiedene Phenole: K. Zaitsu et al., Analytical Bio chemistry 109, 109-113 (1980) und die Aminosäure Tyrosin: J. Williams et al., Biochem. J. 121, 203-209 (1971).

Zu lumineszenten Substraten außer den DPDs gehören Poly phenole, wie Pyrogallol, Lophin, also 2,4,5-Triphenyl imidazol, Acridiniumverbindungen und Diaryloxalate. Siehe die Zusammenfassung von T. P. Whitehead et al., oben.

Eine Verstärkung von Peroxidase-katalysierten Oxidationen verschiedener organischer Verbindungen durch verschiedene Verstärker (die die Reaktionsgeschwindigkeit oder die Farbintensität oder die gemessene Luminiszenz erhöhen) ist beschrieben worden, wie in den folgenden Tabellen 1 und 2 gezeigt wird:

Literaturangaben zu den Tabellen 1 und 2

A J R Whitaker et al., Biochim. Biophys. Acta 62, 310-317 (1962)
B I Fridovich, J. Biol. Chem. 238, 3921-3927 (1963)
C W Straus, Journal of Histochem. Cytochem. 30, 491-493 (1982)
D US Patent 4,521,511 (Enzyme Technology Company) erteilt 4 June 1985.
E B Chance, Arch. Biochem. Biophys. 41, 389-410 (1952)
F I Yamazaki, "Free Radicals in Biology", Bd. III, Nrsg. W. A. Pryor, Academic Press,New York 1977, Kap. 5, Seite 183-218
G I Yamazaki, et al., Biochim. Biophys. Acta 77, 47-64 (1963).
H S J Klebanoff, J Biol. Chem. 234, 2437-2442 (1979)
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N G Annstrom et al., Acta. Chem. Scand 19, 313-316 (1965).

Es wurde bereits früher gefunden, daß die Empfindlichkeit der Peroxidase-katalysierten Chemilumineszenzoxidation von DPD verstärkt werden kann, wenn man den Reagentien einen Verstärker beifügt und zwar ein 6-Hydroxybenzo thiazol (EP-A 0 087 959, offengelegt 7. September 1983) und bestimmte Phenole (EP-A 0 116 454, offengelegt 22. August 1984).

Ob die Peroxidase-katalysierte Oxidation eines DPD von einer gegebenen Verbindung verstärkt wird, läßt sich nicht vorhersagen. Beispielsweise wurde mit Phenol selbst keine wesentliche Verstärkung erzielt und es findet sich ein Hinweis in der Literatur, daß Phenol ein Inhibitor ist (siehe "Heterocyclic Compounds", Hrsg. R. C. Elderfield, L John Wiley & Sons, Inc., Bd., 6, Kapitel 6, S. 228-230, S. 230 mitte). Während 4-Halophenole gute Verstärker sind, sind 4-Aminophenol, 4-Cyanophenol und 4-Methoxyphenol es nicht. Hierfür lassen sich zahlreiche andere Beispiele anführen.

Die vorliegende Erfindung beruht auf dem Befund, daß be stimmte aromatische Amine die Empfindlichkeit der Lumineszenzreaktion bei der Peroxidase-katalysierten Oxidation von 2,3-Dihydro-1,4-phthalazindion (DPD) wesent lich verstärken.

In der vorliegenden Beschreibung bedeutet der Begriff "verstärkt", daß die gesamte Lichtemission der vorliegenden Lumineszenzreaktion und/oder das Signal-Rausch Verhältnis dieser Reaktion größer ist, als das, welches man mit dem 2,3-Dihydro-1,4-phthalazindion/Oxidans/Peroxidase-System in Abwesenheit des Empfindlichkeitsverstärkers erreicht.

Gemäß der vorliegenden Erfindung erhält man einen Assay, der darin besteht eine Chemilumineszenzreaktion zwischen einem Peroxidaseenzym, einem Oxidans und einem chemo lumineszierenden 2,3-Dihydro-1,4-phthalazindion durchzu führen und die dabei erzeugte Chemolumineszenz zu messen oder nachzuweisen, indem man die Reaktion in Gegenwart eines aromatischen Amins der allgemeinen Formel

durchführt,
worin die Symbole R (d. h. R, R¹ , R² , R³, R⁴, R⁵ und R⁶) irgendeine der nachfolgend angegebenen Bedeutungen (a) bis (j) haben und alle anderen Symbole R in jeder Be deutung Wasserstoffatome sind und die kondensierten Ringe im gleichen Konfigurationssinn zu lesen sind, wie Formel 1:

(a) R = R¹ = CH₃;
(b) Cyclohexyl oder Alkyl oder Alkoxy mit 1 bis 4 Kohlen stoffatomen,
c) R², R³ und R⁴ zusammen können das folgende mehr kernige kondensierte Ringsystem bedeuten:
d) R³ und R⁴ zusammen können den folgenden konden sierten Ring oder das kondensierte Ringsystem be deuten:
e) R³ und R⁴ zusammen können das folgende kondensierte Ringsystem bedeuten: und R⁵ und R⁶ zusammen bedeuten den kondensierten Ring
f) R² = NH² und
g) R² = R⁶ = CH₃ und
h) R³ = C₂H₅
i) R² = R⁴ = CH₃ und
j) R³ = R⁴ = CH₃.

Die Erfindung umfaßt auch einen Kit zur Durchführung des Assays, der aus dem DPD, dem Peroxidaseenzym und dem aromatischen Amin besteht.

Bevorzugte Ausführungsformen

Das chemolumineszierende 2,3-Dihydro-1,4-phthalazindion (DPD) kann jedes freie oder konjugierte DPD sein, das in einer Chemolumineszenzreaktion in einen angeregten Zustand umgesetzt wird und dann unter Lichtemission in einen nicht angeregten Zustand zurückfällt.

Vorzugsweise entspricht das 2,3-Dihydro-1,4-phthalazin dion der allgemeinen Formel (2)

worin Z¹ eine Amino- oder substituierte Aminogruppe be deutet und Z², Z³ und Z⁴ jeweils Wasserstoff, gegebenenfalls substituiertes C₁-C₆ Alkyl, gegebenenfalls substituiertes C₁-C₆ Alkenyl, Hydroxyl, C₁-C₆ Alkoxyl, Carboxyl, Amino oder substituiertes Amino bedeutet oder Z² Amino oder substituiertes Amino bedeutet und jeder der Reste Z¹, Z³ und Z⁴ Wasserstoff, gegebenenfalls ,substituiertes C₁-C₆ Alkyl, gegebenenfalls substituiertes, C₁-C₆ Alkenyl, Hydroxyl, C₁-C₆ Alkoxyl, Carboxyl, Amino oder substituier tes Amino bedeutet, oder Z¹ und Z² bedeuten zusammen ein Amino- oder substituiertes Aminoderivat einer Benzogruppe und jeder der Reste Z³ und Z⁴ jeweils Wasserstoff, ge gebenenfalls substituiertes C₁-C₆ Alkyl, gegebenenfalls substituiertes C₁-C₆ Alkenyl, Hydroxyl, C₁-C₆ Alkoxyl, Carboxyl, Amino oder substitutiertes Amino bedeuten. (In der vorliegenden Beschreibung umfaßt der Begriff "substituiertes Amino" beispielsweise Alkylcarbonyl substituierte Aminogruppen, d. h. Amido-, Aminoalkyl- und Amidoalkyl-substituierte Aminogruppen). Besonders bevor zugte DPD zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind Luminol und Isoluminol.

Die Form, die das chemolumineszierende DPD in der Luminiszenz reaktion gemäß der vorliegenden Erfindung annimmt, wird von der Art des jeweiligen Assays abhängen. Im Falle von Assays, wie Organolumineszenz und organoluminometrischen Immuno assays, worin das Phthalazindion als Markierung (Label) verwendet wird, wird das chemolumineszierende DPD ein substituiertes Aminoderivat eines 2,3-Dihydro-1,4- phthalazindions sein, worin die Aminogruppe an einen Liganden gekoppelt ist, wie etwa ein Protein, Hormon, Hapten, Steroid, eine Nukleinsäure, einen Metaboliten, ein Antigen oder einen, Antikörper. Die Aminogruppe kann an den Liganden direkt oder über eine Brücke gekoppelt sein. Geeignete Brücken sind dem Fachmann bekannt, wie sich aus der Diskussion dieser Technik in der englischen Patentanmeldung 2008247A und der US-PS 4 104 029 ersehen läßt. Bevorzugt als Brücken sind unter anderem solche, die sich von Hemisuccinat, Hemiglutarat, Hemimaleinat Carboxymethyl, Glucuronid, Mercaptoacetat und Carboxy methylderivaten ableiten. Die Aminogruppe kann an den Liganden durch jede bekannte geeignete Methode gekoppelt werden. Verschiedene solcher Prozeduren sind wiederum in der englischen Patentanmeldung 2008247A und der US-PS 4 104 029 diskutiert. Zu bevorzugten Kopplungsmethoden gehört die Verwendung von gemischten Anhydriden, Carbodiimiden und/oder aktiven Estern.

Obwohl chemolumineszierende DPD, die zur Verwendung in diesen Assays, worin ein Phtalazindion als Label ver wendet wird, geeignet sind, grundsätzlich jedes sub stituierte Aminoderivat eines 2,3-Dihydro-1,4-phthalazin dions, worin die Aminogruppe an einen Liganden gekoppelt ist, sein kann, sind die bevorzugten Substanzen doch 5-Amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazindion (Luminol) und 6-Amino-2,3-dihydro-2,4-phthalazindion (Isoluminol), wo bei in jedem Fall die Aminogruppe an einen Liganden, speziell an einen Antikörper, gekoppelt ist.

Im Falle anderer Assays als derer, worin Phthalazindione als Label verwendet werden, wird das chemolumineszierende DPD gewöhnlich frei in Lösung oder an einer Matrix immobilisiert vorliegen. Besonders bevorzugt als DPD werden wiederum Luminol und Isoluminol.

Jedes der oben definierten aromatischen Amine kann in dem hier beschriebenen Assay verwendet werden.

Es wurde jedoch gefunden, daß zahlreiche andere, nicht innerhalb der Definition liegenden Amine, nicht in einem beträchtlichen oder brauchbaren Ausmaß zu einer Ver stärkung der Peroxidase katalysierten DPD-Oxidation führen. Beispiele solcher nicht-verstärkenden oder schwach ver stärkenden Verbindungen sind unter anderem Anilin selbst, 4-Haloaniline (Halogen = Chlor, Brom, Jod), 4-Decylanilin, 2,4-Dichloranilin, 2-Chlor-4-methylanilin, 3-Haloanilin (Halogen = Chlor, Brom, Jod), 3-Methoxyanilin, N,N-Di methylanilin und N-Ethylanilin, 1-Aminoanthracen und Pyridin. 4-Aminoanilin (p-Phenylendiamin) ist tatsächlich ein Inhibitor. (Dieses Ergebnis wurde erhalten wie folgt: Eine Lösung des Verstärkers (1 mg/ml) in DMSO wurde her gestellt. Verschiedene Mengen dieser Lösung (5, 10 oder 20 µl) wurden 950 µl eines Gemisches von Natriumluminol (25 mg) in Trispuffer (0,1 mol/l, pH 8,5) (100 ml) zuge setzt, welcher Wasserstoffperoxid (30% Gew.-Volumen) (31 µl) und 10 µl einer 1 : 1000 Verdünnung des an Meer rettich-Peroxidase (HRP) konjugierten Antikörpers ent hielt, zugegeben. Die Lichtemission bei jeder Konzen tration des Verstärkers wurde unter Verwendung eines Luminometers der Firma Wolfson Research Laboratories auf gezeichnet. Für jeden Verstärker wurde die Lichtemission auch in einem Leerwert (Leerwert 1), worin das Per oxidasekonjugat weggelassen war, und einem Leerwert (Leerwert 2) worin das Peroxidasekonjugat und der Verstärker weggelassen waren, aufgezeichnet.)

Hieraus ist ersichtlich, daß die Erfindung vor dem Hintergrund einer beträchtlichen Unvorhersagbarkeit ge macht wurde und deshalb ist die Definition der hier be schriebenen Verstärker eng an die in Tabelle 3 der Bei spiele vorgelegten experimentellen Ergebnisse gebunden.

Bevorzugt als aromatische Aminverstärker werden N,N,N′,N′- Tetramethylbenzidin, 4-Benzyloxyanilin, 4-Methoxyanilin und 3-Aminofluoranthren.

Im allgemeinen kann jedes Peroxidaseenzym (EC Nr. 1.11.1.7), das die Lumineszenzreaktion eines 2,3-Dihydro-1,4-phthal azendions, speziell Luminol, katalysiert in der Lumineszenzreaktion der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Beispiele hierfür sind unter anderem die pflanz lichen Peroxidasen. Vorzugsweise ist das Enzym Meer rettichperoxidase (HRP). Jede geeignete HRP, die ohne unge wöhnliche Reinigungsprozeduren hergestellt ist, ist zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet. Bei spielsweise sind die HRP geeignet, die für normale Assay zwecke, z. B. zum Markieren von Antikörpern für einen ELISA verwendet werden. Nach unserer Erfahrung gibt es jedoch Hinweise darauf, daß saure Peroxidase-Isoenzyme, wie die von der Firma Sigma vertriebenen Typen VII und VIII, keine nennenswerte Verstärkung ergeben. Die unge wöhnlichen Materialien sind um ein vielfaches teurer als der Typ VI des von der Firma Sigma vertriebenen Enzyms, welches eine gewöhnliche, in dieser Erfindung brauchbare Meerrettichperoxidase darstellt.

Der Begriff "Peroxidase", wie er hier verwendet wird, be zieht sich nicht auf Microperoxidase, Hämoglobin, Hämatin und Myoglobin.

Die Form, welche das Peroxidaseenzym in der Lumineszenz reaktion der vorliegenden Erfindung annimmt, wird von der Art des Assays abhängen. Im Falle von Assays, inbesondere Immunoassays, worin die Peroxidase als Label verwendet wird, wird sie an einen Liganden, wie ein Protein, Hormon, Hapten, Steroid, eine Nukleinsäure, einen Metaboliten, ein Antigen oder einen Antikörper gekoppelt (konjugiert) sein. Im allgemeinen wird die Peroxidase an den Liganden über eine Brücke gekoppelt werden. Geeignete Brücken und Kopplungsverfahren sind alle beliebigen, dem Fachmann be kannten Verfahren.

Im Falle von anderen Assays als solchen, die Peroxidase als Label verwenden, wird das Enzym in seiner freien Form, entweder in Lösung oder an einer Matrix immobilisiert, und nicht an einen Liganden gekoppelt vorliegen.

Jedes beliebige Oxidationsmittel, das mit Peroxidase und einem DPD, insbesondere Luminol oder Isoluminol, reagiert, wobei das DPD angeregt wird, so daß es in einer Lumineszenz reaktion Licht emittiert, kann in der Lumineszenzreaktion gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Besonders als Oxidationsmittel bevorzugt werden Wasserstoffperoxid und das Perborat-Ion.

In Assays, insbesondere Immunoassays, worin ein 2,3- Dihydro-1,4-phthalazindion oder ein Peroxidaseenzym als Label für einen Liganden verwendet werden, wird eine bekannte Menge des Oxidationsmittels dem Reaktionsgemisch, im allgemeinen in Form von Markenware aus dem Fach handel zugesetzt werden. In gewissen anderen Assays wird jedoch die Menge an Oxidationsmittel, im allgemeinen Wasserstoffperoxid, die im Assay vorliegt, unbekannt sein. Bei diesem zweiten Typ von Assay wird das Label ein Stoff, oft ein Enzym, wie Glukoseoxidase, sein, welcher an der Umwandlung eines Substrats in das Oxidationsmittel be teiligt ist. Deshalb wird in diesem Fall die Lumineszenz reaktion gemäß der vorliegenden Erfindung dazu verwendet, die Menge des markierten Liganden durch Messung der Oxidationsmittelkonzentration im Lumineszenzreaktiongemisch zu bestimmen.

Die Lichtemission aus der Lumineszenzreaktion gemäß der vorliegenden Erfindung, obwohl primär abhängig von der Wahl von Peroxidase, Oxidationsmittel, Empfindlichkeits verstärker und chemolumineszierendem DPD, wird auch durch sekundäre Faktpren, wie Temperatur, pH, Reagenzienkonzen tration, Mischungsgeschwindigkeit und der Methode der Lichtmessung bestimmt. Um die Empfindlichkeit des vor liegenden Systems zu maximieren, sollten diese sekundären Faktoren so eingestellt werden, daß man die maximale Lichtemission auf reproduzierbare und leicht meßbare Weise erhält, wobei das Verhältnis von Signal zu Hintergrund so groß wie möglich sein sollte.

Die gewählten Bedingungen werden in der Regel einen Kompromiß zwischen Enzym- oder katalytischer Aktivität der Peroxidase, der Kinetik der Reaktion, der eingesetzten Apparatur, dem Signal/Rauschverhältnis und der erforder lichen Empfindlichkeit sein.

Wir haben gefunden, daß zur Erreichung optimaler Ergebnisse die Lumineszenzreaktion der vorliegenden Erfindung unter milden Temperaturbedingungen im Bereich von 10 bis 50°C und im pH-Bereich von 6 bis 10, meist zwischen 7 und 9, durchgeführt werden sollte. Geeignete Puffer zur Ver wendung im Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung sind Phosphat, Tris(hydroxymethyl)aminomethan, 2-Amino-2-methyl- 1,3-propandiol, Acetat, Carbonat und Borat.

Im allgemeinen werden die Konzentrationen der Reagenzien im Lumineszenzreaktionsgemisch mit Ausnahme des zu be stimmenden Materials, konstant gehalten. Der variable Faktor kann beispielsweise die Konzentration eines markierten Liganden, des Produkts einer Markierung, eines Oxidationsmittels oder der ungebundenen Peroxidase sein.

Die nachfolgend aufgeführten Reagenzienkonzentrationen sind besonders geeignet zur Verwendung in der Lumineszenz reaktion gemäß der vorliegenden Erfindung:

Peroxidase
0,1 µg - 5000 mg/l
Oxidationsmittel	10 µmol - 300 mmol/l
Chemolumineszierendes DPD	0,5 µmol - 200 mmol/l
Aromatischer Aminverstärker	0,1 µmol - 100 mmol/l

Bei der Durchführung der Lumineszenzreaktion gemäß der vorliegenden Erfindung werden bestimmte der vier not wendigen Reagenzien (wobei mindestens eines weggelassen wird) in einem Probengefäß vorgelegt. Die Lumineszenz reaktion wird dann durch Zusatz des oder der fehlenden Reagenzien zum Probengefäß gestartet. Das emittierte Licht kann quantifiziert werden durch eine Standardmeß vorrichtung, wie etwa einer Photomultiplierröhre, deren Signal einem Aufzeichnungsgerät, Oscilloskop oder Skalar, eingegeben und dort angezeigt oder aufgezeichnet wird. Das Licht kann in einigen Fällen auch mit dem bloßen Auge beobachtet oder auf einer photographischen Platte aufgezeichnet werden. Vorzugsweise wird das Licht jedoch in einem Luminometer des in der GB-Patentanmeldung 2025609A beschriebenen Typs quantifiziert.

Die Lumineszenzreaktion gemäß vorliegender Erfindung kann in drei Grundtypen von Immunoassays verwendet werden, die sich in der Art des an den Liganden gebundenen Labels unterscheiden. Die Labels sind:

a) ein Amino oder ein substituiertes Aminoderivat eines 2,3-Dihydro-1,4-phthalzindions, worin die Aminogruppe an den Liganden gebunden ist;
b) ein Peroxidaseenzym, sowie
c) ein anderer Stoff als die unter a) und b) angegebenen, und im allgemeinen ein Enzym, wie Glukoseoxidase, das an der Umsetzung eines Substrats in ein Material, das durch die Lumineszenzreaktion der Erfindung bestimmt werden kann (im allgemeinen Wasserstoffper oxid oder Peroxidase) beteiligt ist.

In den oben genannten Immunoassays ist es möglich, den zu bestimmenden Stoff oder einen Antikörper gegen diesen Stoff zu markieren.

Abhängig von der Art der eingesetzten Markierung (Label) kann der Assay entweder heterogen oder homogen sein. Im ersteren Fall können komplexe Flüssigkeiten, wie etwa Serum analysiert werden, im letzteren Fall kann jedoch ein vorheriger Extraktions- oder Reinigungsschritt not wendig sein.

Typische heterogene und homogene Lumineszenz- oder luminometrische Immunoassays sind im folgenden skizziert:

1. HeterogenerLumineszenz- oder luminometrischer Immuno assay

Bei diesem Typ von Immunoassay wird der zu bestimmende Stoff mit einem Antikörper gegen diesen Stoff zur Reaktion gebracht. Der freie Antikörper wird dann vom gebundenen Antikörper abgetrennt. Die Reaktion wird quantifiziert, in dem man entweder den Antikörper, die zu bestimmende Substanz oder ein anderes Molekül, das mit den freien oder gebundenen Anteilen nach der Trennung reagiert, markiert.

2. Kompetitiver heterogener Lumineszenz-Immunoassay

In diesem Falle wird eine unbekannte Menge der zu be stimmenden Substanz mit einer bekannten Menge dieser Substanz, die an ein Label gekoppelt ist, und einer be kannten, jedoch begrenzten Menge eines Antikörpers ge mischt. Es folgt eine kompetitive Reaktion zwischen der markierten und der unmarkierten Substanz um den Anti körper. Die Komplexe zwischen Antikörper und unmarkiertem Stoff und zwischen Antikörper und markiertem Stoff werden von den freien markierten und unmarkierten Substanz abge trennt.

Die Menge des markierten Stoffes, die an den Antikörper gebunden ist, wird zur zu bestimmenden Menge an un markierter Substanz in der Lösung in Beziehung gesetzt. Diese Mengen können bestimmt werden, in dem man entweder die Menge des an den Antikörper gebundenen Labels oder die verbleibende Menge der freien markierten Substanz bestimmt. Beispiele für diese Art von Assay, worin Peroxidase das Label ist und der Antikörper an einen festen Träger, nämlich die Wände eines Glasreagenzröhr chens, gebunden ist, sind in der GB-Patentanmeldung 2044927A angegeben.

3. "Two-Site" Heterogener luminometrischer Immunoassay

Bei diesem Typ von Immunoassay wird die zu bestimmende Substanz zunächst an einen unmarkierten Antikörper gegen diese Substanz gebunden, der seinerseits an einen festen Träger, wie etwa Plastik, gebunden ist. Der Komplex zwischen Antikörper und dem Stoff wird dann mit einem markierten Antikörper behandelt. Die Analyse des markierten Antikörpers im enthaltenen festen Komplex kann durchgeführt werden, in dem man einen festen Komplex aus der Lösung abtrennt und dann die Menge des Labels bestimmt, das entweder im abgetrennten festen Komplex oder im in der Lösung verbleibenden gelösten markierten Antikörpers vorliegt.

4. Homogener Lumineszenz- oder luminometrischer Immuno assay

Hierunter sind Immunoassays zu verstehen, bei denen das Label ein Amino- oder substituiertes Aminoderivat eines 2,3-Dihydro-1,4-phthalazindions ist. Der Assay basiert darauf, daß das Licht, das von der freien markierten Substanz von Interesse (oder einem Antikörper hiergegen) emittiert wird, eine unterschiedliche Intensität oder Wellenlänge im Vergleich zu dem Licht besitzt, welches von der gebundenen markierten Substanz von Interesse (oder dem Antikörper hiergegen) stammt.

In einem Beispiel wurde etwa gefunden, daß die Inten sität des emittierten Lichtes aus der Reaktion eines Progesteron-Isoluminol-Derivat-Konjugates, eines Häm katalysators und Wasserstoffperoxid eine geringere Intensität besitzt als wenn die gleiche Reaktion in Gegen wart von Antiprogesteron IgG durchgeführt wird.

Infolgedessen wurde im Assay eine unbekannte Progesteron probe zunächst mit einer bekannten Menge eines Anti progesteron IgG inkubiert. Nach Erreichen des Gleichge wichtes wurde eine bekannte Menge eines Progesteron- Isoluminol-Derivat-Konjugates zugesetzt, gefolgt von einer bekannten Menge von Häm und Wasserstoffper oxid. Das emittierte Licht wurde gemessen und die Menge des in der unbekannten Probe vorliegenden Progesterons konnte hieraus aus der Standardkurve bestimmt werden (je mehr Progesteron in der unbekannten Probe vorliegt, um so weniger freies IgG bleibt unter Gleichgewichtsbe dingungen übrig und um so niedriger ist die Lichtausbeute der Lumineszenzreaktion).

Auf diese Weise kann Progesteron bestimmt werden, ohne daß ein Trennschritt erforderlich ist.

In allen den oben ausgeführten Immunoassays kann der Schritt zur Quantifizierung, dem Nachweis oder Lokali sation (im strikten Sinne ist die Lokalisation eine Form des Nachweises) die Lumineszenzreaktion gemäß der vor liegenden Erfindung sein.

Die in den oben ausgeführten Immunoassays eingesetzten Antikörper können im Handel erworben oder nach bekannten immunologischen Verfahren hergestellt werden.

Die Antikörper können in Form eines komplexen Gemisches von Antikörpern vorliegen oder sie können ein oder mehrere monoklonale Antikörper darstellen. Im allgemeinen ist nur ein geringes Volumen von Antikörper erforderlich und dieses wird bei den für seine Aktivität geeigneten Bedingungen für pH, Ionenstärke und Temperatur gehalten.

Antikörper gegen die folgende unvollständige Liste von Stoffen können erfolgreich in Immunoassays unter Ver wendung der Lumineszenzreaktion der vorliegenden Er findung eingesetzt werden: Proteine wie Insulin, Alpha fetoprotein und Ferritin, Hormone wie Wachstumshormon, Parathormon, Follikel stimulierendes Hormon (FSH), Luteinisierendes Hormon (LH), Tyhroidea stimulierendes Hormon (TSH), Adrenocorticotropes Hormon (ACTH), Glukagon, Prolactin und Calcitonin, Haptene und Steroide wie etwa Östradiol, Progesteron und Cortisol, Pharmaka, wie Digoxin, Antigene wie Zelloberflächenantigene und carzino embryonales Antigen sowie Antikörper wie etwa Mumpsvirus antikörper, humanes Immunglobulin G (IgG), Kaninchen IgG, Schaf IgG, Meerschweinchen IgG, Esels IgG und menschliches Immunglobulin E und M.

Die Lumineszenzreaktion gemäß der vorliegenden Erfindung kann auch in anderen Assays als den oben beschriebenen Immunoassays verwendet werden. Hierzu gehören:

1. Elastaseassay basierend auf der Freisetzung von Per oxidase aus einer unlöslichen Peroxidase-Elastin Zubereitung

Bei diesem Assay wird ein festes Elastin-Peroxidase Konjugat mit verschiedenen Mengen des Enzyms Elastase inkubiert. Nach einer vorher festgelegten Zeit wird nicht abreagiertes Konjugat durch Zentrifugieren entfernt und der Überstand wird auf nicht gebundene Peroxidase unter sucht.

Die Menge der im Überstand vorliegenden nicht gebundenen Peroxidase wird zur Elastaseaktivität in der untersuchten Probe in Beziehung gesetzt.

2. Bestimmung von Proteinase, basierend auf der Frei setzung von Isoluminol aus einem synthetischen Peptid substrat

Bei diesem Assay wird ein immobilisiertes synthetisches Peptidsubstrat Affigel 10-Ala-Ala-Ala-Phe-Isoluminol, mit verschiedenen Mengen von Proteinase behandelt. Nach einer vorher festgelegten Reaktionszeit wird nicht ab reagiertes Substrat durch Zentrifugation entfernt und der Überstand wird auf Isoluminol untersucht. Die Menge von Isoluminol im Überstand wird zur Proteinaseaktivität in der untersuchten Probe in Beziehung gesetzt.

3. Glukoseassay, basierend auf coimmobilisierter Glukose oxidase und Peroxidase

Bei diesem Assay werden Glukoseoxidase und Peroxidase auf einem festen Träger, z. B. Sepharose oder Plastikröhrchen, coimmobilisiert. Hierzu wird eine Lösung von Luminol und einem Empfindlichkeitsverstärker zugegeben. Schließlich wird eine Glukoselösung zugesetzt und die Lichtemission aufgezeichnet. Die Lichtemission läßt sich direkt zur Menge der in Lösung vorliegenden Glukose korrelieren.

4. Assay markierter DNA

Bei der mittlerweile wohlbekannten Technik der Markierung von DNA mit Biotin kann ein geeigneter, daran bindender Ligand, wie etwa Avidin oder Streptavidin, mit Peroxidase markiert und die Peroxidase nach der Methode der vor liegenden Erfindung quantifiziert werden.

Die Erfindung ist auch anwendbar auf anders mit Peroxidase markierte DNA, hierzu siehe beispielsweise die PCT-An meldung Nr. 84/03520 (A.D.B. Malcolm et al.).

Der Assay gemäß der vorliegenden Erfindung wird haupt sächlich in der klinischen Chemie und in der ärztlichen Praxis angewandt werden. In solchen Laboratorien oder Praxen erhalt man die Materialien zur Verwendung in einem gegebenen Nachweis für Verfahren üblicherweise in Form eines Assaykits. Zusätzlich zu DPD, aromatischem Amin verstärker und Peroxidase kann der Kit auch ein Oxidations mittel umfassen, in vielen Fällen kann dieses Material jedoch entweder seperat davon geliefert werden oder es stellt die zu bestimmende Substanz dar.

Vorzugsweise werden Peroxidaseenzym, Oxidationsmittel, Empfindlichkeitsverstärker und chemolumineszierendes DPD jeweils eine der oben als bevorzugt zur Verwendung der vorliegenden Erfindung erwähnten Substanzen sein. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des Assaykits gemäß der vorliegenden Erfindung ist mindestens eines der Be standteile, nämlich Peroxidaseenzym und chemolumineszieren des DPD konjugiert, beispielsweise an einen Antikörper gegen die zu bestimmende Substanz.

Gegebenenfalls kann der Assaykit auch eine oder mehrere Standardlösungen enthalten, die jeweils eine bekannte Menge der zu bestimmenden Substanz enthalten, und/oder eine oder mehrere der bevorzugten Pufferlösungen. Praktischerweise kann der Assaykit auch ein Reaktionsge fäß umfassen, das geeignet ist zur Verwendung in Ver bindung mit der Vorrichtung zur Bestimmung des im Verlauf der Durchführung des Assays emittierten Lichtes. Ferner kann auch eine Mischvorrichtung im Assaykit enthalten sein, die zur Sicherstellung einer ausreichenden Ver mischung der Reagenzien verwendet wird.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Materialien und Methoden Reagenzien

Ein Meerrettichperoxidase (HRP) markiertes Kaninchen antihumanes α-Fetoprotein Antikörperkonjugat wurde von Dako Products, Mercia Brocades Ltd., Brocades House, Pyrford Road, West Byfleet, Weybridge, Surrey, UK, be zogen.

Enzymimmunoassaykits zur Bestimmung von carcinoembryonai Antigen (CEA) wurden von Abbott Laboratories Ltd., Diagnostics Division, Basingstoke, UK, bezogen.

Luminol (5-Amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazindion) und Isoluminol (6-Amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazindion) wurden von der Firma Sigma Chemical Co., Poole, Dorset, UK, be zogen. Das Natriumsalz von Luminol wurde hergestellt wie bereits früher beschrieben bei Ham et al., Anal. Lett., 12, S. 535, (1979).

7-Dimethylaminonaphthal in-1,2-dicarbonsäurehydrazid, Formel (2) Z¹ und Z² werden zusammengenommen und stellen eine dimethylaminosubstituierte Benzogruppe dar, Z³ = Z⁴ Wasserstoff, wurde von der Firma Boehringer Mannheim, BRD, bezogen.

N-(6-Aminobutyl)-N-ethylisoluminol wurde von der Firma LKB, Finnland, erhalten.

Alle aromatischen Amine wurden von der Firma Aldrich Chemical Co., USA, bezogen.

Analytische Gerätschaften

Im Fall der Beispiele 1 bis 24 wurden die Chemolumines zenzreaktionen in 10 mm×10 mm messenden 4 ml Einmal- Plastikküvetten (W. Sarstedt Ltd. Leicester, LE3 1UQ, UK) durchgeführt. Das emittierte Licht wurde quantifiziert in einem Luminometer gemäß früherer Beschreibung (Carter et al., GB-Patentanmeldung 2025609A), das eine Modifi kation umfaßte, die es erlaubte, mehrere Cüvetten nach einander exakt reproduzierbar vor der Photokathode der Photomultiplierröhre in Position zu bringen.

Die Ergebnisse wurden auf einem schnellen potentio metrischen Schreiber (des Typs PM 8202 der Firma Philips, Eindhoven, Niederlande, Zeit für den vollen Skalenaus schlag weniger als 0,25 s) aufgezeichnet.

Im Falle des Assays für carcinoembryonales Antigen wurden die Chemolumineszenzreaktion in 55 mm×11 mm messenden durchsichtigen Polystyrolröhrchen mit rundem Boden der Firma LIP (Equipment and Services) Ltd., Shipley, West Yorkshire, UK, durchgeführt. Der automatische Start der Lumineszenzreaktionen und die Messung der Lichtemission wurden unter Verwendung eines Autobiolumat LB 950 Luminometers der Firma Laboratorium Prof. Dr. Berthold, Wildbad, BRD, durchgeführt. Dieses Instrument benutzt Photonenzählung und wird von einem 48K Apple II Computer gesteuert.

Beispiel 1 Lumineszenzassay von Peroxidase unter Ver wendung von Luminol und N,N,N′,N′-Tetramethyl benzidin

Natriumluminol (50 mg) und Wasserstoffperoxyd (62 µl, 30 Gew./Vol.-%) wurden zu 200 ml Trispuffer (0,1 mol/l, pH 8,5) zugesetzt. Diese Lösung wurde etwa 0,5 h vor Verwendung stehen gelassen und vor einfallendem Licht ge schützt. Zu 10 µl Kaninchen-Anti-α-Fetoprotein-HRP-Konju gat in 1 : 1000 Verdünnung in einer Cüvette wurden 0,9 ml des Luminol/H₂O₂ Reagenz zugesetzt. Die resultierende Lichtemission wurde vor dem Zusatz von 20 µl N,N,N′,N′- Tetramethylbenzidin (4,54 mol/l in Demethylsulfoxid) zum Reaktionsgemisch aufgezeichnet. Der verstärkte Lichtaus stoß wurde ähnlich aufgezeichnet und die Verbesserung des Signals wurde bestimmt. Die obige Prozedur wurde wiederholt, wobei das Kaninchen-Anti-α-Fetcprotein-HRP- Konjugat weggelassen wurde, um den Effekt von N,N,N′,N′- Tetramethylbenzidin auf den Hintergrund der Reaktion zu bestimmen. Die Verbesserung im Signal und im Signal/ Hintergrundverhältnis wurden gemessen und sind in Tabelle 3 angegeben. Die Verbesserung des Signals wird als der signifikantere Parameter angesehen.

Beispiele 2 bis 20

Das Vorgehen von Beispiel 1 wurde wiederholt, jedoch mit der Ausnahme daß N,N,N′,N′-Tetramethylbenzidin durch andere aromatische Amine ersetzt wurde. Die Verbesserung im Signal/Hintergrundverhältnis wurde bestimmt und ist in Tabelle 3 angegeben.

Vergleichsbeispiel

Das Vorgehen von Beispiel 1 wurde wiederholt, jedoch mit der Ausnahme, daß kein Empfindlichkeitsverstärker zu dem Lumineszenz-Reaktionsgemisch zugesetzt wurde. Die Er gebnisse sind in Tabelle 3 aufgeführt. Die Buchstaben in der linken Spalte setzen die Verbindungen in Beziehung zu den Symbolen R in der obigen Formel (1).

Tabelle 3

Verbesserung des Signal/Rauschverhältnisses durch ver schiedene aromatische Amine

Beispiel 21

Stammlösungen von Isoluminol (24 mg) in 100 ml Trispuffer (0,1 mol/l, pH 8,5) und Wasserstoffperoxid (450 µl, 30 Gew.-Vol.-%) in 100 ml Trispuffer (0,1 mol/l, pH 8,5) wurden hergestellt. Die folgenden Reagenzien wurden in eine Cüvette gegeben: 50 µl der Isoluminol-Stammlösung, 50 µl Wasserstoffperoxid-Stammlösung, 10 µl Kaninchen- Anti-α-Fetoprotein-HRP-Konjugat (Verdünnung 1 : 1000) und 10 µl N,N,N′,N′′-Tetramethylbenzidin (TMB) oder 4-Benzyl oxanilin (4,54 mmol/l) in Dimethylsulfoxid). Die Reagenzien wurden gemischt und die Reaktion durch Zusatz von 0,9 ml Trispuffer (0,1 mol/l, pH 8,5) gestartet. Die folgende Lichtemission wurde gemessen. In einem Kontrollexperiment wurde die obige Prozedur wiederholt, jedoch mit der Aus nahme, daß 10 µl DMSO das Amin ersetzten. Eine beträcht liche Verstärkung des Signals der TMB- oder 4-Benzylox anilin verstärkten Reaktion gegenüber der Kontrolle wurde festgestellt.

Beispiel 22

Das Vorgehen von Beispiel 21 wurde wiederholt, jedoch mit der Ausnahme daß Isoluminol durch N-(6-Aminobutyl)-N-ethyl isoluminol ersetzt wurde.

Beispiel 23

Das Vorgehen von Beispiel 21 wurde wiederholt, jedoch mit der Ausnahme, daß Isoluminol durch 7-Dimethylamino naphthalen-1,2-dicarbonsäurehydrazid(9-dimethylamino- 2,3-dihydrobenzo(f)-phthalazin-1,4-dion) ersetzt wurde.

Beispiel 24

Das Vorgehen von Beispiel 21 wurde wiederholt, jedoch mit der Ausnahme daß Wasserstoffperoxid durch Natriumperborat und Isoluminol durch Luminol ersetzt wurden.

In jedem der Beispiele 22 bis 24 wurde die Verstärkung der Lichtemission aufgrund des Zusatzes von TMB oder 4-Benzyl oxanilin festgehalten.

Beispiel 25 Bestimmung von carcinoeebryonalem Antigen (CEA)

Die Bestimmungen wurden gemäß der Beschreibungen in den Herstellerinformationen durchgeführt. Standards (200 µl), hergestellt in Natriumacetatpuffer (0,2 mol/l, pH 5,0, enthaltend 0,01% Thiomersal-Konservierungsmittel) wurden in die Vertiefungen einer Kunststoffreaktionsplatte ge geben. Eine Plastikperle, die mit Meerschweinchen-Anti- CEA-Antikörper beschichtet war, wurde in destilliertem Wasser gespült und jeweils in eine Vertiefung gegeben. Die Platte wurde zur Entfernung etwaiger Gasbläschen an der Oberfläche der Perle kurz gerüttelt und 2 h in einem Wasserbad bei 45°C inkubiert. Die Proben wurden dann ab gesaugt und jede Probe wurde mit destilliertem Wasser (5×2 ml) gewaschen. Ziegen-anti-human-CEA-HRP- Konjugat (200 µl, ca. 0,05 µg/ml in Trispuffer, ent haltend Proteinstabilisator und 0,01% Thiomersal) wurde jeder Kugel zugesetzt und dann wurde die Platte behandelt wie oben beschrieben und weitere 2 h bei 45°C inkubiert. Nach Absaugen der jeweiligen Lösung wurden die Kugeln mit destilliertem Wasser (5×2 ml) gewaschen, in 55 mm× 11 mm messende Polystyrolröhrchen überführt und dann nochmals gewaschen (2×4 ml). Gebundenes HRP-Konjugat wurde dann quantifiziert, wobei die Bestimmungsmethode gemäß der vorliegenden Erfindung mit TMB als Verstärker verwendet wurde.

Jedem Röhrchen wurden 0,5 ml Trispuffer (0,05 mol/l, pH 8,0) zugesetzt. Die Lumineszenzreaktion wurde dann automatisch im Autobiolumat Luminometer durch Injizieren von 0,5 ml einer Luminol/Wasserstoffperoxyd/TMB-Lösung gestartet. Diese Lösung wurde vorher hergestellt, in dem man 1 ml TMB-Lösung (0,5 mg/ml in DMSO) zu 100 ml eines Gemisches von Luminol (2,4 mmol/l), Wasserstoffperoxid (5,4 mmol/l) in Trispuffer (0,05 mol/l, pH 8,0) zugab.

Beim Start der Lumineszenzreaktion wurde die Lichtemission zwischen 0 und 180 s (nach dem Start) integriert und automatisch für jede Kugel aufgezeichnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 aufgeführt.

Beispiel 26

Die Assays nach Beispiel 25 wurden wiederholt, jedoch mit der Ausnahme, daß die TMB-Lösung eine Konzentration von 2,5 mg/ml hatte. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 aufge führt.

Beispiel 27

Die Assays des Beispiels 25 wurden wiederholt, jedoch mit der Ausnahme, daß die TMB-Lösung eine Konzentration von 5,0 mg/ml hatte. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 aufge führt.

Beispiel 28 (Vergleichsbeispiel)

Die Assays des Beispiels 25 wurden wiederholt, jedoch ohne Zusatz von TMB-Lösung. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 4 aufgeführt.

Tabelle 4

CEA-Assays - Anzahl Photonen für verschiedene CEA-Konzen trationen

Claims

1. Lumineszenz- oder luminometrischer Assay mittels Durchführung einer chemilumineszenten Reaktion zwischen einem Peroxydaseenzym, einem Oxidationsmittel, einem chemilumines zierenden 2,3-Dihydro-1,4-phthalazindion und Messung oder Nach weis der dabei erzeugten Chemilumineszenz, dadurch ge kennzeichnet, daß die Reaktion in Gegenwart eines aromatischen Amins der folgenden allgemeinen Formel durchge führt wird worin die Symbole R (d. h. R, R¹, R², R³, R⁴, R⁵ und R⁶) irgendeine der nachfolgend angegebenen Bedeutungen (a) bis (j) haben und alle anderen Symbole R in jeder Be deutung Wasserstoffatome sind und die kondensierten Ringe im gleichen Konfigurationssinn zu lesen sind, wie Formel 1:

(a) R = R¹ = CH₃;
(b) Cyclohexyl oder Alkyl oder Alkoxy mit 1 bis 4 Kohlen stoffatomen,
c) R², R³ und R⁴ zusammen können das folgende mehr kernige kondensierte Ringsystem bedeuten:
d) R³ und R⁴ zusammen können den folgenden konden sierten Ring oder das kondensierte Ringsystem be deuten:
e) R³ und R⁴ zusammen können das folgende kondensierte Ringsystem bedeuten: und R⁵ und R⁶ zusammen bedeuten den kondensierten Ring
f) R² = NH₂ und
g) R² = R⁶ = CH₃
h) R³ = C₂H₅
i) R² = R⁴ = CH₃ und
j) R³ = R⁴ = CH₃.

2. Assay nach Anspruch 1, dadurch gekenn zeichnet, daß das chemilumineszierende 2,3-Di hydro-1,4-phthalazindion folgende allgemeine Formel 2 hat: worin Z¹ Amino oder substituiertes Amino und jeder der Reste Z², Z³ und Z⁴ Wasserstoff, gegebenenfalls substituiertes C₁-C₆ Alkyl, gegebenenfalls substituiertes C₁-C₆ Alkenyl, Hydroxyl, C₁-C₆ Alkoxyl, Carboxyl, Amino oder substituiertes Amino bedeutet oder Z² Amino oder substituiertes Amino bedeutet und jeder der Reste Z¹, Z³ und Z⁴ Wasserstoff, gegebenenfalls substituiertes C₁-C₆ Alkyl, gegebenenfalls substituiertes C₁-C₆ Alkenyl, Hydroxyl, C₁-C₆ Alkoxyl, Carboxyl, Amino oder substituier tes Amino bedeutet, oder Z¹ und Z² bedeuten zusammen ein Amino- oder substituiertes Aminoderivat einer Benzogruppe und jeder der Reste Z³ und Z⁴ bedeutet Wasserstoff, ge gebenenfalls substituiertes C₁-C₆ Alkyl, gegebenenfalls substituiertes C₁-C₆ Alkenyl, Hydroxyl, C₁-C₆ Alkoxyl, Carboxyl, Amino oder substitutiertes Amino.

3. Assay nach Anspruch 2, dadurch gekenn zeichnet, daß das chemilumineszierende 2,3-Di hydro-1,4-phthalazindion Luminol oder Isoluminol ist.

4. Assay nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekenn zeichnet, daß das Peroxydaseenzym Meerrettichper oxidase ist.

5. Assay nach Anspruch 1, 2, 3 oder 4, dadurch ge kennzeichnet, daß, die Peroxidase in einer zu analysierenden Substanz in einer freien oder konju gierten Form vorliegt und ihr Vorliegen oder ihre Menge vom Nachweis bzw. der Messung der Chemilumineszenz abge leitet wird.

6. Assay nach einem der vorhergehenden Ansprüche, da durch gekennzeichnet, daß das aromatische Amin N,N,N′,N′-Tetramethylbenzidin, 4-Benzyloxyanilin, 3-Aminofluoranthren oder 4-Methoxyanilin ist.

7. Kit zur Verwendung im Assay nach Anspruch 1, ent haltend:

- ein chemilumineszierendes 2,3-Dihydro-1,4-phthalazin dion,
- ein Peroxidasenzym und
- ein aromatisches Enzym nach Anspruch 1.

8. Kit nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das chemilumineszierende 2,3-Dihydro-1,4-phthalazindion ein solches gemäß Anspruch 2 ist.

9. Kit nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekenn zeichnet, daß das aromatische Amin ein solches ge mäß Anspruch 6 ist.