JPH0679560B2 - 胆汁酸測定用試験紙の製造方法 - Google Patents
胆汁酸測定用試験紙の製造方法Info
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- JPH0679560B2 JPH0679560B2 JP11667686A JP11667686A JPH0679560B2 JP H0679560 B2 JPH0679560 B2 JP H0679560B2 JP 11667686 A JP11667686 A JP 11667686A JP 11667686 A JP11667686 A JP 11667686A JP H0679560 B2 JPH0679560 B2 JP H0679560B2
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は体液中の胆汁酸を検出しうる胆汁酸測定用試験
紙の製造方法に関する。
紙の製造方法に関する。
（従来の技術） 胆汁に含有される胆汁酸は血液，尿などの体液中にも微
量含有される。このような体液中の胆汁酸は肝胆道系疾
患によりその量が変化し，特に血液中の胆汁酸量はこの
ような疾患の鋭敏なマーカーとなることが知られてい
る。例えば，乳児の胆道閉塞症においては血液中もしく
は尿中の胆汁酸量が増加することが知られている。胆道
閉塞症は乳児約１万人あたり１人という高率で発生して
おり，患者は迅速な手術が必要とされる。疾病の認知が
遅れた場合には死亡率も高い。このような疾患を早期発
見するためにも体液中，特に，血液中の胆汁酸を集団検
診時などに精度良く測定することが望まれる。
量含有される。このような体液中の胆汁酸は肝胆道系疾
患によりその量が変化し，特に血液中の胆汁酸量はこの
ような疾患の鋭敏なマーカーとなることが知られてい
る。例えば，乳児の胆道閉塞症においては血液中もしく
は尿中の胆汁酸量が増加することが知られている。胆道
閉塞症は乳児約１万人あたり１人という高率で発生して
おり，患者は迅速な手術が必要とされる。疾病の認知が
遅れた場合には死亡率も高い。このような疾患を早期発
見するためにも体液中，特に，血液中の胆汁酸を集団検
診時などに精度良く測定することが望まれる。
胆汁酸を含有うる試料溶液中の胆汁酸量を測定する方法
は，例えば，特公昭59−13197号，特開昭56−144096号
および特開昭56−151499号公報に開示されている。それ
によれば，まず，胆汁酸を含む試料を酸性下で熱処理し
（特公昭59−13197号公報），あるいは，オキサミド
酸，ピルビン酸などを添加して（特開昭56−144096号公
報，特開昭56−151499号公報）乳酸脱水素酵素（LDH）
などの，測定を妨害する酵素を失活させる。次いで，こ
れに３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（３
α−HSD），ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（N
AD+），ジアホラーゼおよびテトラゾリウム塩を含有す
る反応用溶液をpH8〜９のアルカリ条件下で反応させ
る。胆汁酸の水酸基は３α−HSDの存在下でNAD+と反応
してカルボニル基となり次のようにケト型の胆汁酸を生
じる。
は，例えば，特公昭59−13197号，特開昭56−144096号
および特開昭56−151499号公報に開示されている。それ
によれば，まず，胆汁酸を含む試料を酸性下で熱処理し
（特公昭59−13197号公報），あるいは，オキサミド
酸，ピルビン酸などを添加して（特開昭56−144096号公
報，特開昭56−151499号公報）乳酸脱水素酵素（LDH）
などの，測定を妨害する酵素を失活させる。次いで，こ
れに３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（３
α−HSD），ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（N
AD+），ジアホラーゼおよびテトラゾリウム塩を含有す
る反応用溶液をpH8〜９のアルカリ条件下で反応させ
る。胆汁酸の水酸基は３α−HSDの存在下でNAD+と反応
してカルボニル基となり次のようにケト型の胆汁酸を生
じる。
NADHはジアホラーゼの存在下で電子受容性の色原体であ
るテトラゾリウム塩と反応して次のようにホルマザンを
生じる。NADHは再び酸化されてNAD+となる。テトラゾリ
ウム塩の代わりにレザズリンを用いてもよく，この場合
はレゾルフィンが生成する。
るテトラゾリウム塩と反応して次のようにホルマザンを
生じる。NADHは再び酸化されてNAD+となる。テトラゾリ
ウム塩の代わりにレザズリンを用いてもよく，この場合
はレゾルフィンが生成する。
生じたホルマザン（レゾルフィン）のモル数はNADHのモ
ル数（つまり，胆汁酸のモル数）に相当する。そのた
め，このホルマザンの吸光度（レゾルフィンの螢光強
度）を測定することにより胆汁酸を定量することが可能
である。
ル数（つまり，胆汁酸のモル数）に相当する。そのた
め，このホルマザンの吸光度（レゾルフィンの螢光強
度）を測定することにより胆汁酸を定量することが可能
である。
このような方法により試料中の胆汁酸を感度良く測定す
ることができるが，溶液系での反応を利用した測定法で
あるため煩雑な操作を必要とする。そのため，マススク
リーニングや簡便に胆汁酸を検出するためには不適当で
ある。測定のためにも高価な吸光度測定装置などが必要
であることも欠点である。
ることができるが，溶液系での反応を利用した測定法で
あるため煩雑な操作を必要とする。そのため，マススク
リーニングや簡便に胆汁酸を検出するためには不適当で
ある。測定のためにも高価な吸光度測定装置などが必要
であることも欠点である。
このような欠点を解決するため，発明者は，上記方法に
おいて使用する試薬を適当な緩衝液（例えば,pH7.0リン
酸緩衝液）に溶解し，これを瀘紙などの高分子素材から
なる担体上に含浸・凍結乾燥して試験紙を作製し，胆汁
酸の半定量を試みた。しかし，前記テトラゾリウム塩が
不安定であるため凍結乾燥を行っても試験紙自体が約16
時間で赤紫〜紫色に発色する。さらに，時間経過ととも
に着色度が進むため，このような方法で得られた試験紙
を用いて胆汁酸を検出することはできない。
おいて使用する試薬を適当な緩衝液（例えば,pH7.0リン
酸緩衝液）に溶解し，これを瀘紙などの高分子素材から
なる担体上に含浸・凍結乾燥して試験紙を作製し，胆汁
酸の半定量を試みた。しかし，前記テトラゾリウム塩が
不安定であるため凍結乾燥を行っても試験紙自体が約16
時間で赤紫〜紫色に発色する。さらに，時間経過ととも
に着色度が進むため，このような方法で得られた試験紙
を用いて胆汁酸を検出することはできない。
（発明が解決しようとする問題点） 本発明は上記従来の欠点を解決するものであり，その目
的とするところは，肝胆道系疾患の重要なマーカーであ
る体液中の胆汁酸の量を簡便な方法を用いて短時間で，
かつ安価に測定しうる試験紙の製造方法を提供すること
にある。本発明の他の目的は，長時間安定に保存しうる
胆汁酸測定用試験紙の製造方法を提供することにある。
的とするところは，肝胆道系疾患の重要なマーカーであ
る体液中の胆汁酸の量を簡便な方法を用いて短時間で，
かつ安価に測定しうる試験紙の製造方法を提供すること
にある。本発明の他の目的は，長時間安定に保存しうる
胆汁酸測定用試験紙の製造方法を提供することにある。
（問題点を解決するための手段） 本発明の胆汁酸測定用試験紙の製造方法は、（１）ニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチド,3α−ヒドロキシス
テロイドデヒドロゲナーゼおよびジアホラーゼを含有し
た脱塩水水溶液を，高分子素材からなる担体に含浸させ
る工程，（２）該水溶液の含浸された該担体を凍結乾燥
する工程，および（３）該凍結乾燥後の担体にテトラゾ
リウム塩の非水溶媒溶液を含浸させる工程，を包含し，
そのことにより上記目的が達成される。
チンアミドアデニンジヌクレオチド,3α−ヒドロキシス
テロイドデヒドロゲナーゼおよびジアホラーゼを含有し
た脱塩水水溶液を，高分子素材からなる担体に含浸させ
る工程，（２）該水溶液の含浸された該担体を凍結乾燥
する工程，および（３）該凍結乾燥後の担体にテトラゾ
リウム塩の非水溶媒溶液を含浸させる工程，を包含し，
そのことにより上記目的が達成される。
本発明の胆汁酸測定用試験紙に用いられる高分子素材か
らなる担体としては，天然もしくは合成繊維からなる抄
紙や不織布のほかメンブレンフィルターなどが用いられ
る。試料が尿または血清である場合には，市販の瀘紙な
ど天然もしくは合成繊維からなる抄紙や不織布が好適に
用いられる。試料が全血である場合には，合成繊維から
なる抄紙や不織布、メンブレンフィルターなどが好適に
用いられる。メンブレンフィルターとしては，穴径が0.
1〜0.4μｍの酢酸セルロース系の膜が好ましい。合成紙
としては，例えば，積水化学工業（株）製のセルボア
（親水性タイプ）が好適である。
らなる担体としては，天然もしくは合成繊維からなる抄
紙や不織布のほかメンブレンフィルターなどが用いられ
る。試料が尿または血清である場合には，市販の瀘紙な
ど天然もしくは合成繊維からなる抄紙や不織布が好適に
用いられる。試料が全血である場合には，合成繊維から
なる抄紙や不織布、メンブレンフィルターなどが好適に
用いられる。メンブレンフィルターとしては，穴径が0.
1〜0.4μｍの酢酸セルロース系の膜が好ましい。合成紙
としては，例えば，積水化学工業（株）製のセルボア
（親水性タイプ）が好適である。
本発明方法により試験紙を製造する場合には，まず,NAD
+,3α−HSDおよびジアホラーゼを脱塩水に溶解した水溶
液を調製する。これを上記担体に含浸させた後，凍結乾
燥を行う。ここで用いられる酵素の由来は特に限定され
ないが，耐有機溶剤性，経時安定性などに優れた酵素が
好ましい。このような酵素として,3α−HSDとしてはシ
ュードモナス テストステローニ（Pseudomonas testo
steroni）由来のものが，そしてジアホラーゼとしては
バチルス ステアロテルモフィルス（Bacillus stearo
thermophilus）由来のものが好適に用いられる。NAD+の
代わりにニコチンアミドアデニンジヌクレオチドフォス
フェイド（NADP+）が用いられてもよい。NADP+もNAD+と
同様に補酵素として働き，還元されると還元型ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチドフォスフェイド（NADP
H）を生じる。３α−HSDおよびジアホラーゼは担体100c
m2あたりそれぞれ0.1〜10000IUの割合で,NAD+（以下,NA
D+はNADP+であってもよく,NADPはNADPHであってもよ
い）は、0.1〜100mgの割合で担持される。過少であると
胆汁酸による発色が充分におこらず，過剰であるとその
分解生成物により酵素反応が阻害される。
+,3α−HSDおよびジアホラーゼを脱塩水に溶解した水溶
液を調製する。これを上記担体に含浸させた後，凍結乾
燥を行う。ここで用いられる酵素の由来は特に限定され
ないが，耐有機溶剤性，経時安定性などに優れた酵素が
好ましい。このような酵素として,3α−HSDとしてはシ
ュードモナス テストステローニ（Pseudomonas testo
steroni）由来のものが，そしてジアホラーゼとしては
バチルス ステアロテルモフィルス（Bacillus stearo
thermophilus）由来のものが好適に用いられる。NAD+の
代わりにニコチンアミドアデニンジヌクレオチドフォス
フェイド（NADP+）が用いられてもよい。NADP+もNAD+と
同様に補酵素として働き，還元されると還元型ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチドフォスフェイド（NADP
H）を生じる。３α−HSDおよびジアホラーゼは担体100c
m2あたりそれぞれ0.1〜10000IUの割合で,NAD+（以下,NA
D+はNADP+であってもよく,NADPはNADPHであってもよ
い）は、0.1〜100mgの割合で担持される。過少であると
胆汁酸による発色が充分におこらず，過剰であるとその
分解生成物により酵素反応が阻害される。
ここで使用される水は，既述のように，有機塩類および
無機塩類を含有しない脱塩水（脱イオン水），好ましく
は蒸溜水であることが重要である。３α−HSDは活性至
適pHが弱アルカリ性であるため，酵素反応のうえからは
弱アルカリ性緩衝液を使用するのが好ましいと考えられ
る。しかし，発明者らが種々の条件下で実験を行ったと
ころ，含有される塩濃度が高いほど得られる試験紙の下
地の発色が顕著であることがわかった。例えばpH8.5の
リン酸緩衝液を用いて得られた試験紙を室温に保存する
と，約１週間で下地の発色が起こる。脱塩水を用いるこ
とにより，このような下地の発色は抑制される。脱塩水
を用いると後述の胆汁酸検出特の試験紙内における反応
系は中性となるが,NAD+から生じるNADHはただちにテト
ラゾリウムと反応して消費されるため，弱アルカリ性条
件下でないにもかかわらず,NAD+→NADHの反応が円滑に
進行する。
無機塩類を含有しない脱塩水（脱イオン水），好ましく
は蒸溜水であることが重要である。３α−HSDは活性至
適pHが弱アルカリ性であるため，酵素反応のうえからは
弱アルカリ性緩衝液を使用するのが好ましいと考えられ
る。しかし，発明者らが種々の条件下で実験を行ったと
ころ，含有される塩濃度が高いほど得られる試験紙の下
地の発色が顕著であることがわかった。例えばpH8.5の
リン酸緩衝液を用いて得られた試験紙を室温に保存する
と，約１週間で下地の発色が起こる。脱塩水を用いるこ
とにより，このような下地の発色は抑制される。脱塩水
を用いると後述の胆汁酸検出特の試験紙内における反応
系は中性となるが,NAD+から生じるNADHはただちにテト
ラゾリウムと反応して消費されるため，弱アルカリ性条
件下でないにもかかわらず,NAD+→NADHの反応が円滑に
進行する。
上記水溶液中に添加剤が含されていてもよい。添加剤と
しては酵素や補酵素の活性化剤や安定化剤が挙げられ
る。酵素活性化剤としては，例えばトリトンＸ−100
（商品名などの界面活性剤が好適に用いられる。そして
酵素安定化剤としては，例えばウシ血清アルブミン（BS
A）などの蛋白質が好適に用いられる。上記界面活性剤
や蛋白質が添加されていると,NAD+や酵素（３α−HSDお
よびジアホラーゼ）がこれら化合物に包含される。この
ような界面活性剤や蛋白質は，後述のテトラゾリウム塩
を担持させる工程で使用される非水溶媒に溶解しないた
め，非水溶液中の色原体であるテトラゾリウム塩と上記
酵素や補酵素が直接接触するのが避けられる。その結
果，下地の発色がより効果的に抑制される。
しては酵素や補酵素の活性化剤や安定化剤が挙げられ
る。酵素活性化剤としては，例えばトリトンＸ−100
（商品名などの界面活性剤が好適に用いられる。そして
酵素安定化剤としては，例えばウシ血清アルブミン（BS
A）などの蛋白質が好適に用いられる。上記界面活性剤
や蛋白質が添加されていると,NAD+や酵素（３α−HSDお
よびジアホラーゼ）がこれら化合物に包含される。この
ような界面活性剤や蛋白質は，後述のテトラゾリウム塩
を担持させる工程で使用される非水溶媒に溶解しないた
め，非水溶液中の色原体であるテトラゾリウム塩と上記
酵素や補酵素が直接接触するのが避けられる。その結
果，下地の発色がより効果的に抑制される。
さらに，添加剤として増粘剤が含有されていてもよい。
増粘剤により，いわゆる窓枠現象が抑制される。窓枠現
象とは，例えば，上記水溶液を担体に含浸させて乾燥さ
せるときに水溶液中の溶質が担体周辺部に移動して濃縮
されたり，得られた試験紙に検体溶液を滴下したときに
試験紙に含有されているNAD+,3α−HSDなどの試薬が試
験紙周辺部に移行して濃縮される現象をいう。このよう
な窓枠現象が起こると胆汁酸の測定が正確になされな
い。上記増粘剤としては，メチルセルロース，ポリエチ
レングリコール（PEG）などが挙げられる。増粘剤が含
まれると担体（試験紙）に含浸された液相の粘度が増大
するため溶質の移動が抑制され，その結果，窓枠現象が
抑制される。上記酵素活性化剤，酵素安定化剤，増粘剤
などの添加剤はそれぞれ担体100cm2あたり200mg以下，
好ましくは１〜100mgの割合で担持される。
増粘剤により，いわゆる窓枠現象が抑制される。窓枠現
象とは，例えば，上記水溶液を担体に含浸させて乾燥さ
せるときに水溶液中の溶質が担体周辺部に移動して濃縮
されたり，得られた試験紙に検体溶液を滴下したときに
試験紙に含有されているNAD+,3α−HSDなどの試薬が試
験紙周辺部に移行して濃縮される現象をいう。このよう
な窓枠現象が起こると胆汁酸の測定が正確になされな
い。上記増粘剤としては，メチルセルロース，ポリエチ
レングリコール（PEG）などが挙げられる。増粘剤が含
まれると担体（試験紙）に含浸された液相の粘度が増大
するため溶質の移動が抑制され，その結果，窓枠現象が
抑制される。上記酵素活性化剤，酵素安定化剤，増粘剤
などの添加剤はそれぞれ担体100cm2あたり200mg以下，
好ましくは１〜100mgの割合で担持される。
このように酵素などを含む水溶液が含浸された担体の凍
結乾燥工程では，充分に水分を除去することが重要であ
る。担体に水分が残留していると次工程で担持されるテ
トラゾリウム塩の安定性が極端に低下する。
結乾燥工程では，充分に水分を除去することが重要であ
る。担体に水分が残留していると次工程で担持されるテ
トラゾリウム塩の安定性が極端に低下する。
次に，上記凍結乾燥後の担体にテトラゾリウム塩を非水
溶媒に溶解させた溶液を含浸させる。テトラゾリウム塩
としては，ニトロテトラゾリウムブルー（NTB）もしく
はニトロブルーテトラゾリウム（NBT）と呼ばれる３・
３′−（３・３′−ジメトキシ−４・４′−ビフェニレ
ン）−ビス〔２−（ｐ−ニトロフェニル）−５−フェニ
ル−2H−テトラゾリウムクロライドが好適に用いられ
る。非水溶媒は，テトラゾリウム塩を溶解させることが
可能であればよく，メタノール，エタノールなどのアル
コール類；酢酸エチルなどが用いられる。テトラゾリウ
ム塩は担体100cm2あたり0.1〜500mgの割合で担持され
る。過少であると胆汁酸による発色が充分におこらず，
過剰であると溶媒に溶けにくくなり，また下地の色が濃
くなるので色調の変色の判別が難しくなる。テトラゾリ
ウム塩溶液を含浸させた担体は速やかに，好ましくは凍
結乾燥により，乾燥される。このようにして得られた試
験紙は，適当な大きさの細片に裁断しプラスチックフィ
ルム製のスティックの端に接着させて利用に供せられ
る。
溶媒に溶解させた溶液を含浸させる。テトラゾリウム塩
としては，ニトロテトラゾリウムブルー（NTB）もしく
はニトロブルーテトラゾリウム（NBT）と呼ばれる３・
３′−（３・３′−ジメトキシ−４・４′−ビフェニレ
ン）−ビス〔２−（ｐ−ニトロフェニル）−５−フェニ
ル−2H−テトラゾリウムクロライドが好適に用いられ
る。非水溶媒は，テトラゾリウム塩を溶解させることが
可能であればよく，メタノール，エタノールなどのアル
コール類；酢酸エチルなどが用いられる。テトラゾリウ
ム塩は担体100cm2あたり0.1〜500mgの割合で担持され
る。過少であると胆汁酸による発色が充分におこらず，
過剰であると溶媒に溶けにくくなり，また下地の色が濃
くなるので色調の変色の判別が難しくなる。テトラゾリ
ウム塩溶液を含浸させた担体は速やかに，好ましくは凍
結乾燥により，乾燥される。このようにして得られた試
験紙は，適当な大きさの細片に裁断しプラスチックフィ
ルム製のスティックの端に接着させて利用に供せられ
る。
上記試験紙を用いて尿，血清などの試料中の胆汁酸の測
定が行われる。試料として血液を用いる場合は，あらか
じめオキサミン酸，ピルビン酸などを加えておく。この
ような前処理により，胆汁酸検出のための酵素反応を阻
害するLDH反応などを阻害させることができる。このよ
うに必要に応じて前処理された試料を試験紙に含浸させ
ると，胆汁酸は３α−HSDの存在下でNAD+と反応してケ
ト型の胆汁酸となりNAD+はNADHとなる。NADHはジアホラ
ーゼの存在下でテトラゾリウム塩と反応してホルマザン
を生じる。これは，従来の技術の項で述べた反応機構と
同様である。試料を含浸させた後，通常,1〜300秒でホ
ルマザンが生じ発色がおこる。生じるホルマザンの量は
胆汁酸の量に対応するため，発色の度合を目視観察する
ことにより，試料に含有される胆汁酸の概量を知ること
ができる。目視観察する代わりに反射吸光装置などを利
用した光学的方法によればさらに正確に発色の度合を測
定することが可能である。
定が行われる。試料として血液を用いる場合は，あらか
じめオキサミン酸，ピルビン酸などを加えておく。この
ような前処理により，胆汁酸検出のための酵素反応を阻
害するLDH反応などを阻害させることができる。このよ
うに必要に応じて前処理された試料を試験紙に含浸させ
ると，胆汁酸は３α−HSDの存在下でNAD+と反応してケ
ト型の胆汁酸となりNAD+はNADHとなる。NADHはジアホラ
ーゼの存在下でテトラゾリウム塩と反応してホルマザン
を生じる。これは，従来の技術の項で述べた反応機構と
同様である。試料を含浸させた後，通常,1〜300秒でホ
ルマザンが生じ発色がおこる。生じるホルマザンの量は
胆汁酸の量に対応するため，発色の度合を目視観察する
ことにより，試料に含有される胆汁酸の概量を知ること
ができる。目視観察する代わりに反射吸光装置などを利
用した光学的方法によればさらに正確に発色の度合を測
定することが可能である。
（作用） 本発明方法によれば，このように，酵素反応を利用した
胆汁酸測定用の試験紙が得られる。ホルマザンを生じる
色源体であるテトラゾリウム塩を非水状態で担体上に担
持させることができ，かつ担体に塩類が担持されないた
め，試験紙の保存中にテトラゾリウム塩が変化して下地
が発色することがない。得られた試験紙は，例えば,4℃
６ケ月以上にわたり安定に保存することが可能である。
試料中の胆汁酸量に応じて発色度合が変わるため，これ
を観察することにより胆汁酸量を知ることができる。こ
のような試験紙を用いると簡単な操作で短時間のうち
に，しかも安価に胆汁酸量を測定することができる。そ
のため，集団検診やベッドサイドでの緊急検査に好適に
用いられる。体液中の胆汁酸を測定することにより肝胆
道系疾患を早期発見することが可能である。
胆汁酸測定用の試験紙が得られる。ホルマザンを生じる
色源体であるテトラゾリウム塩を非水状態で担体上に担
持させることができ，かつ担体に塩類が担持されないた
め，試験紙の保存中にテトラゾリウム塩が変化して下地
が発色することがない。得られた試験紙は，例えば,4℃
６ケ月以上にわたり安定に保存することが可能である。
試料中の胆汁酸量に応じて発色度合が変わるため，これ
を観察することにより胆汁酸量を知ることができる。こ
のような試験紙を用いると簡単な操作で短時間のうち
に，しかも安価に胆汁酸量を測定することができる。そ
のため，集団検診やベッドサイドでの緊急検査に好適に
用いられる。体液中の胆汁酸を測定することにより肝胆
道系疾患を早期発見することが可能である。
（実施例） 以下に本発明を実施例につき説明する。
実施例１ （Ａ）胆汁酸測定用試験紙の調製:3α−HSD 163IU,ジ
アホラーゼ680IU,β−NAD+10.2mg,PEG 16mg,BSA 100m
gおよびTriton Ｘ（商品名）10μを蒸溜水10mlに溶
解した。この水溶液を300cm2の瀘紙（Whatman No.3）
に含浸させ，凍結乾燥した。次に，ニトロブルーテトラ
ゾリウム（和光純薬社製 NTB）の0.034w/w％エタノー
ル溶液を調製し，これを上記凍結乾燥後の瀘紙に含浸さ
せた後，速やかに乾燥させた。このようにして得られた
試験紙を6mm×10mmの小片に切断し,6mm×60mmのポリス
チレンフィルム製のスティックの端に両面テープで接着
して試験紙片を得た。得られた試験紙を６ケ月間保存し
たが下地の発色は認められなかった。
アホラーゼ680IU,β−NAD+10.2mg,PEG 16mg,BSA 100m
gおよびTriton Ｘ（商品名）10μを蒸溜水10mlに溶
解した。この水溶液を300cm2の瀘紙（Whatman No.3）
に含浸させ，凍結乾燥した。次に，ニトロブルーテトラ
ゾリウム（和光純薬社製 NTB）の0.034w/w％エタノー
ル溶液を調製し，これを上記凍結乾燥後の瀘紙に含浸さ
せた後，速やかに乾燥させた。このようにして得られた
試験紙を6mm×10mmの小片に切断し,6mm×60mmのポリス
チレンフィルム製のスティックの端に両面テープで接着
して試験紙片を得た。得られた試験紙を６ケ月間保存し
たが下地の発色は認められなかった。
（Ｂ）比色表の作成：生理食塩水に人血清アルブリンを
４％の割合で溶解させた溶液に胆汁酸（グリココール酸
ナトリウム）をその濃度が，それぞれ,0,25,50,100およ
び200μmol/になるように添加し標準試料溶液を得
た。これら濃度既知の標準試料溶液を（Ａ）項で得られ
た試験紙片にそれぞれ25μずつ含浸させた。余分な試
料溶液を除き,1〜２分後にその色度を目視観察したとこ
ろ，表１に示す結果が得られた。この試験紙を用いて胆
汁酸の測定が正確になされうることがわかった。
４％の割合で溶解させた溶液に胆汁酸（グリココール酸
ナトリウム）をその濃度が，それぞれ,0,25,50,100およ
び200μmol/になるように添加し標準試料溶液を得
た。これら濃度既知の標準試料溶液を（Ａ）項で得られ
た試験紙片にそれぞれ25μずつ含浸させた。余分な試
料溶液を除き,1〜２分後にその色度を目視観察したとこ
ろ，表１に示す結果が得られた。この試験紙を用いて胆
汁酸の測定が正確になされうることがわかった。
実施例２ （Ａ）胆汁酸測定用試験紙の調製：実施例１（Ａ）項と
同様の方法で試験紙の調製を行った。
同様の方法で試験紙の調製を行った。
（Ｂ）胆汁酸の測定：検査試料として胆道閉塞症児の尿
（サンプル１），正常人血清（サンプル２および３），
肝炎患者血清（サンプル４および５）を準備した。これ
らに含される胆汁酸を，本実施例（Ａ）項で得られた試
験紙を用い，実施例１（Ｂ）項で定めた基準に従って測
定した。別に，これらの試料をエンバザイル（第一化学
薬品（株）製）を用いて溶液法により測定し，正確な胆
汁酸濃度を算出した。それぞれの結果を表２に示す。
（サンプル１），正常人血清（サンプル２および３），
肝炎患者血清（サンプル４および５）を準備した。これ
らに含される胆汁酸を，本実施例（Ａ）項で得られた試
験紙を用い，実施例１（Ｂ）項で定めた基準に従って測
定した。別に，これらの試料をエンバザイル（第一化学
薬品（株）製）を用いて溶液法により測定し，正確な胆
汁酸濃度を算出した。それぞれの結果を表２に示す。
表２から本発明方法で得られる試験紙を用いた測定結果
は，従来の溶液法による結果とよく対応しており，この
試験紙は胆汁酸検出（測定）用試験紙として充分な機能
を有すると考えられる。
は，従来の溶液法による結果とよく対応しており，この
試験紙は胆汁酸検出（測定）用試験紙として充分な機能
を有すると考えられる。
実施例３ 実施例１と同様に試験紙を調製し，胆汁酸標準液を滴下
して発色させた。標準液滴下直後,10秒後,20秒後および
30秒後に540nmにおける反射光強度を反射光測定装置を
用いて測定した。10秒後および30秒後の反射光強度の差
（Δ13）と胆汁酸濃度との関係を調べたところ50μmol/
の濃度まで次の関係が成立した。
して発色させた。標準液滴下直後,10秒後,20秒後および
30秒後に540nmにおける反射光強度を反射光測定装置を
用いて測定した。10秒後および30秒後の反射光強度の差
（Δ13）と胆汁酸濃度との関係を調べたところ50μmol/
の濃度まで次の関係が成立した。
Δ13＝0.25×〔胆汁酸濃度（μmol/）〕＋12.2 （相関係数R:0.995） このように，胆汁酸濃度と反射光強度差とは直線的な関
係であり，相関係数も１に近い。従って，実施例１の比
色表を利用する代わりに反射光測定機を利用すればより
精密な胆汁酸の分析がなされうることが明らかである。
係であり，相関係数も１に近い。従って，実施例１の比
色表を利用する代わりに反射光測定機を利用すればより
精密な胆汁酸の分析がなされうることが明らかである。
比較例１ ３α−HSD 50IU,シアホラーゼ50IU,β−NAD+10mgおよ
びニトロブルーテトラゾリウム10mgをpH8.0を20mMリン
酸バッファー10mlに溶解した。この溶液を縦10cm,横10c
mの瀘紙（東洋瀘紙No.2）に含浸させ，ただちに凍結乾
燥した。得られた試験紙を6mm×10mmを小片に切断し,6m
m×60mmのポリスチレンフィルム製スフィックの端に両
面テープで接着して試験紙片を得た。得られた試験紙を
24時間保存したところ，下地の発色が認められた。下地
発色の度合は実施例１（Ｂ）項の比色表では（＋）に相
当する。このように下地が発色するため，本比較例の試
験紙は胆汁酸の測定には使用できない。
びニトロブルーテトラゾリウム10mgをpH8.0を20mMリン
酸バッファー10mlに溶解した。この溶液を縦10cm,横10c
mの瀘紙（東洋瀘紙No.2）に含浸させ，ただちに凍結乾
燥した。得られた試験紙を6mm×10mmを小片に切断し,6m
m×60mmのポリスチレンフィルム製スフィックの端に両
面テープで接着して試験紙片を得た。得られた試験紙を
24時間保存したところ，下地の発色が認められた。下地
発色の度合は実施例１（Ｂ）項の比色表では（＋）に相
当する。このように下地が発色するため，本比較例の試
験紙は胆汁酸の測定には使用できない。
比較例２ 蒸溜水の代わりに10mMのピロリン酸緩衝液（pH8.0）を
用いたこと以外は実施例１（Ａ）項と同様に操作して試
験紙片を得た。この試験紙片を保存したところ，約１週
間で下地の発色が認められた。この試験紙を用いての胆
汁酸の正確な測定は困難であるが，約200μmol/以上
の高濃度の胆汁酸の検出は可能であった。
用いたこと以外は実施例１（Ａ）項と同様に操作して試
験紙片を得た。この試験紙片を保存したところ，約１週
間で下地の発色が認められた。この試験紙を用いての胆
汁酸の正確な測定は困難であるが，約200μmol/以上
の高濃度の胆汁酸の検出は可能であった。
（発明の効果） 本発明によれば，このように，試料溶液中の胆汁酸量を
簡便な方法でしかも短時間のうちに測定しうる試験紙が
得られる。試験紙は長時間安定に保存され得，例えば，
経時的に成分が変化して下地が発色することがない。得
られた試験紙を用いて安価に胆汁酸の測定が行われるた
め，集団検診などで肝胆道系疾患を早期に発見すること
が可能である。ベッドサイドでの緊急時の検査にも利用
価値が高い。
簡便な方法でしかも短時間のうちに測定しうる試験紙が
得られる。試験紙は長時間安定に保存され得，例えば，
経時的に成分が変化して下地が発色することがない。得
られた試験紙を用いて安価に胆汁酸の測定が行われるた
め，集団検診などで肝胆道系疾患を早期に発見すること
が可能である。ベッドサイドでの緊急時の検査にも利用
価値が高い。
Claims (2)
- 【請求項１】（１）ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チド,3α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼおよ
びジアホラーゼを含有した脱塩水水溶液を，高分子素材
からなる担体に含浸させる工程， （２）該水溶液の含浸された該担体を凍結乾燥する工
程，および （３）該凍結乾燥後の担体にテトラゾリウム塩の非水溶
媒溶液を含浸させる工程， を包含する胆汁酸測定用試験紙の製造方法 - 【請求項２】前記水溶液が増粘剤，酵素活性化剤および
酵素安定化剤のうちの少なくとも１種を含有する特許請
求の範囲第１項に記載の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11667686A JPH0679560B2 (ja) | 1986-05-21 | 1986-05-21 | 胆汁酸測定用試験紙の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11667686A JPH0679560B2 (ja) | 1986-05-21 | 1986-05-21 | 胆汁酸測定用試験紙の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62272994A JPS62272994A (ja) | 1987-11-27 |
| JPH0679560B2 true JPH0679560B2 (ja) | 1994-10-12 |
Family
ID=14693123
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11667686A Expired - Lifetime JPH0679560B2 (ja) | 1986-05-21 | 1986-05-21 | 胆汁酸測定用試験紙の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0679560B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105445067A (zh) * | 2014-08-07 | 2016-03-30 | 珠海贝索生物技术有限公司 | 干式纸片法质控品及其制备方法 |
-
1986
- 1986-05-21 JP JP11667686A patent/JPH0679560B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS62272994A (ja) | 1987-11-27 |
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