JPH07114709B2 - 酵素活性の定量法 - Google Patents

酵素活性の定量法

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JPH07114709B2
JPH07114709B2 JP62286559A JP28655987A JPH07114709B2 JP H07114709 B2 JPH07114709 B2 JP H07114709B2 JP 62286559 A JP62286559 A JP 62286559A JP 28655987 A JP28655987 A JP 28655987A JP H07114709 B2 JPH07114709 B2 JP H07114709B2
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Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、酵素活性の定量法に関する。
腎障害の指標となるγ−グルタミルトランスペプチダー
ゼ（γ−GTP）、ロイシンアミノペプチダーゼ（LAP）あ
るいはアラニンアミノペプチダーゼ（AAP）等の定量に
おいて特定の基質をこれらを分解する酵素の作用によっ
て分解しエンハンサーを生成するように基質を選択する
ことによって微量の酵素を定量できる。
従来の技術 γ−GTP、LAPあるいはAAPの定量は例えばこれらの酵素
の含有する試料にその基質を加え、必要に応じて分析可
能な物質に誘導するのに必要な酵素を加えて生成する測
定可能な化合物の生成速度を測定することによって行わ
れている。
例えばγ−GTP、LAPによってこれらの酵素の適当な基質
を分解させてアニリン誘導体を生成させ、これと色原体
とを反応させて色素を生成させこの色素の生成速度を定
量することによって行われている。酵素量が少ないとき
はできるだけ分子吸収係数の大きい色素を生成する色原
体が用いられるがこれには限界がある。
問題点を解決するための手段 本発明によれば、試料中の酵素活性の測定において、 （ｉ）活性を測定する酵素と該酵素の基質とを作用させ
て、酸化されて発色する色原体の酸化反応の反応速度を
増大させる化合物（以下、エンハンサーという）を生成
させ、 （ii）生成したエンハンサー、酸素および酸化酵素の存
在下、該色原体を酸化反応に付し、 （iii）該反応進行中の一定時間後における生成色素量
を測定する、 ことを特徴とする酵素活性の定量法を提供できる。
本発明の原理はエンハンサーの量と色素の生成速度が比
例していることに基づいている。すなわち、酸化酵素の
作用によって色原体が酸化され時間に比例して色素が生
成し、エンハンサーが存在すると色素の生成速度が増幅
される。又エンハンサーの量を変えたときの一定時間後
の色素の生成量はエンハンサーの量に比例していること
に基づいている。
本発明を実施するに際してはエンハンサーを生成するあ
るいは含有する試料に色原体及び酸化酵素を加え要すれ
ば緩衝液中で反応させる。反応は用いられる酵素の至適
条件通常20〜40℃、pH5〜９で行われる。
本発明で用いられる緩衝剤としてはグッドバッファー，
リン酸塩，ホウ酸塩，酢酸塩，トリス塩酸塩等が例示さ
れる。
反応に際し各試薬は緩衝剤10mM〜1M、酸化酵素0.001〜1
0000U/ml、色原体0.01〜10mg/の濃度で用いられる。
生成した色素の定量は公知のいずれの手法も適用できる
が簡便には色素の極大吸収波長の光による反応液の吸収
を測定することによって行われる。
本発明におけるエンハンサーは色原体を酸化する反応の
反応速度を増加させる化合物であればいずれでもよい。
かかる化合物の具体例として一般式（Ｉ） 〔式中R1〜R4は同一もしくは異なってよく水素、ハロゲ
ン、アルキル、スルホン又はヒドロキシルを示しR5はヒ
ドロキシル、アミノ又は置換アミノを示し、該置換基は
アルキル、スルホアルキル、ヒドロキシアルキルを示
す〕で表されるアニリン誘導体があげられる。
具体的化合物として3,5−ジブロモ−４−ヒドロキシア
ニリン（DBHA）、3,5−ジクロロ−４−ヒドロキシアニ
リン（DCHA）、ｐ−N,N−ジスルフォプロピルアミノア
ニリン（SPA）、3,5−ジヨード−４−ヒドロキシアニリ
ン（DIHA）、3,3−ジアミノスチルベン−4,4′−ジスル
フォン酸（DSDA）、ｐ−フェニレンジアミン（PPD）、
４−アミノアニリン−３−スルフォン酸（DAS）、２−
メチル−3,5−ジブロモ−４−ヒドロキシアニリン（DMB
HA）、2,6−ジメチル−3,5−ジクロロ−４−ヒドロキシ
アニリン（DMDBHA）、４−N,N−ジスルフォプロピルア
ミノ−3,5−ジブロモアニリン（SDBA）、４−（Ｎ−エ
チル−Ｎ−ヒドロキシエチルアミノ）−3,5−ジブロモ
アニリン（EHDBA）、４−N,N−ジェチルアミノ−3,4−
ジヒドロキシアニリン（DEDHA）、N,N−ジスルフォプロ
ピルアニリン（DSPA）などがあげられる。
本発明のエンハンサーは、色原体の酸化反応の反応速度
を増大させる化合物であれば、酵素賦活剤または補酵素
などであってもよい。
本発明で用いられる酸化酵素としては酵素の存在下色原
体を酸化して色素を生成させる酵素はいずれも使用で
き、ビリルビンオキシダーゼ（BLOD、EC1、３、３、
５）、モノフェノール・オキシゲナーゼ（MPO、EC1、1
4、18、１）、アスコルビン酸オキシダーゼ（AOD、EC
1、10、３、３、）、カテコールオキシダーゼ（EC1、1
0、３、１）、ラッカーゼ（EC1、10、３、２）、Ｏ−ア
ミノフェノールオキシダーゼ（EC1、10、３、４）、３
−ヒドロキシアンスラニレイトオキシダーゼ（EC1、1
0、３、５）、フェノールモノオキシゲナーゼ（EC1、1
4、13、７）などがあげられる。
色原体としては、酸化されて発色するものは何れも使用
できる。高感度を目視す目的に使用するには、分子吸光
係数の高いものが好ましい。しかしエンハンサーの非存
在下の反応において発色（試薬盲検に相当）は少ない
が、エンハンサーの存在により著しく強い発色を示す化
合物が好ましく、例えば次の化合物があげられる。
これらの化合物の吸収極大値が表に示される。
本発明のエンハンサーの定量法は微量の酵素の定量に適
用することによって優れた効果を奏する。
即ち、微量の酵素を含有する試料にその酵素の基質を加
え反応させてエンハンサーを生成させ、このエンハンサ
ーを本発明方法によって定量すれば酵素活性を定量でき
る。
試料中の酵素が微量でエンハンサーの生成速度は小さく
ても徐々にエンハンサーが蓄積し、エンハンサーの増加
に伴って色素の生成速度が徐々に加速されエンハンサー
の量に対応して色素が生成する。この色素の生成速度を
測定すればエンハンサーの生成速度が定量できるので試
料中の酵素活性も定量できる。
酵素活性と色素による反応液の吸光度は比例関係にある
ので検量線は酵素活性と吸光度の関係を求めておけば便
利である。
この方法で酵素活性を定量するに際しては酵素反応を行
わせたときにエンハンサーを定量的に生成する基質が用
いられる。酵素の基質としてエンハンサーを生成するよ
うな基質が知られていないときには公知の酵素の基質に
エンハンサーを結合した基質を調製し、これを用いれば
よい。例えばDBHA、DCHA等のエンハンサーはヒドロキシ
ル基を有するので適当なアミノ酸あるいはペプタイドを
介してエンハンサーと公知の基質を結合させた化合物を
当業者は容易に製造できる。
酵素と基質の組合せが例示される。
酵素活性の定量を実施するに際して、緩衝剤，酸化酵
素，色原体は前述の濃度で用いられ基質は0.1〜100mg/m
l、界面活性剤は１〜10mg/mlの濃度で用いられる。
本発明によれば酸化酵素及び化合物（Ｉ）からなるエン
ハンサー定量用組成物が提供される。この組成物に緩衝
剤，測定すべき酵素の基質，界面活性剤等が加えられる
ことができる。これらの組成物における各成分は前述の
濃度の比が適用される。
本発明によれば測定に必要な試薬液をろ紙ポリマー等適
当な試薬液吸収材料に含ませ乾燥させたシート，フイル
ム，ステック等は診断に便利で有用である。吸収材料に
は測定に必要な成分を前述の濃度比で含ませ乾燥し、発
色用組成物を調製する。酵素活性の測定に際して、発色
用組成物に試料、該酵素を含まないように調製された標
準液（以下、ブランクという）および該酵素を既知量含
むように調製された標準液（以下、色見本という）をそ
れぞれ加えて、同様の方法で反応させる。反応終了後、
ブランクおよび色見本をそれぞれ添加することによって
得られる発色の強度に基づいて作成される検量線と、試
料を添加することによって得られる発色の強度とから該
酵素の活性を測定することができる。
以下に本発明の態様を実施例によって説明する。
実施例１ DIPSO（グッド緩衝液）（pH7.5） 0.1 M デイスパノールＭ−32A ５ mg/ml 化合物Ｐ−１ 0.2 mg/ml BLOD 0.02 U/ml Gly−Gly ３ mg/ml MgCl2 １ mg/ml γ−グルタミル−DBHA（Ｇ−DBHA） ２ mg/ml 上記試薬液3.0mlに2.5,5,7.5及び10mU/mlのγ−GTP液を
0.02mlを加えて37℃で30分反応させ生成する色素による
630nmにおける吸光度の変化を測定した。
この反応は下記で示される。
反応液中のDBHAは徐々に増加し、増加に伴って色素の生
成速度は増加する。色素の生成を測定することにより反
応液中のγ−GTPの活性を知ることができる。
一方比較としてＰ−１の代わりに色原体としてＮ−エチ
ル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ′−サクシニル・
エチレンジアミン（EMSE）を1.5mg/ml,BLODを0.4U/ml用
いる他は上記試薬と同一組成の試薬を用いて同様の実験
を行い反応液の710nmにおける吸光度を測定した。この
反応は下記で示される。
この反応では、反応速度は増加しないので色素の生成が
非常に遅い。
γ−GTPの濃度と吸光度の関係は上記実験結果から比例
関係にあることが下記に示される。
実施例２ 試薬液Ａ DIPSO緩衝液（pH7.5） 0.1M デイスパノールＭ−32A ５ mg/ml 化合物Ｐ−２ 0.2mg/ml AOD 50 U/ml MgCl2 １ mg/ml LL−DSPA ２ mg/ml 3.0mlの試薬液Ａに20mU/mlのLAP含有液0.02mlを加えて3
0分間反応させ、反応液の吸光度を630nmで測定した。又
同様にＰ−２の代わりにEMSEを使用し同様に操作し745n
mの吸光度を測定した系と比較して5.2倍の感度が得られ
た。
実施例３ 試薬液Ａ リン酸緩衝液（pH7.2） 0.1M トリトンＸ−100 ５ mg/ml 化合物Ｐ−１ １ mg/ml AOD 200 U/ml Ｇ−DBHA 10 mg/ml Gly/Gly 20 mg/ml 試薬液Ａに厚さ0.21mmのワットマンNo.41のろ紙を浸し
た後真空乾燥器中で乾燥して試験紙を作成した。
試薬液Ｂ 化合物Ｐ−１の代わりにEMSE（4mg/ml）の及びAODの量
を500U/mlにする以外は試薬液Ａと同じ組成である。こ
れを上記と同様にして試験紙を作成した。
γ−GDPを0,0.1,0.2,0.5,1.0,2.0,5.0,10,20,50mU/ml含
有する水溶液を用意し、この液を100μをそれぞれ試
験紙A,Bの上に滴下してどの濃度のγ−GTPまで検出が可
能なのかを調べた。反応時間が20分ではＢについては5.
0mU/mlまでであったがＡについては0.1mU/mlまで可能で
あり、３分間の反応ではＢが50mU/mlまで、Ａは1mU/ml
まで調べることができた。また、健常人の尿および腎疾
患患者の尿を滴下したところ、試験紙Ｂでは20分でその
違いが認められたが、試験紙Ａでは５分で判断できた。
実施例４ 実施例３のAODの代わりに表に示す酸化酵素を用いる他
は実施例３の方法を繰り返して表に示す結果を得た。
実施例５ 下記物質測定のためにＧ−DBHAの代わりに下表の基質を
用いる他は実施例１の方法を繰り返して行った。
実施例６ LSPAの代わりに表に示す基質を用いる他は実施例２を繰
り返して表に示す酵素活性を測定した。
実施例７ 実施例２のDSPAの代わりに、DIHA,DSDA,PPD,DAS,MDBHA,
DMDBHA,SDBA,EHDBA,DEDHAをそれぞれ使用して実施例２
の実験を行った。ＢとＡの感度比はそれぞれ46.1、3.4,
6.8,4.4,16.6,20.8,5.0,11.4,8.9となった。
発明の効果 本発明によれば、試料中に微量ふくまれるγ−GTP,LAP
などの酵素を容易に短時間に測定することができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｑ 1/48 Ａ 6807−4Ｂ 1/56 6807−4Ｂ

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】試料中の酵素活性の測定において、 （ｉ）活性を測定する酵素と該酵素の基質とを作用させ
    て、酸化されて発色する色原体の酸化反応の反応速度を
    増大させる化合物（以下、エンハンサーという）を生成
    させ、 （ii）生成したエンハンサー、酸素および酸化酵素の存
    在下、該色原体を酸化反応に付し、 （iii）該反応進行中の一定時間後における生成色素量
    を測定する、 ことを特徴とする酵素活性の定量法。
JP62286559A 1987-11-13 1987-11-13 酵素活性の定量法 Expired - Lifetime JPH07114709B2 (ja)

Priority Applications (5)

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JP62286559A JPH07114709B2 (ja) 1987-11-13 1987-11-13 酵素活性の定量法
CA000582644A CA1324065C (en) 1987-11-13 1988-11-09 Method and test composition for determination of enzyme activity
EP88310736A EP0317243B1 (en) 1987-11-13 1988-11-14 Method and test composition for determination of enzyme activity
US07/270,676 US5196312A (en) 1987-11-13 1988-11-14 Method and test composition for determination of enzyme activity
DE3851304T DE3851304T2 (de) 1987-11-13 1988-11-14 Verfahren und Testzusammensetzung zur Bestimmung von Enzym-Aktivität.

Applications Claiming Priority (1)

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JP62286559A JPH07114709B2 (ja) 1987-11-13 1987-11-13 酵素活性の定量法

Publications (2)

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