JPS62272994A - 胆汁酸測定用試験紙の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、発明の詳細な説明 （産業上の利用分野） 本発明は体液中の胆汁酸を検出しうる胆汁酸測定用試験
紙の製造方法に関する。

（従来の技術） 胆汁に含有される胆汁酸は血液、尿などの体液中にも微
量含有される。このような体液中の胆汁酸は肝胆道系疾
患によりその量が変化し、特に血液中の胆汁酸量はこの
ような疾患の鋭敏なマーカーとなることが知られている
。例えば、乳児の胆道閉塞症においては血液中もしくは
尿中の胆汁酸量が増加することが知られている。胆道閉
塞症は乳児約１万人あたり１人という高率で発生してお
り、患者は迅速な手術が必要とされる。疾病の認知が遅
れた場合には死亡率も高い。このような疾患を早期発見
するためにも体液中、特に、血液中の胆汁酸を集団検診
時などに精度良く測定することが望まれる。

胆汁酸を含有する試料溶液中の胆汁酸量を測定する方法
は１例えば、特公昭５９−１３１９７号、特開昭５６−
１４４０９６号および特開昭５６−１５１４９９号公報
に開示されている。それによれば、まず、胆汁酸を含む
試料を酸性下で熱処理しく特公昭５９−１３１９７号公
報）、あるいは、オキサミド酸、ピルビン酸などを添加
して（特開昭５６−１４４０９６号公報、特開昭５６−
１５１４９９号公報）乳酸脱水素酵素（ＬＤＩ＋　）な
どの、測定を妨害する酵素を失活させる。次いで。

これに３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（
３α−Ｈ２Ｏ）　、ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チド（ＮＡＤ”　）　、ジアホラーゼおよびテトラゾリ
ウム塩を含有する反応用溶液をｐＨ８〜９のアルカリ条
件下で反応させる。胆汁酸の水酸基は３α−Ｈ２Ｏの存
在下でＭＡＩＬ”と反応してカルボニル基となり次のよ
うにケト型の胆汁酸を生じる。

ＮＡＤＨはジアホラーゼの存在下で電子受容性の色原体
であるテトラゾリウム塩と反応して次のようにホルマザ
ンを生じる。ＮＡＤＨは再び酸化されてＮＡＤ”となる
、テトラゾリウム塩の代わりにレザズリンを用いてもよ
く、この場合はレゾルフィンが生成する。

生じたホルマザン（レゾルフィン）のモル数はＮＡＤＩ
Ｉのモル数（つまり、胆汁酸のモル数）に相当する。

そのため、このホルマザンの吸光度（レゾルフィンの螢
光強度）を測定することにより胆汁酸を定量することが
可能である。

このような方法により試料中の胆汁酸を感度良く測定す
ることができるが、溶液系での反応を利用した測定法で
あるため煩雑な操作を必要とする。

そのため、マススクリーニングや簡便に胆汁酸を検出す
るためには不適当である。測定のために高価な吸光度測
定装置などが必要であることも欠点である。

このような欠点を解決するため１発明者は、上記方法に
おいて使用する試薬を適当な緩衝液（例えば、　ｐＨ７
，０リン酸緩衝液）に溶解し、これを濾紙などの高分子
素材からなる担体上に含浸・凍結乾燥して試験紙を作製
し、胆汁酸の半定量を試みた。しかし、上記テトラゾリ
ウム塩が不安定であるため凍結乾燥を行っても試験紙自
体が約１６時間で赤紫〜紫色に発色する。さらに９時間
経過とともに着色度が進むため、このような方法で得ら
れた試験紙を用いて胆汁酸を検出することはできない。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明は上記従来の欠点を解決するものであり。

その目的とするところは、肝胆道系疾患の重要なマーカ
ーである体液中の胆汁酸の量を簡便な方法を用いて短時
間で、かつ安価に測定しうる試験紙の製造方法を提供す
ることにある。本発明の他の目的は、長時間安定に保存
しうる胆汁酸測定用試験紙の製造方法を提供することに
ある。

（問題点を解決するための手段） 本発明の胆汁酸測定用試験紙の製造方法は、（１）ニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチド、３α−ヒドロキシ
ステロイドデヒドロゲナーゼおよびジアホラーゼを含有
した脱塩水水溶液を、高分子素材からなる担体に含浸さ
せる工程、（２）該水溶液の含浸された該担体を凍結乾
燥する工程、および（３）該凍結乾燥後の担体にテトラ
ゾリウム塩の非水溶媒溶液を含浸させる工程、を包含し
、そのことにより上記目的が達成される。

本発明の胆汁酸測定用試験紙に用いられる高分子素材か
らなる担体としては、天然もしくは合成繊維からなる抄
紙や不織布のほかメンブレンフィルターなどが用いられ
る。試料が尿または血清である場合には、市販の濾紙な
ど天然もしくは合成繊維からなる抄紙や不織布が好適に
用いられる。

試料が全血である場合には２合成繊維からなる抄紙や不
織布、メンブレンフィルターなどが好適に用いられる。

メンブレンフィルターとしては、穴径が０．１〜０．４
μｍの酢酸セルロース系の膜が好ましい。合成紙として
は１例えば、積木化学工業■製のセルポア（親水性タイ
プ）が好適である。

本発明方法により試験紙を製造する場合には。

まず、　　ＮＡＤ”　、　　３α−１１Ｓｔｌおよびジ
アホラーゼを脱塩水に溶解した水溶液を調製する。これ
を上記担体に含浸させた後、凍結乾燥を行う。ここで用
いられる酵素の由来は特に限定されないが、耐有機溶剤
性、経時安定性などに優れた酵素が好ましい。このよう
な酵素として、３α−Ｈ２Ｏとしてはシュードモナス　
テストステローニ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｔｅｓｔｏ
ｓｔｅｒｏｎｉ）由来のものが、そしてジアホラーゼと
してはバチルス　ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来
のものが好適に用いられる。ＮＡＤ”の代わりにニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチドフォスフエイト（ＮＡ
ＤＰ”　）が用いられてもよい。ＮＡＤＰ”もＮＡＤ゛
と同様に補酵素として働き、還元されると還元型ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチドフォスフエイト（ＮＡ
ＤＰＨ）を生じる。３α−Ｈ２Ｏおよびジアホラーゼは
担体１００　ｃａｌあたりそれぞれ０．１〜１００００
１０の割合で。

ＮＡＤ″″　（以下、　　ＮＡＤ”はＮＡＤＰ”であっ
てもよく。

ＮＡＤＨはＮＡＤＰＨであってもよい）は０．１〜１０
０ｍｇの割合で担持される。過少であると胆汁酸による
発色が充分におこらず、過剰であるとその分解生成物に
より酵素反応が阻害される。

ここで使用される水は、既述のように、有機塩類および
無機塩類を含有しない脱塩水（脱イオン水）、好ましく
は薫留水であることが重要である。

３α−Ｈ２Ｏは活性至適ｐｉが弱アルカリ性であるため
、酵素反応のうえからは弱アルカリ性緩衝液を使用する
のが好ましいと考えられる。しかし２発明者らが種々の
条件下で実験を行ったところ、含有される塩濃度が高い
ほど得られる試験紙の下地の発色が顕著であることがわ
かった。例えばｐＨ８，５のリン酸緩衝液を用いて得ら
れた試験紙を室温に保存すると、約１週間で下地の発色
が起こる。脱塩水を用いることにより、このような下地
の発色は抑制される。脱塩水を用いると後述の胆汁酸検
出時の試験紙内における反応系は中性となるが。

ＮＡＤ”から生じるＮＡＤＨはただちにテトラゾリウム
と反応して消費されるため２弱アルカリ性条件下でない
にもかかわらず、　　ＮＡＤ”　−ＮＡＤＨの反応が円
滑に進行する。

上記水溶液中に添加剤が含有されていてもよい。

添加剤としては酵素や補酵素の活性化剤や安定化剤が挙
げられる。酵素活性化剤としては１例えばトリトンＸ−
１００（商品名）などの界面活性剤が好適に用いられる
。そして酵素安定化剤としては。

例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの蛋白質が好
適に用いられる。上記界面活性剤や蛋白質が添加されて
いると、　ＮＡＤ”や酵素（３α−Ｈ２Ｏおよびジアホ
ラーゼ）がこれら化合物に包含される。

このような界面活性剤や蛋白質は、後述のテトラゾリウ
ム塩を担持させる工程で使用される非水溶媒に溶解しな
いため、非水溶液中の色原体であるテトラゾリウム塩と
上記酵素や補酵素が直接接触するのが避けられる。その
結果、下地の発色がより効果的に抑制される。

、さらに、添加剤として増粘剤が含有されていてもよい
。増粘剤により、いわゆる窓枠現象が抑制される。窓枠
現象とは１例えば、上記水溶液を担体に含浸させて乾燥
させるときに水溶液中の溶質が担体周辺部に移動して濃
縮されたり、得られた試験紙に検体溶液を滴下したとき
に試験紙に含有されているＮＡＤ”　、　　３α−Ｈ２
Ｏなどの試薬が試験紙周辺部に移行して濃縮される現象
をいう。このような窓枠現象が起こると胆汁酸の測定が
正確になされない。上記増粘剤としては、メチルセルロ
ース、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などが挙げら
れる。増粘剤が含まれると担体（試験紙）に含浸された
液相の粘度が増大するため溶質の移動が抑制され、その
結果、窓枠現象が抑制される。上記酵素活性化剤、酵素
安定化剤、増粘剤などの添加剤はそれぞれ担体１００ｃ
Ｉａあたり２００■以下、好ましくは１〜１００■の割
合で担持される。

このように酵素などを含む水溶液が含浸された担体の凍
結乾燥工程では、充分に水分を除去することが重要であ
る。担体に水分が残留していると次工程で担持されるテ
トラゾリウム塩の安定性が極端に低下する。

次に、上記凍結乾燥後の担体にテトラゾリウム塩を非水
溶媒に溶解させた溶液を含浸させる。テトラゾリウム塩
としては、ニトロテトラゾリウムブルー（ＮＴＢ）もし
くはニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）と呼ばれる
３・３’　　−（３・３゛　−ジメトキシ−４・４゛−
ビフェニレン）−ビス〔２−（ｐ−ニトロフェニル）−
５−フェニル−２１１−テトラゾリウムクロライドが好
適に用いられる。

非水溶媒は、テトラゾリウム塩を溶解させることが可能
であればよく、メタノール、エタノールなどのアルコー
ル類；酢酸エチルなどが用いられる。

テトラゾリウム塩は担体１０Ｍあたり０．１〜５００ｍ
ｇの割合で担持される。過少であると胆汁酸による発色
が充分におこらず、過剰であると溶媒に溶けにくくなり
、また下地の色が濃くなるので色調の変色の判別が難し
くなる。テトラゾリウム塩溶液を含浸させた担体は速や
かに、好ましくは凍結乾燥により、乾燥される。このよ
うにして得られた試験紙は、適当な大きさの細片に裁断
しプラスチックフィルム類のスティックの端に接着させ
て利用に供せられる。

上記試験紙を用いて尿、血清などの試料中の胆汁酸の測
定が行われる。試料として血液を用いる場合は、あらか
じめオキサミン酸、ピルビン酸などを加えておく。この
ような前処理により、胆汁酸検出のための酵素反応を阻
害するＬＤＨ反応などを阻害させることができる。この
ように必要に応じて前処理された試料を試験紙に含浸さ
せると。

胆汁酸は３α−Ｈ２Ｏの存在下でＮＡＤ”と反応してケ
ト型の胆汁酸となりＮＡＤ”″はＮＡＤＨとなる。ＮＡ
ＤＨはジアホラーゼの存在下でテトラゾリウム塩と反応
してホルマザンを生じる。これは、従来の技術の項で述
べた反応機構と同様である。試料を含浸させた後１通常
、１〜３００秒でホルマザンが生じ発色がおこる。生じ
るホルマザンの量は胆汁酸の量に対応するため２発色の
度合を目視観察することにより、試料に含有される胆汁
酸の概量を知ることができる。目視観察する代わりに反
射吸光装置などを利用した光学的方法によればさらに正
確に発色の度合を測定することが可能である。

（作用） 本発明方法によれば、このように、酵素反応を利用した
胆汁酸測定用の試験紙が得られる。ホルマザンを生じる
色源体であるテトラゾリウム塩を非水状態で担体上に担
持させることができ、かつ担体に塩類が担持されないた
め、試験紙の保存中にテトラゾリウム塩が変化して下地
が発色することがない。得られた試験紙は９例えば、４
℃で６ケ月以上にわたり安定に保存することが可能であ
る。試料中の胆汁酸量に応じて発色度合が変わるため、
これを観察することにより胆汁酸量を知ることができる
。このような試験紙を用いると筒車な操作で短時間のう
ちに、しかも安価に胆汁酸量を測定することができる。

そのため　（Ｊ団検診やペッドサイドでの緊急検査に好
適に用いられる。

体液中の胆汁酸を測定することにより肝胆道系疾患を早
期発見することが可能である。

（実施例） 以下に本発明を実施例につき説明する。

１崖■土 （＾）胆汁酸測定用試験紙の調製：３α−Ｈ２Ｏ１６３
１ジアホラーゼ６８００１０　、　　β−ＮＡＤ”　１
０．２ｍｇ、　ＰＥＧ１６ｍｇ、　ＢＳＡ　１００ｍｇ
およびＴｒｉｔｏｎ　Ｘ（商品名）１０１！を蒸留水１
０ｍ／に溶解した。この水溶液を３００−の濾紙（Ｗｈ
ａｔｍａｎ　Ｎｏ、３）に含浸させ、凍結乾燥した。次
に、ニトロブルーテトラゾリウム（和光純薬社製ＮＴＢ
）の０．０３４−一％エタノール溶液を調製し、これを
上記凍結乾燥後の濾紙に含浸させた後。

速やかに乾燥させた。このようにして得られた試験紙を
６１１×１０鶴の小片に切断し、　　５ｍｍＸ５Ｑｍｍ
のポリスチレンフィルム製のスティックの端に両面テー
プで接着して試験紙片を得た。得られた試験紙を６ケ月
間保存したが下地の発色は認められなかった。

（Ｂ）比色表の作成：生理食塩水に人血清アルブミンを
４％の割合で溶解させた溶液に胆汁酸（グリココール酸
ナトリウム）をその濃度が、それぞれ、　０．２５．５
０．１００および２００μｍｏｌ／ｌになるように添加
し標準試料溶液を得た。これら濃度既知の標準試料溶液
を（Ａ）項で得られた試験紙片にそり、れぞれ２５μβ
ずつ含浸させた。余分な試料溶液を除き、１〜２分後に
その色度を目視観察したところ２表１に示す結果が得ら
れた。この試験紙を用いて胆汁酸の測定が正確になされ
うろことがわかった。

Δ１３＝１．２５Ｘ　（胆汁酸濃度（ｐｍｏｌ／　ｌ　
）　）　＋１２．２（相関係数Ｒ：　０．９９５） このように、胆汁酸濃度と反射光強度差とは直線的な関
係であり、相関係数も１に近い。従って。

実施例１の比色表を利用する代わりに反射光測定機を利
用すればより精密な胆汁酸の分析がなされうろことが明
らかである。

ｌ較炎上 ３α−１１ｓＤ　５０１Ｕ、　　ジアホラーゼ５０ＩＵ
、　　β−ＮＡＤ”１０ｍｇおよびニトロブルーテトラ
ゾリウム１０ｍｇをｐＨ８，０の２０ｍＭリン酸バッフ
ァー１０ＩＩｌｌに溶解した。

この溶液を縦１０ｃｍ、横１０ｃｍの濾紙（東洋濾紙！
１ｌｌ１２）に含浸させ、ただちに凍結乾燥した。得ら
れた試験紙を６鶴×１０龍の小片に切断し、５ｍｍＸ６
０龍のポリスチレンフィルム製スティックの端に両面テ
ープで接着して試験紙片を得た。得られた試験紙を２４
時間保存したところ、下地の発色が認められた。下地発
色の度合は実施例１（Ｂ）項の比色表では（＋）に相当
する。このように下地が発色するため３本比較例の試験
紙は胆汁酸の測定には使用できない。

此ＪＲＪ生ｉ 蒸留水の代わりに１０ｍＭのピロリン酸緩衝液（ｐＨ８
，０）を用いたこと以外は実施例１（Ａ）項と同様に操
作して試験紙片を得た。この試験紙片を保存したところ
、約１週間で下地の発色が認められた。

この試験紙を用いての胆汁酸の正確な測定は困難である
が、約２註０ の検出は可能であった。

（発明の効果） 本発明によれば，このように、試料溶液中の胆汁酸量を
簡便な方法でしかも短時間のうちに測定しうる試験紙が
得られる。試験紙は長期間安定に保存され得２例えば、
経時的に成分が変化して下地が発色することがない。得
られた試験紙を用いて安価に胆汁酸の測定が行われるた
め．集団検診などで肝胆道系疾患を早期に発見すること
が可能である。ベッドサイドでの緊急時の検査にも利用
価値が高い。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １（１）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、３
   α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼおよびジア
   ホラーゼを含有した脱塩水水溶液を、高分子素材からな
   る担体に含浸させる工程、 （２）該水溶液の含浸された該担体を凍結乾燥する工程
   、および （３）該凍結乾燥後の担体にテトラゾリウム塩の非水溶
   媒溶液を含浸させる工程、 を包含する胆汁酸測定用試験紙の製造方法。 ２、前記水溶液が増粘剤、酵素活性化剤および酵素安定
   化剤のうちの少なくとも１種を含有する特許請求の範囲
   第１項に記載の製造方法。