JPS6075299A - エタノ−ル測色分析法およびその試験用製品 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 菰里旦光ｊ 本発明は、酵素介在の測色法分析の分野のものである。

本発明は、水性媒体中、とりわけ人体の流体中の低濃度
のエタノールを測定するための測色分析法および試験製
品に関する。

発明の背縫 水性流体中比較的低濃度、レリえば、０．０２５．０．
０５．０．１０または０．２０係のエタノールを測定す
るだめの、簡単だが正確かつ再現性ある方法に対する要
求が増大してきている。このような方法の１つの通常の
適用は、ハイウェー中毒またはしらふの試験として人体
の流体中のエタノール量を測定することであってもよい
。別の適用は、危険な装ｕ１例えば、重い構造物の装ｍ
または軍用装置、のオペレーターがアルコールによって
中１されていないことを確かめることである。このよう
な試、鹸用に週ばれる化学的方法は、１合の実験室操作
、例えば、血液または尿を分析するためのガスクロマト
グラフィー、および一連の実験室または野外の測色法試
験を含んでいる。１９３０年代末期から、ステイーブン
ソン社（５ｔａｐｈｅｎｓｏｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
　）の「酩酊測定器（Ｄｒｕｎｋｏ−ｍｅｔｅｒ　）　
Ｊが用いられてきた。この測色用機械は、呼気中のエタ
ノールが水性酸性過マンガン酸カリウムと反応して退色
する能力に依存している。

１９５４年には、ステイーブンンン社は、９町を測定す
るために呼気中のエタノールと酸性ニクロム酸カリウム
との退色反応に依存する、広く用いられる［ｆレスアラ
イブ−（Ｂｒｅａｔｈａｌｙｚｅｒ）　Ｊ’ｉ導入した
。これらの試験は、長い使用の歴史を持っているが、そ
れらは困難性と論争とを伴わないことはなかった。これ
らの試験は、移動困難なｔ−襲潤試薬、検量線の作成、
正しい読みを行なうに十分正当なレベルのオペレーター
を必要とする。こ几らの試験は、多量の試料の迅速な定
常的操作には、容易には適合しない。

直中のアルコール量の迅速な測定に対する別の適用は、
病院の救急室におけるものである。病院の救急室に一般
に入れられたすべての患者のうち約１／３の患者につい
て、その臨床状態の性質に関する正確な判′ｌ１ｊｒを
行なう目的で血中のアルコール量を試験する。このよう
な測定に対して簡単で迅速な方法が前には存在していな
かったので、現行の実施では静的血中アルコール測定の
ために、静脈穿刺によって血液試料？採取し、その試料
を実験室に運んで試験する。この操作は、３０分から数
時間を要する。

本発明は、酵素アルコールオキシダーゼを用いる。この
物質は、ノヤンセン（Ｊａｎ＋＋＋＋ｅｎ）等によって
Ｂｌｏａｈｅｍ　Ｂｌｏｐｈｙｓ　Ｒ＠ｓ　Ｃｏｍｍｕ
ｎ　（米国）１９６５年９月８日、２０．（５）６３０
〜４画に報告されており、現在ペーリンガー・マンハイ
ム・パイオケミカルズ社（Ｂｏｅｈｒｌｎｇｅｒ　Ｍａ
ｎｎｈｅｌｍ　Ｂｉｏ−ａｈｅｍｌｃａｌｇ　）％イン
ディアナーリス、ＩＮおよびフィリップス石油（Ｐｈ１
ｌｌｌｐｓ　Ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ）の子会社、フィリッ
プス・ケミカル社（ＰｈｌｌｌｌｐｓＣｈｅｍｉｃａｌ
　）によって販売されている。

アルコールオキシダーゼは、迅速に劣化し失活する、と
りわけ不安定な酵素である。この酵素は、フィリップス
によって、７０重ｉ％庶糖の溶液として販売されている
。この酵素は、ペーリンが−によって、多量の過酸化物
拮抗質である改元されたグルタチオンを用いて安定化さ
れた同体として販売されている。このアルコールオキシ
ダーゼは、Ａ酸化水垢を発生させてそれを定員すること
を必要とするこの分析に対して、許容できる形のもので
はない。多量の過酸化物拮抗質は、この要件金妨げる。

さらに、この酵素は、興味深いが、自動酸化を行ない、
その酵素自体との反応によって過酸化物を発生させると
いう取り扱い困難な性質を有していることも見い出され
た。

電極エタノール分析系におけるこの酵素の使５Ｈは、Ｃ
ｈｅｍ　Ａｂｓｔｒａｃｔｓ、１３５５８０ａｆ’Ｃ％
告されており、工、ソリ／グ（Ｅｇｇｅｌｌｎｇ　）等
のＵＳＰ４．２５０，２６１にｉ０載されている。マジ
キツクーシン（Ｍａｊｋｉｃ　−Ｓｌｎｇｈ　）および
ノ４−クス（Ｂｅｒｋｅｇ）は、Ａｎａｌｙｔｌｃａ　
Ｃｈｅｍｉａａｌ　Ａｅｔａ　＋　４０１〜５（１９８
０年）に、色バ体２．２′−アジノ一ノ（３−エテルペ
ンズチアソリン　−６−スル＊＄　−ト）（ＡＢＴＳ　
）　ｋ　％　アルコールオキシダーゼによって発生され
る過酸化水系と反応させる、エタノールの測定方法全報
告している。このに来力法を実施して、災験室装櫛の分
光光度ｈ１によって溶液の吸光度を測定する。この方法
は、結果の低下または変動全防止するための感受性の強
いアルコールオキシダーゼの注意深い取り扱いによって
も特徴付けられる。

ホプキンス（１（ｏｐｋｌｔ＋＋ｓ　）のＵＳＰ　４，
４３０，４２７も、溶液分析装置にエタノールオ牛ンダ
ーゼを用いている。

今や本タロ明によってめられそして提供されるものは、
水性流体、例えば、人体の流体、と力わけ唾液およ、び
全血、中のエタノール１度測定のだめの、永続性ある、
正確かつ１角１単な測色方法である。

発明の開示 今や、水溶液中のエタノールを検出し測定する製品およ
び方法が見い出された。この製品は、安定化された乾燥
形の酵素アルコールオキシダーゼ、過酸化活性？有する
物質、および過酸化水素と反応して異なる色の化合物を
与える酸素受容体を含む不活性支持体・寄ッド、を含ん
でいる使い捨ての試駆用ストリップである。

この製品葡、本質的に周囲榮件において、約０．３％エ
タノールまでのｉ’１ｌｌｌ定可能な濃ｆψのエタノー
ルを含有する水溶液と接触させた場合に、エタノールは
、酸素およびアルコールオキシダーゼと反応して過酸化
水素（Ｈ２Ｏ２）を発生させる。仁のｆ（、Ｏ□は、ペ
ルオキシダーゼおよび酵素受容体と反応して、エタノー
ル濃度に比例した量の有色イし合物を発生させるか消費
する。有色化合物の竜を、色強度を測定することによっ
て淘Ｊ定する。色強度を、反射系測定、例えば、反射率
分光光度計、を用いて、または標準との比較によって測
定することができる。従って、本発明の製品および方法
は、少なくとも２つの一般的使用領域における容易な適
用を見い出す。

別の見地からすれば、本発明は、前記試験用製品および
試験方法に用いられる、安定化形のアルコールオキシダ
ーゼ「安定化されたアルコールオキシダーゼ」を提供す
るものである。「安定化されたアルコールオキシダーゼ
」を、５〜８個の炭素および５〜７個のヒドロキシル基
を有する、安定化濃度の固体脂肪族ポリヒドロキシル化
合物と、所望ならば糖類２よびキレート化剤と、アルコ
ールオキシダーゼとを均質に混合することによりて達成
することができる。

本発明の必要な別の見地から、この酵素の自動酸化の順
向を、制御量の過酸化物掃去剤、例えば、アスコルビン
酸筐たはシスティン、と・−緒に混合することによって
除去または抑制する、中和された形のアルコールオキシ
ダーゼを提供する。

さらに別の見地から、本発明をエタノールの定性を行な
うより定量を行なうために用いる場合には、追加の制御
量の過酸化物掃去剤をアルコールオキシダーゼと混合し
て、より段階的な色質化を与える。

図面は、４つの図を含む。

第１図は、本発明の製品の極めて簡単な１幅様の、一定
比率でない拡大透視図である。

第２図、第３図および第４図は、本発明の製品の幾分か
より複雑な態様の、同様に一定比高でない拡大図である
。

本発ψ」の試験用製品を、エタノールに対して試験され
るべき水性物質の試料の吸収が可能な親水性吸収剤物質
から構成される・９ツド１０として、極めて簡単な形で
第１図に示す。前記・９ツドは、醇素系、および反応し
てエタノールに応じた色変化または発色をする、色変化
する酸素受容体を有する。・ヤッド１Ｏｔｌ−１天然の
または合成の吸収性物質から構成してもよい。／リド１
ｏは、以下に列挙する任意の水不溶性で親水性の物質か
らできていてもよい。前記水不溶性で親水性の物質は、
天然物質、例えば、セルロース、紙、綿、絹および架橋
したゼラチン、並びに合成物質、例えば、架橋したヒド
ロキシメチルアクリレートおよびアクリレート、セルロ
ース、硝酸セルロース、架橋シタポリ（ビニルアルコー
ル）、ポリ（ビニルアミン）、ポリ（ビニルスルホネー
ト）コポリマー、ポリ（スチレンスルホネート）および
スチレンスルホネート革位を有するコポリマー、Ｉす（
ビニルアセテート）、ポリ（無水マレイン酸）、ポリ（
ビニル２−メトキシエチルニーデル）、ポリ（４−ビニ
ルフタル酸）、ポリ（Ｎ−ビニルスルホネート）、ポリ
（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（メタクリル酸）１．
ｆ？す（アクリルアミド）、Ｉす（メタクリルアミＰ）
、ポリ（エチレンオキシド）等を含んでいる。前記親水
性物質は、ｒル層、多孔質または繊維質等であってもよ
い。セルロースおよびセルロース銹導体は、容易に入手
でき、十分に、働き、従って好ましい親水性基材である
。水性液試料を・ぐラド１０に適用する。基材・９ツド
１０を、適用される試料より小さな容積であるような大
きさにつくる。基材・ぞラド１０がル（料より大きいか
もしくは同じ容積である場合、試料・ゼットが試料の「
クロマトグラフィーを行なう」か互たは試料金「広げ」
て一様でない結果を生じさせるという問題が起こる。第
１図に示したように、）４　、、＋ド１０金必ずしも一
定の比に拡大して図示しない。通常、パッド１０は、約
０．０１＋ｍ〜０、５　ｌｌＩｍの厚さであり、最も普
通りこけ０．０５〜０．３０−の厚さである。

中毒に対して人をふるい分けするための本製品の適用に
おいては、水性試料は、全血、・４液または尿である。

血液を用いる場合には、最小的外傷の「指ｊ１ｊｌ、　
Ｊから得る５〜２０マイクロリ、トル容積の血液が極め
て好ましく用いられる。通常、新鮮な全血が試験試料で
ある場合、試験パッドの面積は、ｌＯ＋ｏ＋２〜１００
扁２のオーダー、とりわけ１０領２〜５０１１ＩＩ２の
オーダーでなければならなぃ。試料・ｆ２ドは、任意の
エタノールと反応して異なる色の、とりわけ濃背色の、
化合物を生ずる化学試薬および酵素を含んでいる。これ
らのことを以下に分脱して記載する。

第２図を参照するに、本発明の製品の第２の態様を示す
。この態様におい工、前記の・９ツド１０をハンドルｌ
ｏａに取り付ける。ハンドル１０ａは、試薬を含まない
他はノ！ツド１０と同一の物質であってもよいか、また
はそｉｔは、例えば、第３図Ｖこ関して裏材として記載
する、異なる物質であってもよい。

第３図において、裏材１１に取り付けた吸収剤・臂ッド
１０をよんでなる、本発明の製品の別の態様を示す。裏
材１１は、好ましくは、水性試料を吸収しない材料から
なる。裏材１１を、グラスチック、木、疎水性紙製品、
例えば、撥水剤処理（７た板紙素材、厚紙等から構成し
てもよい。１つの特別の態様において、・ヤッド１０が
少なくとも部分的に透明または不透明でありかつ＾材１
１が拡散反射面を与えるように、裏材１１および・９．
ド１０を選ぶ。試験用製品に対するＯの構成のおおむね
および拡散反射性計器を用いたその使用は、本願と共通
に鎮護された係属中の米国特許出願（ＵＳＳＮ）４３８
．３９９に開示され、特許請求の範囲に記載されている
。

第４図において、半透性の透明な「膜」１２で・臂ッド
１０１上魚すする、本発明のさらに別の態様を示す。こ
の膜は、低分子、例えば、水およびエタノール、に対し
て透過性であるが、全血球および同様な高分子に対して
は不透性である。このような膜は、血中グルコース測定
装置の技術に開示されている（ゾエンシｗ　（Ｇｅｎａ
ｈａｗ　）のＵＳＰ４．２１１，８４５およびマスト（
Ｍａｓｔ）のＵＳＲ３，２９８，７８９を参照されたい
）。これは、全血中のエタノールの定量に対して好まし
い方法である。

エチルセルロースは、前記定量の場合の適用および研究
に用いられてきた。他の同等の物質、例えハ、酢酸セル
ロース、ゾロピオン酸セルロース、ポリ酢酸ビニルおよ
びポリメタクリル酸メチル、をさらに用いることができ
る。この膜は、大きな物体（すなわち、全血球）によっ
て着色される血液のようなｔｙ＋ｃ、体中でアルコール
量を検出する場合に、好都合である。この膜は、前記着
色した血球や試薬・ぞラドの中へ入れない。色変化を測
定する前に、前記血球を洗い流すかまたはふき取ること
ができるので、前記血しＲは、試薬・９．ド中の色変化
に彫＃を与えない。

第４図の膜１２の図示は、このような膜の１つの可能な
形を陵、明しており、膜がどのように働くかについての
理解を容易にするものである。しかしながら、最もＪ１
ｎ常の、（態様においては、この上塗り層を、トルエン
、ベンゼンなどの如き水工ｉ′Ｚ　Ｊ、！性有機溶剤中
の、乾燥されるべき、溶液又は“ワニス“として前記・
９ツドに適用する。この方法で形成した物質の電子頒イ
＋及鏡写真は、ＭｊＪ記上塗り層が、正確には第４因に
示した分離したホ位とはなっていないで、むしろ、）９
ツド１０を構成する個個の繊維を塗布していることを示
している。２つの態様は、具現化として働くものであり
、膜１２の定義内に含１れるものであろう 所望ならば、塗布１２を含む・９ツド１０を、図示しな
い保護用カバーによりて偉う。この力・臂−は、使用時
には取り除くが、使用前には・ヤ、ド１０の周りに取り
はずしができるようにシールする。

この□カバー金、箔、防水加工紙、または水−酸素およ
び光−不透過性の保護用プラスチック、例えば、ポリ（
エチレン）またはポリ（塩化ビニル）等からｆノ４成す
ることができ、ぞしてこのカバーによって、試験時にこ
の製品を使用する前１で７４’ワド１０中の酵素および
化学物質を崩壊から保護する。

・ｆウド１０は、試薬系を含んでいる。この試薬系を、
安定化されたアルコールオキシダーゼ、ペルオキシダー
ゼおよび色変化する酸素受答体から構成する。この糸は
、さらに他の物質を含んでいてもよい。「安定化された
アルコールオキシダーゼ」を、５６℃で１５日間、乾燥
形で貯賦した場合Ｖこ少なくとも５０俤の活性そして好
ましくは少なくとも７０多の活性を保持するアルコール
オキシダーゼを意味するものと定義する。本発明の好ま
しい態様によって、これらの試験条件下で少なくとも９
０嚢の活性を保持する　「安定化されたアルコールオキ
シダーゼ」を得ることができる。

安定化されたアルコールオキシダーゼは、本発明の重要
な要素であり、最も簡単な形において、前記アルコール
オキシダーゼは、有効安定（？Ｊ９度）、５〜８個の炭
Ｆ＜および５〜７個のヒドロキシル基を有する固体脂肪
族化合物と均質混合状態のアルコールオキシダーゼを含
んでなる。好ましくは、安定化さ１１．たアルコールオ
キシダーゼは、本質的に中性のｐｌ（まで緩衝され、キ
レート化剤、とりわけアミン多酸をも含んでいる。さら
に、所望ならば、ＦＪｎ記安定化され７ヒアルコールオ
キシダーゼは１、ＩＡ！１類を含んでいる。

アルコールオハ・シダーゼは、市販であり、２つ）販売
元、ヘーリンｔｔ−・マンハイム・バイオケミカルズ社
（ＢＭＢ）およびフィリ、ブス・ケミカル社から入手可
能である。前記２社はいずれも供給者ではないが、本願
明細、瞥に記載の適用に適する酵素の形を開発すること
が可能であった。ＢＭＢは、多値の、過酸化物掃去剤で
ある還元されたグルタチオン音用いて安定化した乾燥形
の前記酵素を販売している。このｍ％累の形は、過ｒ浚
化物化学に基づく分析的通用に用いることはできない。

それは、多量のグルタチオンが、杉１１を及ぼすからで
ある。フィリッグス・グミカルは、安定な乾燥形の前ｄ
己酵素に開発することができなかったので、冷凍状！ｄ
で１．１送され貯蔵される前記酵素の溶液のみを販売し
ている。しかしながら、この溶液を、本願１３１細書に
記載の方法を用いて安定な乾燥形に変成することができ
る。用いる酵素量を、慣例的に、酵素活性の単位、すな
わち、５００単位等、によって表わす。新鮮な場合の市
販溶液は、通常、約１０００牟位／ｄを有している。

安定化されたアルコールオキシダーゼ中に用いられる固
体脂肪族ポリヒドロキシル化合物は、５〜８個の炭素お
よび５〜７個のヒドロキシルを有している。好ましくは
、５個まｆＣは６個の＋２（素を有している。また、好
ましくは、それは非＄１．湿性である。これらの中で好
ましい物質は、５〜８個の炭素および５〜７個のヒドロ
キシル基、好ｌしくは５〜６個の炭素を有する、固体多
価アルコール（ポリオール）である。このような物質の
例は、マンニット、ソルビット、ブルシッ）（ｂｌｕｃ
ｊｔｅｌ）およびイノジットである。マンニットは、好
ましい多価アルコールである。

キレート化剤値、金属イオンとのキレート諧体を形成す
ることができる物質である。アミン多酸、例えば、エチ
レンジアミン四酢＆　（ＥＤＴＡ　）またはエチレンジ
アミン五酢酸、グロビレン１．３−ジアミン四酢酸等、
およびとりわけ２〜３個のアミン基および４〜７個の脂
肪族酸基、とりわけ酢酸基を含有する２〜４個の炭素の
アル中ルーｆｉ？リアミン多酸が好ましい。ＥＤＴＡは
、入手容易性ゆえ最も好ましいキレート化剤である。

安定化されたアルコールオキシダーゼを、さらに、好ま
しくは、水に溶解した場合に６〜９の範囲の、好ましく
は７〜８の範囲の、−１を与えるように緩衝する。これ
を、混合物に、緩ｉ■の不活性緩価物質、例えば、アル
ηり金属燐酸塩またはピロ燐酸塩、マレイン酸のアルカ
リ金属塩またはイミダゾールを加えることによって達成
することが可能である。

しかしながら、好ましくは、用いられる緩衝剤は、双性
イオン緩衝剤、好ましくは、グツド（Ｇｏｏｄ）の緩衝
剤、とりわけモルホリノスルホン酸またはピペラジンス
ルホン酸である。これらの物質の例は、３−（Ｎ−モル
ホリノ）プロ／４′ンスノ ルホン酸（頭字ユ・丑［ＭＯＰＳ　Ｊ　）、Ｎ−２−ヒ
ドロキシエチルピペラジン−ｇ−２−エタンスルホン酸
（ｒ　ｕｇｐｇｓ　Ｊ　）、２−（Ｎ−モルホリノ）エ
タンスルホン酸（ｒＭＥｓＪ）、およびピペラジン−Ｎ
、Ｎ’−ビス（２−エタン−スルホン酸）（ｒ　ＰＩＰ
ｇＳ　Ｊ　）であ′る。これらの物質は、遊離酸および
塩として販売されている。酸または塩基を用いて所望に
−をルー整するために、前記遊離酸または塩のいずれか
の形、またはそれらを組合せた形を用いることができる
。これらの特別の媛薊剤ハ、（リアルコールオキシダー
ゼがより安定して存在すること、および（２）アルコー
ルオキシダーゼが燐酸塩緩衝液等よシこれらの緩衝液中
でより容易に溶けること、という２つの利益を提供する
。

所望ならば、安定化された酵素系は、さらに糖類を含有
している。アルコールオキシダーゼの１つの市販品は、
実質量の蔗糖を含有している。さらに、他の同様な単傭
類、三糖類または三糖類を加えてもよい。これらは、例
えば、ガラクトース、フルクトース、マルトース、セロ
ビオースおヨヒラフィノースを含んでいる。

安定化猿のポリヒドロキシル化合物は、アルコールオキ
シダーゼと共に存在する。「安定化５ｔ」または「安疋
化濃度」は、本願明細書中で定義した用語「安定化され
たアルコールオキシダーゼ」を達成するに十分な量であ
る。一般に、このようす童ハ、アルコールオキシダーゼ
よシ過剰址のポリヒドロキシル化合物の墓を含んでいる
。規準として、通常、１０００単位の酵素当り約０．３
〜２．５ｇのポリヒドロキシル化合物を用い、好ましく
は、１０００単位のアルコールオキシダーゼ当９０．４
〜１．２ｙのポリヒドロキシル化合物を用いる。

キレート化剤の蛍は、通常、ｔｏｏｏ単位蟲り約２〜約
５０ダの範囲にあり、好ましくは１０００単位当υ約４
〜約２５ｍ９の量を用いる。

所望の糖類が存在する場合には、前記菌類は、通常、ポ
リ（ヒドロキシル）化合物に基づいて、約２倍ｉ！ｉ剰
量までの童で存在する。所望ならば、２柿もしくはそれ
以上の任意の物質群の混合物を、安定化された酵素系中
に用いることができる。

例示として、本発明に有用な代表的な安定化された酵素
系の一群を、第１表中にリストする。これらの糸を、本
発明の最終製品中の乾燥化学混合物中に存在する乾燥ア
ルコールオキシダーゼの重量に基づいて重量部で表わす
。

以下余白 第１表 アルコールオキシダーゼ　ｔｏｏｏｓ−位ポリヒドロキ
シル化合物　３００〜２５０　Ｑｔａｙ中レートし剤　
２〜５０ｍ９ 緩衝剤を加えて　ｐ１４５〜９ アルコールオキシダーゼ　１０００１位マンニ、トおよ
び／″ｉたはソルビット　４００〜２０００ηアルキル
ポリアミン多酸　２〜５０ｍＩ／燐ぼ塩綬衝斉すを刃口
えて　−７〜８ アルコールオキシダーゼ　１０００単位マンニット　４
００〜２Ｏ−００１９ ＥＤＴＡ　２〜５ダ Ｊｒａ塩緩南剤を加えて　−７〜８ アルコールオキシダーゼ　１０００単位マンニット　４
００〜２０００ダ ＥＤＴＡ　２〜５０ダ 糖類　４００〜２０００ダ 緩衝剤ｆ、）ＪＱえて　−７〜８ 前記安定化された酵素系に不活性物質等を加えることに
よっては本発明の教示を逸脱しないことは、当業者に容
易に理解されるところである。しかしながら、通常は、
他の安定化剤の添加は必要でなく、実際には、酵素を安
定化すると考えられる多くの他の物質は、添加された場
合、有害である。例えば、アルカリ金属チオ硫酸塩、ポ
リビニルアルコール、グリセリン、カゼインおよびウシ
血清アルブミン、すべての可能な安定化剤は、実際に、
アルコールオキシダーゼに対しては不安定化剤である。

少量のこれらの物質が、本発明の精神を逸脱することな
く組成物中に存在するかもしれないが、本発明の機能お
よび目的に実質的に有害な効果を及ぼす、このような少
量物質を排除することが好ましい。

好ましいＮｇ、およびＬｅｎｈｏｆｆ系またはその変形
の場合には、ツメチルアミノ安息香酸（ｒｎＭＡｎＪ）
または同様のジ（低級アルキル）アミノ安息香酸を、３
−メチル−２−ベンゾチアゾリン（ｒＭＢＴＨＪ）また
は同様の３−吐吸アルキルー２−ベンゾチア！リンと反
応させて、インドミン（ｌｎｄｏｍｌｎｅ）色素を与え
る。この反応は、ＤＭＡＢ：ＭＢＴＨ（またはその類似
物）のモル比が１．０以下、とりわけ０．８以下に制御
された場合に、よりよい分析結果、とりわけ極めて広い
動的範囲を与えることができる。これを、ｌまたはそれ
以上のモル比を用いるＮｇＯ等の文献の教示とは反対で
ある。好ましい比は、０．１〜０．６である。

前記試薬系は、過酸化活性を有する物質を含んでいる。

この物質は、エタノールと０２との反応によって発生し
たＨ２Ｏ２と、色変化する酸素受容体との反応を促進す
る。最も普通には、植物の酵素ペルオキシダーゼ、例え
ば、西洋わさび（ｈｏｒｓｅｒａｄｌｓｈ　）のペルオ
キシダーゼまたはじゃがいも（ｐｏｔａｔｏ　）のペル
オキシダーゼが好ましく、それらを用いるが、過酸化活
性を有する種種の他の有機または無機の物質を用いるこ
とができる。これらのｖＡ質に、有機物質、例えば、所
定のポルフィリン、並びに、無機物質、例えば、アンモ
ニウムまたはアルカリ金属ヨーシト、アルカリ金Ｊｔ’
ｉ　硫（Ｒクロム、フェロシアン化法（■）、塩化第一
鉄およびチオシアン酸鉄尋を含めることは、公知である
。過酸化活性を有する物質は、Ｈ２Ｏ２と色変化する酸
素受容体との反応を促進する。適当な酸素受容体は、還
元状態から酸化状態に変成される場合に、視覚的に検出
可能な色変化を行なうものである。多数のこのような物
質は、従来、主としてグルコース分析の関係において開
示されてきた。

ベンジジンは、グルコース分析において酸素受容体とし
て用いられてきたが、発癌性の問題を有している。３，
３．５．５−テトラアルキルベンゾジンは、ＵＳＰ　４
，２１１，８４５によって、グルコース分析における酸
素受容体として示唆されている。ＵＳＰ３．６３０，８
４７は、色形成酸素受容体として一群の・４ラヒドロキ
シルまたはノ９ラアミノビリジンをにｌ示している。Ｎ
ｇｏおよびＬｅｎｂｏｆｆによるＡｎａｌＢｌｏａｈｅ
ｍ　、　１０５　、３８９〜９７　ｇ（１９８０年）は
。

再びグルコース分析装置直に、ジメチルアミノ安息香酸
および３−メチルベンゾチアゾリノンを用いることをυ
目示している。リヒタリヒ（Ｒｌｃｈｔｅｒｌｃｈ）等
による原本Ｃ１１ｎｌｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ゾ
、ン・ウィリーおよびサンＪｅ（Ｊｏｈｎ　Ｗｌｌｅｙ
　＆　５ｏｎｓ　）。

３６６〜３６７頁には、グルコース分析における酸素受
容体として、０−シアニシジン、０−トリジン、２−２
’−アズインジー〔３−エチルベンズチアゾリンスルホ
ン酸−（６）　）のアンモニウム塩、３−メチル−２−
ペン！チアゾリノンヒドラ！ン／Ｎ、Ｎ−ツメチルアニ
リン、およびフェノール／４−アミノフェナジンが論じ
られている。これらの物質は卓に代辰的なものであるに
過ぎないということが強調されるべきである。本発明は
、任意の特定の色変化する（すなわち、色形成するまた
は退色する）酸素受容体系に限定されるものではない。

通常、工１２０２　と反応してＩ（２０□の址に比例し
た色変化を与える任意の系を用いることができる。

したしｌがらＮｇＧおよびＬｏｎｈｏｆｊ　の色形成系
はすぐれている。それは、向い吸光係数を有し工いる。

すなわち、極めて強い色のものであり、その青色は極め
て特有でろる。

酸素受容体の量は変化することが可能であるが、部分的
に１ｔＪｖｈられる物質に依存している。大ざっばには
、酸素受答体の計は１ｏｎｓ単位のアルコールオキシダ
ーゼ当９約５〜約１０００Ｉｎ９の範囲にあるが、１０
００単位のアルコールオキシダーゼ当りｌθ〜約４００
　＋６９の社が好゛ましい。

係属中のＵＳＳＮ　４３８，３９９においては、本発明
の概略的も゛イ成の測色法分析が色終点または色の変化
率に基づくことが可能であることが開示されている。こ
の出願明細書中、変化率測定法がしばしばより正確な結
果を与え得ることが指１商きれている。本発明において
は、終点測定を用いることが好ましい。それは、変化率
の場合には、存在するエタノールｆｉ（すなわち、所望
の・９ラメータ）ばかりでなく、アルコールオキシダー
ゼの活性（所鼠でない・９ラメータ）にも依存し得るか
らである。

前記ＵＳＳＮ　４３８，３９９に記載の、通常の変化率
測定およびその測定方法を特に用いることもできるが、
好ましいものではない。

単にエタノールの存在の有無の表示を与えるためにだけ
試験装置を用９る場合には、色変化する物質および酵素
安定化系の特徴および量を、識別して測定可能なエタノ
ール依存の色変化の終点の発色である結果のみを有する
極めて強くかつ極めて迅速な色変化を与えるように、選
択することが可能である。

発明の背景で指摘したように、アルコールオキシダーゼ
は、安定化された場合でさえ、自動酸化反応を行なう。

このことは、糸が誤った陽性の終点音導え得ることがあ
るということを意味している。この問題点は、試薬混合
物に制御式れた中和量の過酸化物掃去剤を加えることに
よって自Ｕｌ酸化から生ずる過酸化物の官能価を中和す
ることにより防止することができる。このような物質は
、アスコルビン酸、システィン、Ｃ−１元されたグルタ
チオン、および尿酸を含んでいる。中和量は、特別に、
１０００単位のアルコールオキシダーゼ当す０．２〜１
２モルおよび、とりわけ４〜８モルであると規だする。

このよ５な添加は、’Ａ−）ｆｃ陽性を防止しかつ明白
に測定可能な終点を生じさせる。

よ゛り通常の適用において、所望には、エタノールの存
在を同定するのみならず存在するエタノール量全定にす
る。この場合には、色変化の程度を、用いた試薬、（濃
度等に基づいて選択すべきであり、そのことによって試
験試料エタノール量に依存する検出可能な幹、囲の色変
化を与える。このような試験においては、色変化発現に
対する適当な期間の後、色を読み取り、そしてその色変
化に基づいてエタノール濃度を測定する。

試験製品に迫力ｎのｉ酸化物掃去剤を添加することによ
って、色変化の程度を緩２１することができる。この添
加は、異なるエタノール祉の場合に見られる色変化の間
により良好な分離を与える効果を有している。通常、１
０００単位のアルコールオキシダーゼ当り４〜８０ｍ２
の掃去剤の添加が働＠、’１０００単位当り４〜２０モ
ル、とりわけ４〜８０モルの場合は、種々のエタノール
量間で色変化の分離が小さいが、同時に低エタノール量
に対してより大きな絶対感度を与える。一方、この範囲
の高い方の側、すなわち、１０００単位当り２０〜８０
モル、とりわけ４０〜８０モルでの添加の場合は、絶対
感度は低いがよシ大きな分離を与える。

エタノールを定量する場合の、色変化発現の時間は、通
常、約１０秒〜数分である。通常、終点の少なくとも９
５チに鴫しい値は、前記時間範囲内で達成される。エタ
ノールは、通常、エタノール金含有する水性試料よシ渾
発注であるので、エタノール分析体の４先蒸発を防止す
るために使用時に試験用製品を覆うかまたは包むことが
必要であるかもしれないというこに注；ｔ＜　して、長
時間の発色を行なうことができる。

エタノールの反応によって生じた色変化の種間（ｉｌ−
４ｆｆｌ々の方法で測定することができる。２つの手動
方法は、試験試料をブランクと比較すること、および試
験試料を、適合するまで、各々が所定のエタノール量を
表示する一連の標準と比較することを含む。

分光光度計等を用いて、好ましくは、実質的色変化、す
なわち総色変化の９０＋係、を与えるに十分な時間間隔
の後に試験試料とブランクとを比較するか、または、や
や好ましくは、２点またはそれ以上の時点の間の試験試
料の吸光度の変化を測定することによる測定によって、
色変化を機器で測定することも可能である。

機器による色変化の測定を、色変化を検出し得る波長で
の、反射屈または吸収小測定によって婁施することがで
きる。前記の如く、反射ぶ測定を用いる場合には、ＵＳ
ＳＮ４３８，３９９に開示の装置および／または試験法
を用いてもよい。

本発明を用いて試験される試料は、水性試料。

通常は人体水性流体、例えば、全血、血清、血漿、唾液
等である。全血および唾液は通常の試験試料である。こ
れらの流体のアルコール量は互いに関係があり、そして
さらにこれらのアルコール量は人の中襟の程度に直接関
係しているということが、よく文献に示されている。例
えば、ＣｌＩｎ、　Ｓｅｌ。

（英国）、乞１％Ａ３．２８３〜２８６頁、１９７９年
およびＣｌＩｎ、　％、　Ｐｈａｒｍａａｏｌ、　地Ｌ
す１ユ（英国）、旦、跪１．５３〜５９頁、１９７９年
を参照されたい。尿が試験試料であってもよいが、その
アルコール量は、消費したアルコール量だけでなく抽々
の他の要因にも依存しているので、その清は中毒測定に
は適さない。

試験される試料が、（垂液、尿または同様に薄く着色し
た物質である場合には、第１図から第４図のいずれの製
品を用いてもよい。試料が濃く着色された全血等である
場合には、必要というわけではないが好ましくは、全血
球を排除して色変化の迎］定に関して全血球による障害
を防止し得る膜を有する、第４図に示した製品を用いる
。

最も広い意味において、本発明試験方法は、試料を試験
用ストリッジに適用すること、色変化を生じさせること
、色変化の程度または率を測定すること、１ツυ記測定
量とアルコール量とを関連させること【含んでなる。例
えば、全血について「膜」ストリッジを用いる場合の試
験の原案を以下のように示すことができる： ■、新鮮な全面の試料（ｌＯ〜３０マイクロリットル）
をテストストリップの・ぜ、ドに適用する。

２．２０〜４０秒後、適用したストリッジから、赤血球
をふき取り、そして過剰の試料を除去する。

（時間を一定にしなければならない。）３、　色変化ま
たは発色のために２０〜９０秒間待つ。（同様に、時間
を比較的一定にしなければならない。） ４、手動でまたは機器によって色変化を読み取る。

５、　色の読み取りを標準の足置因子等を介してエタノ
ール量と関連させる。

膜製品會用いる場合には、他の試料についてもこのタイ
プの原案を用いることができる。

膜なしのストリッジを用いる場合には、色変化の程度ｒ
よ、しばしばより大きいかまたはよυ著しいものであり
得る。それは、試料が十分に・ンツドを飽和し、多量の
反応が・起こることがあるからである。このような製品
を用いる場合の、典型的試験原案を以下に示す； １、新鮮な試験液体の試料を、ノ！ッＰを＠和させる以
上の量で試験用製品の・譬、ドに適用する。

（１０マイクロリ、トルまたはそれ以上。）２、　３１
Ａ刺の試験液体をぬぐい取る。

３、色変化または発色をさせる。（通常、総変化の約９
５％が２分間以内に、９９＋チが４分以内に起こった。

Ａ発を最小にする場合には、最も艮好な結果が得られる
。） ４、　色変化を読み取る。

５、ｍｔｌ記の如く、エタノール量に対して色変化ｆ、
関連づける。

変化率測定方法を用いる場合には、前記方法を分光光度
計によって実施することが通常量も好ましい。ｏｆ＋記
分光光度計は、試料が・ゼットと接触さ・れた時点から
測定して２点もしくはそれ以上の時点で読み取り上行な
い、これらの航み取りから変化名′！ｌ−計４し、そし
てこの変化率から自動的にエタノール量を与え得るもの
である。このような装置は、ＵＳＳＮ　４３８，３９９
にさらに十分に記載されている。

本！６明の試験製品の製造方法は、通常の意味において
、酵素、過酸化的活性物質、安定化剤および色変化する
酸素受容体の溶液を形成すること、その溶液？再現可能
な黛および方法で・母、ド基材に適用すること、および
その溶剤を蒸発させて前記基材上に前記の物質群を沈着
させることを含んでいる。通常の溶剤は、水、および水
混和性の（すなわち、極性の）不活性有機溶剤、例えば
、ＤＭＦ％　ＴＨＦ％　ｐＭｓｏ　、アセトンまたは他
のケトン、アセトニトリル等、との組合わせの水から選
ばれる。明らかに、アルコール量用いるべきではない。

これらの有機溶剤を、通常、しばしば水のみの場合には
Ｉ２すかしか可溶でない色変化する酸素受容体化＠物の
′５１溶化を助けるように用いる。

構成する溶液中の成分濃度は、アルコールオキシダーゼ
についてはｍｌ当り約２０〜約５００草位まで、とりわ
け５０〜３００単位まで変化してもよく、他の成分は、
前記割合で存在する。溶液を、通常は、エタノールオキ
シダーゼを除いたすべての物質を混合し、最後にエタノ
ールオキシダーゼを添加することによって構成する。い
ったん混合したならば、溶液をできるだけ早く使用する
ことが通常最も好ましい。本発明の試験用製品の乾燥を
、通常は、温和な条件、例えば、１５〜３０℃で真空、
に訃いて実絢する。同様に、Ａｉｌ記試験用製品を、冷
却乾燥環境中に、理想的には実質的に酸素との接触がな
い環境中に、貯蔵することが好ましい。しかしながら、
いったん使用に付した場合には、試験ス）　ＩＪツブは
、極めて安定であり、２週間またはそれ以上一定の色を
保持する。このことは、ストリッジが空気、湿気または
適度な高温と接触していてもいなくても同じである。

実施例 本発明を、代表的な、水性流体中のエタノールの測定用
製品の製造および使用？、説明しおよび本発明のもので
ない他の製品とこれらの結果とを比較する、以下の実施
例および比較実験によってさらに説明する。本実施例は
、本発明を説明するためにのみ提供するものであって、
本発明の範囲を限定するものと理解されるべきものでは
ない。

実施例Ｉ 水性流体中のエタノール濃度を測定するため、の試験用
製品を製造した。この製品は、色形成酸素受答体として
、ツメチルアミノ゛安息香ｔｇ　（ＤＭＡＢ）および３
−メチルベンゾチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）ｒ
ｆ用いる、ＮｇｏおよびＬｅｎｈｏｆｆ　５Ａｎａｌ　
Ｂｌｏｃｈｅｍ、１０５．３８７〜９７頁（１９８０年
）の系に類似した系を使用した。

ＤＭＡＢ　（７２ｔｖ　）と０．５ｄのアセトニトリル
および１．　Ｑ　ｍｌの０．４そル燐酸二ナトリウム媛
両液とを混合することによって、紀ｌ溶液を調製した。

前記緩衝液は、ＤＭＡＨの大部分を脱プロトン化させて
溶解させるレベルのＩｌｋ有していた。ＥＤＴＡ二ナト
！ｊ　’）ム（２，４ａ＋＃）１０ｒｎｆ／／ａｔ　溶
液）を加え、次いで（本質的に飽和まで）　４．　ｌ　
ｍｌの脱イオン水および１５０Ｑｙ＋ノのマンニットを
加えた。この溶液を暖め、マンニットを溶解させ、室温
まで冷却し、セして６ダのアスコルビン酸を加えた。こ
の系に〃口元たアスコルビン酸の量は重要である。それ
は、アスコルビン酸の量が、系の「検量」手段として働
くからである。多量のアスコルビン酸はシステムの発色
を遅らせるが、少量のアスコルビン酸はよシ迅速な発色
を可能とする。溶液の声を、ＮａＯＨを用いて７．２に
調整した。次いで、１０８単位／　ｒｑの酵素活性ヲ有
する西洋わさび（Ｈｏｒｓｅｒａｄｌｓｈ）のペルオキ
シダーゼ（１（ｌり）を激しい混合下に加えた。この溶
液を一時間に貯蔵した。長期間の貯蔵に対しては、ガス
抜きおよび／またはＮ　ガスシールによって酸素接触全
最小にすることが有利である。

８−の５０１５０水／アセトニトリル中に１４４ηのＭ
ＢＴＨを含むように第２溶液を構成した。溶液の−’ｋ
、ＮａＯＨを用いて７．２に調整した。

７０チ庶糖水中アルコールオキシダーゼ（１０００酵素
単位／ｍ）の溶液を得た（フィリップス石油）。

最初の２つの溶液？、４容量部対１答量部の比で混合し
、約４℃まで冷却した。１容量部のアルコールオキシダ
ーゼ終液（４℃）を加えた。

下記のような混合溶液を得た： ６ｍｙ１ｍｌ　ＤＭＡＢ ５ダ／ａｒｔ　ＭＢＴＨ ２ｎ９　／ｒｒｒｌ　Ｎａ　２　ＥＤＴＡｏ、０３Ｍ　
燐酸二ナトリウム ■２．５俤　マンニット １４チ　蔗糖 １２％Ｖ　アセトニトリル ０．５ｍ９７ｍ１　アスコルビン酸 ０、８３１９７Ｍ　ペルオキシダーゼ １７００　単位／ｍｌ　アルコールオキシダーゼこの混
合物（１，０，７１））をガラス機上に広げ、３　ａｎ
　Ｘ　３　ｃｍ片のワットランナ５４１紙をこの混合物
上Ｋ　ｍかに置き、溶液の「吸上」を最小にしかつ飽和
の均一性が最大になるようＫした。飽和した紙を、反対
の面を飽和させるように裏返し、その板から取り上げ、
別の板上に置き、１００　ｍＨｇ絶対圧の２０〜２２℃
の真空オーブンで３０分間乾燥させた。次いで、この紙
を、シリカダル乾燥剤を有するシールされた容器内で、
１６時間、７６０閣Ｈｇ、２０〜２２℃に保持し、ｆ＆
終的痕跡量の液体を除去した。

前記の処理紙を、０．５のＸ０６６備片に切断し、３Ｍ
のす４６５両面透明透明剤を用いて白色ボリスチレン支
持体に取９付け、試験製品をつくった。

これに代えて、好ましくは、溶剤（トルエン）を用いて
ポリスチレン表面を軟化きぜ、軟化したプラスナックに
紙を粘着嘔せることによって紙を取シ付けることができ
ろう １２日間５６℃で加圧後、前記のように製造した紙は、
１００　ｈｌｙ７ｄｌエタノールで発色させた場合、実
質的に、光音に色を保持している。

実施例Ｉ１ １つの変化以外は、実施例Ｉの製造方法を実質的に縁り
返した。含浸紙を軟線後、この紙を、トルエン中１．０
重Ｎ％のエチルセルロース溶液テ上塗りし、次いで、真
空中２０〜２２℃で乾燥させ、微分子不透過性塗膜を得
た。

１４日間５６℃で加圧後、前記の如く製造した紙は、１
００ｍ９７ｄｌのエタノールで発色させた場合、大部分
そのもとの色を保持している。全血と共に用いて前記血
中のエタノール量を測定する場合、このストリップは、
全血球がストリ、７″に入いるのを許容しないという利
益を有しており、従って容易に全血球をストリップから
ふき取ることができる。

実施例ｉｌｌ 以下の変化を行なった以外は実施例■の製造方法を２回
繰り返した。第１の繰り返しにおいては、０．５　ｔｎ
９　／　ｍｌのアスコルビン酸の代わりに１．０Ｉｎ９
７ｍｌのアスコルビン酸を用いた。第２の繰り返しにお
いては、アスコルビン酸き用いなかった。第１のストリ
ップは実施例■のストリップより緩和されておシ、試験
試料中の低いエタノール量に対しては感度が小さいが、
異なるエタノール量の試料間では良好な色分離を与えた
。アスコルビン酸を含まない第２の試料は他めて敏感で
あったが、試料間の分離は不良であった。

実施例■ ＤＭＡＢおよびＭＢ’ｒＨＯ代わシＫ、単一の１１２素
受容色素成分、６−ジ−メチルアミノ−４−ヒドロキシ
−２−ナフタレンスルホン酸ＣＤＭＡＩＮ　）　を用ｉ
て、実施例１に類似したエタノール用試験製品を製造し
た。第１の溶液ｙ、　ＤＭＡＢ　？ｌ−除外して、実施
例ＩＫ＋４己載のように製造した。第２の浴液を、ＭＢ
ＴＩ（の代わりＫＤＭＡＮを用いて、実施例ＩＫ記載の
ように製造した。水性エタノールで発色させた場合、製
造した紙は、Ｑ　ｔ・ψ／ｄのＥｔＯＨで淡褐色から２
００　Ｉｎ９／ｍｌ　（１）　ＥｔＯＨテ金色を帯びた
橙黄色まで変化する色を与える。

比較実験 基準として、比＠実験Ｈを実施した。これは、安定化剤
を含めない以外は実施例ＩのＪｉｌり返しであ−）た。

すなわち、マンニットおよびＥＤＴＡを除外した。市販
のアルコールオキシダーせ中の庶塘が存在していた。３
７℃で１８日間の貯蔵後、前記の如く製造した紙は、１
００ノｎｙ　／　ｔｔｔのＥｔＯＨで発色させた場合、
その色の６８俤を損失していた。

この結果を、当業者に公知のいくつかの酵素安定化剤成
分を用いて行なった他の比較実験の結果と一緒に、実施
例Ｖの次の表中に示した。

比較実絵入 ＥＤＴＡを除外し、２　ｃｙ／／ｎｌノカセインｔｍ、
ｔ、そしてＱ、　３　Ｌｙ　／　ｍｌのアスコルビン酸
を用いた以外は、実施例■の製造を実質的に繰り返した
。カゼインは、酵素安定化剤として公知である。３７℃
で１８日間の貯蔵後、前記の如く製造した紙は、１０．
０ｓｙ／ｓのｇｔｏｕで発色させた場合に、実質量の色
を失なっていた。このことは、実験Ｈとの比較によって
、カゼインが効果がなく、おそらく有害であるというこ
とを示している。

比較実験Ｂ マンニットを除外し、そして０．３　Ｍ　トリ（ヒドロ
キシメチル）アミノメタン（ｒｒｔｘｓ　）　緩ｇ［を
燐酸塩緩衝液の代わりに用いた以外は、実施例Ｉの製造
を実質的に繰り返した。（ＴＲｌ５　）は、酵素安定化
剤として示唆されているが、アルコールオキシダーゼと
一緒の場合には、効果的でなく、または有害でさえあっ
た。

比１滓実験Ｃ マンニットを靜外し、当業者に公知の酵素安定化剤であ
るウシ血清アルブミン（ＢＳＡ　）　２０　、ＩＱ／Ｉ
ＬＩを加えた以外は、実施例Ｉの製造を実質的に繰シ返
した。陽性の効果は観察されず、製品は、未安定化酵素
より安定性が小さかった。

−匿収去摺恵 マンニットを除外し、３０ａｌ／ゴのポリビニルアルコ
ール（ｆｆＡ　）を加えた以外は、実施例Ｉの製造を実
質的に繰り返した。本発明には係らない尚分子ポリオー
ル、ポリビニルアルコールは、アルコールオキシダーぜ
活性全破壊した。別の酵素安定化剤は、３炭素ポリオー
ルグリセロールである。この物質は、液体であるので乾
燥の試験ストリッグには有用でなく、アルコールオキシ
ダーゼと反応してダルを形成する注′ｊｉｔをも有して
いる。

従って、これは有用ではない。

匙メ遣負１ マンニットを除外し、燐酸塩緩＋ｊｊｉ［の代わりに０
．４Ｍイミダゾールを用い、そして当業者に公知の安定
化剤であるアラビアゴム２５夕／ｄを加えた以外は、実
施例Ｉの製造を実質的に繰り返した。

実ＭＡｌ（と比較して所定の安定性が系されたが、安定
性の損失は、実施例Ｉで観察されたものよりはるかに大
きいものでめった。

比較実Ｉａ’ ＰＩＩ全、本願明細中で好ましい範囲外の−であるｐＨ
５，５に緩衝させたという変化ｆ：伴って実施例Ｉの製
造を繰り返した。酵未はＰＨ５，５において不安定であ
った。そして本質的にすべての色形成能力が失われた。

比較実験Ｇ ＥＤＴＡを除外し、セして当東者に公知の酵素安定化剤
Ｎａ　２５２ｏ４に加えた以外は、実繍例■の製造を繰
り返した。Ｎａ２Ｓ２Ｏ４は、アルコールオキシダーゼ
と一緒に動かず、この酵素活性を害した。

実施例Ｖ 一連の試ｋＩｊ、蜆品を実施例Ｉの手順に鉱って製造し
た。実施例■のｇＤＴＡ　、マンニット、鏝価液安定化
剤系の代わりに１一連の他の安定化剤金用い、μｌ′ｆ
、に化させた。次いで、試験用製品を１４〜２０日間貯
蔵し、その活性を、標皐の水中０，１％エタノール混合
物に対する反応を測定することによって延食した。試験
の構成および結呆を、下記の表中に示す＠ 試料　安定化剤 一二、ト ーンニッ□ １０％マンニット 実施例Ｖｃ　ｐＨ７，２琲酸塩後面液、１０％マンニッ
ト 実施例Ｖｄ　ｐ”　９．　Ｏｊｉｊｊ　ｉｔａ　表１１
１ｊ’Ｌ、１０チマンニツト 比較実験 Ａ　力ぜイン添児、ＥＤＴＡ除外 Ｂ　Ｔｒｊｓ嶺加１．Ａ阪塩除外、 マンニット除外 ＣＢＳＡ添加、マンニット除外 Ｄ　ＰＶＡ添ｍ、マンニット除外 Ｅ　イミグゾール添加、アラビアゴー マンニット除外 Ｆ　Ｏ，２％ＥＤＴＡ、１０蒼７７＝ｙ　）、−ＧＮＩ
Ｌ２Ｓ２０４添力口、ＥＤＴＡ除外Ｈ安定化剤なし １７　１００ １９　１００ １７　８６ １６　９０ １６　９０ １８　３０ １８　７ １８　２４ １７　１ 添ノＪ口、　１７　５１ １５．５　１６　３ １４　Ｑ １８　３２ 実施例■ 本発明を用いて追加の試験用製品を製造した。

２３５ｔｎｌのアセトニトリルおよび２３１ｄのｆＳ製
水中に９．６４１の無水ＭＢＴＨ・ＨＣＡ、５．０３　
ｇの無水ＭＯＰ　Ｓおよび３０．６　、＠の庶、糖を溶
解させることによって第１溶液を調製した。溶液ＰｌＩ
を、ＮＢＱＨを用いて７．２に１４整した。試験紙をこ
の溶液で含浸させ、そして乾燥させた。３．５０．９の
ＮａＤＭＡＢ。

９．６３９のＮａＭＯＰＳ　、　６．５’　３９のＭＯ
ＰＳ、７４ｄの１　％　Ｎａ　２ＥＤＴＡ　”　２Ｈ２
０、および２９０ｍ１の４８８水を含有する第２ｍ液を
製造した。これに対して、４１．７００単位の西洋わさ
びペルオキシダーゼおよび２４７ｍ９のアスコルビン酸
を刃口えた。濃縮ＨＣ１およびＮａＯＨｔ−用いてｐＨ
’ｉ７．２０に調整した。

次いで、この溶液に対して、１３８，０００単位のアル
コールオキシダーゼ（フィリップスの溶液として）を加
えた。均一になるまで、この溶液を攪拌し、その溶液を
飽和まで試験紙に適用し、次いでこの紙？：乾凍し、水
性媒体中のエタノールを測定するすぐれた結果を与える
最終的なエタノール試験紙を得た。この材料を、溶剤融
合法によって４リスチレン良材に取り付けた。その際、
トルエンを用いてポリスチレンを軟化して、試験紙をそ
れに粘着させて、試験製品金得た。

溶剤融合法においては、プラスチック裏材の外層を、溶
剤の層を用いて軟化させる。ＡＢＳシラスチックの場合
には、ケトン、例えば、メチルエチルケトン、ＴＨＦ　
、およびノ・１炭化水素、例えば、塩化メチレンを用い
ることができる。アセテートの場合には、ケトンおよび
ノ・１炭化水素が働く。

アクリル樹脂の場合には、・・１炭化水素が好ましい物
質である。セルロース樹脂の場合には、ケトンがよく働
くが、ポリ塩化ビニルの場合には、シクロヘキサン、Ｔ
ＨＦおよびジクロロベンゼンが好ましい物質である。ポ
リスチレンおよびボリカー〆ネートの場合には、ノーロ
炭化水素が働くが、ポリスチレンケトンおよびアルキル
芳香Ａ化合物の場合には、トルエンまたはキシレンがよ
く動く。

この溶剤融合法は、表面上は、単に他の接着方法、例え
ば、接滑剤および超音波接着の同等＊に過ぎないが、実
際には、アルコールオキシダーゼ含有試験ストリップに
極めて良好な活性を与える。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の製品の極めて簡単な態様の、一定比
率でない拡大透視図でるる。 第２図、第３図および第４図は、本発明の製品の幾分か
より複雑な態様の、同様に一定の比ぶてない拡大図であ
る。 １０・・・ｔ４−ｔド、１０ａ・・・ハンドル、１１・
・・裏材、１２・・・膜。 特許出願人 ライフスキャン、インコーポレイテイド特許出願代理人 弁理士　青　木　朗 弁理士　西　舘　和　之 弁理士吉田維夫 弁理士　山　口　昭　之 弁理士西山雅也 手続補正書（方式） 昭和５９年１１月Ｉ６日 特許庁長官　志賀　学　殿 １、事件の表示 昭和５９年　特許願　第１４３３８３号２、発明の名称 エタノール測色分析法およびその試験用製品３、補正を
する者 事件との関係　特許出願人 名称　ライフスキャン、　インコーホレイティド４、代
理人 （外　４　名） ６、補正の対象 （１）願書の「出願人の代表者」の欄 （２）委任状 （３）明細書 （４）図　面 ７、補正の内容 （１１（２）　別紙の通シ （３）　明細書の浄書（内容に変更なし）（４）　図面
の浄書、（内容に変更なし）８　添附書類の目録 （１）訂正願書　１通 （２）　委任状及び訳文　各１通 （３）浄書明細書　１通 （４）浄書図面　１通

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、安ｗ化されたアルコールオキシダーゼを含有する不
   活性支持体・デッド、過酸化活性を有する物質および過
   酸化水屋と反応して異なる色の化合物を与える物質を含
   んでなる、水性流体中のエタノールを検出するための試
   験用製品。 ２、ｒｔ＋」記安定化されたアルコールオキシダーゼが
   、５〜８個の炭素および５〜７個のヒドロキシル基を有
   する有効安定化濃度の固体脂肪族ポリヒドロキシル化合
   物と均質に混合された状態でアルコールオキシダーゼを
   含んでなる、時計請求の範囲＾１１項記載の試験用製品
   。 ３６　目１」一固体脂肪族ポリヒドロキシル化合物が多
   価アルコールでるる、特許請求の範囲４５２項記載の試
   験用製品。 ４、Ａ’Ｑ　ｍ己ｇｒ　価−／ルコールが、マンニット
   、ソルビット、グルシ、トおよびイノシ、トからなる弾
   の一つを含んでなる、特許請求の範囲第３項記載の試験
   用製品。 ５、前記多価アルコールがマンニットである、特許請求
   の範囲第４項記載の試験用製品。 ６、前記安定化されたアルコールオキシダーゼがさらに
   キレート化剤を含んでなる、特許請求の範囲第１項〜第
   ５項までのいずれかに記載の試験用製品。 ７、　前記キレート化剤がポリアミン多酸を含んでなる
   、特許請求の範囲ｆＡ６項記載の試験用製品。 ８、　前記ポリアミン多酸がＥＤＴＡである、特許請求
   の範囲第７項記載の試験用製品。 ９、　前記安定化されたアルコールオキシダーゼが、さ
   らに、水中で６〜８のＰｌ（を与える緩衝剤を含んでな
   る、特許請求の範囲第１項〜第８項までのいずれかに記
   載の試験用製品。 １０、前記緩衝剤が双性イオン緩衝剤である、請求の範
   囲第１項〜第９項までのいずれかに記載の試験用製品。 １１、前記緩衝剤がＭＯＰＳである、特許請求の範囲第
   １０項記載の試験用製品。 １２、前記不活性支持体・４ツドがさらに過酸化物掃去
   剤を含んでなる、特許請求の範囲第１項〜第１１項まで
   のいずれかに記載の試験用製品。 １３、　ｉ１ノ記過酸化物帰去剤が、アスコルビン酸、
   システィン、還元されたグルタチオンおよび尿酸からな
   る群から選ばれる、特許請求の範囲第１２ＪＪｊ記載の
   試験用製品。 １４、前記支持体・ちドが、全細胞不透過性水透過性物
   質で上塗り嘔れている、特許請求の範囲第１項〜第１３
   項までのいずれかに記載の試験用製品。 １５、過酸化水素と反応する前記物質が１．０以下のモ
   ル此のＤＭＡＢ　：　ＭＢＴＨである、特許請求の範囲
   第１項〜第１４項までのいず九かに記載の試験用製品。 １６、さらに、その上に前記支持体・ンツドが設けられ
   る不活性の裏材を含んでなる、特許請求の範囲第１項〜
   第１５項までのいずれかに記載の試験用製品。 １７、前記裏材がプラスチック製でありかつ前記支持体
   ・ｆラドが前記農村上へ溶剤結合されている。 特許請求の範囲第１６拍記載の試験用製品。 １８．５〜８個の炭素および５〜７個のヒドロキシル基
   を有する有効安定化製置の固体脂肪族ポリヒドロキシル
   化合物、キレート化剤および水中で６〜８のＰｌ（を与
   える緩衝剤と均質に混合された状態でアルコールオキシ
   ダーゼを含んでなる、安定化されたアルコールオキシダ
   ーゼ乾燥配合物。 １９、アルコールオキシダーゼ、および１０００酵素単
   位肖）０．２〜１２μモルの過酸化物掃去剤を含んでな
   る、中和されたアルコールオキシダーゼ乾燥配合物。 ２０、アルコールオキシダーゼ、および１０００酵素単
   位当り４〜８０μモルの過酸化物掃去剤を含んでなる、
   中和され、色緩和されたアルコールオキシダーゼ配合物
   。 ２１、水性試料中のエタノール′（ｉ：測定するだめの
   方法であって、安定化されたアルコールオキシダーゼを
   含有する不活性支持体パッド、過酸化活性を有する物質
   および過酸化水素と反応して異なる色の化合物を与える
   物質を含んでなる、水性流体中のエタノールを検出する
   ための試験用製品に前記試料を適用し、エタノール含有
   量に依存する色変化を発現させ、前記色変化を測定し、
   そして前記色変化とエタノール含有量とを関連させるこ
   とを含んでなる方法。