NO300244B1 - Fremgangsmåte for bestemmelse av en analytt ved anvendelse av et tungtlöselig salt av en heteropolysyre samt middel for anvendelse ved bestemmelsen - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår anvendelsen av et tungtløselig salt av en heteropolysyre til bestemmelse av en analytt. Oppfinnelsen angår dessuten en fremgangsmåte for bestemmelse av en analytt ved hjelp av dannelse av heteropolyblått og et for dette formål egnet middel. Oppfinnelsen angår også anvendelse av et tungtløselig salt av en heteropolysyre til fremstilling av et middel for bestemmelse av en analytt gjennom dannelse av heteropolyblått.

Heteropolysyrer er uorganiske polysyrer med minst to forskjellige sentralatomer. De består av flerbasiske oksygen-syrer av et metall, som molybden, wolfram, vanadium, og ét ikke-metall eller metall, som fosfor, silisium, arsen, jod, jern, mangan, kobolt, som partielle blandede anhydrider. Eksempler er molybdenfosforsyre eller wolframfosforsyre. Heteropolysyrer er vannløselige, men de er imidlertid

stabile i sur løsning.

Heteropolysyrer av molybden og wolfram har vært kjent i lange tider. Disse reagenser anvendes analytisk til bestemmelse av fosfat og også til påvisning av arsenat eller silikat gjennom dannelse av de tilsvarende heteropolysyrer med molyb-dat eller wolframat og etterfølgende reduksjon av heteropolysyrene til et blått fargestoff, det såkalte heteropolyblått. Fargen skyldes lysabsorpsjon på grunn av elektronovergang mellom fem- eller seksverdig molybden eller wolfram. Heteropolyblått fra heteropolysyrer er et fargestoff med høy ekstinksjon, som under avhengighet av bølgelengden oppviser et meget bredt absorpsjonsmaksimum. Dette er typisk for "charge-transfer"-absorpsj onsbånd.

Heteropolysyrer til påvisning av reduserende forbindelser ved hjelp av dannelse av heteropolyblått er kjente. I "Spot Tests in Organic Analysis" av F. Feigl, Elsevier Publishing Company, 5. opplag, 1956, s. 128 og 129, beskrives at 12-molybdenfosforsyre reduseres til molybdenblått ved hjelp av flere reduserende stoffer. Fordi denne påvisningsreaksjonen er uspesifikk, anbefales det for å oppnå en god selektivitet å alkalisere proben som skal undersøkes, etterfulgt av ekstrak-sjon med eter. Det erholdte eterekstrakt inneholder fremfor alt aromatiske nitrogenbaser og eterløselige nøytrale stoffer. Sure stoffer forblir oppløst i den vandige fase.

Fra P.B. Issopoulos, Pharm. Acta Heiv. 64, 82 (1989), er det kjent at bestemte legemidler som inneholder en o-hyd-roksykinonstruktur, som f.eks. metyldopa, i svovelsur løsning virker reduserende på molybdenfosforsyre og fører til dannelse av molybdenblått.

I M.L. Matheke et al., Clin. Chem. 33, 2109-2110

(1987), beskrives anvendelse av fosforwolframsyre til påvisning av urinsyre. Den reduktive dannelse av wolframblått tjener som indikator for tilstedeværelsen av urinsyre. Påvisningsreaksjonen forstyrres av tilstedeværende reduserende legemidler. Fra B. Klein et al., Clin. Chem. 12, 816-823 (1966), er det kjent en bestemmelse av glukose i serum eller plasma som er basert på den følgende reaksjonssekvens: Glukose oksideres ved hjelp av kaliumheksacyanoferrat (III), hvorved det dannede kaliumheksacyanoferrat (II) virker reduserende på fosformolybdensyre og fører til dannelse av molybdenblått. Fordi serum og plasma kan inneholde forskjellige mengder av urinsyre, legemidler eller andre reduserende stoffer, som f.eks. bilirubin og glutation, programmeres ved denne fremgangsmåten deres forstyrrende innflytelse på for-hånd. Mangelen ved alle de hittil kjente analytiske metoder som benytter seg av den reduktive dannelse av heteropolyblått fra heteropolysyrer, skyldes fremfor alt uspesifisiteten av den aktuelle påvisningsreaksjon. Svært mange reduserende forbindelser kan virke forstyrrende fordi de likeledes fører til dannelse av heteropolyblått. Heteropolysyrer er dessuten kun stabile under sure betingelser. Dette innskrenker anvendelses-området i meget høy grad. Spesielt er koblingen av dannelsen av heteropolyblått med enzymatiske reaksjonstrinn til spesifikk påvisning og spesifikk bestemmelse av forbindelser hittil ikke kjent. Nettopp for påvisning av bestanddeler av kroppsvæsker som blod, serum, plasma, urin etc. er imidlertid enzymatiske bestemmelsesfremgangsmåter ofte nødvendig. Målet for foreliggende oppfinnelse var å anvende dannelsen av heteropolyblått som påvisnings- og bestemmelses-reaksjon av forbindelser, spesielt av forbindelser i kroppsvæsker, og spesielt i kombinasjon med enzymatiske reaksjonstrinn. Urenheter med reduserende virkning skulle dessuten ikke virke forstyrrende, og påvisnings- og bestemmelsesreaksjonene burde forløpe ved de påkrevde pH-verdier for enzymatiske reaksjoner. Påvisnings- og bestemmelsesreaksjonene burde dessuten kunne gjennomføres hurtig. Det er ved foreliggende oppfinnelse funnet at et tungtløselig salt av en heteropolysyre fordelaktig kan anvendes for bestemmelse av en analytt, spesielt når analytten er et elektronrikt, aromatisk amin eller når analytten sammen med en ytterligere forbindelse fører til et slikt amin. Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse til bestemmelse av en analytt ved hjelp av dannelse av heteropolyblått er kjennetegnet ved at analytten er et elektronrikt, aromatisk amin eller at analytten omsettes med en forbindelse, hhv. et enzym, som fører til dannelse av et aromatisk, elektronrikt amin som bringes i kontakt med et tungtløselig salt av en heteropolysyre. Målet for foreliggende oppfinnelse oppnås ved anvendelse av et tungtløselig salt av en heteropolysyre til fremstilling av et middel til bestemmelse av en analytt gjennom dannelse av heteropolyblått. Ifølge oppfinnelsen fremstilles et middel til bestemmelse av en analytt gjennom dannelse av heteropolyblått, som er kjennetegnet ved at det inneholder en forbindelse som sammen med analytten fører til dannelse av et elektronrikt, aromatisk amin og dessuten et tungtløselig salt av en heteropolysyre eller stoffer som dannes fra kontakt med et slikt salt. Dersom midlet ifølge foreliggende oppfinnelse skal anvendes til direkte bestemmelse av et elektronrikt, aromatisk amin, er det tilstrekkelig at midlet inneholder et tungtløse-lig salt av en heteropolysyre eller stoffer som dannes ved kontakt med et slikt salt i et flytende medium eller bundet til en bærer. Ifølge foreliggende oppfinnelse kan et tungtløselig salt av en heteropolysyre anvendes til bestemmelse av en analytt. Som et tungtløselig salt av en heteropolysyre ifølge foreliggende oppfinnelse skal fremfor alt forstås et slikt salt av en heteropolysyre som er uløselig eller meget tungt-løselig i vann eller vandige medier, som buffere eller kroppsvæsker, som f.eks. blod, plasma, serum, urin eller spytt, og som også forblir under test- og fargedannelsesbetingelsene. Spesielt er saltet av en heteropolysyre så tungtløselig at den maksimale mengde som er løselig i en flytende probe, ikke alene er tilstrekkelig til bestemmelse av den deri inneholdte analytt. Det har overraskende vist seg at et slikt tungtløse-lig salt av en heteropolysyre ikke bare er stabilt i syrer, men også i nøytrale og basiske pH-områder, spesielt inntil pH på tilnærmet 10. Det kan således anvendes pH-områder hvor de fleste enzymer er aktive og derved medføre dannelse av heteropolyblått i kombinasjon med enzymatiske reaksjoner. Fremfor alt i uoppløst tilstand er et tungtløselig salt av en heteropolysyre ifølge oppfinnelsen stabil også ved forhøyede tempe-raturer. Til tross for den tunge løselighet har det vist seg at en analytt ved hjelp av et salt av en heteropolysyre ifølge oppfinnelsen meget hurtig, dvs. i løpet av noen få sekunder til noen få minutter, kan påvises og bestemmes gjennom dannelse av heteropolyblått. Det er herved mulig å oppnå en selektiv bestemmelse uten forstyrrelse av andre i seg selv reduserende stoffer. Dette tillater en følsom målemetode som også spesielt på grunn av det brede absorpsjonsmaksimum for det dannede heteropolyblått, som strekker seg fra tilnærmet 550 til høyere enn 100 nm, ikke stiller noen spesielle krav til måleapparatur, og som også lett kan følges visuelt. Anvendelige salter av heteropolysyrer ifølge foreliggende oppfinnelse er salter av heteropolysyrer av molybden, molybden og wolfram, vanadium og molybden eller vanadium og molybden og wolfram, med fosfor, arsen, silisium eller germanium som heteroatomer. Spesielt foretrukne er heteropolysyrer av molybden med fosfor eller arsen. Fosfor er spesielt foretrukket som ikke-metallatom. Som metallatom er molybden fortrinnsvis foretrukket. Utmerket egnede er tungtløselige salter av 12-molybdenfosforsyre, 18-molybdendifosforsyre, 12-molybdenarsensyre, 18-molybdendiarsensyre, 11-molybden-1-vanadiumfosforsyre, 10-molybden-2-vanadiumfosforsyre og 9-molybden-3-vanadiumfosforsyre, hvorved 18-molybdendifosforsyre er spesielt foretrukket på grunn av det høye fargeutbyttet ved

reduksjon til molybdenblått.

Tungtløselige salter av heteropolysyrer er slike hvis kationer er større enn ammonium, NH4<+.> Foretrukne kationer kan fremstilles ved hjelp av den generelle formel I

hvori

R1, R<2>, R3 og R<4> er like eller forskjellige og betegner en alkylrest, arylrest eller aralkylrest,

eller hydrogen, når alle rester ikke er like, eller

hvori to rester til sammen danner en alkylenrest, og X betegner et fosforatom eller nitrogenatom.

I alkylrester og aralkylrester betegner alkyl en rettkjedet eller forgrenet hydrokarbonrest med 1-22 karbonatomer, fortrinnsvis 1-6 karbonatomer. Aryl i arylrester eller aralkylrester betegner en aromatisk rest med 6-10 karbonatomer. Spesielt foretrukket er fenyl eller naftyl.

Som aralkylrest er benzylgruppen spesielt foretrukket .

En alkylenrest er en mettet eller umettet hydro-karbonkjede med 4-6, fortrinnsvis 4 eller 5, karbonatomer, som er bundet til X med begge ender. Kationer med generell formel I kan inneholde to slike alkylenrester. Fortrinnsvis foreligger imidlertid kun én alkylenrest.

I den generelle formel I betegner X fortrinnsvis et nitrogenatom. Likeledes kan foretrukne kationer i tungtløse-lige salter av heteropolysyrer også være fra gruppen nitrogen-heteroaromater inneholdende et kvaternært N-atom. Eksempelvis kan nevnes pyridin eller kinolin, med en alkylrest eller aralkylrest festet til nitrogenatomet, hvorved definisjonen av restene R<1>, R2, R3 og R<4> har samme betydning som angitt under formel I ovenfor. Et tungtløselig salt av en heteropolysyre ifølge foreliggende oppfinnelse kan eksempelvis erholdes ved omsetning av en heteropolysyre med en tilsvarende basisk forbindelse. Til dette anvendes som regel minst én forbindelse i form av en løsning, fortrinnsvis en vandig løsning. Begge saltbestanddelene i fast form kan imidlertid også tilsettes en væske, spesielt en vandig væske, eller omvendt.

Som analytt betegnes en forbindelse som skal bestemmes. Foreliggende oppfinnelse har vist seg spesielt egnet for forbindelser som foreligger oppløst i en væske, spesielt en vandig væske. Spesielt fordelaktig kan et tungtløselig salt av en heteropolysyre anvendes til bestemmelse av forbindelser i kroppsvæsker, som f.eks. blod, plasma, serum, urin eller spytt. Som mulige analytter i denne forbindelse kan f.eks. nevnes glukose, kolesterin, laktat, NADH eller etanol. Ifølge foreliggende oppfinnelse kan prinsipielt alle de forbindelser bestemmes som sammen med én eller flere andre forbindelser kan omsettes til slike analytter, eller som selv er slike analytter, og som med hensyn til deres redokspotensialer og deres kinetikk er i den tilstand at de kan redusere et tungtløselig salt av en heteropolysyre til heteropolyblått i løpet av noen få sekunder til noen minutter, fortrinnsvis mindre enn 3 min. Det har overraskende vist seg at elektronrike, aromatiske aminer har denne egenskap. Fremfor alt er det overraskende at en selektiv bestemmelse uten forstyrrelse av andre i seg selv reduserende forbindelser er mulig.

Ved et elektronrikt, aromatisk amin skal forstås en forbindelse som er mer elektronrik enn anilin og derved representerer et sterkere reduksjonsmiddel. Elektronrike, aromatiske aminer har et redokspotensial mindre enn 0,6 V, fortrinnsvis mindre enn 0,45 V, overfor en normal hydrogen-elektrode. Størrelsen av redokspotensialet alene er imidlertid ikke avgjørende. Det er dessuten viktig at den tilsvarende forbindelse er i stand til å redusere et tungtløselig salt av en heteropolysyre til heteropolyblått, dvs. i løpet av mindre enn tilnærmet 3 min. Slike anvendelige forbindelser er eksempelvis alle anilinderivater, til hvilke er bundet én eller flere +1- eller/og +M-substituenter, som hydroksy-, alkyl-, alkoksy-, aryloksy-, alkyltio-, aryltio-, amino-, monoalkylamino- og dialkylaminorester.

Alkyl-, alkoksy-, alkyltio-, monoalkylamino- og dialkylaminorester er rester i hvilke alkylgruppen representerer en hydrokarbonrest med 1-6 karbonatomer, som på sin side kan være substituert med en hydroksygruppe, eventuelt en aminogruppe som er mono- eller flersubstituert med alkyl med 1-6 karbonatomer, H2P03, HS03 eller HC02. Syrerestene H2P03, HS03 og HC02 kan foreligge som slike rester eller i saltform som ammonium-, alkali- eller jordalkalisalter.

Aryloksyrester og aryltiorester er rester med 6-

10 karbonatomer, hvor fenoksyrester og fenyltiorester er spesielt foretrukne.

Ved anilinderivater skal også forstås forbindelser med en usubstituert aminogruppe eller en aminogruppe som er mono- eller flersubstituert med alkyl, bundet til et aromatisk ringsystem som er ortoforbundet med én eller flere aromatiske og/eller alicykliske ringer. Aromatiske ringer kan være både karbonaromatiske systemer og heteroaromater. Eksempler er ortoforbundne benzen- eller naftalenringer eller en ortoforbundet pyridinring.

Alicykliske ringer betegner mettede eller umettede cykloalifater med 5-7 karbonatomer, fortrinnsvis 5 eller 6 karbonatomer.

Mulige alkylsubstituenter på aminogruppen kan være hydrokarbonrester med 1-6 karbonatomer, som på sin side kan være substituert med en hydroksygruppe, en aminogruppe som eventuelt er mono- eller flersubstituert med alkyl med 1-

6 karbonatomer, H2P03, HS03 og HC02. Syrerestene H2P03, HS03 og HC02 kan foreligge som sådanne eller i saltform som ammonium-, alkali- eller jordalkalisalter. Spesielt egnede som elektronrike, aromatiske aminer er forbindelser med generell formel II

hvori

R<5> betegner hydroksy eller amino, hvor aminogruppen eventuelt er substituert med 1 eller 2 alkylrester og alkylresten på sin side eventuelt er substituert med en hydroksygruppe, en aminogruppe som eventuelt er mono- eller flersubstituert med alkyl, H2P03, HS03 eller HC02,

R6 og R7 er enten begge like eller forskjellige og betegner hydrogen eller alkyl, hvor alkylresten eventuelt er substituert med en hydroksygruppe, en aminogruppe som eventuelt er mono- eller flersubstituert med alkyl,

H2P03, HS03 eller HC02, og

R<8>, R9, R<10> og R<11> er enten like eller forskjellige og betegner hydrogen, alkyl, alkoksy, alkyltio, aryloksy, aryltio, halogen, karboksy, karboksyalkyl eller alkoksy-karbonyl.

Alkylrester og "alkyl" i alkyltio, karboksyalkyl- og alkoksykarbonylrester er hydrokarbonrester med 1-6 karbonatomer. Spesielt foretrukne er rester med 1-3 karbonatomer.

Alkoksyrester er likeledes hydrokarbonrester med 1-

6 karbonatomer. Spesielt foretrukne er rester med 1-3 karbonatomer. Aryloksy- og aryltiorester er rester med 6-10 karbonatomer, hvorved fenoksy- og fenyltiorester er spesielt foretrukne. Halogen betegner fluor, klor, brom eller jod. Klor og brom er foretrukne halogensubstituenter.

Syrerestene H2P03, HS03 eller HC02 kan foreligge som sådanne eller i saltform som ammonium-, alkali- eller jordalkalisalter .

Ammoniumsalter er salter som inneholder ammoniumionet, NH4<+>, eller slike salter som inneholder ammoniumkationer som er mono- eller flersubstituert med alkyl-, aryl- eller aralkylrester. Alkyl i alkyl- og aralkylrester betegner en hydrokarbonrest med 1-6 karbonatomer. Aryl i aryl- og aralkylrester er et aromatisk ringsystem med 6-10 karbonatomer, hvor fenyl er foretrukket. En foretrukket aralkylrest er benzyl.

Alkalisalter er fortrinnsvis salter av litium, natrium eller kalium. Jordalkalisalter er fortrinnsvis salter av magnesium eller kalsium.

Elektronrike, aromatiske aminer kan umiddelbart bestemmes ved hjelp av et tungtløselig salt av en heteropolysyre gjennom dannelse av heteropolyblått. Det kan imidlertid også utføres bestemmelse av forbindelser som på støkiometrisk måte omsettes til et elektronrikt, aromatisk amin ved hjelp av kjemisk eller enzymatisk reaksjon med en ytterligere forbindelse. Eksempelvis kan det som reaksjonspartnere anvendes slike forbindelser hvis grunnskjelett allerede inneholder et elektronrikt, aromatisk amin som kan frigis ved hjelp av en kjemisk eller enzymatisk reaksjon med analytten som skal bestemmes. Herunder skal fortrinnsvis forstås slike forbindelser som danner et elektronrikt, aromatisk amin gjennom hydrolyse. Som eksempler kan nevnes amider, estere eller glykosider av elektronrike, aromatiske aminer. Analytter som kan bestemmes på denne måte er fortrinnsvis enzymer som katalyserer omset-ningen av de tilsvarende substrater til elektronrike, aromatiske aminer, spesielt hydrolase som spalter amidbindinger og/eller peptidbindinger, enzymer som spalter esterbindinger som karbonsyrebindinger, fosforsyrebindinger eller svovelsyre-bindinger, og enzymer som spalter glykosidbindinger, dessuten også transferaser som katalyserer overføringen av grupper, som f.eks. Y-glutamyltransferase.

Eksempelvis kan det videre også utføres bestemmelse av forbindelser som kan oksideres enzymatisk, og dessuten kan det som elektronakseptorer innføres slike forbindelser som danner elektronrike, aromatiske aminer gjennom reduksjon. Fremfor alt er det for stoffer i kroppsvæsker, som blod, plasma, serum, urin eller spytt, kjent et stort antall oksidoreduktaser som gjenkjenner spesifikt bestemte forbindelser og som oksiderer disse forbindelser under tilstedeværelse av en funksjonerende elektronakseptor.

Eksempler er flavinavhengige oksidaser som L- og D-aminosyre-oksidase, kolesterin-oksidase, glukose-oksidase, glyserol-3-fosfat-oksidase, laktat-oksidase eller pyruvat-oksidase og ikke-NAD(P)-avhengige dehydrogenaser som pyrrolo-kinolin-kinon-avhengig glukose-dehydrogenase eller også diaforase (NADH: fargestoff-oksidoreduktase).

I tilfellet med oksidoreduktaser, spesielt oksidaser og ikke-NAD(P)-avhengige dehydrogenaser, kan det tilsettes elektronakseptorer for enzymatisk oksidasjon som reduseres til et elektronrikt, aromatisk amin gjennom den enzymatiske oksidasjon av enzymsubstratet. På denne måte kan forbindelser som oksideres enzymatisk påvises og bestemmes ved å bringe det dannede elektronrike, aromatiske amin i kontakt med et tungt-løselig salt av en heteropolysyre som gir dannelse av heteropolyblått .

Som elektronakseptorer ifølge foreliggende oppfinnelse skal i denne forbindelse spesielt nevnes aromatiske nitrosoforbindelser, oksimer og hydroksylaminer. Spesielt foretrukne er aromatiske nitrosoforbindelser og oksimer. Helst foretrukne er spesielt slike nitrosoforbindelser og oksimer som er beskrevet i europeisk patentsøknad EP-A-0.354.441.

Til gjennomføring av fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse for bestemmelse av en analytt gjennom dannelse av heteropolyblått er det tilstrekkelig at analytten, som beskrevet ovenfor, bringes til reaksjon med en forbindelse og omsettes til et elektronrikt, aromatisk amin og bringes i kontakt med et tungtløselig salt av en heteropolysyre. Når det elektronrike, aromatiske amin selv er analytten som skal bestemmes direkte, bringes dette i kontakt med et tungtløselig salt av en heteropolysyre uten forutgående kjemiske eller enzymatiske reaksjoner.

Som regel foreligger i det minste det elektronrike, aromatiske amin som innvirker på saltet av heteropolysyren i oppløst form, fortrinnsvis i vandig løsning, eksempelvis vann, buffer eller kroppsvæske. Når analytten som skal bestemmes ikke selv er et elektronrikt, aromatisk amin, er fortrinnsvis den nødvendige forbindelse som sammen med analytten frem-bringer et elektronrikt, aromatisk amin likeledes løselig i vandige væsker. Den vandige løsning kan tilsettes til proben før den bringes i kontakt med et tungtløselig salt av en heteropolysyre. Løsningen kan imidlertid også først bringes i kontakt med det tungtløselige salt av en heteropolysyre eller endog helt til slutt bringes i kontakt med proben som skal undersøkes. Hvilken rekkefølge som velges, er avhengig av det enkelte tilfelle og kan avgjøres av fagmannen på grunnlag av den allmenne fagkunnskap eller på grunnlag av noen få opti-maliserende forsøk. Forbindelsen som er nødvendig for å danne et elektronrikt, aromatisk amin, kan tilsettes en vandig probe i fast eller oppløst form.

Forbindelsen som sammen med analytten som skal bestemmes danner et elektronrikt, aromatisk amin, må bringes i kontakt med proben i minst en så stor mengde at den samlede mengde analytt kan bringes til reaksjon. Fortrinnsvis tilsettes et 2-10 gangers overskudd.

Det tungtløselige salt av en heteropolysyre kan i form av et fast stoff bringes i kontakt med proben som skal undersøkes. Saltet kan imidlertid også foreligge i form av en suspensjon i en væske, fortrinnsvis en vandig væske, og for å gjennomføre analysenestemmelsen blandes suspensjonen med proben som skal undersøkes. Ved tilstedeværelse av analytten som skal bestemmes, dannes det i vann tungtløselig heteropolyblått som er gjenkjennelig på grunn av den intensive farge. Til kvantitativ bestemmelse er det mulig å utskille det tungt-løselige heteropolyblått så vel som uomsatt heteropolysyresalt fra væsken, eksempelvis ved hjelp av sentrifugering, etterfulgt av oppløsning i et egnet løsningsmiddel som dimetylsulfoksid og fotometrisk måling av konsentrasjonen av heteropolyblått-fargestoff, eventuelt med referanse til standard-løsninger eller standardkurver, for derved å bestemme konsentrasjonen av analytten som skal påvises.

Det tungtløselige salt av en heteropolysyre må være til stede i en så stor mengde at det elektronrike, aromatiske amin som foreligger eller dannes i proben fører til dannelse av heteropolyblått, som kan settes i en kvantitativ sammenheng med mengden av analytten hhv. det elektronrike, aromatiske amin som skal bestemmes. Prinsipielt må det derfor tilsettes en så stor mengde tungtløselig salt av en heteropolysyre at selv med den høyeste relevante konsentrasjon av det elektronrike, aromatiske amin vil en økning av aminmengden føre til en økning av heteropolyblåttmengden.

Et middel ifølge foreliggende oppfinnelse til bestemmelse av en analytt gjennom dannelse av heteropolyblått inneholder en forbindelse som sammen med analytten fører til et elektronrikt, aromatisk amin og et tungtløselig salt av en heteropolysyre. Et slikt middel kan eksempelvis tilsettes i form av en suspensjon eller et lyofilisat, en pulverblanding eller presset til tabletter. Bestanddelene kan foreligge samlet eller atskilt, hvorved hver av bestanddelene kan bearbeides til sin mest egnede form. Det er også absolutt mulig at et middel ifølge oppfinnelsen ikke inneholder et ferdig preparert tungtløselig salt av en heteropolysyre, men kun de nødvendige bestanddeler for preparering av et slikt salt, nemlig eksempelvis en heteropolysyre og en kationisk eller basisk forbindelse, hvilke begge bringes i kontakt med hverandre først umiddelbart før bestemmelsesreaksjonen ifølge oppfinnelsen og først da danner det tilsvarende salt. Spesielt fordelaktig er det når midlet ifølge foreliggende oppfinnelse inneholder et tungtløselig salt av en heteropolysyre i finfor-delt form, slik at det oppviser en stor reaktiv overflate. Midlet ifølge oppfinnelsen kan eventuelt inneholde ytterligere reagenser som buffere og hjelpestoffer, som f.eks. fukte-midler, stabiliseringsmidler og strukturdannende midler. Er analytten som skal bestemmes selv et elektronrikt, aromatisk amin, behøver midlet ifølge oppfinnelsen selvsagt ikke inneholde en forbindelse som danner et elektronrikt, aromatisk amin først etter reaksjon med analytten.

Spesielt fordelaktig utføres bestemmelsen av en analytt ifølge foreliggende oppfinnelse ved hjelp av en såkalt tørrtest. Anordninger som er egnet til utførelse av en tørr-test er kjent for fagmannen fra eksempelvis EP-A-0.016.387, DE-A-3.247.608, EP-A-0.262.445 eller EP-A-O.256.806. Test-anordningene kan betegnes som testbærermaterialer. Til utførelse av en test foreligger heri nødvendige reagenser i tørr form, dvs. ikke oppløst i en væske, i eller på et absorberende materiale som f.eks. papir, en åpen film ifølge EP-A-0.016.387, glassfiberull eller en porøs kunststoffmembran, eller i eller på et svellbart materiale som f.eks. en tilsvarende film av kunststoff, gelatin eller cellulose.

Ved påføring av den probeinneholdende væske på testbærermaterialet eller ved neddypping av testbærermaterialet i den probeinneholdende væske danner det seg et flytende miljø i testbærermaterialet, inne i hvilket påvisningsreaksjonen for-løper. Den forårsakede fargedannelse ved reaksjonen kan evalueres visuelt eller fotometrisk, f.eks. refleksjonsfoto-metrisk.

Til fremstilling av midlet ifølge foreliggende oppfinnelse i bærerbundet form impregneres et egnet bærermateriale, som filtrerpapir, cellulose eller syntetisk fiber-ull, med de nødvendige løsninger og/eller suspensjoner av reagenser i lett flyktige løsningsmidler, som f.eks. vann, metanol, etanol eller aceton, som anvendes ved fremstilling av en testanordning. Dette kan foregå i et impregneringstrinn. Det er ofte hensiktsmessig at impregneringen gjennomføres i flere trinn, hvorved det tilsettes løsninger og/eller suspensjoner som eventuelt inneholder én del av bestanddelene i det ferdige middel. I et første trinn kan det således på et bærermateriale eksempelvis appliseres en suspensjon av et tungt-løselig salt av en heteropolysyre og i et andre trinn en løsning av en forbindelse som sammen med analytten som skal bestemmes gir et elektronrikt, aromatisk amin, hvilken løsning også eventuelt kan inneholde buffer og andre tilsetnings-materialer. Bærermaterialet behandlet på denne måte anvendes som sådant eller klebes på et stivt underlag, som en stiv kunststoffolie, for å kunne håndteres lettere.

Istedenfor en flertrinns impregnering av det samme bærermateriale kan reagensene i midlet ifølge foreliggende oppfinnelse også fordeles på forskjellige bærermaterialer, som ved gjennomføring av analysebestemmelsen kan bringes i kontakt med hverandre gjennom en væskeutveksling.

Til fremstilling av bærerbundne testmidler kan det istedenfor en impregnering også anvendes filmdannende bestanddeler, dvs. polymerer eller polymerdispersjoner, fra hvilke det kan fremstilles løsninger som er så viskøse at de ved hjelp av kjente fremstillingsmetoder, som bestrykning og valsebelegging, kan anvendes for å fremstille filmer. I disse løsninger innarbeides reagensene og eventuelt bufferstoffer og hjelpematerialer. Beleggmassene påføres bærerfolier, tørkes, og de ferdige filmer bearbeides f.eks. til teststriper. Figur 1 og 6 viser eksempler på foretrukne testanordninger. De øvrige figurer 2-5 og 7 viser diagrammer over refleksjonen i prosent som funksjon av tid, bølgelengde eller analyttkonsentrasjon, erholdt med testanordninger ifølge hhv. figur 1 og figur 6. Figur 1: et tverrsnitt gjennom en foretrukket testanordning. Figur 2: et diagram som viser refleksjonen i prosent som en funksjon av tiden i sekunder etter påføring av en probe på en testanordning ifølge figur 1 for probene a)-f) med forskjellige glukosekonsentrasjoner. Figur 3: et diagram som viser refleksjonen i prosent som en funksjon av bølgelengden i nanometer for probene a)-f) med forskjellige glukosekonsentrasjoner ved anvendelse av en testanordning ifølge figur 1. Figur 4: et diagram som viser refleksjonen i prosent som en funksjon av glukosekonsentrasjonen målt med en testanordning ifølge figur 1. Figur 5: et diagram som viser refleksjonen i prosent som en funksjon av NADH-konsentrasjonen målt med en testanordning ifølge figur 1. Figur 6: et tverrsnitt gjennom en ytterligere foretrukket testanordning. Figur 7: et diagram som viser refleksjonen i prosent som en funksjon av etanolkonsentrasjonen målt med en testanordning ifølge figur 6.

De etterfølgende eksempler viser noen av de mulige fremgangsmåtevariantene til bestemmelse av en analytt gjennom dannelse av heteropolyblått. Disse utførelsesformer er imidlertid ikke begrensende for foreliggende oppfinnelse. Figurene blir nærmere forklart i eksemplene.

Eksempel 1

Påvisning av glukose med 18- molybdendifosfat

Det fremstilles en testanordning ifølge figur 1. Den består av en 350 um tykk polyesterfolie som bærerfolie (1) med målet 2 x 3 cm. I sentrum av folien er det en åpning med dia-meter 6 mm. Ved hjelp av et lim (2) festes reagensbæreren (6) bestående av en 200 um tykk, gjennomsiktig polykarbonatfolie (5), et første reagenssjikt (4) og et andre reagenssjikt (3), over åpningen i bærerfolien på en slik måte at probevæsken som appliseres gjennom denne åpningen først kommer i kontakt med det andre reagenssjikt. Reagensbæreren har målene 2 x 1 cm.

Fremstilling av reagensbæreren (6) utføres som følger:

Første reagenssjikt:

omrøres til en homogen masse og påføres den gjennomsiktige folie (5) i en tykkelse på 150 um. Sjiktet tørkes i 1 time ved 60 °C.

Andre reagenssjikt:

omrøres til en homogen masse og påstrykes på det første reagenssjikt i en tykkelse på 400 um. Luftblærer fjernes ved forsiktig luftblåsing, og sjiktet tørkes i 1 time ved 60 °C. Ved tidspunktet t = 0 tilsettes humant plasma med a) 0 mg glukose/dl, b) 47,5 mg glukose/dl, c) 108,7 mg glukose/dl, d) 200,8 mg glukose/dl, e) 392,3 mg glukose/dl og f) 766 mg glukose/dl på en testanordning fremstilt som beskrevet ovenfor. Remisjonen i prosent måles ved 950 nm. Den

første målingen foretas etter 8 sekunder, og ytterligere målinger foretas med 4 sekunders mellomrom. Ved plotting av remisjonen (R) i prosent mot tiden (t) i sekunder erholdes et diagram som vist i figur 2. Fargedannelsen og remisjonsreduk-sjonen er allerede ved den første målingen fullstendig. Det ble oppnådd en stabil sluttverdi som kan måles ved nesten et hvilket som helst tidspunkt etter starten.

Dersom prober med en glukosekonsentrasjon på a)

0 mg/dl, b) 100 mg/dl, c) 240 mg/dl og d) 800 mg/dl måles ved

Dersom prober med en glukosekonsentrasjon på a)

0 mg/dl, b) 100 mg/dl, c) 240 mg/dl og d) 800 mg/dl måles ved forskjellige bølgelengder ved hjelp av en testanordning ifølge figur 1, fremstilt som beskrevet ovenfor, og dersom remisjonen (R) i prosent plottes mot bølgelengden (A) i nm, erholdes et diagram som vist i figur 3. Som vist i de avbildede kurver kan enhver bølgelengde mellom 550 nm og inntil høyere enn 1100 nm anvendes til måling av glukosekonsentrasjonen. På grunn av de ytterst flate spektre er toleransen overfor endringer i bølge-lengder anvendt ved måling meget høy.

Nedenfor er vist et reaksjonsskjerna som viser hvordan glukose omdannes til et elektronrikt aromatisk amin.

Påvisning av glukose med 18-molybdendifosfat (eksempel 1)

Eksempel 2

Spesifisitet av glukosepåvisninger med 18- molybdendifosfat

De i tabell 1 oppførte forstyrrende stoffer tilsettes i de angitte konsentrasjoner til humant plasma med a) 0 mg glukose/dl (Cgluc = 0) og b) 110 mg glukose/dl (Cgluc <=>

110 mg/dl). Dersom et slikt humant plasma undersøkes med en testanordning ifølge figur 1, fremstilt og beskrevet som i eksempel 1, erholdes ved 660 nm remisjonsverdier i prosent (% R) som angitt i tabell 1.

Uavhengig av glukosekonsentrasjonen i humant plasma (0 og 110 mg/dl) ble det ikke funnet noen signifikante for-styrrelser.

Med en testanordning ifølge figur 1 som fremstilles analogt med anordningen ifølge eksempel 1 og som er identisk med den deri beskrevne testanordning, med unntak av at tetra-butylammoniumklorid utelates i den sammenlignende testanordning, erholdes meget dårlig reproduserbare, sterkt spredt-liggende resultater på grunn av at den tilsatte 18-molybdendifosforsyre dekomponeres ved pH-verdier høyere enn 5,5. De reduserende stoffer virker heri dessuten forstyrrende gjennom ytterligere fargedannelse.

Eksempel 3

Testanordning til påvisning av glukose på basis av 12-molvbdenfosfat

Ved erstatning av 18-molybdendifosforsyre i oppskriften ifølge eksempel 1 med den samme mengde 12-molybdenfosforsyre erholdes en testanordning med svakere fargedannelse ved tilstedeværelse av glukose som egner seg spesielt for høyere glukosekonsentrasjoner. Ved anvendelse av prober med forskjellige men kjente glukosekonsentrasjoner (C) og ved måling av de tilsvarende remisjoner (R) i prosent ved 650 nm erholdes kurven ifølge figur 4. Ved måling ved 950 nm erholdes en identisk kurve.

Lignende resultater erholdes med 12-molybdenarsenat (V), 18-molybdendiarsenat (V), 11-molybden-l-vanadiumfosfat, 10-molybden-2-vanadiumfosfat og 9-molybden-3-vanadiumfosfat, som alle kan fremstilles ifølge G. Brauer, "Handbuch der praparativen anorganischen Chemie", Enke-Verlag, Stuttgart,

(1954). I den følgende tabell 2 er oppført navn og formler av heteropolysyrene så vel som absorpsjonsmaksimum for det tilsvarende heteropolyblått.

Eksempel 4

Testanordning for bestemmelse av NAD( P) H

Ved erstatning av glukoseoksidasen i oppskriften ifølge eksempel 1 med den samme mengde diaforase erholdes en testanordning til påvisning av NAD(P)H. Fra prober med kjent konsentrasjon av NADH og ved måling av reaksjonen i prosent ved 660 nm erholdes kurven ifølge figur 5. Denne kurven kan tjene som kalibreringskurve til bestemmelse av ukjente NADH-konsentrasj oner.

Fremgangsmåter for dannelse av NAD(P)H fra NAD(P) - avhengig dehydrogenase, tilsvarende substrat og NAD(P) er kjent. Etter tilsvarende forreaksjoner kan derfor NADH-testanordningen anvendes til påvisning av dehydrogenasesubstrater eller til påvisning av dehydrogenaser i seg selv.

Eksempel 5

Testanordning til bestemmelse av etanol ved hjelp av alkohol-dehydrogenase og diaforase. så vel som 18- molybdendifosfat

a) Fremstilling av testanordningen

Det fremstilles en testanordning ifølge figur 6.

Denne testanordningen er således oppbygd at indikatorsystemet består av en homogen suspensjon av

pådryppet på et absorberende papir og deretter tørket i 30 min ved 40 °C.

Enzymet anbringes på et separat papir. Papiret gjennomfuktes med en løsning av og tørkes deretter ved 40 °C i 20 min. Det således fremstilte indikatorpapir (13) og enzympapir (12) oppdeles eventuelt i 14 x 6 mm store strimler.

På en 350 pm tykk, 9,8 cm lang og 0,6 cm bred polyesterfolie festes en 16 mm lang, 6 mm bred og 0,25 mm tykk glassfiberullbit med en flatevekt på 25 g/m<2> som transport-legeme (14), en 6 mm bred, 6 mm lang og 700 pm tykk glassfiberullbit med en flatevekt på 60 g/m<2> som erytrocyttutskil-lingslegeme (15) så vel som et beskyttelsesnett (16) av "Scrynel PE280HC rød" med målene 6 x 8 mm og en maskebredde på 280 pm, ved hjelp av en tapestrimmel (18) som vist i figur 6. Enzympapir (12) og indikatorpapir (13) festes sammen med en 200 pm tykk, 15 mm lang og 6 mm bred, gjennomsiktig polykarbonatfolie (11) på bærerfolien (17) ved hjelp av en dråpe lim (19), på en slik måte at (11), (12) og (13) ikke kommer i berøring med hverandre, men som bringes i berøring så vel med hverandre som i væskekontakt med en væske som befinner seg i transportlegemet (14), ved hjelp av trykk.

b) Bestemmelse av etanol

På beskyttelsesnettet (16) i testanordningen ifølge

figur 6, fremstilt ifølge a), appliseres 32 pl blod. Etter 60 sekunder, ved anvendelse av trykk på den gjennomsiktige folien (11), trykkes enzympapiret (12) og indikatorpapiret (13) mot transportlegemet (14) som inneholder serum. Etter 120 sekunder måles remisjonen i prosent ved 642 nm gjennom den gjennomsiktige folien (11). Ved tilsetning av kjente men forskjellige etanolkonsentrasjoner i blod erholdes en kurve ifølge figur 7. Denne kurven kan tjene som kalibreringskurve til bestemmelse av en ukjent etanolkonsentrasjon i en probe.

Eksempel 6

Bestemmelse av p- galaktosidase (EC 3.2.1.23)

De følgende løsninger ble applisert:

Buffer: 0,1 M HEPES, 20 mM magnesiumklorid, pH 6,8 Substrat: 50 mM p-aminofenyl-p-galaktosid (fremstilt fra p-nitrofenyl-p-D-galaktosid ved hjelp av hydrering med hydrogen på Pd-kull ifølge "Organikum" (VEB Deutscher Verlag der

Wissenschaften, 15. opplag, Berlin 1976) i vann Nøytrali-

sator: 1 N natronlut

Indikator: 100 mg/ml 18-molybdendifosforsyre og 50 mg/ml

fenyl-trimetyl-ammoniumklorid i vann

Enzym: 180 U/ml i buffer (den oppgitte enzymaktivitet refererer til anvendelse av o-nitrofenolgalakto-sid som substrat)

I en testreaksjonsblanding ble det anvendt:

Etter inkubasj on i 4,5 min ble reaksj onsblandingen sentrifugert i 1/2 min, supernatanten ble kastet, bunnfallet ble løst i 1 ml dimetylsulfoksid, og ekstinksjonen (E) ble umiddelbart målt. De erholdte resultater er vist i tabell 3.

Den resulterende kalibreringskurve fra disse verdier kan anvendes til bestemmelse av p-galaktosidaseinnhold i ukjente prober.

Ved anvendelse av 50 mM p-aminofenylfosfat (fremstilt ifølge L.H. De Riemer, CF. Meares, Biochemistry 20, 1606

(1981), som substrat i oppskriften ifølge eksempel 6, og ved anvendelse av 1 M dietanolamin, 1 mM magnesiumklorid, 0,1 mM sinkklorid, pH 9,8, som buffer, kan det utføres bestemmelse av enzymet alkalisk fosfatase. Med kjente enzymkonsentrasjoner ble det som i eksempel 6 funnet en lineær sammenheng mellom enzymkonsentrasjon og ekstinksjon ved 800 nm.

Eksempel 8

Testanordning til påvisning av y- glutamyltransferase

(EC 2.3.2.2)

Analogt med eksempel 1 ble det fremstilt en testanordning, imidlertid med de følgende endringer: I det andre reagenssjikt ble bufferen (2 vekt% "Keltrol F" i 0,2 M sitratbuffer, pH 6,0) erstattet med 2 vekt% "Keltrol F" i vann, N,N-bis-(2-hydroksyetyl )-p-nitroso-anilin x HC1 og glukoseoksidase ble utelatt. Mellom limsjiktet (2) og det andre reagenssjikt (3) ble det innlagt et papir som var gjennomfuktet med substrat, fremstilt på følgende måte: Et teposepapir (12 g/m<2>) ble gjennomfuktet med en løsning av 250 mM glykylglysin og 20 mM y-L-glutamyl-3-karboksyl-1,4-fenylendiamin (fremstilt ifølge EP-A-0.103.823) i 250 mM tris-buffer, pH 7,6, og tørket i 20 min ved 50 °C.

I 0,1 M tris-buffer inneholdende 10 mg/ml bovint serumalbumin, pH 7,5, ble det fremstilt en fortynningsrekke av y-glytamyltransferase. 10 ul av denne løsningen ble applisert på en ovenfor beskrevet testanordning. Remisjonsverdiene i prosent ble målt ved en bølgelengde på 950 nm etter 1 min ved 37 °C, og disse verdier er oppført i tabell 4.

Den således erholdte kurve kan anvendes til bestemmelse av ukjente y-glutamyltransferaseinnhold i væsker.

Eksempel 9

Testanordning til påvisning av sur fosfatase (EC 3.1.3.2)

Analogt med eksempel 8 ble det erholdt en testanordning til påvisning av sur fosfatase når teposepapiret ble gjennomfuktet med 10 mM p-aminofenylfosfat (fremstilt ifølge L.H. De Riemer, CF. Meares, Biochemistry 20, 1606, 1981), i 0,1 M sitratbuffer, pH 5,0.

Claims (12)

1. Anvendelse av et tungtløselig salt av en heteropolysyre til bestemmelse av en analytt, hvori analytten er et elektronrikt, aromatisk amin, eller hvori analytten i en for-reaksjon med én eller flere ytterligere forbindelser hhv. enzymer fører til et slikt elektronrikt, aromatisk amin.

2. Fremgangsmåte for bestemmelse av en analytt ved hjelp av heteropolyblåttdannelse, karakterisert ved at analytten er et elektronrikt, aromatisk amin eller at analytten omsettes med en forbindelse, hhv. ét enzym, som fører til dannelse av et aromatisk, elektronrikt amin som bringes i kontakt med et tungtløselig salt av en heteropolysyre.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at det anvendes et tungt-løselig salt av en heteropolysyre av molybden, molybden og wolfram, vanadium og molybden eller vanadium og molybden og wolfram, med fosfor, arsen, silisium eller germanium som heteroatom.

4. Fremgangsmåte ifølge et av krav 2 eller 3, karakterisert ved at det som tungtløselig salt av en heteropolysyre anvendes et salt hvori kationet er større enn ammoniumionet.

5. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 2-4, karakterisert ved at det som tungtløselig salt av en heteropolysyre anvendes et slikt salt hvor kationet har generell formel I hvori R<1>, R<2>, R<3> og R<4> er like eller forskjellige og betegner en alkyl-, aryl- eller aralkylrest, eller hydrogen, forutsatt at ikke alle rester er like, eller hvorved to rester til sammen danner en alkylenrest, og X betegner et fosforatom eller nitrogenatom.

6. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 2-4, karakterisert ved at det som tungtløselig salt av en heteropolysyre anvendes et salt med et kation fra gruppen kvaternære nitrogen-heteroaromater.

7. Middel for bestemmelse av et elektronrikt, aromatisk amin eller en annen analytt ved hjelp av heteropolyblåttdannelse, karakterisert ved at det for bestemmelse av et elektronrikt, aromatisk amin inneholder et tungtløslig salt av en heteropolysyre, eller de for dette formål nødvendige forbindelser, eller at det for bestemmelse av en annen analytt inneholder en forbindelse, hhv. et enzym, som inneholder en forbindelse som sammen med analytten fører til dannelse av et elektronrikt, aromatisk amin og et tungtløselig salt av en heteropolysyre, eller de for dette formål nødvendige forbindelser.

8. Middel ifølge krav 7, karakterisert ved at det inneholder et tungtløselig salt av en heteropolysyre av molybden, molybden og wolfram, vanadium og molybden eller vanadium og molybden og wolfram, med fosfor, arsen, silisium eller germanium som heteroatom.

9. Middel ifølge et av krav 7 eller 8, karakterisert ved at det som tungtløselig salt av en heteropolysyre inneholder et slikt salt hvis kation er større enn ammoniumionet.

10. Middel ifølge et av kravene 7-9, karakterisert ved at det som tungtløselig salt av en heteropolysyre inneholder et salt hvor kationet har generell formel I hvori R<1>, R<2>, R3 og R4 er like eller forskjellige og betegner en alkyl-, aryl- eller aralkylrest, eller hydrogen, med forbehold av at ikke alle rester er like, eller hvorved to rester til sammen danner en alkylenrest, og X betegner et fosforatom eller nitrogenatom.

11. Middel ifølge et av kravene 7-9, karakterisert ved at det som tungtløselig salt av en heteropolysyre inneholder et slikt salt med et kation fra gruppen kvaternære nitrogen-heteroaromater.

12. Anvendelse av et tungtløselig salt av en heteropolysyre for fremstilling av et middel til bestemmelse av en analytt ved hjelp av heteropolyblåttdannelse.