FI77896B - Komposition foer bestaemning av urinsyra eller kolesterol i ett vaetskeprov. - Google Patents

Description

Koostumus virtsahapon tai kolesterolin määrittämiseen neste- näytteestä 1 77896

Esillä oleva keksintö koskee yleisesti diagnostisia 5 kokeita ja erityisesti koostumuksia, jotka ovat käyttökelpoisia virtsahaposta tai kolesterolista valittujen analyyt-tien kvalitatiiviseen ja kvantitatiiviseen määrittämiseen kehon nesteistä kuten virtsasta tai verestä kokeilla, joissa analyytti muutetaan hapettavaksi aineeksi, kuten 10 peroksidiksi.

Fenolin ja myös 4-aminoantipyriininä tunnetun 4-aminofenatsonin välinen hapettava liittymisreaktio punaisen kinoni-imiinivärin tuottamiseksi on ollut tunnettu kauan; sen on kuvannut Emerson julkaisussa J. Org. Chem.

15 8:417 (1943).

Reaktio on saavuttanut suosiota kliinisessä kemiassa sen jälkeen, kun Trinder (Ann. Clin. Biochem. 6:24 (1969) esitti sen käytön glukoosin entsymaattiseen määrittäminen, joka perustuu seuraavan kaavion mukaiseen reak-20 tioon: glukoosi- oksidaasi glukoosi + 02 -^ glukonihappo + H202 2H202 + fenoli + 4-aminofenoatsoni peroksidaasi ^ 25 kinoni-imiiniväri + 4H20

Kromatogeenistä järjestelmää fenoli (sisältäen substituoidut fenolit) + 4-aminofenatsoni + peroksidaasi, johon viitataan Emerson-Trinder -järjestelmä, käytetään nykyään glukoosin kvantitatiivisen määrittämisen lisäksi 30 myös kolesterolin ja virtsahapon määrittämiseen seerumista, plasmasta tai muista biologisista nesteistä. Tämän järjestelmän käyttö glukoosin määrittämiseen on esitetty US-patenttijulkaisussa 3 886 045 Meiattini, joka on julkaistu uudelleen US-patenttijulkaisuna Re 29 498.

2 77896 Tämän reaktion yleinen reaktiokaavio on seuraava: spesifinen i ~ oksidaasi , 1) analyytti + 0„ v hapettunut ana- -7 lyytti + H202 5 ?6H5 2) Γ + peroksidaasiy 10 H3C NH2 4-aminofenatsoni fenoli ieH5 h3c 'kT" \_. / (värillinen tuote) / \ /=\ h3c N\_/°

Monia fenoleita voidaan käyttää Emerson-Trinder-20 reaktiossa. Esimerkkejä kliinisessä kemiassa yleisemmin käytetyistä ovat fenoli, p-hydroksibentsoaatti, 2,4-di-kloorifenoli, 3,5-dikloori-2-hydroksibentseenisulfonihappo. Samoin eri tavoin substituoituja ja substituoimattomia naftoleja voidaan käyttää.

25 Määrityskelpoisiin näyteaineosiin kuuluvat glukoosi, kolesteroli, virtsahappo tai muut metaboliitit, jotka voidaan hapettaa spesifisellä oksidaasilla niin, että samanaikaisesti muodostuu vetyperoksidia. Oksidaasi on glukoosi-oksidaasi glukoosin määrittämiseen; kolesterolioksidaasi 30 kolesterolin määrittämiseen (kolesteroliesterihydrolaasia lisätään myös hydrolysoimaan esteröitynyt kolesteroli); ja urikaasi virtsahappomäärityksiin.

Muodostuneen värin määrä on suhteessa vetyperoksidin väkevyyteen ja sen vuoksi hapettuvan analyytin väke- i 3 77896 vyyteen näytteessä. Siten tämän analyytin väkevyys näytteessä voidaan saada yksinkertaisella reagoineen absorbans-simittauksella ja vertaamalla tällaista mittausta analyytin tunnetun vertailuliuoksen mittaukseen.

5 Muodostunut väri voidaan mitata näkyvällä alueel la, yleensä välillä 500 ja 550 nanometriä (nm) (riippuen käytetystä fenolista), jolloin tarvitaan vain kolorimetri tai näkyvän värialueen fotometri.

Emerson-Trinderin kromogeenisen järjestelmän suu-10 rimpana haittana on, että hapettavaan liittymisreaktioon vaikuttavat pelkistävät yhdisteet ja bilirubiini, metabo-liitti, jota on yleensä läsnä seerumissa enintään väkevyyksinä 1 milligramma desilitraa kohti (mg/100 ml), mutta joka voi joissakin taudeissa saavuttaa hyvin korkeita 15 tasoja (20 mg/100 ml tai tätäkin korkeampia). Normaalia korkeammat bilirubiinitasot vaikuttavat entsymaattisiin glukoosi-, kolestroli- ja virtsahappokokeisiin vähentämällä reaktion väriä. Vaikutus kasvaa bilirubiinitason kasvaessa.

20 Pelkistävien yhdisteiden, esim. askorbiinihapon, negatiivisen vaikutuksen selitys on aivan ilmeinen, koska ne toimivat pääasiassa kormogeenin kilpailijoina pe-roksidaasin katalysoimassa reaktiossa vetyperoksidin kanssa tai valkaisuaineina muodostavalle värille. Pelkistä-25 vien aineiden vaikutus ei kuitenkaan ole todellinen ongelma ainakaan seerumissa, jossa askorbiinihappo harvoin ylittää 3 mg/dl.

Sitä vastoin bilirubiinin häiritsevä vaikutus on merkittävä ongelma metaboliittien seerumimäärityksissä 30 Emerson-Trinderin kromogeenisellä järjestelmällä ja se on tämän järjestelmän merkittävin epäkohta laboratorion rutiinikäytännössä, jossa toistuvasti esiintyy näytteitä, joissa on normaalia suurempi bilirubiinipitoisuus.

4 77896

Bilirubiinin reaktiomekanismi on melko monimutkainen eikä toistaiseksi täysin ymmärretty. Ongelman parhaan lähestymistavan tähän mennessä on julkaissut Witte (Clin. Chem. 24:1778 (1978)), joka katsoo bilirubiinin vaikutuk-5 sen johtuvaksi jostakin seuraavista tekijöistä: yksinkertaiset spektraaliset vaikutukset, toimiminen vaihtoehtoisena peroksidaasisubstraattina tai peroksidaasireaktion välituotteiden hajottaminen.

Sen vuoksi esillä olevan keksinnön tarkoituksena 10 on aikaansaada parannettu koe virtsahaposta tai kolesterolista valitun analyytin toteamiseksi nestenäytteestä siten, että bilirubiini ei vaikuta häiritsevästi koetuloksiin.

Esillä olevan keksinnön osana on keksitty, että 15 bilirubiini häiritsee voimakkaasti sen tyyppisiä kromo- geenisiä kokeita, joissa käytetään substituoitua tai subs-tituoimatonta fenolia ja 4-aminofenatsonia, pääasiassa kahdella eri mekanismilla: (1) peittämällä osin reaktiossa muodostuneen värin spektrin, jolloin aiheutuu positiivi-20 nen häiriö ja (2) edellä esitetyllä kemiallisella mekanismilla, joka aiheuttaa negatiivisen häiriön. Ensimmäisestä mekanismista aiheutuva positiivinen häiriö voidaan poistaa lukemalla absorbanssi aallonpituudella 520 nm tai korkeammalla. Toisen mekanismin suhteen tapaus on 25 kuitenkin erilainen. Tämä toinen mekanismi on erittäin tärkeä, sillä se aiheuttaa epätarkkoja tuloksia ylläkuvatuissa kokeissa, kun bilirubiinia on näytteessä epänor-• naaleina pitoisuuksina.

Päinvastoin kuin alan aikaisemmat koostumukset 30 esillä olevan keksinnön mukainen koostumus on erittäin herkkä toteamaan virtsahaposta ja kolesterolista valitun analyytin läsnäolon kehon nesteissä, samalla kun se on oleellisen resistentti bilirubiinihäiriöille.

Tämä yllättävä tulos saavutetaan esillä olevan 35 keksinnön mukaisesti käyttämällä koostumusta, joka on tarkoitettu virtsahaposta tai kolesterolista valitun ana- 5 77896 lyytin toteamiseen nestenäytteestä ja joka on tyypiltään sellainen, että se sisältää osan, joka reagoi mainitun ana-lyytin läsnäoloon näytteessä, fenolia tai naftolia ja 4-aminofenatsonia ja joka saadaan resistentiksi bilirubiini-5 häiriöille lisäämällä siihen reagenssia, sisältää ferro-syanidi-ionia.

Vaikka seuraavassa on selvyyden vuoksi käytetty tiettyjä termejä, näiden termien on tarkoitus viitata vain keksinnön tiettyyn sovellutukseen, joka on valittu esimerkit) kikuvaukseksi, eikä ole tarkoitettu määrittelemään eikä rajoittamaan keksinnön piiriä.

Keksinnön mukainen koostumus voi esiintyä monissa fysikaalisissa muodoissa ja sisältää fenolia mukaan luettuna substituoidut ja substituoimattomat fenolit, joka on 15 hyvin tunnettu käyttökelpoisuudestaan 4-aminofenatsoni-indikaattorikoostumuksissa, yhdessä reagenssin kanssa, jonka muodostaa ferrosyanidi-ioni. Nämä samoin kuin haluttaessa lisäksi käytettävät aineet, kuten stabilointiaineet ja muut tavanomaiset lisäaineet, kuvataan.

20 Edullisiin reagenssiaineisiin, jotka sisältävät ferrosyanidi-ionin, kuuluvat ferrosyanidin alkalimetalli-suolat, kuten natrium- tai kaliumferrosyanidi, samoin kuin mikä tahansa muu ferrosyanidilähde, mukaan lukien kaikki muut suolat tai järjestelmät, jotka sisältävät tai pysty- -4 25 vät luovuttamaan Fe(CN)g -ioneja.

Koostumus sisältää keksinnön mukaisen reagenssiai-neen lisäksi reagenssia, joka reagoi virtsahaposta ja kolesterolista valitun analyytin läsnäoloon nestenäytteessä tuottaen hapettavan aineen. Tällaiset analyytin läsnäoloon 30 reagoivat aineet ovat luonteeltaan entsymaattisia ja sisältävät edullisesti peroksidatiivisesti aktiivisen aineen, urikaasin virtsahapon määrittämiseen ja kolesterolioksidaa-sin kolesterolin määrittämiseen. Analyytin läsnäolon reagoivana aineena käyttökelpoisten reagenssien tyypit ja 35 pitoisuudet vastaavat alalla tunnettuja.

6 77896

Koeaineita voidaan käyttää liuoksena analyytin määrittämiseksi. Liuosten valmistukseen käytetyt liuottimet voivat olla vettä, fysiologisia liuoksia, orgaanisia liuottimia, kuten metanolia, tai niiden seoksia.

5 Koostumusta käytetään edullisesti analyytin totea miseksi lisäämällä se näytteeseen kuten virtsaan, selkäydinnesteeseen, kudosviljelyn emäliemeen ja edullisesti seerumiin, plasmaan tai kokovereen.

Kun koostumusta käytetään liuosmuodossa, reagenssi-10 ainetta, joka sisältää ferrosyanidi-ionia, käytetään edullisesti väkevyyksinä noin 1,0 mikromoolia/litra (yumol/1). Kun urikaasi on osa analyytin läsnäoloon reagoivasta aineesta, sen väkevyydet ovat edullisesti noin 10 kansainvälistä yksikköä (I.U)/litra - noin 200 I.U./litra. Kun ko-15 lesterolioksidaasi on osa analyytin läsnäoloon reagoivasta aineesta, sen väkevyydet ovat edullisesti noin 10 I.U./l - noin 200 I.U./l.

Kun kolesteroliesterihydrolaasia käytetään kokonaiskolesterolipitoisuuksien määrittämiseen, sen väkevyydet 20 ovat edullisesti noin 10 I.U./l - noin 200 I.U./l. Kun pe-·. roksidaasi on vähintään yksi reagensseista, jotka muodos tavat analyytin läsnäolon reagoivan aineen, peroksidaasin väkevyydet ovat edullisesti noin 10 I.U./l noin 200 I.U./l.

Entsyymiaktiivisuus ilmoitetaan kansainvälisinä yk-25 sikköinä (I.U.), jolloin 1 I.U. on sen entsyymiaktiivisuus-määrä, joka tarvitaan katalysoimaan 1 mikromoolin (yumol) - substraattia muuttuminen minuutissa määritellyissä pH- ja lämpötilaolosuhteissa. Piparjuuriperoksidaasi, urikaasi ja kolesterolioksidaasi, joita käytetään esimerkeissä, 30 voidaan saada firmalta Research Products Division, Miles Laboratories, Inc., Elkhart, Indiana.

Keksinnön kohteena ovat myös koevälineet, jotka sisältävät keksinnön mukaista koostumusta, ja menetelmä tällaisten koevälineitten valmistamiseksi, joka menetelmä kä-35 sittää koostumuksen sisällyttämisen kantaja-aineeseen, i 7 77896 kuten matriisiin. Kun tämä toteutetaan kyllästämällä kantaja-aine keksinnön mukaisen seoksen liuoksella, kuivataan näin kyllästetty kantaja-aine sen jälkeen. Kyllästämisen lisäksi esillä olevan keksinnön mukaiset välineet voidaan 5 tehdä muilla sopivilla menetelmillä, kuten painamalla tai suihkuttamalla seos substraatille tai matriisille. Vaihtoehtoisesti keksinnön mukaiset seokset voidaan lisätä kantaja-aineeseen, joka on muodoltaan puristettu tai valettu tabletti, joka sisältää tavanomaista kantaja-ainetta.

10 Termi kantaja-aine viittaa matriiseihin, jotka ovat liukenemattomia ja säilyttävät rakenteellisen erillisyytensä ollessaan fysiologisen tai muun nesteen yhteydessä. Sopiviin matriiseihin, joita voidaan käyttää, kuuluvat paperi, selluloosa, puu, synteettiset hartsihahtuvat, lasi-15 kuitu, kuitukankaat ja kudotut kankaat, gelatiini, erilaiset orgaaniset polymeerit, kuten polypropleeni ja muut orgaaniset aineet, jotka alan asiantuntija tuntee hyvin kal-vonmuodostajina. Mukavuuden vuoksi kantaja-aine tai koevä-line voidaan liittää liukenemattomaan tuki- tai käsitte-20 lyosaan, joka voi olla esimerkiksi polystyreeniä.

Kun koostumusta käytetään virtsahapon tai kolesterolin toteamiseen verestä, kyllästetyn kantaja-ainematrii-sin pinta peitetään edullisesti puoliläpäisevällä läpinäkyvällä etyyliselluloosasta tai muusta sopivasta materiaalis-25 ta valmistetulla päällystekalvolla. Tämä voidaan saada aikaan levittämällä esimerkiksi kerros bentseeniin liuotet-V tua etyyliselluloosaa kyllästetyn kantaja-ainematriisin pinnalle, minkä jälkeen liuotin poistetaan kuivaamalla haihduttaen.

30 Indikaattoreita käsiteltyjen kantaja-ainematriisien tai koevälineiden muodossa säilytetään usein huomattavia ajanjaksoja ennen käyttöä, ja sen vuoksi on toivottavaa, etteivät valitut reagenssit ole helposti ilmassa itsestään hapettuvia. Suositeltavasti koevälineet olisi suojattava 35 valolta ja joissakin tapauksissa olisi toivottavaa pitää 8 77896 ne suljettuina kosteudentorjuvaan pakkaukseen, joka aukaistaan vain, kun täytyy poistaa yksi tai useampia koevälinei-tä juuri ennen niiden käyttöä.

Haluttaessa kantaja-ainematriisi voidaan käsitellä 5 tietyn värisellä taustavärillä, kuten keltaisella, niin että koereaktiossa muodostuva väri sekoittuu taustaväriin tuottaen vaihtelevia sävyjä, jotka vastaavat analyytin pitoisuutta näytteessä.

Koeväline valmistetaan edullisesti yksinkertaisella 10 kastamismenetelmällä. Kastamiseen käytettyjen reagenssien _3 väkevyydet vaihtelevat noin 10 nM:sta kyllästettyyn liuokseen. 4-aminofenatsonille yleensä käyttökelpoisin väkevyys on noin 0,2 nM. Peroksidaasiväkevyys on noin 0,1 mg/100 ml - noin 20 mg/100 ml kastoliuoksessa. Kyllästys-15 liuoksen valmistamiseen käytetyt liuottimet voivat olla vettä, fysiologisia liuoksia, orgaanisia liuottimia tai niiden yhdistelmiä.

Koevälinettä käytetään edullisesti kastamalla se hetkeksi tutkittavaan näytteeseen tai muulla tavalla saat-20 tamalla näyte kantaja-ainematriisin kanssa yhteyteen, jolloin sen pinnalla tapahtuu havaittava värin vaihtuminen, kun analyyttiä on läsnä. Koevälinettä voidaan käyttää samalla tavalla, olipa kokeiltavana plasma-, seerumi- tai muu kehon nestenäyte. Kuitenkin kokoverta tutkittaessa on 25 edullista saattaa tippa verta välineen pinnan yhteyteen.

Seuraavat esimerkit havainnollistavat keksintöä. Esimerkki 1

Virtsahapon määritys seerumista urikaasin ja peroksidaasi/ 3,5-dikloori-2-hydroksibentseenisulfonihappo/4-aminofenatso-30 nin avulla

Valmistettiin alan aikaisemman käytännön mukaiset ja esillä olevan keksinnön mukaiset koeliuokset ja verrattiin niiden herkkyyttä häiritsevälle vaikutukselle virtsa-hapon määrityksessä.

35 Alan aikaisemman käytännän mukaan valmistettiin koe liuokset, joiden koostumus oli seuraava: 9 77896 fosfaattipuskuri 150 mmol/1, pH 7,0 urikaasi 60 I.U./l peroksidaasi 140 I.U./l 4-aminofenatsoni 0,24 mmol/1 5 3,5-dikloori-2-hydroksi- 2,0 mmol/1 bentseenisulfonihappo

Koeliuokset, jotka sisälsivät keksinnön mukaisen koostumuksen, valmistettiin täsmälleen kuten yllä, mutta lisäten 20 yummol/1 kaliumferrosyanidia ZiC^Fe (CN) .

10 2,0 ml:n näyte alan aikaisemman käytännön mukaista koeliuosta pipetoitiin kuhunkin ensimmäisen ryhmän koeputkista ja 2,0 ml näyte keksinnön mukaisen koostumuksen liuosta pipetoitiin kuhunkin ryhmän koeputkeen. Lisäksi valmistettiin rinnakkainen näytesarja kummankin ryhmän koe-15 putkille.

Seeruminäytteet hankittiin, yhdistettiin ja niiden virtsahappo- ja bilirubiinipitoisuus tutkittiin. Virtsahap-poa lisättiin yhdistettyihin väkevyyteen 6,0 mg/dl saakka ja liuos jaettiin tasaosiin. Bilirubiinimäärät lisättiin 20 siten, että saatiin virtsahappokoeliuosnäytteet, joissa oli bilirubiiniväkevyydet 0.7, 1,4, 2,2, 3,6, 5,0, 6,5, 8,8, 12,1, 16,7 ja 23,4 mg/100 ml. Muita virtsahappoliuos-näytteitä, joissa ei ollut bilirubiinia, käytettiin vertai luliuoksena.

25 Jokaiseen koeputkiryhmään injektoitiin rinnakkaiset sarjat 0,05 ml:n näyte-eriä, jotka sisälsivät eri bilirubiiniväkevyydet, ja reaktion näissä koeputkissa annettiin edetä 15 minuutin ajan huoneen lämpötilassa. Liuosten ab-sorbanssit luettiin 520 nm:ssä vastaavia nollanäytteitä 30 vastaan, jotka oli saatu jättämällä urikaasi pois reagens-sivalmisteista.

Tulokset, jotka ilmoittavat virtsahapon saannon prosentteina kokeissa, joissa käytettiin alan aikaisemman käytännön mukaisia ja keksinnön mukaisia koostumuksia eri 35 bilirubiiniväkevyyksissä, on esitetty taulukossa 1.

10 77896

Taulukko 1

Todettu virtsahappo (saanto %)

Bilirubiini Mukana Ilman (mg/100ml) K^Fe(CN)g K4Fe(CN)g 5 0,7 100,0 + 1,2 100,0 + 1,2 1,4 100,0 97,2 2,2 99,2 93,5 3,6 98,0 83,6 5,0 97,0 78,5 10 6,5 95,9 71,5 8,8 93,4 59,0 12,1 91,0 43,5 16,7 90,0 21,0 23,4 89,0 15

Huomattava kemiallinen häiriö (noin 6 %) huomataan virtsahappokokeessa ferrosyanidin puuttuessa jopa niin alhaisilla bilirubiinitasoilla kuin 2 mg/100 ml, ja tämä on vielä hälyttävämpi (yli 20 %) tasolla 5 mg/100 ml.

20 Ferrosyanidia käytettäessä bilirubiinin aiheuttama kemiallinen häiriö vähenee voimakkaasti (tilastollisesti ei merkitsevä bilirubiinitasolla 2 mg/100 ml; 3 % tasolla 5 mg/100 ml; noin 10 % niin korkealla bilirubiinitasolla kuin 15-20 mg/dl).

25 Esimerkki II

Koevälinen virtsahapon määrittämiseksi virtsasta urikaasin ja peroksidaasi/3,5-dikloori-2-hydroksibentseenisulfoni-happo/4-aminofenatsonin avulla

Valmistettiin koevälineet, jotka sisältävät alan 30 aikaisemman käytännön mukaisia ja esillä olevan keksinnön mukaisia koostumuksia ja verrattiin niiden herkkyyttä bilirubiinin häiritseville vaikutuksille tutkittaessa virtsa-hapon esiintymistä virtsassa.

11 77896

Valmistettiin kyllästysliuos alan aikaisemman käytännön mukaan koostumukseltaan seuraavaksi: fosfaattipuskuri 150 mml,pH 7.0 urikaasi 150 I.U.

2 peroksidaasi 860 I.U.

4-aminofenatsoni 0.24 mmol 3,5-dikloori-2-hydroksibentseeni-sulfonihappo ^ mmol H20 ad 1000 ml 10

Kyllästysliuokset, jotka sisälsivät esillä olevan keksinnön mukaisen koostumuksen, valmistettiin täsmälleen kuten yllä lisäten kuitenkin 20^umol kaliumferrosyanidia /k^Fe(CN)g/.

15 Whatman no. 17 suodatinpaperiarkit (Whatman,

Inc. Clifton, N.J.) kyllästettiin kyllästyspisteeseen kyllästysliuoksilla ja kuivattiin 60°C:ssa. Nämä arkit, jotka sisälsivät kyllästysliuosten kuivuneen jäännöksen, leikattiin 2,5 mm x 2,5 mm kokoisiksi välineitten muodostamiseksi. Välineiden taustaan kiinnitettiin sitten kaksipuolinen teippi ja ne kiinnitettiin samalla muovi-varsiin.

Hankittiin virtsanäytteitä, yhdistettiin ne ja tutkittiin niiden virtsahappo- ja bilirubiinipitoisuus. Yhdistetty virtsa laimennettiin sitten 10 tilavuudella 25 tislattua vettä. Virtsahappoa lisättiin laimennettuun virtsaerään, kunnes saatiin virtsahapon väkevyys 6 mg/dl. Sitten lisättiin laimennettuun virtsaerään bilirubiinia kunnes väkevyys oli 10 mg/100 ml, jolloin käytettävissä oli koeliuos. Tämä koeliuos jaettiin tasaosiin.

30 Keksinnön mukaiset koevälineet upotettiin hetkeksi yhteen virtsahappokoeliuosnäytteeseen ja alan aikaisemman käytännön mukaiset koevälineet upotettiin hetkeksi toiseen näytteeseen.

12 77896

Koevälineistä tutkittiin noin 10 minuutin kuluttua silmämääräisesti värin muutos.

Keksinnön mukaisesti valmistetuissa välineissä ilmeni selvä värinmuutos, joka osoitti virtsahapon esiinty-5 mistä, kun taas alan aikaisemman käytännön mukainen seos ei muuttanut väriä ja osoitti siten virheellisesti virtsa-hapon puuttuvan.

Esimerkki III

Kolesterolin määritys kolesterolioksidaasi/kolesteroli-10 esterihydrolaasin ja peroksidaasi/fenoli/4-aminofenatso-nin avulla

Valmistettiin koeliuokset alan aikaisemman käytännön mukaan ja esillä olevan keksinnön mukaan ja verrattiin niiden bilirubiinin häiritseville vaikutuksille kolestero-15 limäärityksessä.

Koeliuokset valmistettiin alan aikaisemman käytännön mukaan koostumukseltaan seuraavaksi: fosfaattipuskuri 100 mmol/1, pH 7,7 kolesteroliesterihydrolaasi 80 I.U./l 20 kolesterolioksidaasi 40 I.U./l peroksidaasi 500 I.U./l 4-aminofenatsoni 0,5 mmol/1 fenoli 10 mmol/1 natriumkolaatti 3 mmol/1 25 Triton X-100 0,5 tilavuus-%

Koeliuokset, jotka sisälsivät keksinnön mukaisen koostumuksen, valmistettiin täsmälleen kuten yllä lisäten kuitenkin 12 mmol/1 kaliumferrosyanidia /T^Fe (CN) .

2,5 ml:n näyte alan aikaisemman käytännön mukaista 30 koeliuosta pipetoitiin jokaiseen ensimmäisen ryhmän koeputkeen ja 2,5 ml:n näyte keksinnön mukaisen koostumuksen liuosta pipetoitiin jokaiseen toisen ryhmän koeputkeen. Rinnakkainen sarja näytteitä valmistettiin lisäksi kummankin ryhmän koeputkilla.

i3 778 9 6

Valmistettiin kolesterolin vesiliuos, joka väkevyys oli 200 mg/dl ja liuos erotettiin tasaeriin. Lisättiin bi-lirubiinimäärät, niin että saatiin kolesteroliliuosnäyt-teet, joiden bilirubiiniväkevyydet vastaavasti olivat 1,3, 5 3,8, 6,3, 9,8, 12,0, 13,5 ja 18,3 mg/100 ml. Toista koles- teroliliuosta ja käyttöliuosta käytettiin nolla-arvon ka-libroimiseen.

Jokaiseen koeputkiryhmään injektoitiin rinnakkainen sarja 0,02 ml:n näyte-eriä, jotka sisälsivät eri biliru-10 biiniväkevyydet, ja reaktion näissä koeputkissa annettiin edetä 15 minuutin ajan 37°C:ssa. Mitattiin absorbanssit ja laskettiin kolesteroliväkevyydet käyttäen samaa menetelmää ja kaavaa, jota käytettiin virtsahapolle esimerkissä I.

15 Tulokset, jotka ilmoittavat kokeissa todetun koles- terolimäärän käyttäen alan aikaisemman käytännön mukaisia ja keksinnön mukaista koejärjestelmää eri bilirubiinivä-kevyyksillä, on esitetty taulukossa 2.

20 Taulukko

Todettu kolesteroli (saanto %)

Bilirubiini Mukana Ilman (mg/100 ml) K4Fe(CN)g K4Fe(CN)6 1.3 100,0 + 1,7 100,0 + 1,7 25 3,8 99,2 97,1 6.3 98,3 93,0 9,8 97,8 87,1 12,0 97,9 85,4 13,5 97,6 85,8 30 18,3 97,9 80,5

Kemiallinen häiriö kolesterolikokeessa ferrosyani-din puuttuessa on huomattava. Kuitenkin ferrosyanidin läsnäollessa häiriö pienenee niin voimakkaasti, että sitä 35 voidaan käytännössä pitää merkityksettömänä ainakin tasolle 18 mg bilirubiinia/100 ml saakka.

1« 77896

Esimerkki IV

Koevälinen kolesterolin määrittämiseksi seerumista koleste-rolioksidaasin ja peroksidaasi/3,5-dikloori-2-hydroksi-bentseenisulfonihappo/4-aminofenatsonin avulla 5 Valmistettiin koevälineet, jotka sisälsivät alan aikaisemman käytännön mukaisia ja esillä olevan keksinnön mukaisia koostumuksia, ja verrattiin niiden herkkyyttä bi-lirubiinin häiritseville vaikutuksille tutkittaessa kolesterolin esiintymistä seerumissa.

10 Valmistettiin kyllästysliuos alan aikaisemman käy tännön mukaan koostumukseltaan seuraavaksi: fosfaattipuskuri 100 mmol/1, pH 7,7 kolesteroliesterihydrolaasi 240 I.U./l kolesterolioksidaasi 120 I.U./l 15 peroksidaasi 2500 I.U./l 4-aminofenatsoni 0,5 mmol/1 3,5-dikloori-2-hydroksibentseeni- 10 mmol/1 sulfonihappo natriumkolaatti 3 mmol/1 2q Triton X-100 0,5 tilavuus-%

Kyllästysliuokset, jotka sisälsivät esillä olevan keksinnön mukaista koostumusta, valmistettiin täsmälleen kuten yllä lisäten kuitenkin 20 ^umol/1 kaliumferrosyanidia /K4Fe(CN)g7.

25 Whatman No. 17 suodatinpaperiarkit (Whatman, Inc.

Clifton, N.J.) kyllästettiin kyllästyspisteeseen kylläs-tysliuoksilla ja kuivattiin 60°C:ssa. Nämä arkit, jotka sisälsivät kuivatun kyllästysliuosten jäännöksen, leikattiin 2,5 mm x 2,5 mm kokoisiksi välineitten muodostamisek-30 si. Välineiden taustaan kiinnitettiin kaksipuolinen teippi ja ne kiinnitettiin samalla muovivarsiin.

Hankittiin seeruminäytteet, yhdistettiin ne ja tutkittiin niiden kolesterolipitoisuus (joka oli noin 200 mg/100 ml) ja bilirubiinipitoisuus. Yhdistetty seerumi 15 77896 laimennettiin sitten 10 tilavuudella tislattua vettä. Bi-lirubiinia lisättiin laimennettuun seerumierään väkevyyteeni 20 mg/100 ml saakka, jolloin saatiin koeliuos. Tämä koeliuos jaettiin tasaosiin.

5 Keksinnön mukaiset koevälineet upotettiin hetkeksi kolesterolikoeliuoksen yhteen näytteeseen ja alan aikaisemman käytännön mukaiset koevälineet upotettiin hetkeksi sen toiseen näytteeseen. Koevälineitten värinmuutos tutkittiin silmämääräisesti noin 10 minuutin kuluttua.

10 Keksinnön mukaisesti valmistetuissa välineissä esiintyi selvä värinmuutos, joka osoitti kolesterolin läsnäolon, kun taas alan aikaisemman käytännön mukaisissa koe-välineissä ei esiintynyt värin muutosta, joten ne tällöin virheellisesti ilmoittivat kolesterolin puuttuvan.

Claims (10)

16 7789 6

1. Koostumus virtsahaposta tai kolesterolista valitun analyytin määrittämiseksi nestenäytteestä, joka koostu- 5 mus sisältää a) mainitulle analyytille spesifistä entsyymiä, b) fenolia tai naftolia ja c) 4-amino-fenatsonia, tunnettu siitä, että koostumus sisältää myös ferro-10 syanidi-ionia sisältävää reagenssiainetta.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että fenoli on substituoimaton fenoli.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että fenoli on 3,5-dikloori-2-hydroksibent- 15 seenisulfonihappo.

4. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-3 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että reagenssiaine on ferrosyanidi-ionisuola.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen koostumus, t u n -20 n e t t u siitä, että ferrosyanidi-ionisuola on natrium- ferrosyanidi.

6. Patenttivaatimuksen 4 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että ferrosyanidi-ionisuola on kaliumferro-syanidi.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen koostumus virtsa- hapon määrittämiseksi nestenäytteestä, tunnettu siitä, että se sisältää a) näytteen virtsahapolle spesifistä oksidaasia, b) substituoimatonta fenolia, 30 c) 4-aminofenatsonia ja d) kaliumferrosyanidia.

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen koostumus kolesterolin määrittämiseksi nestenäytteestä, tunnettu siitä, että se sisältää 35 a) näytteen kolesterolille spesifistä oksidaasia, b) substituoimatonta fenolia, 17 77896 c) 4-aminofenatsonia ja d) natriumferrosyanidia.

9. Koeväline, tunnettu siitä, että se sisältää kantaja-aineen, johon on sisällytetty minkä tahansa 5 patenttivaatimuksista 1-8 mukainen koostumus.

10. Menetelmä koevälineen valmistamiseksi virtsa-hapon tai kolesterolin määrittämistä varten, tunnet-t u siitä, että kantaja-aineeseen sisällytetään minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-8 mukainen koostumus. 18 77896