JPH066577B2 - 新規なトリアリールイミダゾール誘導体 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の利用分野〕 本発明は、酸化性物質又はペルオキシダーゼ様物質の定
量の際の発色成分として有用な、新規なトリアリールイ
ミダゾール誘導体に関する。

〔発明の背景〕

生体成分、例えば血液や尿などの体液成分を測定するこ
とは、その変動が疾病と大きく関連しているため、疾患
の診断、病態の解明、治療経過の判定を行なう上で、必
須なものとなっている。例えば、血液中のコレステロー
ル、トリグリセライド、グルコース、尿酸、リン脂質、
胆汁酸、モノアミンオキシダーゼなどを始め、非常に多
種類の微量成分の測定法が開発されており、疾病の診断
上役立っていることは周知の通りである。

現在、血清成分の測定法としては、それが酵素以外のも
のである場合には、目的成分に特異的に作用する酵素を
用い、また、目的成分が酵素の場合には、その基質とな
るべき化合物を用いて、夫々酵素反応を行ない、これに
よる生成物を測定して目的成分量を求める、所謂“酵素
法”が一般に広く普及している。なかでも、H₂O₂生成酵
素、例えば、オキシダーゼを働かせて目的成分に相当す
るH₂O₂を生成させ、これをペルオキシダーゼ、及び発色
成分である被酸化性呈色試薬を用いて発色系に導き、こ
れを比色定量することにより目的成分量を求める方法
が、被酸化性呈色試薬の開発と相まって増加しつつあ
る。例えば、コレステロール−コレステロールオキシダ
ーゼ、トリグリセライド−リポプロテインリパーゼ−グ
リセロールオキシダーゼ、尿素−ウリカーゼなどの組合
せで発生するH₂O₂を、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、被
酸化性呈色試薬を用いて発色系に導き、その呈色の吸光
度を測定することにより目的成分量を求める方法であ
る。この方法に於て用いられる発色成分である被酸化性
呈色試薬の代表的なものとしては、４−アミノアンチピ
リンと、フェノール系化合物又はＮ，Ｎ−ジ置換アニリ
ン系化合物とを組合せた被酸化性呈色試薬、３−メチル
ベンゾチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）とアニリン
系化合物との組合せ試薬、２，２′−アジノビス（３−
エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴ
Ｓ）、トリフェニルメタン系ロイコ色素、ベンジジン誘
導体、ｏ−トリジン誘導体、ジフェニルアミン誘導体、
ｏ−フェニレンジアミン等が挙げられる。しかしなが
ら、これら従来から用いられている被酸化性呈色試薬
は、ジフェニルアミン誘導体を除いていずれもその呈色
波長が７００nm以下であり、ビリルビン、ヘモグロビン
等の血清成分の影響を受け易く（尿中成分測定時には尿
中の色素体の影響を受け易い）、又、４−アミノアンチ
ピリンとの組合せ試薬やトリフェニルメタン系ロイコ色
素の一部を除いて、いずれも色原体の安定性が低い等の
問題点を有する。一方、比較的色原体の安定性が良く、
又呈色波長が比較的長波長側にある色原体として染料前
駆体（ロイコ色素）のトリアリールイミダゾール誘導体
が開示されている。（特公昭５７−５５１９号公報、特
公昭５７−２６１１８号公報、特開昭５８−４５５５７
号公報、米国特許第３２９７７１０号明細書等） しかしながら、これら既存のトリアリールイミダゾール
誘導体は、いずれもそのフェニル基の一つに−ＯＨ基を
有し、 が となることにより呈色するものであって、その呈色波長
はいずれも依然として７００nm以下である。従って、こ
れらのトリアリールイミダゾール誘導体にしても、血液
や尿など生体試料中の微量成分の測定に於ける発色成分
として用いて未だ充分満足のいくものであるとは言えな
い。

〔発明の目的〕

本発明の目的は、上記した如き従来法の問題点を解決し
た、極大吸収波長が７００nm以上で、且つ色原体が安定
である新規な被酸化性呈色試薬の開発にある。

〔発明の構成〕

本発明は、下記一般式〔Ｉ〕 （式中、Ｒ^１〜Ｒ^６は夫々独立して低級アルキル基を表
わし、Ｘ^１〜Ｘ^３は夫々独立して水素原子、低級アルキ
ル基又は低級アルコキシ基を表わす。但し、Ｘ^１〜Ｘ^３
のうち少なくとも一つは低級アルキル基又は低級アルコ
キシ基を表わす。）で示されるトリアリールイミダゾー
ル誘導体、の発明である。

即ち、本発明は上記一般式〔１〕で示されるトリアリー
ルイミダゾール誘導体が、いずれもその呈色波長が850n
m以上の長波長側にあり、しかも、色原体として極めて
安定であることを本発明者らが初めて見出し、これを血
清や尿など生体試料中の微量成分の測定に於ける発色成
分として用いることにより、上記した本発明の目的を達
成し得ることを見出して本発明を完成するに到ったもの
である。

一般式〔Ｉ〕で示される本発明のトリアリールイミダゾ
ール誘導体に於て、Ｒ^１〜Ｒ^６で表わされる低級アルキ
ル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル
基、ブチル基等が挙げられる。また、Ｘ^１〜Ｘ^３として
は、水素原子、例えばメチル基、エチル基、プロピル
基、ブチル基等の低級アルキル基、例えばメトキシ基、
エトキシ基、プロポキシ基等の低級アルコキシ基が挙げ
られるが、Ｘ^１〜Ｘ^３のうち少なくとも一つは低級アル
キル基又は低級アルコキシ基である。また、Ｘ^１〜Ｘ^３
の置換位置は、夫々オルト位、又はパラ位の何れにても
よい。

本発明化合物は、酸化により次の如き構造の色素を生成
する。

（式中、Ｒ^１〜Ｒ^６及びＸ^１〜Ｘ^３は前記と同じ。但
し、Ｘ^１〜Ｘ^３のうち少なくとも一つは低級アルキル基
又は低級アルコキシ基を表わす。）。

本色素は、驚くべきことに既存のトリアリールイミダゾ
ール誘導体に於て になることにより生ずる色素よりもその呈色波長が更に
長波長側にシフトし、極大吸収波長はいずれも８５０ｎ
ｍ以上となる。

表１に、一般式〔Ｉ〕で示される本発明化合物の具体例
数例と、その呈色時の極大吸収波長を示すが、本発明化
合物はこれらに限定されるものではない。

一般式〔Ｉ〕で示される本発明化合物は、公知の方法、
例えば、米国特許第３２９７７１０号明細書に記載の方
法に準じて容易に合成することができる。

即ち、例えば、Organic Syntheses Vol.５１１１頁 １
９７３年に記載の方法に準じて、式〔III〕で示される
エタンジオンを合成し、 次いで、これをＲ¹−ＣＨＯ（Ｒ¹は前記と同じ）なるア
ルデヒド類及び酢酸アンモニウムと酢酸溶媒中数時間加
熱（要すれば還流）反応させた後、常法に従って、中
和、晶出、取、洗浄、乾燥等の後処理を行うことによ
り、目的とするトリアリールイミダゾール誘導体が得ら
れる。

本発明のトリアリールイミダゾール誘導体は、酸化性物
質の定量やペルオキシダーゼ様物質の定量に於ける発色
成分として有効に用い得るが、とりわけ酵素反応により
生成した過酸化水素をペルオキシダーゼの存在下発色系
に導き、その呈色を測定することにより行う生体試料中
の微量成分の定量に於ける発色成分として特に有効に使
用し得る。

即ち、本発明のトリアリールイミダゾール誘導体を発色
成分として用いる酸化性物質の定量法は、基質、又は酵
素反応により生成した物質に酸化酵素を作用させ生成す
る過酸化水素を定量することにより行う生体試料中の基
質又は酵素活性の定量法として特に効果的に使用し得
る。

本発明のトリアリールイミダゾール誘導体を発色成分と
して用いる定量法（以下、本発明に係る定量法と略記す
る。）により測定可能な生体試料中の微量成分として
は、例えば、コレステロール、グルコース、グリセリ
ン、トリグリセライド、遊離脂肪酸、尿酸、リン脂質、
胆汁酸、モノアミンオキシダーゼ、グアナーゼ、コリン
エステラーゼ等が挙げられるが、これらに限定されるも
のではなく、酵素反応により生成する過酸化水素を定量
することによって測定が可能な生体成分は全て定量可能
である。

本発明に係る定量法による生体成分の定量に於て、過酸
化水素を生成させる酵素として用いられる酸化酵素（オ
キシダーゼ）及びその他の目的で用いられる酵素類並び
に酵素反応に関与する基質及びその他の物質の種類及び
使用量は被酸化性呈色試薬を用いる自体公知の生体成分
の定量法に準じて夫々測定対象となる物質に応じて適宜
選択すればよい。又、本発明に係る過酸化水素の定量法
に於て用いられるペルオキシダーゼとしては、その起
源、由来に特に限定はなく、植物、動物、微生物起源の
ペルオキシダーゼ又はペルオキシダーゼ様物質が、一種
若しくは要すれば二種以上組合せて用いられる。又、そ
の使用量は目的に応じて適宜定められ、特に限定されな
い。

本発明に係る定量法による生体成分の定量は、通常、pH
４．０〜１０．０、より好ましくはpH６．０〜8.0で実
施される。用いられる緩衝剤としては、リン酸塩、クエ
ン酸塩、ホウ酸塩、炭酸塩、トリス緩衝液、グッド(Goo
d′s)緩衝液などが挙げられるが、特にこれらに限定さ
れない。

本発明のトリアリールイミダゾール誘導体は、過酸化水
素等酸化性物質の定量に有効に用い得るが、又、これと
過酸化水素とを組み合わせることによりペルオキシダー
ゼ様物質の定量を行うことも可能である。ペルオキシダ
ーゼ様物質としては、ペルオキシダーゼそのものの他、
ヘモグロビンその他のヘム化合物が挙げられる。

即ち、本発明のトリアリールイミダゾール誘導体は、例
えば、ペルオキシダーゼを標識化合物に用いた酵素免疫
測定法にも応用可能であり、又、血清中のヘモグロビン
を過酸化水素若しくは過硼素酸ナトリウムのような酸化
性物質を用いて測定する場合などにも有効に使用し得
る。

以下に実施例を挙げるが、本発明はこれら実施例により
何ら制約を受けるものではない。

〔実施例〕

実施例１． ２−（４−ジエチルアミノフェニル）−
４，５−ビス（４−ジエチルアミノ−２−メチル−フェ
ニル）イミダゾール（本発明化合物(2)）の合成 (i) １，２−ビス（４−ジエチルアミノ−２−メチル
−フェニル）エタン−１，２−ジオンの合成 塩化アルミニウム（無水）６．７ｇに二硫化炭素２０ml
を加え氷冷下、Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｍ−トルイジン22ｇ
を滴下した。さらに攪拌下、氷冷しながらオキザリルク
ロリド１．５ｇを滴下し、６０分間攪拌反応させた。反
応後、水５０ml及びクロロホルム１００mlを加え、分液
して得たクロロホルム層を減圧、濃縮して結晶を析出せ
しめた。析出した結晶を取し酢酸エチルから再結晶し
て黄色の目的物６．０ｇを得た。

(ii) ２−（４−ジエチルアミノフェニル）−４，５−
ビス（４−ジエチルアミノ−２−メチル−フェニル）イ
ミダゾールの合成 (i)で得た１，２−ビス（４−ジエチルアミノ−２−メ
チル−フェニル）エタン−１，２−ジオン１．５ｇと４
−ジエチルアミノベンズアルデヒド１．０ｇ酢酸アンモ
ニウム５ｇを酢酸３０ml中で２時間加熱還流して反応さ
せた。冷却後水６０mlを加え氷冷下アンモニア水で中和
したところ結晶が析出した。析出した結晶を取し、水
洗、乾燥後酢酸エチルから再結晶し白色の目的化合物
０．５ｇを得た。

ＮＭＲ（ＴＭＳ、ＣＤＣｌ_３）δppm：１．１０（１８
Ｈ，ｔ，−Ｃ−ＣＨ_３ ），１．９０（１Ｈ，ｓ， ３．１〜３．４（１２Ｈ，broad，−ＣＨ_２ −ＣＨ₃），
6.4〜7.2（１０Ｈ、broad， ３４００，２９６０，２６３０，１７０５，１６４５，
１６０５，１５２０。元素分析値C₃₅H₄₇N₅として 計算値（％）：C78.17,H8.81,N13.02 実測値（％）：C78.28,H8.84,N12.97 酸化呈色時のλmax＝８６０nm（ε＝95000） 実施例２． ２−（４−ジエチルアミノ−３−メトキシ
フェニル）−４，５−ビス（４−ジエチルアミノ−２−
メチル−フェニル）イミダゾール（本発明化合物(3)）
の合成 実施例１の(i)で得た１，２−ビス（４−ジエチルアミ
ノ−２−メチル−フェニル）エタン−１，２−ジオン
１．５ｇと４−ジエチルアミノ−３−メトキシベンズア
ルデヒド１．０ｇ、酢酸アンモニウム５ｇを酢酸３０ml
中で２時間加熱還流して反応させた。冷却後水６０mlを
加え、氷冷下アンモニア水で中和したところ結晶が析出
した。析出した結晶を取し水洗乾燥後ヘキサンで処理
して白色の目的化合物０．６ｇを得た。

３４２０，２９６０，１６４０，１６１０，１５２０ 元素分析値 C₃₆H₄₉N₅Oとして、 計算値（％）：C76.15,H8.70,N12.33 実測値（％）：C76.10,H8.74,N12.28 酸化呈色時のλmax＝８５０nm 実施例３ 実施例１に於ける４−ジエチルアミノベンズアルデヒド
に代えて４−ジメチルアミノベンズアルデヒドを用い、
実施例１と同様に反応を行い２−（４−ジメチルアミノ
フェニル）−４，５−ビス（４−ジエチルアミノ−２−
メチル−フェニル）イミダゾール（本発明化合物(1)）
を得た。

３４００，２８８０，１６０５，１５２０，１５１０ 元素分析値 C₃₃H₄₃N₅として 計算値（％）：C77.76,H8.50,N13.74 実測値（％）：C77.90,H8.57,N13.69 酸化呈色時のλmax＝８５５nm 比較例 実施例１に於けるＮ，Ｎ−ジエチル−ｍ−トルイジンに
代えてＮ，Ｎ−ジエチルアニリンを用い、及び４−ジエ
チルアミノベンズアルデヒドに代えて４−ジメチルアミ
ノベンズアルデヒドを用い、実施例１と同様に反応を行
い２−（４−ジメチルアミノフェニル）−４，５−ビス
（４−ジエチルアミノフェニル）イミダゾールを得た。

３４００，２９６０，１６４０，１６０５，１５２０ 元素分析値 C₃₁H₃₉N₅として 計算値（％）：C77.30,H8.16,N14.54 実測値（％）：C77.15,H8.20,N14.46 酸化呈色時のλmax＝８２０nm 参考例１． 過酸化水素の定量 (1) 試薬 ５０ｍmol／リン酸緩衝液（pH７．０）に
ペルオキシダーゼ２０００Ｕ／、本発明化合物(3)１
００μmol／の濃度になるように調製した。

(2) 試料 市販過酸化水素水を蒸留水で希釈し、２．
０，１．５，１．０，０．５ｍmol／になるように調
製した。

(3) 測定操作 各試料液及び蒸留水各々２０μに試
薬３．０mlを加え、３７℃で５分間加温し、８５０nmの
吸光度を盲検を対照に測定した。

各過酸化水素濃度に対してプロットした吸光度を結ぶ検
量線は、第１図に示されるように、原点を通る直線とな
り、検量線は良好な定量性を示している。

参考例２． 尿酸の定量 (1) 試薬 ５０ｍmol／ＭＥＳ〔２−（Ｎ−モルホリ
ノ）エタンスルホン酸〕緩衝液（pH６．５）にウリカー
ゼ１００Ｕ／、ペルオキシダーゼ２０００Ｕ／、本
発明化合物(3)１００μmol／の濃度になるように調製
した。

(2) 試料 尿酸を蒸留水で１０，７．５，５．２５mg
／dlになるように溶解し調製した。

(3) 測定操作 各試料液及び蒸留水各５０μに試薬
３．０mlを加え、３７℃で５分間加温し８５０nmの吸光
度を盲検を対照に測定した。

各尿酸濃度に対してプロットした吸光度を結ぶ検量線
は、第２図に示されるように、原点を通る直線となり、
検量線は良好な定量性を示している。

〔発明の効果〕

以上述べた如く、本発明の新規トリアリールイミダゾー
ル誘導体は、いずれもその呈色時の極大吸収波長が、８
００nm以上と長波長側にある為、血清、尿等生体試料中
の微量成分の定量に於ける発色成分としてこれを用いた
場合には、試料中に共存する有色の妨害物質の影響を全
く受けずに測定を行うことができるという点に顕著な効
果を奏するものであり、斯業に貢献するところ大なるも
のである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、参考例１に於て得られた検量線を表わし、横
軸の各過酸化水素濃度（ｍmol／）について得られた
吸光度を縦軸に沿ってプロットした点を結んだものであ
る。 第２図は、参考例２に於て得られた検量線を表わし、横
軸の各尿酸濃度（mg／dl）について得られた吸光度を縦
軸に沿ってプロットした点を結んだものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 Ｃｈｅｍ Ａｂ、第74巻 第22号 （1971）要約番号 119391ｗ Ｃｈｅｍ Ａｂ、第72巻 第17号 （1970）要約番号 89636ｕ

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】一般式［Ｉ］ （式中、Ｒ^１〜Ｒ^６は夫々独立して低級アルキル基を表
   わし、Ｘ^１〜Ｘ^３は夫々独立して水素原子、低級アルキ
   ル基又は低級アルコキシ基を表わす。但し、Ｘ^１〜Ｘ^３
   のうち少なくとも一つは低級アルキル基又は低級アルコ
   キシ基を表わす。）で示されるトリアリールイミダゾー
   ル誘導体。