JPH0555517B2 - - Google Patents
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Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
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Description
〔産業上の利用分野〕
本発明はＮ−アセチル−β−Ｄ−ヘキソサミン
誘導体およびそれを基質として用いるＮ−アセチ
ル−β−Ｄ−ヘキソサミニダーゼ（以下、NAG
アーゼと称する。）活性測定試薬に関する。 NACアーゼは腎尿細管上皮に多く含まれるリ
ゾソーム（lysosom）中に存在する酸素の１つで
あり、ムコ多糖類や糖蛋白の分解に関与してい
る。尿中のNAGアーゼは各種腎疾患や腎臓の手
術後においては上昇し、また糖尿病においては尿
中ばかりでなく、血清中のNAGアーゼも上昇す
ることが認めれている。このような各種腎疾患の
検出や治療経過の観察、薬物の腎毒性検討等の指
標として、また臨床および動物実験面においても
NAGアーゼの測定が注目されている。 （従来の技術、発明が解決しようとする問題点〕 NAGアーゼの測定には従来、ｐ−ニトロフエ
ニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミナイド
〔Biochemical Preparations.10，118（1963）〕お
よびΔ−メチルウンベリフエリル−Ｎ−アセチル
−β−Ｄ−グルコサミナイド〔Clinica Chimica
Acta，69(1)，85（1976）〕が広く用いられている。
しかし、前者は測定波長においてビリルビン、溶
血メモグロビンなどの主体成分の影響を受け易
く、検体ごとにブランクを測定する必要があり、
測定のための操作が煩雑であるという欠点があ
り、さらにNAGアーゼの至適PH（PH４〜5.5）と
ｐ−ニトロフエノールの発色PH（PH９以上）が相
違するために、NAGアーゼ活性の測定に際して
酵素反応と発色反応を別々に行なうことが必要で
あり、試薬数と操作ステツプが多くなり、酵素活
性を求める場合に最も適当とされている速度分析
（レートアツセイ）法を適用することができない。
また、後者は螢光光度計のような特殊な機器が必
要であるという欠点を有している。 さらに、ブラツクテストを行なわなくてもよい
ように改良した基質としてｍ−クレゾールスルホ
ンフタレイニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコ
サミナイドが知られている（特開昭58−994号）。
しかし、この場合は反応停止剤試薬を加え、アル
カリ性で発色させて測定するエンドポイント法を
用いるため、速度分析法を適用できず２試薬法で
測定する必要があり、長時間を要する上に自動化
のための機種が限定される等の問題点がある。 また、本発明の化合物（）の製法として化学
合成法（特開昭61−112092号公報）等が知られて
いるが、これらの方法は各種の副生物が生成した
り、反応工程が複雑であつたりして、実用化しう
る程度に完成されたものとは云い難い。しかも、
具体的に記載されている２−クロロ−４−ニトロ
フエル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミナイ
ドを基質とすると、水溶性が著しく劣るため、
NAGアーゼ活性測定に必要な基質量を溶解させ
ることが困難であり、正確な測定ができない。さ
らに、NAGアーゼの活性測定域PH4.0〜6.0で発色
基２−クロロ−４−ニトロフエノールが十分な感
度を示すことができないという問題があつた。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明者は水溶性にすぐれ、高感度でレートア
ツセイが可能なNAGアーゼ活性測定用の基質と
なる化合物ならびに該化合物を基質として用いた
NAGアーゼ活性測定試薬の提供を目的としてい
る。 本発明者らは、かかる目的を達成すべく検討を
重ねた結果、一般式（）で表わされる化合物は
水溶性にすぐれ、この化合物を基質として用いる
ことにより体液中のNAGアーゼ活性を短時間で
正確かつ簡単にレートアツセイ出来ることを見出
して本発明に到達した。 すなわち本発明は、一般式（） （式中、Ｘは水素原子を示す。） で表わされるＮ−アセチル−β−Ｄ−ヘキソサミ
ン誘導体に関し、さらに基質として上記一般式
（）で表わされる化合物を含有することを特徴
とするＮ−アセチル−β−Ｄ−ヘキソサミダーゼ
活性測定試薬ならびに該一般式（）で表わされ
る化合物と共にサイクロデキストリンを含有する
ことを特徴とするＮ−アセチル−β−Ｄ−ヘキソ
サミニダーゼ活性測定試薬に関する。 一般式（）で表わされる化合物は、Ｎ−アセ
チルヘキソサミンまたはその誘導体がその還元性
未端で２−フルオロ−４−ニトロフエニル基とβ
−結合したものである。この化合物は、たとえば
Ｎ−アセチルヘキソサミンをアセチル化し、この
アセチル化されたＮ−アセチルヘキソサミン と
２−フルオロ−４−ニトロフエノールを結合させ
た後、脱アセチルする方法（実験化学講座、第24
巻、第304頁，1958年）、アセチル化されたＮ−ア
セチルヘキソサミンをハロゲン化し、次いでその
ハロゲン化物と２−フルオロ−４−ニトロフエノ
ールをエーテル結合させた後、脱アセチルする方
法（Methods in Carbohydrate Chemistry，，
第334頁）により合成することができる。 上記一般式（）で表わされる化合物の２−フ
ルオロ−４−ニトロフエニル基において、２位の
フツ素が他のハロゲン原子で置換されている場
合、水に対する溶解性が悪く、本発明が企図して
いる基質として用いることは不適当である。 本発明の一般式（）で表わされる化合物を
NAGアーゼ活性測定試薬として用いる場合、体
液中のNAGアーゼの至適PHであるPH4.0〜6.0の値
を保ち得る緩衝剤に溶解させる。この要件を満足
する緩衝剤としては様々なものがあり、たとえば
クエン酸、酢酸、コハク酸、フタル酸等の有機酸
の緩衝剤などが挙げられる。さらに、サイクロデ
キストリンを添加することによりNAGアーゼ活
性の測定感度を向上させることができる。ここで
サイクロデキストリンとしてはα−サイクロデキ
ストリン、β−サイクロデキストリン、γ−サイ
クロデキストリンなどが挙げられ、αサイクロデ
キストリンが好ましい。基質濃度については特別
な制限はなく、最大のNAGアーゼ活性を示す濃
峠が適当であり、通常は1mM以上、好ましくは
３〜10mMである。 本発明の試薬には、必要により界面活性剤、防
腐剤、塩化ナトリウム、安定化剤等を適宜加える
ことができる。 本発明の試薬を用いてNAGアーゼ活性を測定
するには、該試薬を試料と反応させて基質を加水
分解させ、生成するアグリコン、すなわち２−フ
ルオロ−４−ニトロフエノールの発色による吸光
度変化を直接分光光度計を用いて比色定量する。
すなわち、基質を含有する試薬を加えた試験管と
該試薬の代りに基質を除いた緩衝液を加えた試験
管を用意し、37℃で５分加熱する。次いで、試薬
に試料を加えて37℃で15分間反応させた後、反応
停止液を加えて反応を停止させる。一方、別の試
験管に精製水を入れ、同様に反応させた後、反応
を停止させる。試料の吸光度は基質を除いた液を
対照にし、試料ブランク吸光度は水を対照にして
レートアツセイ法にてアグリコンの最大吸収波長
（400nm）で測定する。 〔実施例〕 次に、本発明を実施例により詳しく説明する。 実施例 １ ペンタアセチル−β−アセチルグルコサミン50
ｇ、２−フルオロ−４−ニトロフエノール50ｇお
よび塩化亜鉛12.5ｇをとり、130℃で加熱した。
次いで、ベンゼンにて抽出後、蒸発乾固し、さら
に無水アルコールで再結晶して２−フルオロ−４
−ニトロフエニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グル
コサミナイドを得た。本化合物の理化学的性質を
以下に示す。 融点：169℃ 〔α〕24 D；−15.5（水） UV：λmax294nm（水） 実施例 ２ 被検液中のNAGアーゼ活性量を下記試薬を用
いて下記の方法により測定した。 試薬 Ａ ２−フルオロ−４−ニトロフエニル−Ｎ−アセ
チル−β−Ｄ−グルコサミナイド 1mM α−サイクロデキストリン 0.2％ 塩化ナトリウム 200mM クエン酸緩衝液 0.05M PH5.0 試薬 Ｂ ２−フルオロ−４−ニトロフエニル−Ｎ−アセ
チル−β−Ｄ−グルコサミナイド 7mM α−サイクロデキストリン 0.2％ 塩化ナトリウム 200mM クエン酸緩衝液 0.05M PH5.0 試薬 Ｃ ２−フルオロ−４−ニトロフエル−Ｎ−アセチ
ル−β−Ｄ−グルコサミナイド 1mM 塩化ナトリウム 200mM クエン酸緩衝液 0.05M PH5.0 試薬 Ｄ ２−フルオロ−４−ニトロフエル−Ｎ−アセチ
ル−β−Ｄ−グルコサミナイド 7mM 塩化ナトリウム 200mM クエン酸緩衝液 0.05M PH5.0 試薬 Ｅ ２−クロロ−４−ニトロフエル−Ｎ−アセチル
−β−Ｄ−グルコサミナイド 1mM 塩化ナトリウム 200mM クエン酸緩衝液 0.05M PH5.0 試薬 Ｆ ２−クロロ−４−ニトロフエル−Ｎ−アセチル
−β−Ｄ−グルコサミナイド 7mM 塩化ナトリウム 200mM クエン酸緩衝液 0.05M PH5.0 NAGアーゼ含有被検液50μlに上記試薬３mlを
加えて37℃で３分間温後、吸光度変化を波長
400nmで測定して１分間の吸光度変化を求めた
（ブランクはNAGアーゼ含有被検液の代りに水を
用いた）。第１表にその結果を示す。
誘導体およびそれを基質として用いるＮ−アセチ
ル−β−Ｄ−ヘキソサミニダーゼ（以下、NAG
アーゼと称する。）活性測定試薬に関する。 NACアーゼは腎尿細管上皮に多く含まれるリ
ゾソーム（lysosom）中に存在する酸素の１つで
あり、ムコ多糖類や糖蛋白の分解に関与してい
る。尿中のNAGアーゼは各種腎疾患や腎臓の手
術後においては上昇し、また糖尿病においては尿
中ばかりでなく、血清中のNAGアーゼも上昇す
ることが認めれている。このような各種腎疾患の
検出や治療経過の観察、薬物の腎毒性検討等の指
標として、また臨床および動物実験面においても
NAGアーゼの測定が注目されている。 （従来の技術、発明が解決しようとする問題点〕 NAGアーゼの測定には従来、ｐ−ニトロフエ
ニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミナイド
〔Biochemical Preparations.10，118（1963）〕お
よびΔ−メチルウンベリフエリル−Ｎ−アセチル
−β−Ｄ−グルコサミナイド〔Clinica Chimica
Acta，69(1)，85（1976）〕が広く用いられている。
しかし、前者は測定波長においてビリルビン、溶
血メモグロビンなどの主体成分の影響を受け易
く、検体ごとにブランクを測定する必要があり、
測定のための操作が煩雑であるという欠点があ
り、さらにNAGアーゼの至適PH（PH４〜5.5）と
ｐ−ニトロフエノールの発色PH（PH９以上）が相
違するために、NAGアーゼ活性の測定に際して
酵素反応と発色反応を別々に行なうことが必要で
あり、試薬数と操作ステツプが多くなり、酵素活
性を求める場合に最も適当とされている速度分析
（レートアツセイ）法を適用することができない。
また、後者は螢光光度計のような特殊な機器が必
要であるという欠点を有している。 さらに、ブラツクテストを行なわなくてもよい
ように改良した基質としてｍ−クレゾールスルホ
ンフタレイニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコ
サミナイドが知られている（特開昭58−994号）。
しかし、この場合は反応停止剤試薬を加え、アル
カリ性で発色させて測定するエンドポイント法を
用いるため、速度分析法を適用できず２試薬法で
測定する必要があり、長時間を要する上に自動化
のための機種が限定される等の問題点がある。 また、本発明の化合物（）の製法として化学
合成法（特開昭61−112092号公報）等が知られて
いるが、これらの方法は各種の副生物が生成した
り、反応工程が複雑であつたりして、実用化しう
る程度に完成されたものとは云い難い。しかも、
具体的に記載されている２−クロロ−４−ニトロ
フエル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミナイ
ドを基質とすると、水溶性が著しく劣るため、
NAGアーゼ活性測定に必要な基質量を溶解させ
ることが困難であり、正確な測定ができない。さ
らに、NAGアーゼの活性測定域PH4.0〜6.0で発色
基２−クロロ−４−ニトロフエノールが十分な感
度を示すことができないという問題があつた。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明者は水溶性にすぐれ、高感度でレートア
ツセイが可能なNAGアーゼ活性測定用の基質と
なる化合物ならびに該化合物を基質として用いた
NAGアーゼ活性測定試薬の提供を目的としてい
る。 本発明者らは、かかる目的を達成すべく検討を
重ねた結果、一般式（）で表わされる化合物は
水溶性にすぐれ、この化合物を基質として用いる
ことにより体液中のNAGアーゼ活性を短時間で
正確かつ簡単にレートアツセイ出来ることを見出
して本発明に到達した。 すなわち本発明は、一般式（） （式中、Ｘは水素原子を示す。） で表わされるＮ−アセチル−β−Ｄ−ヘキソサミ
ン誘導体に関し、さらに基質として上記一般式
（）で表わされる化合物を含有することを特徴
とするＮ−アセチル−β−Ｄ−ヘキソサミダーゼ
活性測定試薬ならびに該一般式（）で表わされ
る化合物と共にサイクロデキストリンを含有する
ことを特徴とするＮ−アセチル−β−Ｄ−ヘキソ
サミニダーゼ活性測定試薬に関する。 一般式（）で表わされる化合物は、Ｎ−アセ
チルヘキソサミンまたはその誘導体がその還元性
未端で２−フルオロ−４−ニトロフエニル基とβ
−結合したものである。この化合物は、たとえば
Ｎ−アセチルヘキソサミンをアセチル化し、この
アセチル化されたＮ−アセチルヘキソサミン と
２−フルオロ−４−ニトロフエノールを結合させ
た後、脱アセチルする方法（実験化学講座、第24
巻、第304頁，1958年）、アセチル化されたＮ−ア
セチルヘキソサミンをハロゲン化し、次いでその
ハロゲン化物と２−フルオロ−４−ニトロフエノ
ールをエーテル結合させた後、脱アセチルする方
法（Methods in Carbohydrate Chemistry，，
第334頁）により合成することができる。 上記一般式（）で表わされる化合物の２−フ
ルオロ−４−ニトロフエニル基において、２位の
フツ素が他のハロゲン原子で置換されている場
合、水に対する溶解性が悪く、本発明が企図して
いる基質として用いることは不適当である。 本発明の一般式（）で表わされる化合物を
NAGアーゼ活性測定試薬として用いる場合、体
液中のNAGアーゼの至適PHであるPH4.0〜6.0の値
を保ち得る緩衝剤に溶解させる。この要件を満足
する緩衝剤としては様々なものがあり、たとえば
クエン酸、酢酸、コハク酸、フタル酸等の有機酸
の緩衝剤などが挙げられる。さらに、サイクロデ
キストリンを添加することによりNAGアーゼ活
性の測定感度を向上させることができる。ここで
サイクロデキストリンとしてはα−サイクロデキ
ストリン、β−サイクロデキストリン、γ−サイ
クロデキストリンなどが挙げられ、αサイクロデ
キストリンが好ましい。基質濃度については特別
な制限はなく、最大のNAGアーゼ活性を示す濃
峠が適当であり、通常は1mM以上、好ましくは
３〜10mMである。 本発明の試薬には、必要により界面活性剤、防
腐剤、塩化ナトリウム、安定化剤等を適宜加える
ことができる。 本発明の試薬を用いてNAGアーゼ活性を測定
するには、該試薬を試料と反応させて基質を加水
分解させ、生成するアグリコン、すなわち２−フ
ルオロ−４−ニトロフエノールの発色による吸光
度変化を直接分光光度計を用いて比色定量する。
すなわち、基質を含有する試薬を加えた試験管と
該試薬の代りに基質を除いた緩衝液を加えた試験
管を用意し、37℃で５分加熱する。次いで、試薬
に試料を加えて37℃で15分間反応させた後、反応
停止液を加えて反応を停止させる。一方、別の試
験管に精製水を入れ、同様に反応させた後、反応
を停止させる。試料の吸光度は基質を除いた液を
対照にし、試料ブランク吸光度は水を対照にして
レートアツセイ法にてアグリコンの最大吸収波長
（400nm）で測定する。 〔実施例〕 次に、本発明を実施例により詳しく説明する。 実施例 １ ペンタアセチル−β−アセチルグルコサミン50
ｇ、２−フルオロ−４−ニトロフエノール50ｇお
よび塩化亜鉛12.5ｇをとり、130℃で加熱した。
次いで、ベンゼンにて抽出後、蒸発乾固し、さら
に無水アルコールで再結晶して２−フルオロ−４
−ニトロフエニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グル
コサミナイドを得た。本化合物の理化学的性質を
以下に示す。 融点：169℃ 〔α〕24 D；−15.5（水） UV：λmax294nm（水） 実施例 ２ 被検液中のNAGアーゼ活性量を下記試薬を用
いて下記の方法により測定した。 試薬 Ａ ２−フルオロ−４−ニトロフエニル−Ｎ−アセ
チル−β−Ｄ−グルコサミナイド 1mM α−サイクロデキストリン 0.2％ 塩化ナトリウム 200mM クエン酸緩衝液 0.05M PH5.0 試薬 Ｂ ２−フルオロ−４−ニトロフエニル−Ｎ−アセ
チル−β−Ｄ−グルコサミナイド 7mM α−サイクロデキストリン 0.2％ 塩化ナトリウム 200mM クエン酸緩衝液 0.05M PH5.0 試薬 Ｃ ２−フルオロ−４−ニトロフエル−Ｎ−アセチ
ル−β−Ｄ−グルコサミナイド 1mM 塩化ナトリウム 200mM クエン酸緩衝液 0.05M PH5.0 試薬 Ｄ ２−フルオロ−４−ニトロフエル−Ｎ−アセチ
ル−β−Ｄ−グルコサミナイド 7mM 塩化ナトリウム 200mM クエン酸緩衝液 0.05M PH5.0 試薬 Ｅ ２−クロロ−４−ニトロフエル−Ｎ−アセチル
−β−Ｄ−グルコサミナイド 1mM 塩化ナトリウム 200mM クエン酸緩衝液 0.05M PH5.0 試薬 Ｆ ２−クロロ−４−ニトロフエル−Ｎ−アセチル
−β−Ｄ−グルコサミナイド 7mM 塩化ナトリウム 200mM クエン酸緩衝液 0.05M PH5.0 NAGアーゼ含有被検液50μlに上記試薬３mlを
加えて37℃で３分間温後、吸光度変化を波長
400nmで測定して１分間の吸光度変化を求めた
（ブランクはNAGアーゼ含有被検液の代りに水を
用いた）。第１表にその結果を示す。
【表】
一般式（）で表わされる本発明の化合物は水
溶性にすぐれており、レートアツセイが可能な
NAGアーゼ活性測定のための基質として用いる
ことができる。さらに、サイクロデキストリンを
添加することにより高感度なNAGアーゼ活性測
定が可能である。したがつて、本発明の試薬を用
いることにより、体液中のNAGアーゼ活性を短
時間に正確かつ簡単に測定することができる。
溶性にすぐれており、レートアツセイが可能な
NAGアーゼ活性測定のための基質として用いる
ことができる。さらに、サイクロデキストリンを
添加することにより高感度なNAGアーゼ活性測
定が可能である。したがつて、本発明の試薬を用
いることにより、体液中のNAGアーゼ活性を短
時間に正確かつ簡単に測定することができる。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 一般式（） （式中、Ｘは水素原子を示す。） で表わされるＮ−アセチル−β−Ｄ−ヘキソサミ
ン誘導体。 ２ 基質として一般式（） （式中、Ｘは水素原子を示す。） で表わされるＮ−アセチル−β−Ｄ−ヘキソサミ
ン誘導体を含有することを特徴とするＮ−アセチ
ル−β−Ｄ−ヘキソサミニダーゼ活性測定試薬。 ３ 一般式（） （式中、Ｘは水素原子を示す。） で表わされるＮ−アセチル−β−Ｄ−ヘキソサミ
ン誘導体およびサイクロデキストリンを含有する
ことを特徴とするＮ−アセチル−β−Ｄ−ヘキソ
サミニダーゼ活性測定試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17486887A JPS6419090A (en) | 1987-07-15 | 1987-07-15 | Production of n-acetyl-beta-d-hexosamine derivative and reagent for measuring n-acetyl-beta-d-hexosaminidase activity using said derivative as substrate |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17486887A JPS6419090A (en) | 1987-07-15 | 1987-07-15 | Production of n-acetyl-beta-d-hexosamine derivative and reagent for measuring n-acetyl-beta-d-hexosaminidase activity using said derivative as substrate |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6419090A JPS6419090A (en) | 1989-01-23 |
| JPH0555517B2 true JPH0555517B2 (ja) | 1993-08-17 |
Family
ID=15986060
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17486887A Granted JPS6419090A (en) | 1987-07-15 | 1987-07-15 | Production of n-acetyl-beta-d-hexosamine derivative and reagent for measuring n-acetyl-beta-d-hexosaminidase activity using said derivative as substrate |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6419090A (ja) |
-
1987
- 1987-07-15 JP JP17486887A patent/JPS6419090A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6419090A (en) | 1989-01-23 |
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|---|---|---|---|
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