JPS6359466B2 - - Google Patents
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Description
本発明は、一般的に診断試験の分野に関するも
のであり、特に尿又は血液のような体液中のコレ
ステロールの定性的及び定量的測定に有用な試験
に関する。更に詳しくは、本発明は、コレステロ
ールが過酸化物のような酸化性物質に転換される
ことを特徴とする試験に関する。 フエノールと４―アミノフエナゾン（別名４―
アミノアンチピリン）との酸化カツプリング反応
により赤色キノンイミン染料が生成することは古
くより知られており、エマーソンによりJ.Org.
Chem.8：417（1943）に記載されている。 この反応が臨床化学において人気を獲得したの
は下記反応式に基づくグルコースの酵素による測
定法にトラインダーが適用して以来である。 〔Ann.Clin.Biochem.，６：24（1969）〕： グルコース＋O2グルコースオキシダーゼ ――――――――――――――→ グルコ
ン酸＋H2O22H2O2＋フエノール＋４―アミノフ
エナゾンペルオキシダーゼ ――――――――――→ キノンイミン染料＋
4H2O エマーソン―トラインダー系と呼ばれるこのフ
エノール（置換フエノールも含む）＋４―アミノ
フエナゾン＋ペルオキシダーゼよりなる色素生成
系は、現在ではグルコースのみならず、血清、血
漿、その他の生体液中のコレステロール及び尿酸
の定量にも用いられている。この系をグルコース
の測定に用いた例としては、米国特許第3886045
号（メイアツチニ；現在Re29498号として再発行
特許になつている）が挙げられる。 この反応の一般機構は次の通りである： １ 被検物質＋O2特異的オキシダーゼ ―――――――――――→ 酸化被分
析物質＋H2O2 ２ エマーソン―トラインダー反応では多種のフエ
ノール類が使用可能である。臨床化学において最
も汎用されているものを例示すると、フエノー
ル、ｐ―ヒドロキシベンゾエート、２，４―ジク
ロロフエノール、３，５―ジクロロ―２―ヒドロ
キシベンゼンスルホン酸等がある。同様に、各種
の置換及び未置換のナフトール類を用いることも
できる。 測定可能な試料成分としては、特異的オキシダ
ーゼにより酸化されると同時に過酸化水素を生成
することのできるグルコース、コレステロール、
尿酸或はその他の代謝物質等が挙げられる。用い
られるオキシダーゼは、グルコースを測定する場
合にはグルコースオキシダーゼ、コレステロール
を測定する場合にはコレステロールオキシダーゼ
（コレステロールエステルヒドロラーゼを添加し
てエステル化コレステロールを加水分解すること
もできる）、尿酸測定の場合にはウリカーゼであ
る。 形成される色素の量は過酸化水素濃度、すなわ
ち試料中の成分濃度に比例する。従つて、試料中
の成分濃度は反応溶液の吸光度を単に測定し、そ
の測定値を被測定成分の標準溶液と比較対照する
ことによつて得ることができる。 形成される色素は可視領域において、通常500
〜550ナノメートル（nm）（用いられるフエノー
ルによつて異る）で測定することができるので、
色度計又は可視光光度計を用いるだけでよい。 このエマーソン―トラインダー色素形成系の主
たる欠点は、酸化カツプリング反応が還元性化合
物及びビリルビンによつて影響を受けることであ
る。ビリルビンは、通常、血清中に１mg／dl以下
の濃度で存在する代謝物質であるが、病気によつ
ては極めて高レベル迄（20mg／dl以上）到達する
こともある。正常濃度を越えるビリルビンレベル
により反応の色が減少し、酵素によるグルコー
ス、コレステロール及び尿酸の試験が影響を受け
る。すなわち、ビリルビンレベルの増大と共に妨
害が増大する。 還元性化合物（例、アスコルビン酸）による妨
害の説明は極めて明らかである。つまり、これら
は主にペルオキシダーゼを触媒とする過酸化水素
との反応において色原体の競争相手として、或は
又形成された色素の漂白剤として作用する。しか
しながら、還元性物質の妨害は少くとも血清にお
いては、滅多にアスコルビン酸濃度が３mg／mlを
越えることはないので実際上問題とならない。 これに対して、ビリルビンによる妨害はエマー
ソン―トラインダー色素形成系により血清中の代
謝物質を測定する上で相当量大な問題であり、ビ
リルビン過剰試料が頻繁にみられる日常の実験室
業務に際して大きな欠点となる。 ビリルビンの反応機構は極めて複雑であり、未
だ充分には理解されるには至つていない。これま
でにある、この問題への対策として最良のものは
ヴイツテ〔Clin.Chem.24：1778（1978）〕による
ものであり、ヴイツテはビリルビンの妨害を次に
挙げる要因の一つ又はそれ以上によるものとして
いる：すなわち、単なる光学的な効果、ペルオキ
シダーゼ基質の代替物としての作用又はペルオキ
シダーゼ反応中間体の分解である。 従つて、本発明の目的は、液体試料中のコレス
テロールを検出するための改良された試験方法を
提供することである。 更に、本発明の目的は、ビリルビンの妨害効果
に対して高度な抵抗を有する、コレステロール検
出のための改良された試験方法を提供することで
ある。 その他の目的及び本発明についてのより充分な
理解は、以下の好ましい実施態様に関する説明よ
り得られるであろう。 本発明の一部として、ビリルビンが置換又は未
置換のフエノール及び４―アミノフエナゾンを有
するタイプの色素形成試験を強く妨害する機構は
主として次の二つの異種の機構によるものである
ことが判明した。すなわち、(1)反応で形成された
色素のスペクトルに重なり合うことにより正の妨
害を行うこと、及び(2)前記の如き化学的機構によ
り負の妨害を行うことである。第１の機構により
負の妨害を行うことである。第１の機構により起
る正の防害は520nm以上の波長の吸光度を読み取
ることによつて減少させることができる。しかる
に、第２の機構に対してはかかる手だてはない。
それは極めて重要な役割を果し、試料中にビリル
ビンが異常濃度で存在する場合には上記試験にお
いて不正確な結果をもたらすことになる。 従来の組成物とは対照的に、本発明の組成物は
体液中のコレステロールの存在に対して感度が高
い一方、ビリルビン妨害に対しては実質的に抵抗
を有する。 このような驚くべき結果が本発明により達成さ
れるのは、液状試料中に含まれるコレステロール
測定用組成物であつて、該試料中のコレステロー
ルの存在に感応性を示す試薬手段、フエノール又
はナフトール及び４―アミノフエナゾンを含んで
なる組成物において、該試薬手段にフエロシアン
化物イオンを含有せしめることによつてビリルビ
ンの妨害に対する抵抗を与えることによるもので
ある。 以下の説明において、簡明を期するために特定
の用語が用いられるが、これらの用語は例示の目
的で選ばれた特別の実施態様を指すためにのみ用
いられるものであり、本発明の範囲を限定する趣
旨のものではない。 本発明の組成物は多くの物理的形状をとり得る
ものであり、４―アミノフエナゾン呈色組成物に
有用であることが公知であるフエノール（置換及
び未置換のフエノール類を含む）と、フエロシア
ン化物イオンを含む試薬とを組み合わせて含むも
のである。これ等は、安定剤その他の通常の添加
剤と共に必要により用いることができ、以下にそ
の両者について説明を行う。 フエロシアン化物イオンを含む好ましい試薬と
しては、フエロシアン化ナトリウム又はカリウム
のようなアルカリ金属塩、並びにFe（CN）-4 6イオ
ンを含有又は放出することのできるその他の塩又
は系等のその他のフエロシアン化物源が挙げられ
る。 本発明において、組成物中にはこの試薬と共に
液体試料中のコレステロールに感応して酸化性物
質を作り出す手段（試薬）も含まれる。かかるコ
レステロール感応性手段は、コレステロールオキ
シダーゼ及びペルオキシダーゼ等を含むものであ
る。コレステロール感応性手段において有用な試
薬に濃度及び種類は、公知のものを用いることが
できる。 この試験はコレステロール測定に際して溶液と
して用いることができる。溶液調製に用いること
のできる溶媒としては、水、生理溶液、有機溶
媒、例えば、メタノール又はこれらの混合物等が
挙げられる。 本発明の組成物は、尿、髄液、組織培養上清液
及び、好ましくは血清、血漿、又は全血液等に直
接添加することにより被検物質の測定を行うこと
が好ましい。 この組成物を溶液形態で用いる場合には、フエ
ロシアン化物イオンを含む試薬は、約1.0マイク
ロモル／リツトル（μmol／）乃至飽和溶液の
範囲の濃度で用いることが好ましい。更に好まし
い濃度範囲は約5μmol／乃至約50μmol／で
ある。コレステロールオキシダーゼの濃度は好ま
しくは約10I.U.／乃至200I.U.／である。コレ
ステロールエステルヒドラーゼを用いて総コレス
テロールを測定する場合には、その濃度は好まし
くは約10I.U.／乃至200I.U.／である。また、
ペルオキシダーゼの濃度は好ましくは約10I.U.／
乃至200I.U.／である。 酵素力価は国際単位（I.U.）で表わされ、1I.U.
は特定のPH及び温度条件において毎分1μmolの基
質の転換に触媒作用を及ぼすに必要な酵素活性の
量である。実施例で用いられる西洋わさびペルオ
キシダーゼ、及びコレステロールオキシダーゼは
マイルス・ラボラトリーズ社（インジアナ州、エ
ルクハルト）の研究製品部より得られたものであ
る。 本発明は更に本発明の組成物を組み込んでなる
試験具及びマトリツクスのような担体に組成物を
組み込むことを特徴とするかゝる具の製造方法を
提供する。かゝる組み込みを本発明の組成の溶液
を担体に含浸させて行う場合には、このように含
浸させた担体を次いで乾燥する。含浸法の他に
も、本発明の試験具は、その他の適当な技術、例
えば組成物を基体又はマトリツクス上に印刷又は
散布することにより作成することもできる。更
に、本発明の組成物はプレス成形又はモールド成
形された通常の担体材料を含有する錠剤の形をと
つて担体内に入れることもできる。 本発明で担体というのは、生理液その他の液に
触れた場合に、これらの液中で不溶性であり、そ
の構造的一体性を保持することのできる材質を意
味する。使用に好適なマトリツクスとしては紙、
セルロース、木材、合成樹脂フリース、ガラス繊
維、不織布及び織布、ゼラチン、ポリプロピレン
のような各種有機重合体、その他フイルム形成性
材料として当業者に周知の有機材料等が挙げられ
る。更に、使用上の便宜のために、担体又は試験
具に例えばポリスチレン製の不溶性支持体又は把
手を取り付けることもできる。 試験組成物を血液中のコレステロールの検出に
用いる場合には、含浸された担体マトリツクスの
表面をエチルセルロースその他の半透性透明被覆
フイルムでおおうのが有利である。これは、例え
ば、エチルセルロースのベンゼン溶液の層を含浸
された担体マトリツクス表面に設け、次いで溶媒
を蒸発乾燥させることによつて行うことができ
る。 処理担体マトリツクス形状の呈色剤又は試験具
は使用前に相当長期間貯蔵されることが多いの
で、選ばれる試薬としては空気中で自動酸化を受
けないものがよい。又、試験具は光照射から保護
するのがよく、これらを撥水性の包装内に封入し
て保存し、使用直前にこれを開いて、１つもしく
は１つ以上の試験具を取り出すようにしておくの
がよい場合もある。 又、必要に応じて、担体マトリツクスを特別の
色例えば黄色の背景色素で処理しておき、試験反
応で形成された色が背景色と混り合つて、試料成
分の濃度に対応する色合いを呈示するようにする
こともできる。 本発明の試験具は一回浸漬法で作るのが好まし
い。この浸漬に用いられる試薬濃度は約10-3mM
乃至飽和濃度である。４―アミノフエナゾンの通
常最も有用な濃度は約0.2mMである。浸漬液中
のペルオキシダーゼ濃度は、約0.1mg／dl乃至約
20mg／dlである。含浸溶液調製に用いられる溶媒
は水、生理溶液、有機溶媒又はそれらの混合物等
である。 本発明の試験具は、これを試験試料中に瞬間的
に浸漬させるか或は試験試料を担体マトリツクス
に導入することにより行われ、これによつて被検
物質が存在する場合には検知可能な色変化がその
上で生ずる。又、この試験具の使用要領は試料が
血漿、血清又はその他の体液の何れであるかに拘
わらず同一である。しかし、全血液の試験の場合
には器具の表面に血液を一滴たらすのがよい。 以下、実施例により本発明を更に説明するが、
これらは例示にすぎず本発明の範囲を限定するも
のではない。又、必要に応じて成分及び条件を任
意に変えることもできる。 実施例 １ コレステロールオキシダーゼ／コレステロール
エステルヒドロラーゼ及びペルオキシダーゼ／
フエノール／４―アミノフエナゾンによるコレ
ステロールの測定 試験溶液を従来法及び本発明に従つて調製し、
コレステロール測定におけるビリルビンの妨害効
果に対する抵抗について比較を行つた。 従来法による試験溶液の調製は以下の配合によ
つた： リン酸緩衝液 100mmol／、PH7.7 コレステロールエステルヒドロラーゼ
80I.U.／ コレステロールオキシダーゼ 40I.U.／ ペルオキシダーゼ 500I.U.／ ４―アミノフエナゾン 0.5mmol／ フエノール 10mmol／ コール酸ナトリウム 3mmol／ トリトンＸ―100 0.5％（Ｖ／Ｖ） 本発明の組成物を含有する試験溶液は
12μmol／のフエロシアン化カリウム〔K4Fe
（CN）6〕を添加した他は上記配合と全く同一であ
つた。 従来技術の試験溶液を第１のグループの試験管
に各2.5mlずつピペツトで入れ、本発明の組成物
の溶液を第２のグループの試験管に各2.5mlずつ
入れた。各グループの試験管に一連の試料を並行
させて入れた。 コレステロール水溶液は濃度が200mg／dlとな
るように調製し、得られた溶液を分液した。ビリ
ルビンの添加量はコレステロール溶液試料中のビ
リルビン濃度がそれぞれ1.3、3.8、6.3、9.8、
12.0、13.5及び18.3mg／dlとなるように添加した。
他のコレステロール溶液及び操作溶液を用いてブ
ランク値の較正を行つた。 各グループの試験管に各種ビリルビン濃度の一
連の0.02mlの試料を並行して注入し、これらの試
験管内で反応を37℃で15分間行つた。吸光度の読
み取りを、520nmにおいて対応試料ブランクとし
て試薬配合物からコレステロールオキシダーゼ及
びコレステロールエステルヒドロラーゼを除いた
ものに対照させて行なつた。 表１に各種ビリルビン濃度における従来技術及
び本発明の組成物をそれぞれ用いた場合の試験で
のコレステロール量の結果を示す。
のであり、特に尿又は血液のような体液中のコレ
ステロールの定性的及び定量的測定に有用な試験
に関する。更に詳しくは、本発明は、コレステロ
ールが過酸化物のような酸化性物質に転換される
ことを特徴とする試験に関する。 フエノールと４―アミノフエナゾン（別名４―
アミノアンチピリン）との酸化カツプリング反応
により赤色キノンイミン染料が生成することは古
くより知られており、エマーソンによりJ.Org.
Chem.8：417（1943）に記載されている。 この反応が臨床化学において人気を獲得したの
は下記反応式に基づくグルコースの酵素による測
定法にトラインダーが適用して以来である。 〔Ann.Clin.Biochem.，６：24（1969）〕： グルコース＋O2グルコースオキシダーゼ ――――――――――――――→ グルコ
ン酸＋H2O22H2O2＋フエノール＋４―アミノフ
エナゾンペルオキシダーゼ ――――――――――→ キノンイミン染料＋
4H2O エマーソン―トラインダー系と呼ばれるこのフ
エノール（置換フエノールも含む）＋４―アミノ
フエナゾン＋ペルオキシダーゼよりなる色素生成
系は、現在ではグルコースのみならず、血清、血
漿、その他の生体液中のコレステロール及び尿酸
の定量にも用いられている。この系をグルコース
の測定に用いた例としては、米国特許第3886045
号（メイアツチニ；現在Re29498号として再発行
特許になつている）が挙げられる。 この反応の一般機構は次の通りである： １ 被検物質＋O2特異的オキシダーゼ ―――――――――――→ 酸化被分
析物質＋H2O2 ２ エマーソン―トラインダー反応では多種のフエ
ノール類が使用可能である。臨床化学において最
も汎用されているものを例示すると、フエノー
ル、ｐ―ヒドロキシベンゾエート、２，４―ジク
ロロフエノール、３，５―ジクロロ―２―ヒドロ
キシベンゼンスルホン酸等がある。同様に、各種
の置換及び未置換のナフトール類を用いることも
できる。 測定可能な試料成分としては、特異的オキシダ
ーゼにより酸化されると同時に過酸化水素を生成
することのできるグルコース、コレステロール、
尿酸或はその他の代謝物質等が挙げられる。用い
られるオキシダーゼは、グルコースを測定する場
合にはグルコースオキシダーゼ、コレステロール
を測定する場合にはコレステロールオキシダーゼ
（コレステロールエステルヒドロラーゼを添加し
てエステル化コレステロールを加水分解すること
もできる）、尿酸測定の場合にはウリカーゼであ
る。 形成される色素の量は過酸化水素濃度、すなわ
ち試料中の成分濃度に比例する。従つて、試料中
の成分濃度は反応溶液の吸光度を単に測定し、そ
の測定値を被測定成分の標準溶液と比較対照する
ことによつて得ることができる。 形成される色素は可視領域において、通常500
〜550ナノメートル（nm）（用いられるフエノー
ルによつて異る）で測定することができるので、
色度計又は可視光光度計を用いるだけでよい。 このエマーソン―トラインダー色素形成系の主
たる欠点は、酸化カツプリング反応が還元性化合
物及びビリルビンによつて影響を受けることであ
る。ビリルビンは、通常、血清中に１mg／dl以下
の濃度で存在する代謝物質であるが、病気によつ
ては極めて高レベル迄（20mg／dl以上）到達する
こともある。正常濃度を越えるビリルビンレベル
により反応の色が減少し、酵素によるグルコー
ス、コレステロール及び尿酸の試験が影響を受け
る。すなわち、ビリルビンレベルの増大と共に妨
害が増大する。 還元性化合物（例、アスコルビン酸）による妨
害の説明は極めて明らかである。つまり、これら
は主にペルオキシダーゼを触媒とする過酸化水素
との反応において色原体の競争相手として、或は
又形成された色素の漂白剤として作用する。しか
しながら、還元性物質の妨害は少くとも血清にお
いては、滅多にアスコルビン酸濃度が３mg／mlを
越えることはないので実際上問題とならない。 これに対して、ビリルビンによる妨害はエマー
ソン―トラインダー色素形成系により血清中の代
謝物質を測定する上で相当量大な問題であり、ビ
リルビン過剰試料が頻繁にみられる日常の実験室
業務に際して大きな欠点となる。 ビリルビンの反応機構は極めて複雑であり、未
だ充分には理解されるには至つていない。これま
でにある、この問題への対策として最良のものは
ヴイツテ〔Clin.Chem.24：1778（1978）〕による
ものであり、ヴイツテはビリルビンの妨害を次に
挙げる要因の一つ又はそれ以上によるものとして
いる：すなわち、単なる光学的な効果、ペルオキ
シダーゼ基質の代替物としての作用又はペルオキ
シダーゼ反応中間体の分解である。 従つて、本発明の目的は、液体試料中のコレス
テロールを検出するための改良された試験方法を
提供することである。 更に、本発明の目的は、ビリルビンの妨害効果
に対して高度な抵抗を有する、コレステロール検
出のための改良された試験方法を提供することで
ある。 その他の目的及び本発明についてのより充分な
理解は、以下の好ましい実施態様に関する説明よ
り得られるであろう。 本発明の一部として、ビリルビンが置換又は未
置換のフエノール及び４―アミノフエナゾンを有
するタイプの色素形成試験を強く妨害する機構は
主として次の二つの異種の機構によるものである
ことが判明した。すなわち、(1)反応で形成された
色素のスペクトルに重なり合うことにより正の妨
害を行うこと、及び(2)前記の如き化学的機構によ
り負の妨害を行うことである。第１の機構により
負の妨害を行うことである。第１の機構により起
る正の防害は520nm以上の波長の吸光度を読み取
ることによつて減少させることができる。しかる
に、第２の機構に対してはかかる手だてはない。
それは極めて重要な役割を果し、試料中にビリル
ビンが異常濃度で存在する場合には上記試験にお
いて不正確な結果をもたらすことになる。 従来の組成物とは対照的に、本発明の組成物は
体液中のコレステロールの存在に対して感度が高
い一方、ビリルビン妨害に対しては実質的に抵抗
を有する。 このような驚くべき結果が本発明により達成さ
れるのは、液状試料中に含まれるコレステロール
測定用組成物であつて、該試料中のコレステロー
ルの存在に感応性を示す試薬手段、フエノール又
はナフトール及び４―アミノフエナゾンを含んで
なる組成物において、該試薬手段にフエロシアン
化物イオンを含有せしめることによつてビリルビ
ンの妨害に対する抵抗を与えることによるもので
ある。 以下の説明において、簡明を期するために特定
の用語が用いられるが、これらの用語は例示の目
的で選ばれた特別の実施態様を指すためにのみ用
いられるものであり、本発明の範囲を限定する趣
旨のものではない。 本発明の組成物は多くの物理的形状をとり得る
ものであり、４―アミノフエナゾン呈色組成物に
有用であることが公知であるフエノール（置換及
び未置換のフエノール類を含む）と、フエロシア
ン化物イオンを含む試薬とを組み合わせて含むも
のである。これ等は、安定剤その他の通常の添加
剤と共に必要により用いることができ、以下にそ
の両者について説明を行う。 フエロシアン化物イオンを含む好ましい試薬と
しては、フエロシアン化ナトリウム又はカリウム
のようなアルカリ金属塩、並びにFe（CN）-4 6イオ
ンを含有又は放出することのできるその他の塩又
は系等のその他のフエロシアン化物源が挙げられ
る。 本発明において、組成物中にはこの試薬と共に
液体試料中のコレステロールに感応して酸化性物
質を作り出す手段（試薬）も含まれる。かかるコ
レステロール感応性手段は、コレステロールオキ
シダーゼ及びペルオキシダーゼ等を含むものであ
る。コレステロール感応性手段において有用な試
薬に濃度及び種類は、公知のものを用いることが
できる。 この試験はコレステロール測定に際して溶液と
して用いることができる。溶液調製に用いること
のできる溶媒としては、水、生理溶液、有機溶
媒、例えば、メタノール又はこれらの混合物等が
挙げられる。 本発明の組成物は、尿、髄液、組織培養上清液
及び、好ましくは血清、血漿、又は全血液等に直
接添加することにより被検物質の測定を行うこと
が好ましい。 この組成物を溶液形態で用いる場合には、フエ
ロシアン化物イオンを含む試薬は、約1.0マイク
ロモル／リツトル（μmol／）乃至飽和溶液の
範囲の濃度で用いることが好ましい。更に好まし
い濃度範囲は約5μmol／乃至約50μmol／で
ある。コレステロールオキシダーゼの濃度は好ま
しくは約10I.U.／乃至200I.U.／である。コレ
ステロールエステルヒドラーゼを用いて総コレス
テロールを測定する場合には、その濃度は好まし
くは約10I.U.／乃至200I.U.／である。また、
ペルオキシダーゼの濃度は好ましくは約10I.U.／
乃至200I.U.／である。 酵素力価は国際単位（I.U.）で表わされ、1I.U.
は特定のPH及び温度条件において毎分1μmolの基
質の転換に触媒作用を及ぼすに必要な酵素活性の
量である。実施例で用いられる西洋わさびペルオ
キシダーゼ、及びコレステロールオキシダーゼは
マイルス・ラボラトリーズ社（インジアナ州、エ
ルクハルト）の研究製品部より得られたものであ
る。 本発明は更に本発明の組成物を組み込んでなる
試験具及びマトリツクスのような担体に組成物を
組み込むことを特徴とするかゝる具の製造方法を
提供する。かゝる組み込みを本発明の組成の溶液
を担体に含浸させて行う場合には、このように含
浸させた担体を次いで乾燥する。含浸法の他に
も、本発明の試験具は、その他の適当な技術、例
えば組成物を基体又はマトリツクス上に印刷又は
散布することにより作成することもできる。更
に、本発明の組成物はプレス成形又はモールド成
形された通常の担体材料を含有する錠剤の形をと
つて担体内に入れることもできる。 本発明で担体というのは、生理液その他の液に
触れた場合に、これらの液中で不溶性であり、そ
の構造的一体性を保持することのできる材質を意
味する。使用に好適なマトリツクスとしては紙、
セルロース、木材、合成樹脂フリース、ガラス繊
維、不織布及び織布、ゼラチン、ポリプロピレン
のような各種有機重合体、その他フイルム形成性
材料として当業者に周知の有機材料等が挙げられ
る。更に、使用上の便宜のために、担体又は試験
具に例えばポリスチレン製の不溶性支持体又は把
手を取り付けることもできる。 試験組成物を血液中のコレステロールの検出に
用いる場合には、含浸された担体マトリツクスの
表面をエチルセルロースその他の半透性透明被覆
フイルムでおおうのが有利である。これは、例え
ば、エチルセルロースのベンゼン溶液の層を含浸
された担体マトリツクス表面に設け、次いで溶媒
を蒸発乾燥させることによつて行うことができ
る。 処理担体マトリツクス形状の呈色剤又は試験具
は使用前に相当長期間貯蔵されることが多いの
で、選ばれる試薬としては空気中で自動酸化を受
けないものがよい。又、試験具は光照射から保護
するのがよく、これらを撥水性の包装内に封入し
て保存し、使用直前にこれを開いて、１つもしく
は１つ以上の試験具を取り出すようにしておくの
がよい場合もある。 又、必要に応じて、担体マトリツクスを特別の
色例えば黄色の背景色素で処理しておき、試験反
応で形成された色が背景色と混り合つて、試料成
分の濃度に対応する色合いを呈示するようにする
こともできる。 本発明の試験具は一回浸漬法で作るのが好まし
い。この浸漬に用いられる試薬濃度は約10-3mM
乃至飽和濃度である。４―アミノフエナゾンの通
常最も有用な濃度は約0.2mMである。浸漬液中
のペルオキシダーゼ濃度は、約0.1mg／dl乃至約
20mg／dlである。含浸溶液調製に用いられる溶媒
は水、生理溶液、有機溶媒又はそれらの混合物等
である。 本発明の試験具は、これを試験試料中に瞬間的
に浸漬させるか或は試験試料を担体マトリツクス
に導入することにより行われ、これによつて被検
物質が存在する場合には検知可能な色変化がその
上で生ずる。又、この試験具の使用要領は試料が
血漿、血清又はその他の体液の何れであるかに拘
わらず同一である。しかし、全血液の試験の場合
には器具の表面に血液を一滴たらすのがよい。 以下、実施例により本発明を更に説明するが、
これらは例示にすぎず本発明の範囲を限定するも
のではない。又、必要に応じて成分及び条件を任
意に変えることもできる。 実施例 １ コレステロールオキシダーゼ／コレステロール
エステルヒドロラーゼ及びペルオキシダーゼ／
フエノール／４―アミノフエナゾンによるコレ
ステロールの測定 試験溶液を従来法及び本発明に従つて調製し、
コレステロール測定におけるビリルビンの妨害効
果に対する抵抗について比較を行つた。 従来法による試験溶液の調製は以下の配合によ
つた： リン酸緩衝液 100mmol／、PH7.7 コレステロールエステルヒドロラーゼ
80I.U.／ コレステロールオキシダーゼ 40I.U.／ ペルオキシダーゼ 500I.U.／ ４―アミノフエナゾン 0.5mmol／ フエノール 10mmol／ コール酸ナトリウム 3mmol／ トリトンＸ―100 0.5％（Ｖ／Ｖ） 本発明の組成物を含有する試験溶液は
12μmol／のフエロシアン化カリウム〔K4Fe
（CN）6〕を添加した他は上記配合と全く同一であ
つた。 従来技術の試験溶液を第１のグループの試験管
に各2.5mlずつピペツトで入れ、本発明の組成物
の溶液を第２のグループの試験管に各2.5mlずつ
入れた。各グループの試験管に一連の試料を並行
させて入れた。 コレステロール水溶液は濃度が200mg／dlとな
るように調製し、得られた溶液を分液した。ビリ
ルビンの添加量はコレステロール溶液試料中のビ
リルビン濃度がそれぞれ1.3、3.8、6.3、9.8、
12.0、13.5及び18.3mg／dlとなるように添加した。
他のコレステロール溶液及び操作溶液を用いてブ
ランク値の較正を行つた。 各グループの試験管に各種ビリルビン濃度の一
連の0.02mlの試料を並行して注入し、これらの試
験管内で反応を37℃で15分間行つた。吸光度の読
み取りを、520nmにおいて対応試料ブランクとし
て試薬配合物からコレステロールオキシダーゼ及
びコレステロールエステルヒドロラーゼを除いた
ものに対照させて行なつた。 表１に各種ビリルビン濃度における従来技術及
び本発明の組成物をそれぞれ用いた場合の試験で
のコレステロール量の結果を示す。
【表】
フエロシアン化物が無い場合のコレステロール
試験における化学的妨害が顕著である。しかる
に、フエロシアン化物の存在する場合には妨害が
強力に減少するので実用上少くとも18mgビリルビ
ン／dl迄は妨害を無視することができる。 実施例 ２ コレステロールオキシダーゼ／コレステロール
エステルヒドロラーゼ及びペルオキシダーゼ／
フエノール／４―アミノフエナゾンによる血清
中コレステロールの測定用試験器具 従来法及び本発明の組成物を含む試験器具を調
製し、血清中コレステロール測定におけるビリル
ビンの妨害効果に対する抵抗について比較を行つ
た。 従来法による含浸溶器の調製は以下の配合によ
つた： リン酸緩衝液 100mmol／、PH7.7 コレステロールエステルヒドロラーゼ
240I.U.／ コレステロールオキシダーゼ
120I.U.／ ペルオキシダーゼ 2500I.U.／ ４―アミノフエナゾン 0.5mmol／ ３，５―ジクロロ―２―ヒドロキシベンゼンス
ルホン酸 10mmol／ コール酸ナトリウム 3mmol／ トリトンＸ―100 0.5％（Ｖ／Ｖ） 本発明の組成物を含有する含浸溶液は
20μmol／のフエロシアン化カリウム〔K4Fe
（CN）6〕を添加した他は上記配合と全く同一であ
つた。 ホワツトマンNo.17のロ紙（ホワツトマン社製、
ニユージヤージー州、クリフトン）を含浸溶液で
飽和されるまで含浸させた後60℃で乾燥した。含
浸溶液の乾燥残渣を含むこれらのシートを2.5mm
×2.5mmに切断して器具とした。これらの器具を
両面接着テープで裏打ちし、プラスチツク製把手
に固定した。 血清試料を得て、これをプールしておき、その
コレステロール（約200mg／dlであつた）及びビ
リルビン含量を測定した。プールされた血清を次
いで10倍容の蒸留水で稀釈した。ビリルビンを稀
釈した血清プールに添加して血清濃度を20mg／dl
にした。この試験液を分液した。 本発明の試験器具をコレステロール試験液の一
つの分液中に瞬間的に浸漬させ、従来技術による
試験器具をもう一つの分液中に瞬間的に浸漬し
た。約10分後に試験器具の色変化を目で調べた。 本発明に従つて作られた器具はコレステロール
の存在を示す明確な色変化を示したのに対し、従
来技術の組成物を含む試験器具は色変化を起こさ
ず、間違つたコレステロールマイナスの結果を与
えた。 以上、本発明を特別の例について説明したが、
これは例示にすぎず、本発明の範囲内において各
種変更を行うことができる。
試験における化学的妨害が顕著である。しかる
に、フエロシアン化物の存在する場合には妨害が
強力に減少するので実用上少くとも18mgビリルビ
ン／dl迄は妨害を無視することができる。 実施例 ２ コレステロールオキシダーゼ／コレステロール
エステルヒドロラーゼ及びペルオキシダーゼ／
フエノール／４―アミノフエナゾンによる血清
中コレステロールの測定用試験器具 従来法及び本発明の組成物を含む試験器具を調
製し、血清中コレステロール測定におけるビリル
ビンの妨害効果に対する抵抗について比較を行つ
た。 従来法による含浸溶器の調製は以下の配合によ
つた： リン酸緩衝液 100mmol／、PH7.7 コレステロールエステルヒドロラーゼ
240I.U.／ コレステロールオキシダーゼ
120I.U.／ ペルオキシダーゼ 2500I.U.／ ４―アミノフエナゾン 0.5mmol／ ３，５―ジクロロ―２―ヒドロキシベンゼンス
ルホン酸 10mmol／ コール酸ナトリウム 3mmol／ トリトンＸ―100 0.5％（Ｖ／Ｖ） 本発明の組成物を含有する含浸溶液は
20μmol／のフエロシアン化カリウム〔K4Fe
（CN）6〕を添加した他は上記配合と全く同一であ
つた。 ホワツトマンNo.17のロ紙（ホワツトマン社製、
ニユージヤージー州、クリフトン）を含浸溶液で
飽和されるまで含浸させた後60℃で乾燥した。含
浸溶液の乾燥残渣を含むこれらのシートを2.5mm
×2.5mmに切断して器具とした。これらの器具を
両面接着テープで裏打ちし、プラスチツク製把手
に固定した。 血清試料を得て、これをプールしておき、その
コレステロール（約200mg／dlであつた）及びビ
リルビン含量を測定した。プールされた血清を次
いで10倍容の蒸留水で稀釈した。ビリルビンを稀
釈した血清プールに添加して血清濃度を20mg／dl
にした。この試験液を分液した。 本発明の試験器具をコレステロール試験液の一
つの分液中に瞬間的に浸漬させ、従来技術による
試験器具をもう一つの分液中に瞬間的に浸漬し
た。約10分後に試験器具の色変化を目で調べた。 本発明に従つて作られた器具はコレステロール
の存在を示す明確な色変化を示したのに対し、従
来技術の組成物を含む試験器具は色変化を起こさ
ず、間違つたコレステロールマイナスの結果を与
えた。 以上、本発明を特別の例について説明したが、
これは例示にすぎず、本発明の範囲内において各
種変更を行うことができる。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ コレステロールオキシダーゼ及びペルオキシ
ダーゼ、及び、フエノール又はナフトール、並び
に４―アミノフエナゾンを含んでなり更にフエロ
シアン化物イオンを含んでなる事を特徴とする、
液体試料中のコレステロール測定用組成物。 ２ フエノールが未置換フエノールである特許請
求の範囲第１項記載の組成物。 ３ フエノールが３，５―ジクロロ―２―ヒドロ
キシベンゼンスルホン酸である特許請求の範囲第
１項記載の組成物。 ４ フエロシアン化物イオン塩がフエロシアン化
ナトリウムである特許請求の範囲第１項記載の組
成物。 ５ フエロシアン化物イオン塩がフエロシアン化
カリウムである特許請求の範囲第１項記載の組成
物。 ６ コレステロールオキシダーゼ、未置換フエノ
ール及び４―アミノフエナゾン並びにフエロシア
ン化ナトリウムからなる特許請求の範囲第１項記
載の組成物。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/133,533 US4291121A (en) | 1979-04-13 | 1980-03-24 | Bilirubin-resistant determination of uric acid and cholesterol |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS56155852A JPS56155852A (en) | 1981-12-02 |
| JPS6359466B2 true JPS6359466B2 (ja) | 1988-11-18 |
Family
ID=22459065
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4052481A Granted JPS56155852A (en) | 1980-03-24 | 1981-03-23 | Bilirubin resisting method of measuring uric acid and cholesterol, measuring composition and testing apparatus and production thereof |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4291121A (ja) |
| EP (1) | EP0036563B1 (ja) |
| JP (1) | JPS56155852A (ja) |
| AU (1) | AU523916B2 (ja) |
| CA (1) | CA1144050A (ja) |
| DE (1) | DE3162461D1 (ja) |
| DK (1) | DK163672C (ja) |
| FI (1) | FI77896C (ja) |
| GR (1) | GR74834B (ja) |
| NO (1) | NO810809L (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IT1130252B (it) * | 1980-02-04 | 1986-06-11 | Elvi Spa | Metodo per l'eliminazione dell'interferenza da biliribuna nel dosaggio di perossido di idrigeno mediante una reazione di trinder modificata |
| JPS5783287A (en) * | 1980-11-14 | 1982-05-25 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | Elimination of hydrogen peroxide |
| DE3124590A1 (de) * | 1981-06-23 | 1983-01-27 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Stabilisiertes reagenz zum nachweis von h(pfeil abwaerts)2(pfeil abwaerts)o(pfeil abwaerts)2(pfeil abwaerts) |
| DE3239236A1 (de) * | 1982-02-18 | 1983-09-01 | Amano Pharma Co Ltd | Verfahren zur quantitativen bestimmung von physiologischen komponenten in biologischen fluessigkeiten oder gasen |
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| JPS6348457A (ja) * | 1986-08-19 | 1988-03-01 | Fuji Photo Film Co Ltd | 乾式多層分析要素 |
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| CA2306554A1 (en) * | 1998-08-06 | 2000-02-17 | Jin Po Lee | Uric acid assay device with stabilized uricase reagent composition |
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Citations (3)
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Family Cites Families (6)
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| JPS5425892A (en) * | 1977-07-29 | 1979-02-27 | Wako Pure Chem Ind Ltd | Quantitative determination of hydrogen peroxide |
| US4247631A (en) * | 1979-01-31 | 1981-01-27 | Millipore Corporation | Reagent and method for the analytic determination of hydrogen peroxide |
| CA1134247A (en) * | 1979-04-13 | 1982-10-26 | Giovanni Berti | Bilirubin-resistant determination of uric acid |
-
1980
- 1980-03-24 US US06/133,533 patent/US4291121A/en not_active Expired - Lifetime
-
1981
- 1981-01-29 CA CA000369625A patent/CA1144050A/en not_active Expired
- 1981-03-10 NO NO810809A patent/NO810809L/no unknown
- 1981-03-11 DE DE8181101784T patent/DE3162461D1/de not_active Expired
- 1981-03-11 EP EP81101784A patent/EP0036563B1/en not_active Expired
- 1981-03-20 GR GR64461A patent/GR74834B/el unknown
- 1981-03-20 AU AU68595/81A patent/AU523916B2/en not_active Expired
- 1981-03-20 FI FI810869A patent/FI77896C/fi not_active IP Right Cessation
- 1981-03-23 JP JP4052481A patent/JPS56155852A/ja active Granted
- 1981-03-23 DK DK130881A patent/DK163672C/da not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS4950991A (ja) * | 1972-05-12 | 1974-05-17 | ||
| JPS502594A (ja) * | 1973-03-01 | 1975-01-11 | ||
| JPS6259782A (ja) * | 1985-09-05 | 1987-03-16 | ロックウェル‐セイエム | 特に自動車ドア用の電気的開閉ラツチ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU523916B2 (en) | 1982-08-19 |
| CA1144050A (en) | 1983-04-05 |
| JPS56155852A (en) | 1981-12-02 |
| DK163672B (da) | 1992-03-23 |
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| DK163672C (da) | 1992-08-17 |
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| EP0036563B1 (en) | 1984-03-07 |
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| DK130881A (da) | 1981-09-25 |
| GR74834B (ja) | 1984-07-12 |
| FI810869L (fi) | 1981-09-25 |
| FI77896C (fi) | 1989-05-10 |
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