CN106573910B - 氧化还原指示剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及作为吩嗪‑、菲啶‑、菲咯啉‑、喹啉‑、喹喔啉‑、吖啶‑、异喹啉‑、吡嗪‑或吡啶衍生物的包含共轭π‑体系和π‑受体基团的化合物或其盐或溶剂合物，并涉及其用途。本发明还涉及包含本发明化合物的化学基质和测试元件。本发明还涉及测定测试样品中被分析物的量的方法，其包括使所述测试样品与本发明的化合物、化学基质或测试元件接触并估算在所述测试样品存在下由所述化合物、所述化学基质中包含的化合物、所述测试元件中包含的化合物释放或消耗的氧化还原当量物的量，由此测定所述测试样品中被分析物的量。此外，本发明涉及系统，其包括根据本发明的测试元件和包括传感器的装置，所述传感器用于测量释放或消耗的氧化还原当量物的量。

Description

氧化还原指示剂
发明领域
本发明涉及作为吩嗪-、菲啶-、菲咯啉-、喹啉-、喹喔啉-、吖啶-、异喹啉-、吡嗪-或吡啶衍生物的包含共轭π-体系和π-受体基团的化合物或其盐或溶剂合物，并涉及其用途。本发明还涉及包含本发明化合物的化学基质和测试元件。本发明还涉及测定测试样品中的被分析物的量的方法，其包括使所述测试样品与本发明的化合物、化学基质或测试元件接触并估算在所述测试样品存在下由所述化合物、所述化学基质中包含的化合物、所述测试元件中包含的化合物释放或消耗的氧化还原当量物（redox equivalents）的量，由此测定所述测试样品中的被分析物的量。此外，本发明涉及包括根据本发明的测试元件和包括用于测量释放或消耗的氧化还原当量物的量的传感器的装置的系统。
现有技术
在医学诊断领域中，在许多情况下，必须检测体液，例如血液、组织液、尿液、唾液或其它类型体液样品中的一种或多种被分析物。待检测的被分析物的实例是葡萄糖、甘油三酯、乳酸、胆甾醇或通常存在于这些体液中的其它类型被分析物。如果需要，根据被分析物的浓度和/或存在，可以选择适当的治疗。
被分析物检测和测量的现代方法通常依赖于被分析物特异性酶以对方法赋予特异性。通常，使用氧化还原酶，其将氧化还原当量物转移至其底物（底物的还原），或更通常从底物取出氧化还原当量物（底物的氧化）。大多数氧化还原酶需要存在氧化还原辅因子，例如PQQ、NAD或FAD或其还原形式PQQH2、NADH或FADH，由酶从其或至其初始转移氧化还原当量物。然后可以将从被分析物取出的氧化还原当量物直接或间接转移至氧化还原指示剂或电极。
通常，技术人员已知的装置和方法使用包含一种或多种测试化学品的测试元件，所述测试化学品在待检测被分析物存在下，能够进行一个或多个可检测检测反应，例如光学或电化学可检测检测反应。关于这些测试化学品和其相关方法，可以参考例如J. Hoenes等(The Technology Behind Glucose Meters: Test Strips, Diabetes Technology &Therapeutics,第10卷, 增刊1, 2008, S-10至S-26，US 2009/0246808 Al和Habermüller等(2000), Fresenius J Anal Chem 366 :560)。对于葡萄糖的电化学检测，提供了一篇综述，例如Heller & Feldman (2008), Chem. Rev. 108: 2482。
氧化还原指示剂是当经历氧化还原反应时改变其吸收的化合物（例如在Naumann等, Ullmanns Encykl. Tech. Chem.中的"Indicator Dyes", 4. Aufl.; 1977, 13,183-96;和Hulanicki & Glab, " Redox Indicators: Characteristics andApplications " Pure & Appl. Chem.,第50卷, 463-498; Pergamon Press Ltd., 1978中综述）。本领域已知的大部分氧化还原指示剂显示红移，即当氧化时，在吸收、反射、透射或放射光谱中将谱带位置改变至更长的波长，而仅存在几个当还原时显示红移的氧化还原指示剂的实例。当还原时显示红移的氧化还原指示剂对于被分析物的比色测定特别有用。
众所周知的氧化还原指示剂是磷钼酸（PMO）。然而，该化合物的缺点在于其氧化还原态没有充分限定（Burstein, S.; Anal. Chem.; 1953; 25 (3); 422-424; Rodriguesda Rocha, D.; Research Journal of Chemistry and Environment; 2007; 11; 102-103）。此外，PMO的还原形式还仅具有低消光系数并且PMO不直接由还原辅酶还原，因此必须使用介体。
替代的发色氧化还原指示剂在EP 0 831 327中有述。其中所述化合物的缺点在于这些化合物的还原形式的非常低的消光系数。此外，四唑鎓盐用作氧化还原指示剂（参见例如EP 0 574 769），但这些化合物不是很稳定并且还需要使用介体如吩嗪硫酸二甲酯以在脱氢酶的情况下起作用（Pacaud-Mercier, K.等; Bioorganic Chemistry; 35 (1);2007; 59-67）。然而，吩嗪硫酸二甲酯容易被抗坏血酸还原，这可能引起干扰。
其它提出的作为氧化还原指示剂的是：刃天青，然而其中对于许多应用，氧化和还原形式之间的色差太小；杂多酸（如PMO）（参见例如EP 0 431 456），然而其在不适合于许多应用的波长下具有低摩尔消光和吸收最大值。
在WO 00/31543 A1中，公开了吖啶酯，其可以被NADH还原以形成二氢化吖啶衍生物，相比于吖啶，由于二氢化吖啶不能被诱导发生所公开的过氧化氢诱导的化学发光反应，所以发现化学发光信号与NADH浓度成反比。此外，产生的信号是化学发光，其需要特定检测设备并且难以测量降低的化学发光信号。此外，US 5,498,542 A公开了吩噁嗪和吩噻嗪在葡萄糖的电化学测定中作为介体。公开的化合物包含醌型体系，其中已知π-电子体系在还原时缩短；因此US 5,498,542 A的化合物在还原时经历难以测量的蓝移。
因此，在本技术领域需要提供氧化还原指示剂，特别是避免上述问题的氧化还原指示剂。
待解决的问题
因此本发明的目标是提供符合上述需要，至少部分避免现有技术的缺点的化合物、工具和方法。
发明概述
该问题通过以下解决：包含如本文公开的结构的化合物或其盐或溶剂合物，包含上述化合物或其盐或溶剂合物的化学基质，包含上述化合物或其盐或溶剂合物的测试元件和如本文公开的用于测定被分析物的量的方法。可以单独形式或任何随意组合实现的其它实施方案列在从属权利要求中并描述在本说明书中。
因此，本发明涉及三环化合物或其盐或溶剂合物，所述三环化合物具有式（I）的一般结构，包含共价键合至π-受体基团的三环杂环基团
Figure 856671DEST_PATH_IMAGE001
其中
X是-CH-或-N-，
R1、R2、R3、R4独立地选自氢、烷基，在一个实施方案中是低级烷基；未取代或取代的芳基，在一个实施方案中是ArR9或苯基；卤素、硝基、磺酸酯基、-CN、-COOH、-OR9、-SR9、-SSR9、-C(O)OR9、-C(O)NHR9、NHC(O)R9、C(O)NH2；
R9选自烷基，在一个实施方案中是低级烷基；或未取代或取代的芳基，在一个实施方案中是苯基；
和/或其中Ra和Ra+1（a=1、2或3）一起形成桥以形成5至6元环烷基、芳基、杂环烷基或杂芳基环，在一个实施方案中形成-CH=CH-CH=CH-桥；在一个实施方案中，所述杂环烷基或杂芳基环包含至少一个选自O、N或S的杂原子；在一个其它实施方案中，所述杂环烷基或杂芳基环仅包含一个选自O、N或S的杂原子。
R5和R6独立地选自有机侧链，在一个实施方案中是甲基，在一个其它实施方案中是乙基，在一个其它实施方案中是苯基，
n是0至5的整数，在一个实施方案中是0、1或2，
m是选自0和1的整数，
R7是H或有机侧链，
R8是有机侧链，
或其中R8和R7一起形成桥以形成5至6元任选取代的杂环烷基或杂芳基环。
如下文使用的，术语“具有”“包含”或“包括”或其任何随意语法变体以非排他形式使用。因此，这些术语可以表示除了由这些术语引入的特征外，没有其它特征存在于本文描述的实体中的情况和存在一个或多个其它特征的情况两者。例如，表达“A具有B”、“A包含B”和“A包括B”可以表示除了B之外，没有其它元素存在于A中的情况（即单独且排他地由B组成的情况）和除了B之外，一个或多个其它元素，例如元素C、元素C和D或甚至其它元素存在于实体A中的情况两者。
在一个实施方案中，包含如本文指定的结构的化合物可衍生自由所述式组成的化合物，其通过至多三个化学改性反应，在一个其它实施方案中通过至多两个改性反应，在一个其它实施方案中，通过至多一个改性反应。术语“化学改性反应”是本领域技术人员已知的且涉及改变根据本发明的化合物的化学结构的化学反应，在一个实施方案中，不改变其特征性结构特征。因此，在一个实施方案中，术语化学改性反应涉及本发明的化合物的侧链的改性。在一个实施方案中，侧链的改性是烷基化，例如甲基化或乙基化，酰化，在一个其它实施方案中是乙酰化、糖基化、羟基化、羟烷基化或其任何组合。在一个实施方案中，改性的化合物对于本文称为如本文所述的母体化合物的应用具有相同或相似活性。在一个实施方案中，根据本发明的化合物以使得其可溶于水性缓冲溶液中的方式改性，在一个实施方案中，在25℃的温度下可溶于pH7的50 mM硫酸钠缓冲液。在一个实施方案中，所述溶解度为>15 mmol/L，在一个其它实施方案中> 30 mmol/L，在一个其它实施方案中> 50 mmol/L。提高亲水性和/或溶解度的取代基是本领域公知的。其它实例是羟基、羧基、磺酸、磷酸根和膦酸根取代基。
此外，如下文所用的，术语“优选”、“更优选”、“更优选”、“特别”、“更特别”、“具体”、“更具体”或类似术语与任选特征联合使用，而不限制替代的可能性。因此。通过这些术语引入的特征是任选特征并且不意在以任何方式限制权利要求的范围。如技术人员将认识到的，本发明可以通过使用替代特征实施。类似地，通过“在本发明的一个实施方案中”或类似表示引入的特征意在是任选特征，而不关于本发明的替代实施方案做出任何限制，不关于本发明的范围做出任何限制和不关于以该方式引入的特征与本发明的其它任选或非任选特征的组合的可能性做出任何限制。
如本文所用的，术语“化合物”、“盐”和“溶剂合物”以技术人员已知的其通常含义使用。如果根据本发明的化合物的净电荷是正的，示例性抗衡离子是三氟甲磺酸根（triflate）、硫酸根、烷基磺酸根、甲苯磺酸根、磷酸根、四氟硼酸跟、六氟磷酸根、三氟乙酸根、高氯酸根、氯离子或硝酸根离子。如果根据本发明的化合物的净电荷是负的，示例性抗衡离子是锂、钠和/或钾离子，或四甲基铵离子。在一个实施方案中，根据本发明的化合物的净电荷是在25℃、108Pa和pH=7的标准条件下的水溶液中的化合物的。如将从本文提供的结构限定意识到的，术语“三环化合物”涉及包含如本文所述的三环结构的化合物，其中在一个实施方案中，不排除三环化合物包含其它环结构。
术语“侧链”是技术人员理解的并涉及共价键合至本文所述的化合物的核心部分的原子或化学基团，所述核心部分还被称为“主链”或“骨架”。在一个实施方案中，侧链是如下文所述的有机侧链。术语“取代的”侧链涉及在一个或多个位置取代的侧链，在一个实施方案中，在1、2或3位置取代，其中取代基可以在任何可用原子处连接以产生稳定化合物。技术人员理解的是术语“任选取代的”侧链涉及未取代或取代的侧链。
如本文所用的，术语“有机侧链”涉及包含至少一个碳原子的任何任选取代的侧链。在一个实施方案中，有机侧链是任选取代的烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、环烷基、杂环烷基或杂芳基侧链。在一个实施方案中，取代的有机侧链是被至少一个独立地选自以下的取代基取代的有机侧链： -COO-、=O、-OH、-CN、卤素、-NH2、-NH(烷基)、-N(烷基)2、-N(烷基)3 +、-NH(芳基)、N(芳基)2、-NO2、-O(烷基)、-O-(CH2)n-OH、-O-(CH2)n-O(烷基)、-O(芳烷基)、-O(芳基)、-OPO3 2-、-PO3 2-、-OSO3 -和-SO3 -。在一个实施方案中，取代基的烷基、芳基和芳烷基不被包括烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、杂环烷基或杂芳基的基团进一步取代。在一个其它实施方案中，取代基的烷基、芳基和芳烷基不被进一步取代。
如本文所用的，术语“烷基”涉及直链或支链饱和烃基团，其通过共价键合至其至少一个碳原子的至少一个连接至主链。其它烷基是直链烷基，例如在一个实施方案中是甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基或支链烷基，例如-CH(CH3)2、-CH(CH2CH3)2、-C(CH3)3、-C(CH2CH3)3、-CH(CH3)(CH2CH3)、
-CH2CH(CH3)2、-CH2CH(CH3)(CH2CH3)、-CH2CH(CH2CH3)2、-CH2C(CH3)3、
-CH2C(CH2CH3)3、-CH(CH3)CH(CH3)(CH2CH3)、-CH2CH2CH(CH3)2、
-CH2CH2CH(CH3)(CH2CH3)、-CH2CH2CH(CH2CH3)2、-CH2CH2C(CH3)3、
-CH2CH2C(CH2CH3)3、-CH(CH3)CH2CH(CH3)2或-CH(CH3)CH(CH3)CH(CH3)2。因此，烷基包括伯烷基、仲烷基和叔烷基。其它可设想的烷基是低级烷基，即在一个实施方案中，具有至多12个碳原子的烷基，在一个其它实施方案中，具有至多9个碳原子，在一个其它实施方案中，具有至多5个碳原子。术语“环烷基”涉及环状闭合的饱和或不饱和烃基团，在一个实施方案中，具有3至12个碳原子。其它可设想作为环烷基的是环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。
术语“烯基”侧链涉及包含至少一个C=C双键并通过共价键合至其至少两个碳原子的至少一个连接至主链的侧链。相应地，术语“炔基”侧链涉及包含至少一个C≡C三键并通过共价键合至其至少两个碳原子的至少一个连接至主链的侧链。
术语“环烯基”涉及环状闭合的烃基团，在一个实施方案中，具有5至12个碳原子，其包含至少一个C=C双键并通过共价键合至其至少两个碳原子的至少一个连接至主链。术语“环炔基”涉及环状闭合的烃基团，在一个实施方案中，具有8至12个碳原子，其包含至少一个C≡C三键并通过共价键合至其至少两个碳原子的至少一个连接至主链。
如本文所用的，术语“烷氧基”侧链涉及-O-烷基侧链，在一个实施方案中，具有指示的碳原子数目。在一个实施方案中，烷氧基侧链是-O-甲基、-O-乙基、-O-丙基、-O-异丙基、-O-丁基、-O-仲丁基、-O-叔丁基、-O-戊基、-O-异戊基、-O-新戊基、-O-己基、-O-异己基或-O-新己基。在一个实施方案中，烷氧基侧链是-O-甲基或-O-乙基。
如本文所用的，术语“芳基”涉及具有6至14个碳原子的芳族环或环体系，在一个实施方案中，包含1、2或3个芳族环。其它可设想的芳基侧链是苯基、萘基、蒽基和菲基。在本发明的化合物的情况下，术语“环”被技术人员理解；相应地，术语“环体系”涉及包含共享至少一个共价键的至少两个环的化学结构。因此，在一个实施方案中，“芳基”还包括与环烷基和/或杂环烷基环稠合的芳族环体系。
如本文所用的，术语“芳烷基”涉及烷基侧链，其中至少一个氢被芳基侧链替代。在一个实施方案中，芳烷基是苯甲基或苯乙基。
如本文所用的，术语“杂环烷基”涉及具有5至14个环原子，在一个实施方案中，5至7个环原子的饱和或部分不饱和环或环体系，其中至少一个环原子是选自N、O和S的杂原子，所述环或环体系通过共价键合至所述环或环体系的C或N原子连接至主链。在一个实施方案中，杂环烷基是氮杂基（azepinyl）、二氢呋喃基、二氢吡喃基、咪唑烷基、咪唑啉基、异噻唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、噁唑烷基、哌嗪基、哌啶基、吡唑烷基、吡咯烷基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、噻二唑烷基、噻唑烷基或硫吗啉基。
如本文所用的，术语“杂芳基”涉及具有5至14个环原子，在一个实施方案中，5至7个环原子的芳族环或环体系，其中至少一个环原子是选自N、O和S的杂原子，所述环或环体系通过共价键合至所述环或环体系的C或N原子连接至主链。在一个实施方案中，每个环中多至4个，在一个其它实施方案中，多至3个，在一个其它实施方案中，多至2个环原子是独立地选自N、O和S的杂原子。在一个实施方案中，杂芳基是吡啶基、哒嗪基、吡嗪基、quinaoxalyl、吲嗪基、苯并[b]噻吩基、喹唑啉基、嘌呤基、吲哚基、喹啉基、嘧啶基、吡咯基、吡唑基、噁唑基、噻唑基、噻吩基、异噁唑基、噁噻二唑基（oxathiadiazolyl）、异噻唑基、四唑基、咪唑基、三唑基、呋喃基、苯并呋喃基或吲哚基。
在本说明书的结构式的情况下，“X”涉及基团-CH-或氮原子（N）；另外，n是0至5的整数，在一个实施方案中是0、1或2，并且m是选自0和1的整数。在一个实施方案中，m是0。另外在一个实施方案中，n和m的和在一个实施方案中是3或更小，在一个其它实施方案中，n和m的和是2或更小，在一个其它实施方案中，n和m的和是1。
另外，在本说明书的结构式的情况下，侧链R1、R2、R3、R4独立地选自氢、烷基，在一个实施方案中是低级烷基；未取代或取代的芳基，在一个实施方案中是ArR9或苯基；卤素、硝基、磺酸酯基、-CN、-COOH、-OR9、-SR9、-SSR9、-C(O)OR9、-C(O)NHR9、NHC(O)R9、C(O)NH2；
R9选自烷基，在一个实施方案中是低级烷基；或未取代或取代的芳基，在一个实施方案中是苯基。在一个实施方案中，Ra和Ra+1（a=1、2或3）一起形成桥以形成5至6元环烷基、芳基、杂环烷基或杂芳基环，因此在一个实施方案中R1和R2一起形成桥以形成5至6元环烷基、芳基、杂环烷基或杂芳基环，R2和R3一起形成桥以形成5至6元环烷基、芳基、杂环烷基或杂芳基环和/或R3和R4一起形成桥以形成5至6元环烷基、芳基、杂环烷基或杂芳基环。在一个其它实施方案中，Ra和Ra+1（a=1、2或3）一起形成-CH=CH-CH=CH-桥。因此在一个实施方案中R1和R2一起形成-CH=CH-CH=CH-桥，或R2和R3一起形成-CH=CH-CH=CH-桥，或R3和R4一起形成-CH=CH-CH=CH-桥，或R1/R2和R3/R4都分别一起形成-CH=CH-CH=CH-桥。在一个实施方案中，R1、R2、R3和R4的至少一个是氢。在一个其它实施方案中，R1、R2、R3和R4的至少两个或至少三个是氢。在一个其它实施方案中，R1、R2、R3和R4是氢。
此外，侧链R5和R6独立地选自有机侧链，在一个实施方案中是任选取代的芳基、烷基或环烷基，在一个其它实施方案中是甲基、丙基、丁基、环戊基或环己基，在一个其它实施方案中是乙基，在又一个其它实施方案中是苯基或(C3-C6)烷基磺酸酯基或(C3-C6)烷基-N+Me3；侧链R7是H或有机侧链，R8是有机侧链。然而，还设想R8和R7一起形成桥以形成5至6元杂环烷基或杂芳基环。
技术人员理解的是包含π-受体基团的侧链可以经由式（I）中指明的任何碳原子C1至C4共价连接至式（I）的环体系。在一个实施方案中，侧链π-受体基团直接或经由一个或多个碳-碳双键（或亚乙烯基）共价连接至杂环基团，其中在侧链π-受体基团经由多于一个碳-碳双键共价连接至杂环基团的情况下，所述多于一个碳-碳双键是共轭的（不分离或累计（cumulate））。π-受体基团的连接的其它实施方案在本文中其它地方指明。
在一个实施方案中，在三环化合物中，X是-N-并且π-体系共价键合至如式（I）所示的杂芳族体系的C1、C2、C3或C4；或X是-CH-并且π-体系共价键合至如式（I）所示的杂芳族体系的C2或C4。在一个其它实施方案中，在三环化合物中，X是-N-并且π-体系共价键合至如式（I）所示的杂芳族体系的C1；或X是-CH-并且π-体系共价键合至如式（I）所示的杂芳族体系的C2。
根据本发明的化合物的π-受体基团包括二价含季氮阳离子基团，即亚胺离子（iminium）基团( =N+R2)。在一个实施方案中，π-受体基团不被还原辅酶NADH、FADH或PQQH还原。在一个实施方案中，R7和R8一起形成任选取代的杂环烷基、杂芳基、杂环基或杂环烷基环基，在一个实施方案中，例如形成3H-吲哚基、3,3-二甲基-3H-吲哚基、1-甲基-1H-苯并咪唑基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、苯并硒唑基、苯并[cd]吲哚基或吡啶基。更多的π-受体基团是本领域公知的并用于聚甲炔染料化学，例如从A. I. Tolmachev, A. Y. Il’chenko,Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, John Wiley & Sons, Inc.,2000和从下文引用的其它参考文献。
在一个实施方案中，π-受体基团选自
(i) 包含式（II）的结构的侧链
Figure 242653DEST_PATH_IMAGE002
其中Y是-N(Me)-、-S-、-Se-、-O-或-C(Me)2-，
(ii) 包含式（III）的结构的侧链
Figure 756810DEST_PATH_IMAGE003
(iii) 包含式（IV）的结构的侧链
Figure 620861DEST_PATH_IMAGE004
和
(iv) 包含式（V）的结构的侧链
Figure 638496DEST_PATH_IMAGE005
其中在式（II）至（V）的各式中，R10是烷基或环烷基，在一个实施方案中是甲基。
在一个其它实施方案中，三环化合物是10-甲基-1-[(E)-2-(1,3,3-三甲基-3H-吲哚鎓-2-基)乙烯基]吩嗪鎓（式XX）或三环化合物是9-乙氧基-10-甲基-1-[(E)-2-(1,3,3-三甲基-3H-吲哚鎓-2-基)乙烯基]吩嗪鎓（式XXI）。这些式中显示的抗衡离子仅是示例性抗衡离子并且可以交换为如上所述任何其它合适的抗衡离子。
Figure 726538DEST_PATH_IMAGE006
在一个实施方案中，本发明的化合物是在标准条件下并相对于标准氢电极具有至少-0.4 V的中点电位的化合物。在一个其它实施方案中，本发明的化合物是具有至少-0.1V的中点电位的化合物，在一个其它实施方案中，在标准条件下并相对于标准氢电极为至少0.2 V。在一个实施方案中，在本发明的化合物的情况下所用的还原涉及根据以下方案，环体系获得两个电子：
Figure 196833DEST_PATH_IMAGE007
氧化形式
Figure 661313DEST_PATH_IMAGE008
Figure 533454DEST_PATH_IMAGE009
还原形式
在上式 中，Acc代表如上所述的π-受体基团。
因此，在本发明的化合物中，在还原时形成聚甲炔型给体-受体染料。因此，在一个实施方案中，本发明的化合物是在还原时经历红移的化合物。在一个其它实施方案中，所述化合物的还原形式在400至800 nm的波长下具有吸收最大值。
有利地，在本发明的研究中发现本文所述的化合物是在还原时经历红移的化合物，并且所述化合物的氧化还原电位使得其适合特别从还原的烟碱腺嘌呤二核苷酸（NADH）接受氧化还原当量物。此外，发现所述化合物在可见光范围内具有至少一个吸收最大值，使得能够在一定波长下进行它们的氧化还原态的目视检查和/或光度测定，在所述波长下来自例如血液样品中包含的其它化合物的干扰是最低的或至少是可接受的。一些化合物还在还原时发荧光，因此可以用于通过荧光光谱法或荧光成像（参见例如R. Freeman, R.Gill, I. Shweky, M. Kotler, U. Banin, I. Willner, Angewandte Chemie 2009,121, 315-319）测定或检测还原剂。
上文做出的定义经过必要修正应用于下文。下文做出的额外定义和解释也经过必要修正应用于本说明书所述的所有实施方案。
此外，本发明涉及包含氧化还原辅因子和化合物或其盐或溶剂合物的化学基质，所述化合物具有式（VI）的一般结构，包含共价键合至π-受体基团（Acc）的杂环基团（Het）
Figure 792397DEST_PATH_IMAGE010
其中Het包括选自式（VII）至（XV）的结构：
Figure 749988DEST_PATH_IMAGE011
其中R11是有机侧链，在一个实施方案中是甲基，在一个其它实施方案中是乙基，在一个其它实施方案中是苯基，
其中-(亚乙烯基)lAcc基团连接至表示为C*的一个碳原子，
其中l是0至5的整数，在一个实施方案中是0、1或2，
并且其中Acc选自-(C=O)芳基、-(C=C(CN)2)，和通式（XVI）的π-受体基团
Figure 752579DEST_PATH_IMAGE012
其中
R12是有机侧链，在一个实施方案中是甲基，在一个其它实施方案中是乙基，在一个其它实施方案中是苯基，
k是选自0和1的整数，
R13是H或有机侧链，
R14是有机侧链，
或其中R13和R14一起形成桥以形成5至6元杂环烷基或杂芳基环。
术语“化学基质”是技术人员已知的并且涉及包括上述化合物的化合物和下述氧化还原辅因子的混合物。在一个实施方案中，除了上述化合物外，本发明的化学基质还包含如下所述的氧化还原酶。技术人员理解的是组合物可以包含额外组分，例如在一个实施方案中，缓冲液组分（例如磷酸盐缓冲盐水、Tris缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、甘油磷酸盐缓冲液或Good缓冲液）或其它盐、洗涤剂等，包括如下所述的组分。
如本文所用的，术语“氧化还原辅因子”或“辅因子”涉及氧化还原活性黄素、烟酰胺或吡咯并喹啉醌（PQQ）辅酶。技术人员已知如何合适地选择一种上述辅酶，取决于选择的氧化还原酶。在一个实施方案中，黄素、烟酰胺或PQQ辅酶是黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）、黄素单核苷酸（FMN）或PQQ或一种上述化合物的衍生物。在一个其它实施方案中，氧化还原辅因子是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+）或其衍生物。其它NAD+或NADP+衍生物是稳定化NAD+或NADP+衍生物，即在一个实施方案中是carba环状衍生物，在一个其它实施方案中包括carbaNAD+或carbaNADP+，如例如Slama (Biochemistry 27:183 (1988)), Hutchinson等(Chem. Comm. 24: 2765 (1996))、US 5,801,006、WO98/33936、WO01/49247和WO2007/012494中公开的。在一个其它实施方案中，氧化还原辅因子是还原的NAD+、NADP+、carbaNAD+或carbaNADP+，即在一个实施方案中是NADH、NADPH、carbaNADH或carbaNADPH。如技术人员将理解的，在一个实施方案中，术语“包含氧化还原辅因子”包括将至少一种氧化还原辅因子本身添加至化合物的混合物的情况以及至少一种氧化还原辅因子作为添加至化合物的所述混合物的不同化合物的成分存在于化学基质中的情况，例如在一个实施方案中，作为添加至化合物的所述混合物的一种或多种细胞的成分。
如本文所用的，术语“杂环基团”涉及根据如上所述的式（VII）至（XV），在一个实施方案中，式（VII）至（XVa）之一的化学侧链。在一个实施方案中，杂环基团是氧化还原活性杂环基团。氧化还原活性杂环基团从现有技术（J. W. Bunting, V. S. F. Chew, G. Chu,The Journal of Organic Chemistry 1982, 47, 2303-2307; D. Ostovic, I. S. H.Lee, R. M. G. Roberts, M. M. Kreevoy, The Journal of Organic Chemistry 1985,50, 4206-4211; R. Hisada, T. Yagi, The Journal of Biochemistry 1977, 82,1469-1473; J. W. Bunting, A. W. C. Ng, Bioorg Chem 1993, 21, 156-169）已知。
如本发明的式的情况下所用和如上所述的侧链Acc是技术人员已知的π-受体基团，例如在一个实施方案中，从聚甲炔染料化学（参见例如A. I. Tolmachev, A. Y. Il’chenko, Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, John Wiley & Sons,Inc., 2000）已知。在一个实施方案中，侧链Acc直接或经由一个或多个乙烯基或亚乙烯基共价连接至杂环基团。在一个实施方案中，基团XVI以使得包含亚胺离子氮原子的共轭π体系的相邻原子和亚乙烯基碳原子通过3或4个碳原子的链或通过-CH2-O-CH2-链连接的方式取代。此类环闭合是聚甲炔染料化学公知的（参见例如A. V. Kulinich, N. A.Derevyanko, A. A. Ishchenko, Journal of Photochemistry and Photobiology A:Chemistry 2008, 198, 119-125; I. L. Mushkalko, Y. A. Sogulyaev, Ukr. Khim.Zh. (Russ. Ed.) 1986, 52, 509-513; A. Samanta, M. Vendrell, R. Das, Y.-T.Chang, Chem Commun (Camb) 2010, 46, 7406-7408; X. Chen, X. Peng, A. Cui, B.Wang, L. Wang, R. Zhang, Journal of Photochemistry and Photobiology A:Chemistry 2006, 181, 79-85）。在一个实施方案中，Acc是-(C=O)芳基、-(C=C(CN)2)或通式（XVI）的π-受体基团
Figure 479227DEST_PATH_IMAGE013
。
如本说明书的结构式的情况下使用的，k涉及选自0和1的整数。在一个实施方案中，k是0。还在一个实施方案中，l和k的和在一个实施方案中是3或更小，在一个其它实施方案中，l和k的和是3或更小，在一个其它实施方案中，l和k的和是1。
如本文所用的，R12涉及有机侧链，在一个实施方案中是任选取代的芳基、烷基或环烷基，在一个其它实施方案中是甲基、丙基、丁基、环戊基或环己基，甚至在一个其它实施方案中是乙基，在一个其它实施方案中是苯基或(C3-C6)烷基磺酸酯基或(C3-C6)烷基-N+Me3。R13是有机侧链。在一个实施方案中，R12和R13一起形成桥以形成任选取代的5至6元杂环烷基或杂芳基环。
根据本发明，包含π-受体基团的侧链经由任何所示碳原子C*共价连接至氧化还原活性基团的环体系。π-受体基团的连接的其它实施方案在本文中其它地方指明。
在一个实施方案中，化合物是包含或由选自式（XVII）至（XXVII）、（XXX）至（XXXII）和在一个实施方案中（LII）的结构组成的化合物：
Figure 174651DEST_PATH_IMAGE014
Figure 616609DEST_PATH_IMAGE015
Figure 157311DEST_PATH_IMAGE016
Figure 4045DEST_PATH_IMAGE017
Figure 542473DEST_PATH_IMAGE018
Figure 474657DEST_PATH_IMAGE019
。
根据本发明的化学基质可以在一个实施方案中通过首先在溶剂或溶剂的混合物中溶解本发明的组合物的组分提供。在一个其它实施方案中，所述溶剂或溶剂的混合物随后通过合适的处理除去，使得剩余组合物基本不含所述溶剂或溶剂的混合物。在本发明设想的一个实施方案中，合适的处理包括热处理、蒸发技术、冷冻干燥等。在一个实施方案中，设想的处理是热处理并特别是在以下条件下的热处理：在热循环的情况下，在约60℃或更高温度下热处理约20至45分钟或在约95℃下热处理约1至2分钟；化学基质的厚度为20至200微米或更小；在1 bar或0.1 bar的压力下。此外，将理解的是为了保持化学基质在干燥条件下，在一个实施方案中，储存在干燥剂，即除湿剂存在下进行。在一个实施方案中，合适的干燥剂包括硅胶、沸石、碳酸钙或硫酸镁。根据本发明的化合物还可以聚合或共聚或并入聚合物中以形成氧化还原活性膜。
如本文所用的，术语“氧化还原酶”是指能够催化一个实施方案中的底物的特定氧化或还原的多肽，其通过转移作为氧化还原当量物的氢离子（H-）至本文其它地方所称的氧化还原辅因子或从氧化还原辅因子转移作为氧化还原当量物的氢离子（H-）。在一个实施方案中，氧化还原酶是脱氢酶，即能够通过转移作为氧化还原当量物的氢离子（H-）至受体分子，在一个实施方案中，至本文其它地方所称的氧化还原辅因子而催化底物的氧化的多肽。本发明设想的脱氢酶在一个实施方案中是依赖于氧化还原辅因子（或有时称为辅酶）的那些，所述氧化还原辅因子为例如吡咯并喹啉醌（PQQ）或其衍生物、烟酰胺-腺嘌呤-二核苷酸（NAD）或其衍生物、或黄素辅因子，例如黄素-腺嘌呤-二核苷酸（FAD）或黄素单核苷酸（FMN）或其衍生物。其它脱氢酶特别是乳酸脱氢酶（EC号1.1.1.27或1.1.1.28）、葡萄糖脱氢酶（见下文）、醇脱氢酶（EC号1.1.1.1或1.1.1.2）、L-氨基酸脱氢酶（EC号1.4.1.5）、甘油脱氢酶（EC号1.1.1.6）、苹果酸酯脱氢酶（EC号1.1.1.37）、3-羟基丁酸酯脱氢酶（EC号1.1.1.30）或山梨糖醇脱氢酶（EC号1.1.1.14）。
在一个其它实施方案中，所述氧化还原酶是葡萄糖脱氢酶。在一个其它实施方案中，所述葡萄糖脱氢酶选自葡萄糖脱氢酶（EC号1.1.1.47）、醌蛋白葡萄糖脱氢酶（EC号1.1.5.2），特别是吡咯并喹啉醌（PQQ）依赖性葡萄糖脱氢酶（EC号1.1.5.2），葡萄糖-6-磷酸酯脱氢酶（EC号1.1.1.49）、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）-依赖性葡萄糖脱氢酶（EC号1.1.1.119）和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）-依赖性葡萄糖脱氢酶（EC号1.1.99.10）或其酶活性突变体。
上述酶的酶活性突变体可以通过从上文列举的现有技术的上述野生型酶报告的氨基酸序列取代、增加或去除一个或多个氨基酸获得。其它设想作为突变体的是如US 7,132,270或US 7,547,535 中公开的相比于其野生型相对物具有改进底物特异性的PQQ-依赖性葡萄糖脱氢酶的突变体。两篇文献都通过关于突变体的引用并入本文。其它突变体是公开在Baik等(Baik, Appl Environ Microbiol (2005) 71: 3285), Vasquez-Figuera等(Vasquez-Figuera, Chem BioChem (2007) 8: 2295)和WO 2005/045016 中的那些。
根据本发明其它可设想的是公开在WO2009/103540A1 (第21页)或EP1660648 中的葡萄糖脱氢酶（E.C. 1.1.1.47）突变体，其至少在氨基酸位置96、170和/或252具有突变，通过引用并入本文。在这些氨基酸位置设想的其它突变是Glu96Gly、Glu170Arg或Lys和/或Lys252Leu，例如Glu170Lys / Lys252Leu组合的取代。在一个其它实施方案中，所述突变是来自枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶中的突变Glu170Arg和Gln252Leu。
如技术人员将意识到的，根据本发明的化合物在氧化还原酶用作报道酶的情况下可以用作报道染料，在一个实施方案中，例如在被分析物的免疫测定中或酶测定中。此外，化合物可以用作细胞活力测试的四唑鎓盐的替代，益处是更高的消光系数。此外，如果化合物被改性，其可以用作标记试剂。
如本文所用的术语“氧化还原当量物”涉及技术人员公知的氧化还原化学中通常使用的概念。在一个实施方案中，该术语涉及从氧化还原酶的底物转移至氧化还原辅因子，和/或从所述氧化还原辅因子转移至氧化还原介体，和/或从所述氧化还原介体转移至指示剂化合物和/或至电极的电子。
在本发明的化学基质的一个其它实施方案中，所述组合物还包含至少一种洗涤剂、溶胀剂、成膜剂和/或固体颗粒。待用于本发明的组合物的合适的稳定剂、洗涤剂、溶胀剂、成膜剂、氧化剂和/或固体颗粒是技术人员已知的。在一个实施方案中，所述至少一种洗涤剂选自N-甲基-N-油酰基牛磺酸钠、N-辛酰基-N-甲基葡糖胺、Mega 8 (N-甲基-N-辛酰基葡糖胺)、磺基琥珀酸二辛酯钠盐（DONS）、Rhodapex®（在一个实施方案中，CO-433或CO-436）。在一个实施方案中，所述至少一种溶胀剂选自甲基乙烯基醚马来酸酐共聚物、黄原胶和甲基乙烯基醚马来酸酐共聚物。在一个实施方案中，所述至少一种成膜剂选自聚乙烯基丙酸酯分散体、聚乙烯基酯、聚乙烯基乙酸酯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸、聚乙烯基酰胺、聚酰胺、聚苯乙烯并且混合的聚合产物也是合适的，例如丁二烯、苯乙烯或马来酸酯的混合的聚合产物。在一个实施方案中，所述至少一种固体颗粒选自二氧化硅颗粒，特别是二氧化硅，硅酸钠或硅酸铝、硅藻土、金属氧化物，特别是氧化钛和/或氧化铝，合成氧化物材料，特别是氧化物材料的纳米颗粒，例如二氧化硅、氧化铝或氧化钛的纳米颗粒，高岭土、玻璃粉、无定型二氧化硅、硫酸钙和硫酸钡。
另外，本发明涉及包含本发明的化合物和/或化学基质的测试元件。
如本文所用的术语“测试元件”涉及在固体载体上包含测试化学品，在一个实施方案中是干燥测试化学品的单元。在一个实施方案中，测试化学品包含在如下所述的测试域（test field）中。另外，在一个实施方案中，测试元件还包括毛细管元件，其适用于在一个实施方案中通过毛细作用采集和/或转移液体至测试域。在一个实施方案中，测试元件选自光学测试元件和电化学测试元件。测试元件可以进一步任选包含至少一个穿刺元件，例如切缝元件，在一个实施方案中，其可以相对于测试域可移动地安装以进行穿刺运动、采样运动或切缝运动，由此在皮肤表面产生切口。在一个实施方案中，测试域在穿刺、采样或切缝运动中保持在固定位置，其中在穿刺、采样或切缝运动之后，例如通过毛细作用和/或通过按压穿刺元件或其一部分至测试域上将体液样品转移至测试域上。在一个实施方案中，测试元件是测试条、测试带或测试盘。
术语“测试域”涉及连续或不连续量的测试化学品，其在一个实施方案中通过至少一种载体，例如通过至少一种载体膜保持。因此，测试化学品可以形成或可以包含在测试域的一个或多个膜或层中，和/或测试域可以包含具有一个或多个层的层设置，其中至少一个层包含测试化学品。因此，测试域可以包含布置在载体上的层设置，其中可以将体液样品从至少一个施加侧，例如从测试域的边缘和/或从测试域的施加表面施加至层设置。在一个实施方案中，测试域具有多层设置，多层设置包含至少一个具有至少一个测试材料的检测层并进一步包含至少一个适用于分离出体液中包含的至少一种颗粒状组分的分离层，其中所述分离层位于检测层和毛细管元件之间。技术人员理解的是所有层任选存在于体液之间并且选择测试域以允许至少通过被分析物。
在一个实施方案中，测试元件是光学测试元件，即测试元件适用于在被分析物存在下改变至少一种光学性质。在一个其它实施方案中，测试元件中包含的至少一种化学基质在被分析物存在下进行至少一种光学可检测检测反应。另外在一个实施方案中，检测反应是氧化还原反应。在一个其它实施方案中，检测反应产生氧化还原当量物和/或电子作为中间体和/或产物。在一个实施方案中，由检测反应产生的光学可检测信号与样品中的被分析物的量和/或浓度成比例。
在一个实施方案中，在适用于在被分析物存在下改变至少一种光学性质的测试元件中，在一个实施方案中，本发明的化合物在被分析物存在下改变至少一种光学性质。然而，还设想测试元件还包含指示剂试剂。如本文所用的术语“指示剂试剂”在一个实施方案中涉及在一个实施方案中取决于测试元件中包含的本发明的化合物的氧化态，与其成比例改变至少一种光学性质的化合物。在一个实施方案中，指示剂试剂是光学指示剂物质，其在化学基质中包含的本发明的化合物在被分析物存在下改变其氧化还原态时，发生至少一种光学可检测性质改变。因此，在一个实施方案中，至少一种指示剂试剂包括发生指示至少一种酶和被分析物的酶反应的光学性质改变的一种或多种染料。
如本文所用的术语“光学性质”涉及可以通过光学仪器检测的性质。具体地，光学性质可以是或可以包括选自以下的至少一种性质：反射性质、透射性质、发射性质、散射性质、荧光性质、磷光性质、衍射性质和偏振性质。在一个实施方案中，本文提及的光学性质是指可以光学检测的化合物的性质，例如光吸收、光发射、光再发射（remission）或与其相关的性质。将理解的是如本文所用的至少一种光性质的这样的改变包括检测之前不可检测的性质的存在，检测之前已经检测的性质的不存在和检测性质的定量改变，即检测与至少一种光学性质的改变程度相关的信号强度改变。本发明设想的其它光学性质是颜色、荧光、发光或折射。将上述光学性质转换成可以读取为测量值的物理信号的方法是本领域公知的并且描述在例如EP 0 821 234、EP 0 974 303和US 2005/0023152中。
根据本发明的化合物和/或指示剂试剂的光学性质根据本发明的酶的活性改变。因此在一个实施方案中，光学性质的改变仅在酶催化检测反应的情况下发生。在一个其它实施方案中，光学性质的改变与化学基质中存在的酶经历的催化循环数成比例。因此，在一个其它实施方案中，光学性质的改变与被酶转化的被分析物分子的数目成比例。
另外在一个实施方案中，测试元件是电化学测试元件并且本发明的化合物具有氧化还原介体的功能，在一个实施方案中，在氧化还原辅因子和测试元件的电极之间介导转移氧化还原当量物。因此，在一个实施方案中，测试元件包含直接或间接接触化学基质的至少两个电极，如本文其它地方指明的。合适的电极、电极设置和操作模式是技术人员已知的并且描述在例如WO 2007/071562 A1、WO 2014/001382 A1、US 2005/0023152和其中引用的参考文件中。此外，本发明设想化学基质包含一种或多种用于与被分析物反应以产生代表样品流体中的被分析物的存在的电化学信号的化学试剂。在一个实施方案中，一种或多种用于与被分析物反应以产生电化学信号的化学试剂包括如上所述的氧化还原辅因子和/或氧化还原酶，所述电化学信号代表样品流体中的被分析物的存在。在一个实施方案中，电化学性质包括指示被分析物的浓度的安培或库仑响应。参见例如美国专利5,108,564、4,919,770和6,054,039。
在一个实施方案中，电化学测试元件包括接触所述测试元件中包含的化学基质的至少两个电极或导电连接至所述测试化学品的接触装置。在一个实施方案中，导电连接至化学基质的装置是连接至化学基质以能够通过所述层扩散氧化还原辅因子和/或氧化还原介体的测试条的层。在一个其它实施方案中，导电连接至化学基质的装置是至少部分覆盖所述化学基质和/或存在于所述化学基质之下以能够通过所述层扩散氧化还原辅因子和/或氧化还原介体的测试条的层。
根据本发明的电化学性质根据本发明的氧化还原酶的活性改变。因此在一个实施方案中，电化学性质的改变仅在氧化还原酶催化检测反应的情况下发生。在一个其它实施方案中，电化学性质的改变与化学基质中存在的氧化还原酶经历的催化循环数成比例。因此在一个其它实施方案中，电化学性质的改变与被氧化还原酶转化的被分析物分子的数目成比例。
在一个其它实施方案中，本发明的测试元件是组合的光学和电化学测试元件。因此，在一个实施方案中，测试元件具有光学测试元件的结构特征以及电化学测试元件的结构特征，即在一个其它实施方案中至少两个电极。对于组合测试元件已经描述了各种形式，例如US 2003/0068666 A1描述了具有两个反应区的双传感器，使得能够同时获得电化学和比色读数。另外，EP 1 318 397 A1教导了具有多个反应区的测试条，并且US 8,460,539 B2公开了具有比色和电化学检测的分离的反应区的混合测试条。
此外，本发明涉及根据本发明的三环化合物或如本说明书结构限定的化合物、根据本发明的化学基质或根据本发明的测试元件在分析或诊断测试中的用途。
术语“测试”被本领域技术人员理解并且涉及用于定量评估或在一个实施方案中定量化合物的混合物中关注的化合物的存在或不存在的任何工艺或方法。
在一个实施方案中，分析测试是用于定量评估或在一个实施方案中定量本文其它地方所述的氧化还原辅因子，在一个其它实施方案中，还原的氧化还原辅因子的存在或不存在的测试。因此，在一个实施方案中，分析测试是细胞活力测试，在一个其它实施方案中，是体外细胞活力测试。然而，还设想包括评估还原的氧化还原辅因子的存在的其它实施方案，例如测试微生物污染。在一个其它实施方案中，分析测试包括检测产生的还原的辅因子，例如通过连接至特异性结合至抗体的分子的氧化还原酶，在一个实施方案中，在免疫测定中是抗-抗体免疫球蛋白。
因此，本发明还涉及根据本发明的三环化合物或其盐或溶剂合物或根据本发明的包含共价键合至π-受体基团（Acc）的杂环基团（Het）的化合物用于分析细胞的活力或代谢的用途。
在一个其它实施方案中，分析或诊断测试包括定性和/或定量测定可通过光学和/或断华夏方法检测的任何生物或化学被分析物。在一个实施方案中，被分析物包含在个体的测试样品中，在一个其它实施方案中，体液的测试样品。在一个其它实施方案中，分析或诊断测试包括测定测试样品中的葡萄糖浓度。在一个其它实施方案中，分析或诊断测试包括测定来自患有糖尿病或疑似患有糖尿病的个体的测试样品中的葡萄糖浓度。另外，在一个实施方案中，分析或诊断测试是用于监测血糖浓度的测试，在一个实施方案中，患有糖尿病或疑似患有糖尿病的个体的血糖浓度。在一个实施方案中，分析或诊断测试是体外测试。
如本文所用的术语“被分析物”涉及存在于个体的测试样品中，在一个实施方案中，体液中的化合物。在一个实施方案中，被分析物是小分子，即在一个实施方案中，被分析物不是生物大分子。在一个其它实施方案中，被分析物是有机分子，在一个其它实施方案中，是能够在根据本发明的测试化学品存在下经历氧化还原反应的有机分子。在一个实施方案中，被分析物是个体代谢的分子。另外在一个实施方案中，被分析物是低分子量化合物，在一个其它实施方案中，是分子量小于1000 u (1000 Da; 1.66×10−24 kg)的化合物。在一个其它实施方案中，被分析物选自以下列表：苹果酸酯、乙醇、抗坏血酸、胆甾醇、甘油、脲、3-羟基丁酸酯、乳酸、丙酮酸酯、甘油三酯、酮、肝参数、肌酐、HDL等；在一个其它实施方案中，被分析物是血糖。
如本文所用的术语“个体”涉及脊椎动物。在一个实施方案中，个体是哺乳动物，在一个其它实施方案中，是小鼠、大鼠、猫、狗、仓鼠、豚鼠、绵羊、山羊、猪、牛或马。还在一个其它实施方案中，个体是灵长目动物。在一个其它实施方案中，个体是人。在一个实施方案中，个体患有或疑似患有至少一种被分析物的标准的可测量偏离相关的疾病或病况。在一个其它实施方案中，个体患有糖尿病。
如本文所用的术语“体液”涉及已知包含或疑似包含本发明的被分析物的个体的所有体液，包括血液和血液制品、血浆、血清、泪液、尿液、淋巴液、脑脊髓液、胆汁、粪便、汗液、组织液和唾液。在一个实施方案中，体液是血浆或血清。在一个其它实施方案中，体液是血液。
术语“测试样品”被技术人员理解并涉及组织的任何合适尺寸的子部分，或在一个实施方案中，是个体的体液。体液测试样品可以通过公知的技术，包括例如静脉或动脉穿刺、表皮穿刺等获得。
如本文所用的术语“糖尿病”是指其中葡萄糖代谢受损的疾病状况。所述损害导致高血糖。根据世界卫生组织（WHO），糖尿病可以细分成四类。1型糖尿病由缺乏胰岛素导致。胰岛素通过所谓的胰岛细胞产生。所述细胞可以通过1型糖尿病的自身免疫反应损害（类型1a）。此外，1型糖尿病还包括特发性变体（类型1b）。2型糖尿病由抗胰岛素性导致。根据目前分类，3型糖尿病包括所有其它特定类型的糖尿病。例如β细胞可能具有影响胰岛素产生的遗传缺陷，抗胰岛素性可能遗传地引起或胰腺本身可能被损害或受损。此外，激素放松管制或药物也可能导致3型糖尿病。4型糖尿病可能在怀孕期间发生。在一个实施方案中，如本文所用的糖尿病是指1型糖尿病或在一个其它实施方案中，是2型糖尿病。根据GermanSociety for Diabete，通过在空腹状态血浆葡萄糖水平高于110 mg/dl或在餐后高于220mg/dl诊断糖尿病。可以与本发明的分析或诊断测试联合使用或除此之外使用的用于诊断糖尿病的其它诊断技术是本领域公知的并且描述在医学标准教科书，例如Stedman或Pschyrembl中。
技术人员理解的是在糖尿病中，必须定期检查血糖水平以例如在餐后避免和/或对高血糖采取对策，或例如在施用胰岛素之后避免和/或对高血糖采取对策。因此，本发明还涉及本发明的化合物用于测定血糖水平，在一个其它实施方案中，用于诊断高血糖症、低血糖症或正常葡萄糖水平。
此外，本发明涉及根据本发明的三环化合物或其盐或溶剂合物或如本说明书结构限定的化合物用于生产化学基质或用于生产测试元件的用途。
此外，本发明涉及用于测定测试样品中被分析物的量的方法，其包括
a) 使所述测试样品与根据本发明的三环化合物或如本说明书结构限定的化合物、根据本发明的化学基质或测试元件接触，
b) 估算在所述测试样品存在下由化合物、所述化学基质中包含的化合物或所述测试元件中包含的化合物释放或消耗的氧化还原当量物的量，并
c) 由此测定所述测试样品中的被分析物的量。
在一个实施方案中，本发明的方法是体外方法。此外，其可以包括除以上明确提及的步骤之外的步骤。例如，其它步骤可以涉及例如获得步骤a）的测试样品，或在步骤b）中在所述测试样品存在下测量化合物、化学基质或测试元件的至少一个光学性质。此外，一个或多个所述步骤可以通过自动设备进行。技术人员还理解的是方法的一个或多个步骤，例如估算释放或消耗的氧化还原当量物的量的步骤可以重复。
术语“测定”涉及测量样品中被分析物的量，在一个实施方案中半定量测量或在一个其它实施方案中定量测量。
测量释放或消耗的氧化还原当量物（在一个实施方案中是电子的量）的方法是现有技术已知的。在一个实施方案中，通过光学或电化学传感器测量释放或消耗的氧化还原当量物的量。在一个其它实施方案中，测量释放或消耗的氧化还原当量物的量包括检测如上所述的本发明的化合物的光学性质。
在一个实施方案中，用于测定测试样品中的被分析物的量的方法是用于测定个体中血糖水平的方法，其包括
a) 使所述测试样品与根据本发明的三环化合物或如本说明书结构限定的化合物、根据本发明的化学基质或测试元件接触，
b) 估算在所述测试样品存在下由化合物、所述化学基质中包含的化合物或所述测试元件中包含的化合物释放或消耗的氧化还原当量物的量，并
c) 基于步骤b）中的估算结果测定个体的血糖水平。
技术人员理解的是在样品中，或在一个实施方案中，在来自相同个体的不止一个样品中测定升高的血糖水平的情况下，测定血糖水平的方法可以是辅助诊断糖尿病的方法。
另外，本发明涉及在个体中保持血糖水平在合适的水平的方法，其包括如上所述用于测定个体中血糖水平的方法的步骤和在测定升高的血糖水平的情况下将胰岛素施用至所述个体，或在测定低血糖水平的情况下施用葡萄糖或释放葡萄糖化合物（例如包含淀粉的食品组分）的额外步骤。如本文所用的术语“升高的血糖水平”涉及大于180 mg/dl，在一个实施方案中，大于200 mg/dl的血糖浓度；并且术语“低血糖水平”涉及小于70 mg/dl，在一个实施方案中，小于60 mg/dl的血糖浓度。
此外，本发明涉及用于测定样品中被分析物的量的系统，其包括
a) 根据本发明的测试元件和
b) 包括用于测量释放或消耗的氧化还原当量物的量的传感器的装置。
术语“装置”是技术人员已知的并涉及包括至少一个用于测量被本发明的化合物释放或消耗的氧化还原当量物的量的传感器的技术设备。在一个实施方案中，所述传感器是光学和/或电化学传感器；所述传感器是技术人员已知的。
本说明书引用的所有参考文献关于其全部公开内容和本说明书中具体提及的公开内容通过引用并入本文。
本发明的其它任选特征和实施方案将更详细公开在随后的实施例描述中。如技术人员将意识到的，其中和限定中公开的各任选特征可以以分离方式以及任何随意可行组合实现。本发明的范围不被实施例限制。
在附图中
图1：当在pH为7的50 mM磷酸盐缓冲液中用NADH（20 µM）处理指示剂1-甲基-3-[(E)-2-(1,3,3-三甲基-3H-吲哚鎓-2-基)乙烯基]喹啉鎓碘化物三氟甲磺酸盐 (0.5 mM)时的代表性时间依赖性UV/可见光谱，在添加NADH后显示λmax在535 nm处的吸光度改变。箭头指示在添加NADH后增加的时间；-NADH：不添加NADH。x轴：波长(λ (nm))，y轴：吸光度。
图2：用指示剂1-甲基-6-[(E)-2-(1,3,3-三甲基-3H-吲哚鎓-2-基)乙烯基]喹啉鎓碘化物三氟甲磺酸盐测定NADH。10分钟后在516 nm的吸光度改变相对于NADH浓度。x轴：在516 nm的吸光度改变，y轴：NADH浓度（mM）。
图3：当在pH为7的磷酸盐缓冲液中分别用NADH (二钠盐，20 µM)或抗坏血酸钠(asc, 20 µM)处理指示剂1-甲基-3-[(E)-2-(1,3,3-三甲基-3H-吲哚鎓-2-基)乙烯基]喹啉鎓碘化物三氟甲磺酸盐的两个溶液时的动力学的代表性UV/可见光谱。x轴：时间（分钟），y轴：吸光度。
图4：当在pH为7的100 mM磷酸盐缓冲液中用葡萄糖（385 µM）处理1-甲基-6-[(E)-2-(1,3,3-三甲基-3H-吲哚鎓-2-基)乙烯基]喹啉鎓碘化物三氟甲磺酸盐(0.5 mM)和NAD/GlucDH2的混合物时的代表性时间依赖性UV/可见光谱，在添加葡萄糖后显示λmax在561 nm处的吸光度改变。箭头指示在添加葡萄糖后增加的时间；-glc：不添加葡萄糖。x轴：波长(λ(nm))，y轴：吸光度。
图5：当在pH为7的100 mM磷酸盐缓冲液中用葡萄糖（0-385 µM）处理1-甲基-6-[(E)-2-(1,3,3-三甲基-3H-吲哚鎓-2-基)乙烯基]喹啉鎓碘化物三氟甲磺酸盐(0.5 mM)和NAD/GlucDH2的混合物时的动力学的代表性UV/可见光谱。箭头指示增加的葡萄糖浓度（分别为119 µM、244 µM和385 µM）；-glc：不添加葡萄糖。x轴：时间（分钟），y轴：吸光度。
图6：对应于在20分钟后在517 nm处记录的在pH为7的100 mM磷酸盐缓冲液中用1-甲基-6-[(E)-2-(1,3,3-三甲基-3H-吲哚鎓-2-基)乙烯基]喹啉鎓碘化物三氟甲磺酸盐(0.5 mM)和NAD/GlucDH2的混合物测定葡萄糖的ΔAbs的校准曲线。图中的每个点是三次重复的平均值，误差条线代表标准偏差。x轴：葡萄糖浓度(glc (µM))，y轴：ΔAbs。
图7：当在pH为7的100 mM磷酸盐缓冲液中用葡萄糖（0-385 µM）处理1-甲基-6-[(E)-2-(1,3,3-三甲基-3H-吲哚鎓-2-基)乙烯基]喹啉鎓碘化物三氟甲磺酸盐(0.5 mM)和carbaNAD/GlucDH2的混合物时的动力学的代表性UV/可见光谱。箭头指示增加的葡萄糖浓度（分别为119 µM、244 µM和385 µM）；-glc：不添加葡萄糖。x轴：时间（分钟），y轴：吸光度。
图8：对应于在20分钟后记录的在517 nm处在pH为7的100 mM磷酸盐缓冲液中用1-甲基-6-[(E)-2-(1,3,3-三甲基-3H-吲哚鎓-2-基)乙烯基]喹啉鎓碘化物三氟甲磺酸盐(0.5 mM)和carbaNAD/ GlucDH2的混合物测定葡萄糖的ΔAbs的校准曲线。图中的每个点是三次重复的平均值，误差条线代表标准偏差。x轴：葡萄糖浓度(µM)，y轴：ΔAbs。
图9：在535 nm处记录的NADH的初始浓度对还原形式的1-甲基-3-[(E)-2-(1,3,3-三甲基-3H-吲哚鎓-2-基)乙烯基]喹啉鎓碘化物三氟甲磺酸盐的吸光度改变的影响。图中的每个点是三次重复的平均值，误差条线代表标准偏差。x轴：初始NADH浓度([NADH]0 (µM))，y轴：在535 nm处的吸光度改变（ΔAbs）。
图10：在pH为7的10 mM PIPES中用NADH (4 µM)处理指示剂1-甲基-3-[(E)-2-(1,3,3-三甲基-3H-吲哚鎓-2-基)乙烯基]喹啉鎓碘化物三氟甲磺酸盐(20 µM)时的代表性荧光发射光谱，添加NADH后在535 nm处使用激发显示λmax在560 nm处的荧光强度的改变；-NADH：不添加NADH。x轴：发射(λ (nm))，y轴：荧光强度。
图11：将指示剂1-甲基-3-[(E)-2-(1,3,3-三甲基-3H-吲哚鎓-2-基)乙烯基]喹啉鎓碘化物三氟甲磺酸盐(20 µM)的荧光改变与NADH浓度(0 - 4 µM)关联的校准曲线。测量在pH为7的10 mM PIPES中在560 nm处进行并在培育30分钟后记录，在535 nm处使用激发。x轴：初始NADH浓度([NADH]0 (µM))，y轴：荧光强度。
实施例
实施例1：
1-甲基-6-((E)-3-氧代-3-苯基-丙烯基)-喹啉鎓硫酸二甲酯 (MOPPQ)
1.1合成
1.1.1合成，步骤1：(E)-1-苯基-3-喹啉-6-基-丙烯酮 (XIV)的合成
Figure 819051DEST_PATH_IMAGE020
向6-喹啉甲醛 (XXXIII) (500 mg, 3.18 mmol)在50.0 ml EtOH和6.40 ml NaOH(10%，在H2O中)中的溶液添加苯乙酮(XXXIV) (0.371 ml, 3.18 mmol)。将混合物在室温下搅拌16h，随后在减压下浓缩。将剩余粗产物通过硅胶色谱法(正己烷/丙酮；75:25)纯化，获得117.4 mg (14%)的标题化合物。
1.1.2合成，步骤2：1-甲基-6-((E)-3-氧代-3-苯基-丙烯基)-喹啉鎓硫酸二甲酯(MOPPQ, (XXII))的合成
Figure 520291DEST_PATH_IMAGE021
向(E)-1-苯基-3-喹啉-6-基-丙烯酮(XXXV) (80.0 mg, 0.309 mmol)在3.00 ml丙酮中的溶液添加硫酸二甲酯(0.587 ml, 6.17 mmol)。将混合物在室温下搅拌16h。将获得的悬浮液过滤并将剩余沉淀物用丙酮洗涤3次。将粗产物通过制备型HPLC(H20/CH3CN)纯化，获得22.0 mg (18%)的标题化合物(XXII)。
1.2测量
1.2.1 MOPPQ (XXII)，用NADH和抗坏血酸盐大致估算反应速率
将氧化还原指示剂1-甲基-6-((E)-3-氧代-3-苯基-丙烯基)-喹啉鎓硫酸二甲酯(5.00 mg, 0.013 mmol)在1.00 ml水中的两个溶液分别用过量NADH (二钠盐)或抗坏血酸钠处理。用NADH处理的溶液迅速从几乎无色变成橙色。几分钟后，获得更大量的橙色沉淀物，可能是不溶性二氢喹啉。与此相反，用抗坏血酸盐处理的溶液仅显示浅橙色。即使在16h后也没有发现沉淀物。因此，使用NADH的MOPPQ的转化率与使用抗坏血酸盐高得多。
实施例2
9-乙氧基吩嗪-1-甲醛
2.1合成，步骤1：(9-乙氧基吩嗪-1-基)甲醇的合成
Figure 636145DEST_PATH_IMAGE022
将9-乙氧基吩嗪-1-甲酸(XXXVI) (1.50 g, 5.59 mmol) (通过Rewcastle, G.W.; Denny, W. A. Synth. Commun. 1987, 17, 1171中的方法由N-(2,6-二氟苯基)-3-硝基邻氨基苯甲酸合成)在DMF (15 mL)中的悬浮液用1,1’-羰二咪唑 (CDI) (1.85 g,11.40 mmol)处理并将混合物在50℃下搅拌1h。冷却后，将混合物用DCM/石油醚(1:1)稀释以使imidazolide完全沉淀，将其收集，用石油醚洗涤，干燥，溶解在THF(200 mL)中，然后缓慢添加至NaBH4在H2O (50 mL)中的溶液。搅拌1h后，通过逐滴添加浓HCl中和混合物，然后用EtOAc萃取。将有机层用Na2CO3水溶液，水洗涤，干燥(Na2SO4)并蒸发以产生(9-乙氧基吩嗪-1-基)甲醇(XXXVII) (1.20 g)。
1H NMR (氯仿-d, 400MHz): δ [ppm] = 8.16 (dd, J=8.8, 1.3 Hz, 1 H),7.81 (dd, J=8.8, 1.3 Hz, 1 H), 7.79 (dd, J=8.8, 6.8 Hz, 1 H), 7.76 (dd, J=8.8, 7.3 Hz, 1 H), 7.68 (dd, J=6.8, 1.0 Hz, 1 H), 7.06 (dd, J=7.3, 1.3 Hz, 1H), 5.36 (s, 2 H), 5.26 (br. s., 1 H), 4.34 (q, J=7.0 Hz, 2 H), 1.66 (t, J=6.9 Hz, 3 H)
13C NMR (氯仿-d, 101MHz): δ [ppm] = 154.4, 144.2, 143.7, 141.1, 139.1,135.1, 131.0, 130.6, 128.8, 127.7, 120.9, 107.6, 64.8, 64.6, 14.7
LC-MS m/z 255.2 ([M+H]+)。
2.2合成，步骤2：9-乙氧基吩嗪-1-甲醛的合成
Figure 321205DEST_PATH_IMAGE023
将(9-乙氧基吩嗪-1-基)甲醇(XXXVII) (750 mg, 2.95 mmol)、活化氧化锰(IV)(5.65 g, 58.5 mmol)和DCM (50 mL)的混合物在室温下在氩气气氛下搅拌3 h。然后将反应物通过硅胶垫过滤并浓缩。将残余物溶解在EtOAc中并将获得的溶液用Na2CO3水溶液、水洗涤，干燥(Na2SO4)，蒸发并在真空下干燥24 h以产生作为黄色固体的9-乙氧基吩嗪-1-甲醛(XXXVIII) (530 mg)。
1H NMR (氯仿-d, 400MHz): δ [ppm] = 11.63 (s, 1 H), 8.52 (dd, J=8.7,1.4 Hz, 1 H), 8.48 (dd, J=7.1, 1.5 Hz, 1 H), 7.99 (dd, J=8.3, 7.3 Hz, 1 H),7.78 - 7.87 (m, 2 H), 7.14 (dd, J=6.8, 1.8 Hz, 1 H), 4.39 (q, J=7.0 Hz, 2 H),1.70(t, J=7.1 Hz, 3 H)
13C NMR (氯仿-d, 101MHz): δ [ppm] = 191.3, 154.7, 144.4, 142.6, 141.1,137.1, 135.7, 132.1, 131.6, 130.2, 130.0, 121.2, 108.4, 65.1, 14.7
LC-MS m/z 253.1 ([M+H]+)。
实施例3
2-[(E)-2-(9-乙氧基吩嗪-1-基)乙烯基]-1,3,3-三甲基-3H-吲哚鎓碘化物(XL)的合成
Figure 672552DEST_PATH_IMAGE024
将9-乙氧基吩嗪-1-甲醛(XXXVIII) (120 mg, 0.40 mmol)和1,2,3,3-四甲基-3H-吲哚鎓碘化物(XXXIX) (99 mg, 0.33 mmol)在乙醇(10 ml)中的混合物在氩气气氛下在3 h在哌啶(10 µL, 0.10 mmol)的存在下加热至回流。将反应混合物缓慢冷却至室温并过滤出红色沉淀物，用冷乙醇洗涤，然后用二乙醚洗涤并干燥。获得120 mg红色粉末。
1H NMR (DMSO-d6, 500MHz): δ [ppm] = 9.58 (d, J=16.7 Hz, 1 H), 8.94 (d,J=6.9 Hz, 1 H), 8.49 (d, J=8.5 Hz, 1 H), 8.48 (d, J=16.7 Hz, 1 H), 8.19 (dd,J=8.4, 7.4 Hz, 1 H), 7.93 - 8.02 (m, 3 H), 7.85 (d, J=8.5 Hz, 1 H), 7.64 -7.76 (m, 2 H), 7.40 (d, J=7.6 Hz, 1 H), 4.41 (q, J=6.8 Hz, 2 H), 4.28 (s, 3H), 1.96 (s, 6 H), 1.62(t, J=6.9 Hz, 3 H)
13C NMR (DMSO-d6, 101MHz): δ [ppm] = 182.0, 154.1, 147.3, 144.0,143.7, 142.6, 141.9, 139.5, 135.5, 134.0, 132.5 (2C), 132.4, 131.1, 129.8,129.2, 123.1, 120.4, 116.1, 115.6, 109.0, 64.5, 52.4, 34.9, 25.9 (2C), 14.8
LC-MS m/z 408.0 (M+)。
实施例4
(9E)-10,10-二甲基-9-(喹啉-3-基亚甲基)-7,8,9,10-四氢-6H-吡啶并[1,2-a]吲哚鎓六氟磷酸盐(XLII)的合成
Figure 493877DEST_PATH_IMAGE025
将喹啉-3-甲醛(XXXIII) (500 mg, 3.18 mmol)和10,10-二甲基-7,8,9,10-四氢-6H-吡啶并[1,2-a]吲哚鎓六氟磷酸盐(XLI) (922 mg, 2.67 mmol) (通过Mushkalo,I. L.; Turova, L. S.; Murovanaya, N. V. Dopov. Akad. Nauk Ukr. RSR, Ser. B:Geol., Khim. Biol. Nauki 1979, 1022中的方法由2,3,3-三甲基-3H-吲哚合成)在乙醇(25 ml)中的混合物在氩气气氛下在16 h在哌啶(105 µL, 1.06 mmol)的存在下加热至回流。将反应混合物缓慢冷却至室温并过滤出沉淀物，用冷乙醇洗涤，然后用二乙醚洗涤并干燥。获得1.0 g黄色粉末。
1H NMR (DMSO-d6, 400MHz): δ [ppm] = 9.26 (d, J=2.0 Hz, 1 H), 8.83 (s,1 H), 8.30 (s, 1 H), 8.17 (d, J=7.8 Hz, 1 H), 8.11 (d, J=8.3 Hz, 1 H), 7.90 -7.98 (m, 3 H), 7.74 (t, J=7.5 Hz, 1 H), 7.64 - 7.70 (m, 2 H), 4.46 (t, J=5.6Hz, 2 H), 3.12 (t, J=5.2 Hz, 2 H), 2.21 (t, J=5.6 Hz, 2 H), 1.89(s, 6 H)
13C NMR (DMSO-d6, 101MHz): δ [ppm] = 181.03, 152.74, 147.89, 144.80,144.54, 141.34, 139.27, 132.27, 130.51, 129.79, 129.47, 129.22, 128.33,128.12, 127.99, 127.29, 123.39, 115.58, 53.16, 46.16, 26.15 (2 C), 24.18,19.73
LC-MS m/z 339.1 (M+)。
实施例5
吲哚鎓盐的合成
类似于实施例3-4获得表1中所列的吲哚鎓盐。
表1
Figure 639688DEST_PATH_IMAGE026
Figure 343201DEST_PATH_IMAGE027
Figure 967081DEST_PATH_IMAGE028
实施例6
1-甲基-3-[(E)-2-(1,3,3-三甲基-3H-吲哚鎓-2-基)乙烯基]喹啉鎓碘化物三氟甲磺酸盐(XXIV)的合成
Figure 705230DEST_PATH_IMAGE029
在氩气气氛下向1,3,3-三甲基-2-[(E)-2-(喹啉-3-基)乙烯基]-3H-吲哚鎓碘化物(XLV) (100 mg, 0.23 mmol)在8 mL干燥DCM中的溶液逐滴添加干燥DCM (2 mL)中的TfOMe (103 µL, 0.91 mmol)。将混合物在室温下搅拌16 h后，过滤出沉淀物，用DCM (5 ×10 ml)洗涤，然后用二乙醚洗涤并干燥。获得127 mg黄色粉末。
1H NMR (DMSO-d6, 400MHz): δ [ppm] = 10.16 (s, 1 H), 9.93 (s, 1 H),8.61 (d, J=8.6 Hz, 1 H), 8.59 (d, J=16.7 Hz, 1 H), 8.50 (d, J=7.8 Hz, 1 H),8.37 - 8.44 (m, 1 H), 8.17 (t, J=7.6 Hz, 1 H), 8.05 (d, J=16.7 Hz, 1 H), 8.00- 8.03 (m, 1 H), 7.92 - 7.97 (m, 1 H), 7.68 - 7.76 (m, 2 H), 4.70 (s, 3 H),4.26 (s, 3 H), 1.85 (s, 6 H)
13C NMR (DMSO-d6, 101MHz): δ [ppm] = 181.3, 150.9, 146.4, 144.8,144.1, 141.9, 138.5, 137.2, 131.4, 131.1, 130.4, 129.3, 128.7, 128.3, 123.1,122.3 (TfO-), 119.7, 119.1 (TfO-), 117.4, 116.0, 52.7, 46.1, 35.3, 24.7 (2C)
LC-MS m/z 327.2 ([M - H]+), 345.1 ([M + HO-]+)
UV-Vis (50 mM磷酸盐缓冲液，pH=7): λmax 512 (弱), 384, 311 nm; 用NADH还原后: 535, 528sh nm;
水中的溶解度: ≥ 10 mM。
实施例7
双季盐的合成
类似于实施例6，通过使吲哚鎓盐（来自实施例3-5）与各种三氟甲磺酸盐烷基化试剂反应获得表2中所列的双季盐。反应温度和时间通常可以在宽范围内变化。将产物从合适的溶剂结晶并且如果需要，可以通过常规程序，例如通过使用离子交换树脂改变阴离子。
表2
Figure 284591DEST_PATH_IMAGE030
Figure 413084DEST_PATH_IMAGE031
Figure 902971DEST_PATH_IMAGE032
Figure 167731DEST_PATH_IMAGE033
实施例8
指示剂与NADH的反应
将以下物质在比色皿中混合：50 µL的指示剂(1-甲基-3-[(E)-2-(1,3,3-三甲基-3H-吲哚鎓-2-基)乙烯基]喹啉鎓碘化物三氟甲磺酸盐)在蒸馏水中的10 mM溶液、950 µL的50 mM磷酸盐缓冲液，pH 7、2 µL的NADH在蒸馏水中的10 mM 溶液。添加NADH后在1 min内每7.5秒记录UV/可见光谱(400-1000 nm)（分辨率2 nm）（图1）。在52.5秒后没有进一步颜色改变可以测量。
根据本发明的其它指示剂的UV/可见光谱性质列在表3中。
表3：氧化还原指示剂UV/Vis研究
Figure 717661DEST_PATH_IMAGE034
Figure 333450DEST_PATH_IMAGE035
实施例9
NADH的测定
将以下物质在比色皿中混合：100 µL的指示剂(1-甲基-6-[(E)-2-(1,3,3-三甲基-3H-吲哚鎓-2-基)乙烯基]喹啉鎓碘化物三氟甲磺酸盐)在蒸馏水中的10 mM溶液、1000µL的50 mM磷酸盐缓冲液，pH 7、20-80 µL的NADH在蒸馏水中的10 mM溶液。在10 min后记录在516 nm处的吸光度改变（图2）。
实施例10
1-甲基-3-[(E)-2-(1,3,3-三甲基-3H-吲哚鎓-2-基)乙烯基]喹啉鎓碘化物三氟甲磺酸盐，评估与NADH和抗坏血酸盐的反应速率
分别用蒸馏水中的2 µL 的10 mM NADH (二钠盐)或抗坏血酸钠溶液处理氧化还原指示剂1-甲基-3-[(E)-2-(1,3,3-三甲基-3H-吲哚鎓-2-基)乙烯基]喹啉鎓碘化物三氟甲磺酸盐(0.005 mmol)在1.00 ml的pH为7的50 mM磷酸盐缓冲液中的两个溶液。关于时间测量在535 nm处的吸光度（图3）。用NADH处理的溶液迅速从几乎无色变成粉红色。与此相反，用抗坏血酸盐处理的溶液没有变色。因此，使用NADH的1-甲基-3-[(E)-2-(1,3,3-三甲基-3H-吲哚鎓-2-基)乙烯基]喹啉鎓碘化物三氟甲磺酸盐的转化率比使用抗坏血酸盐高得多。
实施例11
用GlucDH2/指示剂测定葡萄糖
11.1测量1：用葡萄糖和GlucDH2/NAD反应时的吸光度改变
将以下物质在比色皿中混合：500 µL的指示剂(1-甲基-6-[(E)-2-(1,3,3-三甲基-3H-吲哚鎓-2-基)乙烯基]喹啉鎓碘化物三氟甲磺酸盐) 在 100 mM 的pH为7的磷酸盐缓冲液中的1.0 mM溶液、500 µL的葡萄糖脱氢酶2 (GlucDH2)溶液(在100 mM 的pH为7的磷酸盐缓冲液中，含有4.0 mM NAD+)、浓度为491 U/ml, 40 µL的葡萄糖在蒸馏水中的10 mM溶液。在添加葡萄糖后在10 min内每1 min记录UV/可见光谱(300-1000 nm)(分辨率1 nm)(图4)。
11.2测量2：用葡萄糖和GlucDH2/NAD反应的动力学
反应混合物与测量1中相同，除了使用葡萄糖在蒸馏水中的10 mM溶液的10-40 µL样品。在添加葡萄糖后在20 min内每10秒记录在517 nm处的吸光度（图5，6）。
11.3测量3：用葡萄糖和GlucDH2/carbaNAD反应的动力学
条件与测量2中相同，其中用carbaNAD代替NAD。在添加葡萄糖后在20 min内每10秒记录在517 nm处的吸光度（图7，8）。
实施例12
1-甲基-3-[(E)-2-(1,3,3-三甲基-3H-吲哚鎓-2-基)乙烯基]喹啉鎓碘化物三氟甲磺酸盐，准一级反应条件下消光系数(ε)的评估
将以下物质在比色皿中混合：100 µL的1-甲基-3-[(E)-2-(1,3,3-三甲基-3H-吲哚鎓-2-基)乙烯基]喹啉鎓碘化物三氟甲磺酸盐在蒸馏水中的10 mM溶液、900 µL的pH为7的50 mM磷酸盐缓冲液、蒸馏水中的1-3 µL的10 mM NADH。5分钟后当没有进一步颜色变化可以测量时，记录在535 nm处的吸光度变化（图3，9）。
图9显示还原形式的1-甲基-3-[(E)-2-(1,3,3-三甲基-3H-吲哚鎓-2-基)乙烯基]喹啉鎓碘化物三氟甲磺酸盐的浓度与初始NADH浓度成比例。使用等式
Figure 627028DEST_PATH_IMAGE036
由趋势线的斜率计算还原形式的1-甲基-3-[(E)-2-(1,3,3-三甲基-3H-吲哚鎓-2-基)乙烯基]喹啉鎓碘化物三氟甲磺酸盐的ε值为69.3 mM-1cm-1。该ε值是还原形式的MTT的九倍 (Czerlinski, G. H.等; Journal of Biochemical and Biophysical Methods1988, 15, 241)。
实施例13
氧化还原指示剂的循环伏安法（CV）研究
在pH为7的磷酸盐缓冲液中相对于Ag/AgCl参比电极记录实施例6-7中合成的化合物的CV（表4）。
表4：氧化还原指示剂CV研究
Figure 808610DEST_PATH_IMAGE037
Figure 201546DEST_PATH_IMAGE038
E/mV vs Ag/AgCl，0.9% NaCl，pH 7，磷酸盐缓冲液，Au工作电极，扫描速率100mVs-1。
实施例14
NADH的荧光测定
13.1测量1：与NADH反应时的荧光强度变化
将以下物质在比色皿中混合：2 µL的指示剂(1-甲基-3-[(E)-2-(1,3,3-三甲基-3H-吲哚鎓-2-基)乙烯基]喹啉鎓碘化物三氟甲磺酸盐)在蒸馏水中的10 mM 溶液、1000 µL的pH为7的10 mM PIPES缓冲液、 0.5-4 µL的蒸馏水中的1 mM NADH溶液。将混合物在室温下培育30 min。在535 nm处使用激发记录荧光(550-800 nm)(图10，11)。
实施例15
1-甲基-3-[(E)-2-(1,3,3-三甲基-3H-吲哚鎓-2-基)乙烯基]喹啉鎓碘化物三氟甲磺酸盐，应用于细胞活力测试的评估
将HEK-293活细胞和4%多聚甲醛（paraformaldehyde）杀死的HEK-293细胞用1-甲基-3-[(E)-2-(1,3,3-三甲基-3H-吲哚鎓-2-基)乙烯基]喹啉鎓碘化物三氟甲磺酸盐(20 µM) 在pH为7的10 mM PBS中在37℃下培育。在561 nm处使用激发在611 nm处记录共焦荧光显微镜图像。HEK-293活细胞的图像显示细胞摄取1-甲基-3-[(E)-2-(1,3,3-三甲基-3H-吲哚鎓-2-基)乙烯基]喹啉鎓碘化物三氟甲磺酸盐；同时，荧光强度增加，这与细胞代谢产生NADH的事实一致。所得细胞保持活力至少24 h。与此相反，多聚甲醛处理的HEK-293细胞不显示荧光强度增加。因此，当用1-甲基-3-[(E)-2-(1,3,3-三甲基-3H-吲哚鎓-2-基)乙烯基]喹啉鎓碘化物三氟甲磺酸盐处理HEK-293细胞时，活细胞中的荧光强度比死细胞中的荧光强度高得多。
导致本发明的工作已经根据European Union's Seventh Framework Program(FP7/2007-2013) / ERC grant agreement n° 264772 (CHEBANA) 从European ResearchCouncil获得经费。

Claims (21)

1.三环化合物或其盐，所述三环化合物包含共价键合至π-受体基团的三环杂环基团，具有式（I）的一般结构
Figure 192928DEST_PATH_IMAGE001
其中
X是-CH-或-N-，
R1、R2、R3、R4独立地选自氢；具有至多5个碳原子的低级烷基；苯基；卤素；硝基；磺酸酯基；-CN；-COOH；-OR9；-SR9；-SSR9；-C(O)OR9；-C(O)NHR9；NHC(O)R9；C(O)NH2；
其中R9选自具有至多5个碳原子的低级烷基；或苯基；
和/或其中Ra和Ra+1一起形成桥以形成5至6元环烷基、芳基、杂环烷基或杂芳基环，其中a=1、2或3，
R5和R6独立地选自具有至多5个碳原子的低级烷基和苯基，
n是0至5的整数，
m是选自0和1的整数，
R7是H或具有至多5个碳原子的低级烷基，
R8是具有至多5个碳原子的低级烷基，
或其中R8和R7一起形成桥以形成任选取代的5至6元杂环烷基或5至14元杂芳基环。
2.权利要求1的三环化合物或其盐，其中所述R5和R6独立地选自甲基和乙基。
3.权利要求1的三环化合物或其盐，其中所述n是0、1或2。
4.权利要求1-3中任一项的三环化合物或其盐，其中
(i) X是-N-并且其中π-体系共价键合至如式（I）中所示的杂芳族体系的C1、C2、C3或C4，或
(ii) X是-CH-并且其中π-体系共价键合至如式（I）中所示的杂芳族体系的C2或C4。
5.权利要求1-3中任一项的三环化合物或其盐，
(i) X是-N-并且其中π-体系共价键合至如式（I）中所示的杂芳族体系的C1，或
(ii) X是-CH-并且其中π-体系共价键合至如式（I）中所示的杂芳族体系的C2。
6.权利要求1-3中任一项的三环化合物或其盐，其中所述π-受体基团选自
(i) 包括式（II）的结构的侧链
Figure 172386DEST_PATH_IMAGE002
其中Y是-N(Me)-、-S-、-Se-、-O-或-C(Me)2-，
(ii) 包括式（III）的结构的侧链
Figure 952123DEST_PATH_IMAGE003
(iii) 包括式（IV）的结构的侧链
Figure 347332DEST_PATH_IMAGE004
和
(iv) 包括式（V）的结构的侧链
Figure 161704DEST_PATH_IMAGE005
其中在式（II）至（V）的各式中，R10是具有至多5个碳原子的低级烷基。
7.权利要求6的三环化合物或其盐，其中所述R10是甲基。
8.权利要求1-3中任一项的三环化合物或其盐，其中所述化合物或其盐是在还原时经历红移的化合物。
9.权利要求1-3中任一项的三环化合物或其盐，其中在所述化合物或其盐中，所述π-受体基团不被还原辅酶NADH、FADH或PQQH还原。
10.包含氧化还原辅因子和化合物或其盐的化学基质，所述化合物包含共价键合至π-受体基团（Acc）的杂环基团（Het），所述化合物具有权利要求1-9中任一项的三环化合物或其盐的所述结构，其中所述氧化还原辅因子是氧化还原活性黄素、烟酰胺或吡咯并喹啉醌（PQQ）辅酶。
11.权利要求10的化学基质，其中所述化合物由(XX)、(XXI)和(LII)中任一个的结构组成：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
。
12.权利要求10或11的化学基质，其还包含氧化还原酶。
13.权利要求10或11的化学基质，其中所述氧化还原辅因子是烟碱腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）、吡咯并喹啉醌（PQQ）、黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）、烟碱腺嘌呤二核苷酸（NAD）、carbaNAD、或任何上述氧化还原辅因子的还原形式。
14.权利要求10或11的化学基质，其中所述化合物是在还原时经历红移的化合物。
15.权利要求10或11的化学基质，其中在所述化合物中，所述π-受体基团不被还原辅酶NADH、FADH或PQQH还原。
16.包含权利要求1至9中任一项的化合物和/或权利要求10至15中任一项的化学基质的测试元件。
17.根据权利要求1至9中任一项的三环化合物或其盐、如权利要求11中结构限定的化合物或其盐、根据权利要求10至15中任一项的化学基质或根据权利要求16的测试元件在制备用于分析或诊断测试中的测试试剂中的用途。
18.根据权利要求1至9中任一项的三环化合物或其盐、或如权利要求11中结构限定的化合物或其盐在制备用于分析细胞的活力或代谢的测试试剂中的用途。
19.根据权利要求1至9中任一项的三环化合物或其盐、或如权利要求11中结构限定的化合物或其盐用于生产化学基质或用于生产测试元件的用途。
20.根据权利要求1至9中任一项的三环化合物或其盐、如权利要求11中结构限定的化合物或其盐、或根据权利要求10至15中任一项的化学基质的用途，其用于制备测定测试样品中被分析物的量的测试元件，所述测定包括
a）使所述测试样品与所述三环化合物、所述化合物或所述化学基质接触，
b）估算在所述测试样品存在下由所述三环化合物、所述化合物或所述化学基质释放或消耗的氧化还原当量物的量，并
c）由此测定所述测试样品中的被分析物的量。
21.用于测定样品中被分析物的量的系统，其包括
a）根据权利要求16的测试元件和
b）包括传感器的装置，所述传感器用于测量所述测试元件中释放或消耗的氧化还原当量物的量。
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