JP2819258B2 - 新規水溶性テトラゾリウム塩化合物 - Google Patents
新規水溶性テトラゾリウム塩化合物Info
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- JP2819258B2 JP2819258B2 JP16305095A JP16305095A JP2819258B2 JP 2819258 B2 JP2819258 B2 JP 2819258B2 JP 16305095 A JP16305095 A JP 16305095A JP 16305095 A JP16305095 A JP 16305095A JP 2819258 B2 JP2819258 B2 JP 2819258B2
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は新規な水溶性テトラゾリ
ウム塩化合物に関し、特に脱水素酵素と反応させて生成
したホルマザンの吸光度により脱水素酵素並びに基質を
定量分析する方法に関するものである。
ウム塩化合物に関し、特に脱水素酵素と反応させて生成
したホルマザンの吸光度により脱水素酵素並びに基質を
定量分析する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】乳酸脱水素酵素（以下、ＬＤＨと略称す
る）、アルコール脱水素酵素、グルタミン酸脱水素酵素
などの各種脱水素酵素は従来テトラゾリウム塩化合物を
用いて定量分析が行なわれていた。
る）、アルコール脱水素酵素、グルタミン酸脱水素酵素
などの各種脱水素酵素は従来テトラゾリウム塩化合物を
用いて定量分析が行なわれていた。
【０００３】すなわち、テトラゾリウム塩化合物は、こ
れら各種脱水素酵素の作用により遊離した水素を中間電
子運搬体を介して受容しホルマザンとなる。そのホルマ
ザンの吸光度を測定することにより脱水素酵素を定量す
ることができる。
れら各種脱水素酵素の作用により遊離した水素を中間電
子運搬体を介して受容しホルマザンとなる。そのホルマ
ザンの吸光度を測定することにより脱水素酵素を定量す
ることができる。
【０００４】特に、これらの脱水素酵素のうちＬＤＨは
全ての体細胞に分布し、特に心筋、肝臓、骨格筋、腎臓
に多く、心筋梗塞、悪性腫瘍、肝疾患、進行性筋萎縮、
血管内溶血、巨赤芽球性貧血などの疾患の場合には、血
清ＬＤＨ活性が著しく上昇することが知られている。従
って血中のＬＤＨ活性を測定することにより、臨床上、
診断に対する極めて有意義な知見を得ることができる。
全ての体細胞に分布し、特に心筋、肝臓、骨格筋、腎臓
に多く、心筋梗塞、悪性腫瘍、肝疾患、進行性筋萎縮、
血管内溶血、巨赤芽球性貧血などの疾患の場合には、血
清ＬＤＨ活性が著しく上昇することが知られている。従
って血中のＬＤＨ活性を測定することにより、臨床上、
診断に対する極めて有意義な知見を得ることができる。
【０００５】また、近年、血中の尿酸や胆汁酸の測定に
おいても、より生体成分の妨害を受けにくい脱水素酵素
を用いる方法が望まれている。
おいても、より生体成分の妨害を受けにくい脱水素酵素
を用いる方法が望まれている。
【０００６】この目的の水素受容体としては、従来３，
３’−［３，３’−ジメトキシ−（１，１’−ビフェニ
ル）−４，４’−ジイル］−ビス［２−（４−ニトロフ
ェニル）−５−フェニル−２Ｈテトラゾリウム塩化物］
（以下ニトロＴＢと略称する）などが一般的に用いられ
ている。
３’−［３，３’−ジメトキシ−（１，１’−ビフェニ
ル）−４，４’−ジイル］−ビス［２−（４−ニトロフ
ェニル）−５−フェニル−２Ｈテトラゾリウム塩化物］
（以下ニトロＴＢと略称する）などが一般的に用いられ
ている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、このニ
トロＴＢが水素を受容して生じるホルマザンは水に溶け
ず、実用上不便であった。特に自動分析においては、生
成したホルマザンがチューブやセルなどの計測系に付着
する難点があった。これらの欠点を解決するためには、
水溶性のホルマザンを生成するテトラゾリウム塩化合物
を使用することが必要となってきた。
トロＴＢが水素を受容して生じるホルマザンは水に溶け
ず、実用上不便であった。特に自動分析においては、生
成したホルマザンがチューブやセルなどの計測系に付着
する難点があった。これらの欠点を解決するためには、
水溶性のホルマザンを生成するテトラゾリウム塩化合物
を使用することが必要となってきた。
【０００８】このような問題を解決するために、水溶性
のテトラゾリウム化合物がいくつか提案されている。し
かしながら、いずれもホルンマザンの極大吸収波長が４
００〜５００ｎｍとニトロＴＢのホルマザン（５５０ｎ
ｍ）より短いため、ビリルビンやヘモグロビンなどの生
体成分の干渉を受け、実用化は困難であった。
のテトラゾリウム化合物がいくつか提案されている。し
かしながら、いずれもホルンマザンの極大吸収波長が４
００〜５００ｎｍとニトロＴＢのホルマザン（５５０ｎ
ｍ）より短いため、ビリルビンやヘモグロビンなどの生
体成分の干渉を受け、実用化は困難であった。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、溶解性の
良好なホルマザンを生じさせる化合物についてさらに研
究を重ねた結果、上記とは異なる特定の水溶性テトラゾ
リウム化合物が優れた水素受容体で、且つこのものから
生じるホルマザンが水溶性で、長波長の極大吸収をも
ち、自動分析装置への付着や沈殿を起こさず実用化が可
能なことを見出した。
良好なホルマザンを生じさせる化合物についてさらに研
究を重ねた結果、上記とは異なる特定の水溶性テトラゾ
リウム化合物が優れた水素受容体で、且つこのものから
生じるホルマザンが水溶性で、長波長の極大吸収をも
ち、自動分析装置への付着や沈殿を起こさず実用化が可
能なことを見出した。
【００１０】すなわちこのような化合物は、一般式
（１）、
（１）、
【化３】 （１）（式中、Ｒはフェニル又はベンゾチアゾール、た
だし、フェニルの場合はニトロ基、シアノ基、ハロ基、
カルボキシル基、スルホン基の置換基をもってもよく、
ベンゾチアゾールの場合はニトロ基、メチル基、メトキ
シ基の置換基をもってもよい。またｎは２、３、４、５
である）で示される水溶性テトラゾリウム塩化合物であ
る。
だし、フェニルの場合はニトロ基、シアノ基、ハロ基、
カルボキシル基、スルホン基の置換基をもってもよく、
ベンゾチアゾールの場合はニトロ基、メチル基、メトキ
シ基の置換基をもってもよい。またｎは２、３、４、５
である）で示される水溶性テトラゾリウム塩化合物であ
る。
【００１１】上記一般式（１）から生じるホルマザンは
５１０〜５６０ｎｍに極大吸収を有し、ビリルビンやヘ
モグロビンなどの生体成分の妨害を受け難く、安定した
測定が可能であり、臨床検査上有意義である。
５１０〜５６０ｎｍに極大吸収を有し、ビリルビンやヘ
モグロビンなどの生体成分の妨害を受け難く、安定した
測定が可能であり、臨床検査上有意義である。
【００１２】本発明の前記一般式（１）の化合物は常法
によって製造することができる。例えば次の一般式
（２）
によって製造することができる。例えば次の一般式
（２）
【００１３】
【化４】 （２）で示されるヒドラジンに一般式（３）
【００１４】
【化５】 （３）で示されるアルデヒドをアルコール溶液中で反応
させて、一般式（４）
させて、一般式（４）
【００１５】
【化６】 （４）で示されるヒドラゾンを得、次いで対応するジア
ゾニウム塩を有機溶媒／水中、塩基性条件下で反応させ
て、一般式（５）
ゾニウム塩を有機溶媒／水中、塩基性条件下で反応させ
て、一般式（５）
【００１６】
【化７】 （５）で示されるホルマザンを得る。
【００１７】ここで塩基性化剤としては水酸化ナトリウ
ム、水酸化カリウムなどが用いられる。
ム、水酸化カリウムなどが用いられる。
【００１８】次いで得られた一般式（５）のホルマザン
を次亜塩素酸ソーダなどの酸化剤を用いアルコール溶媒
中で酸化し、前記一般式（１）のテトラゾリウム塩化合
物を得ることができる。
を次亜塩素酸ソーダなどの酸化剤を用いアルコール溶媒
中で酸化し、前記一般式（１）のテトラゾリウム塩化合
物を得ることができる。
【００１９】
【実施例】以下の実施例においては一般式（１）のＲが
ベンゾチアゾールでｎが２の化合物（化合物ａ）及びＲ
が４−ニトロフェニルでｎが２の化合物（化合物ｂ）を
合成し、還元型ニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチ
ド（以下ＮＡＤＨと略記する）の定量及びＬＤＨを用い
た乳酸の定量を示すが、本発明はその利用につきこれら
の実施例に限定されるものではない。
ベンゾチアゾールでｎが２の化合物（化合物ａ）及びＲ
が４−ニトロフェニルでｎが２の化合物（化合物ｂ）を
合成し、還元型ニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチ
ド（以下ＮＡＤＨと略記する）の定量及びＬＤＨを用い
た乳酸の定量を示すが、本発明はその利用につきこれら
の実施例に限定されるものではない。
【００２０】実施例１ （化合物ａの合成）タウリン７５．１ｇを水５００ｍｌ
に懸濁させ、これに水酸化ナトリウム水溶液（ＮａＯＨ
２４ｇ／水３００ｍｌ）の３分の２を加え溶解させた。
これを６０℃に加温し、２−ブロモエタンスルホン酸ナ
トリウム水溶液（ブロモエタンスルホン酸ナトリウム１
５３．７ｇ／水４００ｍｌ）を滴下した。その後、残り
の水酸化ナトリウム水溶液を滴下し、一夜６０℃で撹拌
した。水を留去後減圧乾燥し、ジ（スルホエチル）アミ
ンを得た。
に懸濁させ、これに水酸化ナトリウム水溶液（ＮａＯＨ
２４ｇ／水３００ｍｌ）の３分の２を加え溶解させた。
これを６０℃に加温し、２−ブロモエタンスルホン酸ナ
トリウム水溶液（ブロモエタンスルホン酸ナトリウム１
５３．７ｇ／水４００ｍｌ）を滴下した。その後、残り
の水酸化ナトリウム水溶液を滴下し、一夜６０℃で撹拌
した。水を留去後減圧乾燥し、ジ（スルホエチル）アミ
ンを得た。
【００２１】別にｐ−ホルミル安息香酸５８．６ｇを２
５０ｍｌの塩化チオニル中で２時間加熱還流した。反応
液を濃縮後、石油エーテルで結晶化し、９０％の収率で
酸クロリドを得た。
５０ｍｌの塩化チオニル中で２時間加熱還流した。反応
液を濃縮後、石油エーテルで結晶化し、９０％の収率で
酸クロリドを得た。
【００２２】先のジ（スルホエチル）アミンを水７００
ｍｌに溶解し、これにクロロホルム７００ｍｌを加え
た。０℃に冷却し、強撹拌下に、上記酸クロリドのクロ
ロホルム溶液と２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液とを反応液
のｐＨが９〜１０を保つよう滴下した。反応終了後、水
相を分取し２Ｎ塩酸を加えｐＨ２とした。濃縮後、イソ
プロパノールを加えて結晶化させアルデヒドを３６％の
収率で得た。
ｍｌに溶解し、これにクロロホルム７００ｍｌを加え
た。０℃に冷却し、強撹拌下に、上記酸クロリドのクロ
ロホルム溶液と２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液とを反応液
のｐＨが９〜１０を保つよう滴下した。反応終了後、水
相を分取し２Ｎ塩酸を加えｐＨ２とした。濃縮後、イソ
プロパノールを加えて結晶化させアルデヒドを３６％の
収率で得た。
【００２３】２−ヒドラジノベンゾチアゾール９．７ｇ
と上記アルデヒド２０ｇをメタノールに混合し、３時間
加熱還流した。沈殿物を濾取し、ヒドラゾンを５１％の
収率で得た。
と上記アルデヒド２０ｇをメタノールに混合し、３時間
加熱還流した。沈殿物を濾取し、ヒドラゾンを５１％の
収率で得た。
【００２４】得られたヒドラゾン１２ｇを水５０ｍｌと
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド２００ｍｌに溶解し、−
２０℃に冷却した。これにｏ−ジアニシジンテトラゾホ
ウフッ化ナトリウム塩を加えた。この反応混合溶液を−
２０℃に保持しながら水酸化ナトリウム水溶液（ＮａＯ
Ｈ１．１ｇ／水２０ｍｌ）を滴下し、滴下終了後一夜室
温で撹拌した。
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド２００ｍｌに溶解し、−
２０℃に冷却した。これにｏ−ジアニシジンテトラゾホ
ウフッ化ナトリウム塩を加えた。この反応混合溶液を−
２０℃に保持しながら水酸化ナトリウム水溶液（ＮａＯ
Ｈ１．１ｇ／水２０ｍｌ）を滴下し、滴下終了後一夜室
温で撹拌した。
【００２５】反応混合液に塩酸を加え、ｐＨ２とした
後、メタノール１ｌを加えた。生じた沈殿物を濾取し、
得られた粗生成物は水−イソプロパノールから再沈精製
を３回行ない、６１％の収率でホルマザンを得た。
後、メタノール１ｌを加えた。生じた沈殿物を濾取し、
得られた粗生成物は水−イソプロパノールから再沈精製
を３回行ない、６１％の収率でホルマザンを得た。
【００２６】得られたホルマザン８ｇを水１ｌに溶解さ
せた後、濃塩酸３．９ｍｌ及び１２％次亜塩素酸ソーダ
水溶液２５ｇを加え、室温で一夜撹拌した。反応液を４
分の１まで濃縮し、これにイソプロパノール６００ｍｌ
を加えた。析出した沈殿（粗生成物）を濾取し、粗生成
物は水−イソプロパノールから再沈精製を３回行ない、
３０％の収率でテトラゾリウム塩を得た。
せた後、濃塩酸３．９ｍｌ及び１２％次亜塩素酸ソーダ
水溶液２５ｇを加え、室温で一夜撹拌した。反応液を４
分の１まで濃縮し、これにイソプロパノール６００ｍｌ
を加えた。析出した沈殿（粗生成物）を濾取し、粗生成
物は水−イソプロパノールから再沈精製を３回行ない、
３０％の収率でテトラゾリウム塩を得た。
【００２７】得られた化合物の元素分析結果を、同様に
して得られた化合物ｂと共に表１に示す。
して得られた化合物ｂと共に表１に示す。
【表１】
【００２８】実施例２ 化合物ａ０．１ｍＭ及び１−メトキシ−５−メチルフェ
ナジニウムメトスルフェート（以下１−メトキシＰＭＳ
と略称する）５μＭを含有する５０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ８．０）５ｍｌに、５ｍＭのＮＡＤＨをそれぞれ
０、２０、４０、６０、８０及び１００μｌ加え、５分
間室温で反応させた後吸光度を測定した。
ナジニウムメトスルフェート（以下１−メトキシＰＭＳ
と略称する）５μＭを含有する５０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ８．０）５ｍｌに、５ｍＭのＮＡＤＨをそれぞれ
０、２０、４０、６０、８０及び１００μｌ加え、５分
間室温で反応させた後吸光度を測定した。
【００２９】ＮＡＤＨ濃度と５６０ｎｍにおける吸光度
との関係を図１に示す。ＮＡＤＨと吸光度との間には原
点を通る直線性の検量線が得られた。
との関係を図１に示す。ＮＡＤＨと吸光度との間には原
点を通る直線性の検量線が得られた。
【００３０】実施例３ 化合物ａ０．１ｍＭ、１−メトキシＰＭＳ２０μＭ及び
β−ジホスホピリジンヌクレオチド酸化型４００μＭを
１００ｍＭＮ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスル
ホン酸バッファー（ｐＨ８．８）５ｍｌに溶解させた。
乳酸リチウムを各々０〜２００μＭ加え、５分間３０℃
でインキュベートした。これにＬＤＨ（２０Ｕ／ｍｌ）
を１００μｌ加え、１５分間３０℃でインキュベート
し、５６０ｎｍの吸光度を測定した。
β−ジホスホピリジンヌクレオチド酸化型４００μＭを
１００ｍＭＮ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスル
ホン酸バッファー（ｐＨ８．８）５ｍｌに溶解させた。
乳酸リチウムを各々０〜２００μＭ加え、５分間３０℃
でインキュベートした。これにＬＤＨ（２０Ｕ／ｍｌ）
を１００μｌ加え、１５分間３０℃でインキュベート
し、５６０ｎｍの吸光度を測定した。
【００３１】乳酸リチウム濃度と５６０ｎｍにおける吸
光度との関係を図２に示す。乳酸リチウム濃度と吸光度
との間には原点を通る直線性の検量線が得られた。
光度との関係を図２に示す。乳酸リチウム濃度と吸光度
との間には原点を通る直線性の検量線が得られた。
【００３２】
【発明の効果】本発明の水溶性テトラゾリウム化合物を
用いることにより、得られるホルマザンの水溶性が向上
し、測定機器への沈着がなく、また、最大吸収波長が長
波長であるため生体成分の干渉を受けず、自動分析装置
による測定が可能である。
用いることにより、得られるホルマザンの水溶性が向上
し、測定機器への沈着がなく、また、最大吸収波長が長
波長であるため生体成分の干渉を受けず、自動分析装置
による測定が可能である。
【図１】ＮＡＤＨの濃度と生成ホルマザンとの関係。
【図２】乳酸リチウムの濃度と生成ホルマザンの吸光度
との関係。
との関係。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｄ 277:62） (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C07D 257/04 C07D 417/14 C12Q 1/32 C07D 417/14 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
Claims (2)
- 【請求項１】 一般式（１）、 【化１】 （１）（式中、Ｒはフェニル又はベンゾチアゾール、た
だし、フェニルの場合はニトロ基、シアノ基、ハロ基、
カルボキシル基、スルホン基の置換基をもってもよく、
ベンゾチアゾールの場合はニトロ基、メチル基、メトキ
シ基の置換基をもってもよい。またｎは２、３、４、５
である）で示される新規水溶性テトラゾリウム塩化合
物。 - 【請求項２】 テトラゾリウム塩化合物として一般式
（１）、 【化２】 （１）（式中、Ｒはフェニル基又はベンゾチアゾール、
ただし フェニルの場合はニトロ基、シアノ基、ハロ
基、カルボキシル基、スルホン基の置換基をもってもよ
く、ベンゾチアゾールの場合はニトロ基、メチル基、メ
トキシ基の置換基をもってもよい。またｎは２、３、
４、５である）で示される水溶性テトラゾリウム塩化合
物を用いることを特徴とする脱水素酵素または酵素基質
の定量方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16305095A JP2819258B2 (ja) | 1995-06-07 | 1995-06-07 | 新規水溶性テトラゾリウム塩化合物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16305095A JP2819258B2 (ja) | 1995-06-07 | 1995-06-07 | 新規水溶性テトラゾリウム塩化合物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08333352A JPH08333352A (ja) | 1996-12-17 |
| JP2819258B2 true JP2819258B2 (ja) | 1998-10-30 |
Family
ID=15766227
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP16305095A Expired - Lifetime JP2819258B2 (ja) | 1995-06-07 | 1995-06-07 | 新規水溶性テトラゾリウム塩化合物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2819258B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6225074B1 (en) * | 1997-08-18 | 2001-05-01 | Dennis Wright | Direct chloramphenicol acetyl transferase assay |
| WO2017090631A1 (ja) * | 2015-11-24 | 2017-06-01 | 国立大学法人 東京大学 | 細胞外代謝物を検出するための蛍光プローブ及び当該蛍光プローブを用いるスクリーニング方法 |
-
1995
- 1995-06-07 JP JP16305095A patent/JP2819258B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH08333352A (ja) | 1996-12-17 |
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Legal Events
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