JPH04221393A - Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン誘導体、これを有効成分とするＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ活性測定用試薬及びこれを用いたＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ活性の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 【産業上の利用分野】本発明は、新規なＮ−アセチル−
β−Ｄ−グルコサミン誘導体、該誘導体を有効成分とす
るＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ活性測定
用試薬及び該誘導体を用いてＮ−アセチル−β−Ｄ−グ
ルコサミニダーゼ活性を効率よく、かつ正確に測定する
方法に関するものである。 【０００２】 【従来の技術】Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダ
ーゼ（以下、ＮＡＧａｓｅという）は、腎尿細管上皮に
多く含まれるリソソーム（Ｌｙｓｏｓｏｍｅ）中の酵素
の１つであり、糖蛋白やムコ多糖類の分解に関与してい
る。尿中ＮＡＧａｓｅは急性腎不全や糸球体腎炎などの
各種腎臓疾患や腎臓の術後においては上昇し、また糖尿
病においては、尿中ばかりでなく血清中ＮＡＧａｓｅも
上昇することが認められている。こういった各種腎臓疾
患の診断及び経過観察の一助として、また薬物の腎毒性
検討の指標としても、臨床及び動物実験面でＮＡＧａｓ
ｅの測定が注目されている。そして従来、ＮＡＧａｓｅ
活性の測定用基質としては、例えば　ｐ−ニトロフェニ
ル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド［Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，　２８，　７０２（１９７
２）］　及び　４−メチルウンベリフェリル−Ｎ−アセ
チル−β−Ｄ−グルコサミニド［Ｃｌｉｎｉｃａ．　Ｃ
ｈｉｍｉｃａ．　Ａｃｔａ．，　２４，　１８９（１９
６９）］、　ｍ−クレゾールスルホンフタレイニル−Ｎ
−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド［Ｃｌｉｎ．　Ｃ
ｈｅｍ．，　２９，　１７１３（１９８３）］が知られ
ている。 【０００３】しかしながら、これらの化合物をＮＡＧａ
ｓｅ活性の測定用基質として用いた場合は、酵素作用に
よって生成したアグリコンを定量する際、反応液の　ｐ
Ｈ　を１０〜１１　程度という高アルカリ性とする必要
があるために、一旦酵素反応を停止させて酵素活性を測
定するいわゆるエンドポイント法しか適用できず、酵素
活性測定法として最適のレイトアッセイ法を採用するこ
とができないなどの欠点を有している。最近、酵素反応
進行中に直接吸光度変化を計測して酵素活性を測定する
前記レイトアッセイ法が適用可能な基質として、２−ク
ロロ−４−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グ
ルコサミニド［Ｃｌｉｎ．　Ｃｈｅｍ．，　３４，　２
１４０（１９８８）］やソジオ−３，　３′−ジクロロ
フェノールスルホンフタレイニル−Ｎ−アセチル−β−
Ｄ−グルコサミニド（特開昭　６３−３０９１９９号）
が提案されている。しかしながら、これらはいずれもＮ
ＡＧａｓｅの至適　ｐＨである　４．５〜５．０　にお
いては十分な感度を示すことができず、また　２−クロ
ロ−４−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グル
コサミニドはＮＡＧａｓｅ活性測定に必要十分な量を溶
解させることが困難であるなどの欠点を有している。 【０００４】 【発明が解決しようとする問題点】本発明は、このよう
な従来のＮＡＧａｓｅ活性の測定用試薬及びそれを用い
る測定方法が有する欠点を克服し、ＮＡＧａｓｅ活性を
効率よく、かつ正確に測定し得る溶解性の優れた試薬と
して好適な新規化合物を提供するとともに、これを試薬
とした新規なＮＡＧａｓｅ活性の測定方法を提供するこ
とを目的としてなされたものである。 【０００５】 【問題を解決するための手段】本発明者らは、前記目的
を達成するために鋭意研究を重ねた結果、ＮＡＧａｓｅ
活性測定用試薬として、特定の新規なＮ−アセチル−β
−Ｄ−グルコサミン誘導体が極めて好適であり、これを
用いてＮＡＧａｓｅ活性を測定することにより、その目
的を達成し得ることを見出し、この知見に基づいて本発
明を完成するに至った。すなわち、本発明は、一般式（
Ｉ） 【化１】（式中のＲ１は水酸基、カルボキシル基、スル
ホン酸基若しくはリン酸基を有する炭素数　１〜４　の
置換アルキル基若しくはそのアルカリ金属塩、又は水酸
基、カルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基若しくは
前記置換アルキル基を有する置換フェニル基若しくはそ
のアルカリ金属塩、Ｒ２〜Ｒ４はそれぞれ独立して、水
素原子、ハロゲン原子、又はニトロ基を意味する）で表
されるＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン誘導体［以
下、化合物（Ｉ）という］、化合物（Ｉ）を有効成分と
するＮＡＧａｓｅ活性測定用試薬、及びＮＡＧａｓｅ含
有試料に、化合物（Ｉ）を加え、酵素反応によって生成
するアグリコン（フルオレセイン・モノエーテル類）を
定量することを特徴とするＮＡＧａｓｅ活性の測定方法
を提供するものである。 【０００６】以下、本発明について詳細に説明する。先
ず、化合物（Ｉ）において、Ｒ１の、水酸基、カルボキ
シル基、スルホン酸基若しくはリン酸基を有する炭素数
　１〜４　の置換アルキル基若しくはそのアルカリ金属
塩としては、例えばヒドロキシメチル、スルホメチル、
カルボキシメチル、ヒドロキシエチル、スルホエチル、
カルボキシエチル、ヒドロキシプロピル、スルホプロピ
ル、ヒドロキシブチル、スルホブチル、カルボキシブチ
ル、ジヒドロキシメチル、ジスルホキシメチル、ジカル
ボキシメチル、ジヒドロキシエチル、ジスルホキシエチ
ル、ジカルボキシエチルの基など、さらにはこれらのナ
トリウム塩、カリウム塩などが挙げられる。またＲ１の
、水酸基、カルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基若
しくは前記置換アルキル基を有する置換フェニル基若し
くはそのアルカリ金属塩としては、例えばヒドロキシフ
ェニル、スルホフェニル、カルボキシフェニル、ジヒド
ロキシフェニル、ジカルボキシフェニル、ジスルホフェ
ニル、ヒドロキシカルボキシフェニル、ヒドロキシスル
ホフェニル、トリヒドロキシフェニル、ヒドロキシメチ
ルフェニル、スルホメチルフェニル、カルボキシメチル
フェニル、ヒドロキシエチルフェニル、スルホエチルフ
ェニル、カルボキシエチルフェニルの基など、さらには
これらのナトリウム塩、カリウム塩などが挙げられる。 そしてまた該化合物（Ｉ）が置換基Ｒ１を有することに
より、その水に対する溶解性が向上することとなる。 【０００７】さらに、Ｒ２〜Ｒ４はそれぞれ独立して、
水素原子、ハロゲン原子（塩素、ヨウ素、フッ素若しく
は臭素原子）、又はニトロ基である。また、化合物（Ｉ
）には、フルオレセイン部位の　１　位炭素における　
２　種類の立体異性体が存在するが、そのいずれでもあ
るいはそれらの混合物でも有効に用いられる。そして化
合物（Ｉ）としては、例えば　６′−Ｏ−カルボキシメ
チル−２′，７′−ジクロロフルオレセイニル−Ｎ−ア
セチル−β−Ｄ−グルコサミニド、６′−Ｏ−ジカルボ
キシメチル−４′，５′−ジヨードフルオレセイニル−
Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド、６′−Ｏ−（
２−ヒドロキシエチル）−４′，５′−ジブロモ−２′
，７′−ジニトロフルオレセイニル−Ｎ−アセチル−β
−Ｄ−グルコサミニド、６′−Ｏ−（３−ホスホプロピ
ル）−フルオレセイニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グル
コサミニド、６′−Ｏ−（４−スルホブチル）−２′，
４′，５′，７′−テトラヨードフルオレセイニル−Ｎ
−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド、６′−Ｏ−（４
−ヒドロキシフェニル）−２′，４′，５′，７′−テ
トラブロモフルオレセイニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−
グルコサミニド、６′−Ｏ−（３−スルホフェニル）−
２′，４′，５′，７′−テトラヨード−４，５，６，
７−テトラクロロフルオレセイニル−Ｎ−アセチル−β
−Ｄ−グルコサミニド、６′−Ｏ−（２−ヒドロキシ−
４−カルボキシフェニル）−２′，７′−ジフルオロフ
ルオレセイニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニ
ド、６′−Ｏ−（３−ホスホメチルフェニル）−４′，
５′−ジブロモフルオレセイニル−Ｎ−アセチル−β−
Ｄ−グルコサミニド、６′−Ｏ−（４−カルボキシエチ
ルフェニル）−４，５，６，７−テトラクロロフルオレ
セイニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニドなど
、さらにはこれらのナトリウム塩、カリウム塩などが挙
げられる。 【０００８】次に、前記化合物（Ｉ）は、一般式（ＩＩ
）【化２】 （式中のＡｃはアセチル基、Ｙはハロゲン原子を意味す
る）で表されるハロゲノ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサ
ミン誘導体　［以下、化合物（ＩＩ）という］に、一般
式（ＩＩＩ） 【化３】 （式中のＲ１〜Ｒ４は前記と同じ意味をもつ）で表され
るフルオレセイン・モノエーテル類［以下、化合物（Ｉ
ＩＩ）という］を作用させた後、Ｏ−アセチル基を脱離
させることにより製造することができる（合成法は、例
えば特開平　１−２１１５９５　号公報などを参照）。 【０００９】そして前記化合物（ＩＩ）は、例えば市販
のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンにアセチルクロライ
ドあるいはアセチルブロマイドなどを作用させて製造す
ることができる［Ｊ．　Ｏｒｇ．　Ｃｈｅｍ．，　２７
，　１７９４（１９６２）］。該化合物（ＩＩ）として
は、例えば　１−クロロ−１−デオキシ−２，３，４，
６−テトラアセチル−α−Ｄ−グルコサミン、１−ブロ
モ−１−デオキシ−２，３，４，６−テトラアセチルα
−Ｄ−グルコサミンなどが挙げられる。また前記化合物
（ＩＩＩ）は、市販のフルオレセイン類、例えばフルオ
レセイン、２′，７′−ジクロロフルオレセイン、４′
，５′−ジブロモフルオレセイン、４′，５′−ジヨー
ドフルオレセイン、４，５，６，７−テトラクロロフル
オレセイン、　　　２′，４′，５′，７′−テトラヨ
ードフルオレセイン、４′，５′−ジブロモ−２′，７
′−ジニトロフルオレセイン、２′，４′，５′，７′
−テトラブロモ−４，５，６，７−テトラクロロフルオ
レセインなど、さらにはこれらのナトリウム塩、カリウ
ム塩などを用いて適宜の方法で合成することができる　
［例えば、Ｊ．　Ａｍ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．，　５
９，　１１２（１９３７）など］。 【００１０】そして該化合物（ＩＩＩ）としては、例え
ば　２′，７′−ジクロロフルオレセイン・カルボキシ
メチルエーテル、４′，５′−ジヨードフルオレセイン
・（ジカルボキシ）メチルエーテル、４′，５′−ジブ
ロモ−２′，７′−ジニトロフルオレセイン・２−ヒド
ロキシエチルエーテル、フルオレセイン・３−ホスホプ
ロピルエーテル、２′，４′，５′，７′−テトラヨー
ドフルオレセイン・４−スルホブチルエーテル、２′，
４′，５′，７′−テトラブロモフルオレセイン・４−
ヒドロキシフェニルエーテル、２′，４′，５′，７′
−テトラヨード−４，５，６，７−テトラクロロフルオ
レセイン・３−スルホフェニルエーテル、２′，７′−
ジフルオロフルオレセイン・２−ヒドロキシ−４−カル
ボキシフェニルエーテル、４′，５′−ジブロモフルオ
レセイン・３−ホスホメチルフェニルエーテル、４，５
，６，７−テトラクロロフルオレセイン・４−カルボキ
シエチルフェニルエーテルなど、さらにはこれらのナト
リウム塩、カリウム塩などが挙げられる。 【００１１】次に、化合物（Ｉ）の合成法につき例示す
る。先ず、化合物（ＩＩ）に、溶媒及び触媒の存在下で
化合物（ＩＩＩ）を作用させるのであるが、このときの
化合物（ＩＩＩ）に対する化合物（ＩＩ）の添加量は、
通常１〜５０　倍モル当量、好ましくは　５〜２０　倍
モル当量である。溶媒としては、ケトン類、例えばアセ
トン、メチルエチルケトンなど、ニトリル類、例えばア
セトニトリルなど、ハロゲン化炭化水素類、例えばジク
ロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタンなど、ジメ
チルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルアセトアミド（
ＤＭＡ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヘキサ
メチルホスホラミド（ＨＭＰＡ）などが挙げられ、これ
らを組合せて用いてもよいが、アセトニトリルが特に好
ましい。その量は、通常は化合物（ＩＩＩ）の重量の　
５〜１０００　倍量、好ましくは　５０〜５００　倍量
である。溶媒としては、銀塩、例えば　Ａｇ２Ｏ、　Ａ
ｇＣｌＯ４、　ＡｇＮＯ３、Ａｇ２ＣＯ３など、水銀塩
、例えば　ＨｇＯ、Ｈｇ（ＣＮ）２　など、カドミウム
塩、例えば　ＣｄＣＯ３、三級アミン類、例えばトリエ
チルアミン、トリブチルアミンなどが挙げられ、これら
を組合せて用いてもよいが、Ａｇ２Ｏ　が好ましい。そ
の量は通常、化合物（ＩＩ）の　１〜１０　倍モル当量
、好ましくは　１〜３　倍モル当量である。反応温度及
び反応時間は化合物（ＩＩ）、化合物（ＩＩＩ）、溶媒
及び触媒の種類によって異なるが、通常は　２０〜６０
℃で　１〜６０　時間連続して反応させる。 【００１２】こうして得られたものに塩基を作用させて
　Ｏ−アセチル基を脱離させることにより化合物（Ｉ）
が得られる。塩基としては、例えば　ＫＯＨ、　Ｋ２Ｃ
Ｏ３、　ＮａＯＨ、Ｎａ２ＣＯ３　などのアルカリ金属
塩、例えばナトリウムメチラート、ナトリウムフェノラ
ートなどのアルカリ金属のアルコラート及びアンモニア
などが挙げられ、ナトリウムメチラートが特に好ましい
。次いで、常法により精製操作を行なって目的の化合物
（Ｉ）を得ることができる。 精製法としては、例えば適宜の有機溶媒などを用いる析
出法、シリカゲル、ＯＤＳ（オクタデシルシリルシリカ
ゲル）などを用いるカラムクロマトグラフィーなどが挙
げられる。以上のようにして得られた化合物（Ｉ）は、
ＮＡＧａｓｅ活性の測定に極めて有用であり、この化合
物（Ｉ）を用いてＮＡＧａｓｅ活性をレイトアッセイ法
により高感度、高精度で測定することができる。 【００１３】ＮＡＧａｓｅを測定するための有利な系と
しては、例えば化合物（Ｉ）を　１〜２０　ｍＭ　及び
緩衝剤を　２〜２００　ｍＭ含有する系（ｐＨ４．０〜
６．０）などである。この系に用いられる緩衝剤として
は、例えばリン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩
、フタル酸塩などが挙げられる。また必要に応じて溶解
補助剤、安定化剤として、例えばグリセリン、トリトン
Ｘ−１００などの界面活性剤、クラウンエーテル類、シ
クロデキストリン類、グライコール類などを加えてもよ
い。本発明の試薬は、乾燥物あるいは溶解した形で用い
てもよく、薄膜状の担体、例えばシート、含浸性の紙な
どに含浸させて用いてもよい。このような本発明の試薬
を用いることにより、各種の試料に含有されるＮＡＧａ
ｓｅ活性を簡単な操作で正確に、かつ高感度で測定する
ことができる。 【００１４】次に、本発明のＮＡＧａｓｅ活性の測定法
の好適な１例について説明する。先ず、ＮＡＧａｓｅを
含む試料に、化合物（Ｉ）を　１〜２０　ｍＭ、好まし
くは　１〜５　ｍＭ　及び緩衝剤を添加した後、３０〜
６０　℃、ｐＨ　４．０〜６．０　の条件にて　１　分
以上、好ましくは　３〜３０　分間酵素反応させ、生成
するアグリコン（フルオレセイン・モノエーテル類）の
吸光度を直接分光光度計を用いて測定し、単位時間当り
の吸光度の変化量を求める。そして予め同様にして測定
したＮＡＧａｓｅ標品の吸光度変化量と対比させて試料
中のＮＡＧａｓｅ活性を算出する。本発明に用いられる
ＮＡＧａｓｅ含有試料については、ＮＡＧａｓｅを含有
するものであればよく、特に制限はないが、具体的には
微生物の培養液、植物の抽出液、あるいは動物の体液や
尿や組織及びそれらの抽出液などを用いることができる
。また緩衝剤としては、例えばリン酸塩、酢酸塩、クエ
ン酸塩、コハク酸塩、フタル酸塩などが挙げられる。そ
の他、必要に応じて還元物質の影響を少なくするために
、前処理や酸化剤の添加を行なってもよい。 【００１５】 【発明の効果】本発明の前記化合物（Ｉ）は、新規な化
合物であって、ＮＡＧａｓｅ活性測定用試薬として極め
て有用であり、このものを用いることにより、試料中に
含まれるグルコース、ビリルビン、ヘモグロビンなどの
影響を受けることなく、ＮＡＧａｓｅ活性を自動分析法
などにより精度よく、容易に測定することができる。 【００１６】 【実施例】以下に実施例を示して本発明をさらに詳細に
説明する。 実施例１ ソジオ−６′−Ｏ−カルボキシメチル−２′，７′−ジ
クロロフルオレセイニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グル
コサミニド（Ｒ１＝　ＣＨ２ＣＯ２Ｎａ、Ｒ２＝　Ｃｌ
、Ｒ３＝Ｒ４＝Ｈ）の製造　２′，７′−ジクロロフル
オレセイン　１０．０　ｇ（２５　ｍｍｏｌ）をメタノ
ール　２５０　ｍｌに溶解し、２８　％ナトリウムメチ
ラート−メタノール溶液　９．７５　ｍｌ（５０　ｍｍ
ｏｌ）を加え、室温で　３０　分間攪拌しながら反応さ
せた後、メタノールを減圧留去し、ジクロロフルオレセ
イン・２ナトリウム塩を得る。これをＮ，Ｎ−ジメチル
ホルムアミド　７５０　ｍｌ　に溶解し、ブロモ酢酸エ
チル　５．６　ｍｌ（５０　ｍｍｏｌ）を加え、８０　
℃で２　時間攪拌しながら反応させた後、Ｎ，Ｎ−ジメ
チルホルムアミドを減圧留去する。残渣に水　５００　
ｍｌを加え、沈殿物を濾取し、ジクロロフルオレセイン
・エトキシカルボメチルエステル・エトキシカルボメチ
ルエーテル　１２．７　ｇ　を得る。これをエタノール
（８００　ｍｌ）−水（２００　ｍｌ）に懸濁させ、２
Ｎ−水酸化ナトリウム　４０　ｍｌを加えて、室温で　
２　時間攪拌しながら反応させる。次いで、エタノール
を減圧留去し、水　５００　ｍｌ　を加え、さらに　２
Ｎ−塩酸　４０　ｍｌを加える。析出した結晶を濾取し
、乾燥すると、２′，７′−ジクロロフルオレセイン・
カルボキシメチルエーテル　８．５５　ｇ（収率：７４
．５　％）を得た。 【００１７】次に、１−クロロ−１−デオキシ−２，３
，４，６−テトラアセチル−α−Ｄ−グルコサミン　４
０　ｇ（１０９　ｍｍｏｌ）をアセトニトリル　２．５
　ｌ　に溶解し、これに、　２′，７′−ジクロロフル
オレセイン・カルボキシメチルエーテル　５．０　ｇ（
１０．９　ｍｍｏｌ）及び酸化銀（Ａｇ２Ｏ）２５．３
　ｇ（１０９　ｍｍｏｌ）を加え、５０　℃で　２０　
時間攪拌しながら反応させる。次いで、未反応の　Ａｇ
２Ｏ　を濾別し、濾液のアセトニトリルを留去した後、
シリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、クロロホ
ルム−メタノール混液（容量比　４：１）で溶出した区
分をクロロホルム−ジエチルエーテル混液から再結晶す
ると、６′−Ｏ−カルボキシメチル−２′，７′−ジク
ロロフルオレセイニル−２，３，４，６−テトラアセチ
ル−β−Ｄ−グルコサミニド　３．９３　ｇ（４．９９
　ｍｍｏｌ、収率　４５．８　％）を得た。 【００１８】融点：　２０８　℃（分解）紫外部・可視
部吸収スペクトル（ＭｅＯＨ）：吸収極大波長［λｍａ
ｘ］＝　２８２（ε＝９３００），２２８（ε＝５５１
００）ｎｍ赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ）：３４００
，１７５０，１６６０，１６２５，１６０５，１５６５
　ｃｍ−１核磁気共鳴スペクトル（２００　ＭＨｚ）（
ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）８．００−８．０５（２Ｈ
，ｍ），　７．７０−７．８５（２Ｈ，ｍ），　７．３
０−７．４０（２Ｈ，ｍ），　６．８３（１Ｈ，ｓ），
　６．８０　ａｎｄ　６．８１（１Ｈ，ｅａｃｈ　ｓ）
，　６．７３　ａｎｄ　６．７４（１Ｈ，ｅａｃｈ　ｓ
），　５．４６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），　５．
２２（１Ｈ，ｂｒｔ，Ｊ＝９．８Ｈｚ），　４．９７（
１Ｈ，ｂｒ　ｔ，Ｊ＝９．５Ｈｚ），　４．４７（２Ｈ
，ｂｒ　ｓ），　４．１０−４．３０（４Ｈ，ｍ），　
２．０８（３Ｈ，ｓ），　２．０１（３Ｈ，ｓ），　１
．９５（３Ｈ，　ｓ），１．７４　ａｎｄ　１．７６（
３Ｈ，ｅａｃｈ　ｓ）なお、該　６′−Ｏ−カルボキシ
メチル−　２′，７′−ジクロロフルオレセイニル−２
，３，４，６−テトラアセチル−β−Ｄ−グルコサミニ
ドは、フルオレセイン部位の　１　位炭素における　２
　種類の立体異性体の混合物であり、核磁気共鳴スペク
トルよりその存在比は約　１：１　であった。　 【００１９】このようにして得た　６′−Ｏ−カルボキ
シメチル−　　２′，７′−ジクロロフルオレセイニル
−２，３，４，６−テトラアセチル−β−Ｄ−グルコサ
ミニド　２．４　ｇ（３．０５　ｍｍｏｌ）をメタノー
ル（９６　ｍｌ）−クロロホルム（４８　ｍｌ）混液に
溶解し、これに２８　％ナトリウムメチラート−メタノ
ール溶液　１．２　ｍｌ（６．２　ｍｍｏｌ）を加え、
室温で　３０　分間攪拌しながら反応させる。次いで、
メタノール−クロロホルムを減圧留去した後、ＯＤＳ（
ＹＭＣ・ＧＥＬ　ＯＤＳ−ＡＱ　１２０−Ｓ５０）カラ
ムクロマトグラフィーにより精製し、エタノール−水混
液（容量比　１：４）で溶出した区分を凍結乾燥すると
、ソジオ−６′−Ｏ−カルボキシメチル−２′，７′−
ジクロロフルオレセイニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グ
ルコサミニド１．４　ｇ（２．０５　ｍｍｏｌ、収率：
６７．２　％）を得た。 【００２０】融点：　２０６　℃（分解）紫外部・可視
部吸収スペクトル（Ｈ２Ｏ）：吸収極大波長［λｍａｘ
］＝２８１（ε＝　９０００），２２９（ε＝　５５７
００）ｎｍ赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ）：　３４０
０，　１７５５，　１６６０（ｓｈ），１６２５，１６
０５，１５６５　ｃｍ−１核磁気共鳴スペクトル（２０
０　ＭＨｚ）（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ（ｐｐｍ）８．０
０−８．０５（１Ｈ，ｍ），　７．７０−７．８５（３
Ｈ，ｍ），　７．３５−７．４０（１Ｈ，ｍ），　７．
３１（１Ｈ，ｓ），　６．８２（１Ｈ，ｓ），　６．７
４　ａｎｄ　６．７５（１Ｈ，ｅａｃｈ　ｓ），　６．
６９ａｎｄ　６．７０（１Ｈ，ｅａｃｈ　ｓ），　５．
４５（２Ｈ，ｂｒ　ｓ），　５．１０　ａｎｄ　５．１
２（１Ｈ，ｅａｃｈｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），　４．７４
（１Ｈ，ｂｒ　ｓ），　４．３７（２Ｈ，ｓ），　３．
７５−３．９０（２Ｈ，ｍ），　　　　　　　　　　３
．２０−３．６０（４Ｈ，ｍ），　１．７７　ａｎｄ　
１．７９（３Ｈ，ｅａｃｈ　ｓ） 【００２１】 実施例２ 　　ＮＡＧａｓｅ活性の測定用試薬　 　　　　（１）試薬の組成 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　含有物　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　濃度　　　　　　基質試薬：　　　　ソ
ジオ−６′−Ｏ−カルボキシメチル−　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　２′，７′−ジクロロフルオ
レセイニル−　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド　　　　２．
０　ｍＭ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ク
エン酸緩衝液（ｐＨ＝５．０）　　　　　　　　　　　
　　　５０．０　ｍＭ　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　精製水　　　　（２）測定法 基質試薬　１　ｍｌ　を　３７　℃で　５　分間加温し
た後、試料液　２５　μｌ　を加え、３７　℃で　５　
分間加温後からの　５　分間の　４９０　ｎｍ　におけ
る吸光度の変化量を測定する。この吸光度変化量と予め
作成した検量線から算出して、試料液中のＮＡＧａｓｅ
活性の測定を行なうことができる。なお、試料液の酵素
活性の値が検量線の測定範囲を超えた場合は、５０　ｍ
Ｍ　クエン酸緩衝液（ｐＨ＝　５．０）を用いて相当す
る倍数の希釈を行なった後、再測定を行なう。 【００２２】実施例３ ＮＡＧａｓｅ活性の測定方法 （１）　　基質液の調製 実施例１で得たソジオ−６′−Ｏ−カルボキシメチル−
２′，７′−ジクロロフルオレセイニル−Ｎ−アセチル
−β−Ｄ−グルコサミニド　１３６９ｍｇ（２．０　ｍ
ｍｏｌ）を取り、５０　ｍＭ　クエン酸緩衝液（ｐＨ＝
　５．０）を加えて全量を　１　ｌ　として基質液とす
る。 （２）　　標品ＮＡＧａｓｅ液の調製 市販品の酵素活性既知のＮＡＧａｓｅを　５０　ｍＭ　
クエン酸緩衝液（ｐＨ＝　５．０）を用いて数種類の濃
度に希釈して標品ＮＡＧａｓｅ液とする。 （３）　　検量線の作成 基質液　１　ｍｌ　に、各濃度の標品ＮＡＧａｓｅ液　
２５　μｌ　を加え、３７　℃で　５　分間加温後から
の　５　分間の　４９０　ｎｍ　における吸光度の変化
量の関係により検量線を作成する。シグマ社製ＮＡＧａ
ｓｅ（２５　ｕ／０．５　ｍｌ）を使用した場合、検量
線の式はＵ＝　３．５５　×（△Ａ）×　１０３（Ｕ：
酵素活性ｕ／ｌ、△Ａ：吸光度変化量／分）となる。そ
のグラフを図１に示す。 （４）　　試料液中のＮＡＧａｓｅ活性の測定基質液　
１　ｍｌ　に試料液　２５　μｌ　を加え、３７　℃で
　５　分間加温後からの　５　分間の　４９０　ｎｍ　
における吸光度の変化量を測定する。この吸光度変化量
と（３）で作成した検量線から算出して試料液中のＮＡ
Ｇａｓｅ活性の測定を行なうことができる。なお、試料
液の酵素活性の値が検量線の測定範囲（０〜５００　ｕ
／ｌ）を超えた場合は、５０　ｍＭ　クエン酸緩衝液（
ｐＨ＝　５．０）を用いて相当する倍数の希釈を行なっ
た後、再測定を行なう。 【００２３】

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例３におけるＮＡＧａｓｅ活性と生成する
色素の波長　４９０　ｎｍ　における　１分間当りの吸
光度の変化量の関係を示すグラフであって、図中の直線
は検量線である。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】一般式（Ｉ） 【化１】 （式中のＲ１は水酸基、カルボキシル基、スルホン酸基
   若しくはリン酸基を有する炭素数　１〜４　の置換アル
   キル基若しくはそのアルカリ金属塩、又は水酸基、カル
   ボキシル基、スルホン酸基、リン酸基若しくは前記置換
   アルキル基を有する置換フェニル基若しくはそのアルカ
   リ金属塩、Ｒ２〜Ｒ４はそれぞれ独立して、水素原子、
   ハロゲン原子、又はニトロ基を意味する）で表されるＮ
   −アセチル−β−Ｄ−グルコサミン誘導体。
2. 【請求項２】請求項１記載のＮ−アセチル−β−Ｄ−グ
   ルコサミン誘導体を有効成分とするＮ−アセチル−β−
   Ｄ−グルコサミニダーゼ活性測定用試薬。
3. 【請求項３】Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダー
   ゼ含有試料に、請求項１記載のＮ−アセチル−β−Ｄ−
   グルコサミン誘導体を加え、酵素反応によって生成する
   アグリコン（フルオレセイン・モノエーテル類）を定量
   することを特徴とするＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサ
   ニダーゼ活性の測定方法。