JPS637196B2 - - Google Patents
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- C12Q2334/40—Triphenylmethane dye chromogens, e.g. fluorescein derivatives
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/924—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
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Description
Ａ 発明の概略
本発明は新規Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサ
ミン誘導体およびこれを基質として用いるＮ−ア
セチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ活性測定法
およびその試薬に関する。本発明における新規Ｎ
−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン誘導体は下記
一般式で示される。 （式中、R1〜R3は水素、低級アルキル、または
ハロゲンを示し、Y2はアルカリ金属を示す） Ｂ 先行技術および発明の目的 Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ
（以下NAGaseと略す）は、腎尿細管上皮に多く
含まれるリゾソーム（lysosome）中の酵素の１
つであり、ムコ多糖類や糖蛋白の分解に関与して
いる。尿中NAGaseは各種腎疾患や腎臓の術後に
おいては上昇し、また糖糖病においては尿中ばか
りでなく血清中NAGaseも上昇することが認めら
れており、こういつた各種腎疾患の検出の一助と
して、また薬物の腎毒性検討の指標としても、臨
床および動物実験面でNAGaseの測定が注目され
ている。 NAGaseの活性測定としては従来ｐ−ニトロフ
エニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミナイ
ド〔Biochemical Preparations、10、118
（1963）〕および４−メチルウンベリフエリル−Ｎ
−アセチル−β−Ｄ−グルコサミナイド
〔Clinica Chimica Acta、69(1)、85〜91（1976）〕
が広く用いられているが、前者は測定波長におい
てビリルビン、溶血ヘモグロビンなどの生体成分
の影響を受けやすく、検体ごとにブランクを測定
する必要があり、測定操作が煩雑であるなどの欠
点を、また後者はけい光光度計のような特殊な機
器が必要であるなどの欠点を有している。本発明
者らは、前記欠点を克服し、高感度で精密に、か
つ迅速に測定が可能なNAGase測定用基質を見出
すべく鋭意研究した結果、本発明を完成するにい
たつた。本発明の化合物と類似のフエノールフタ
レイニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミナ
イドが妊婦の唾液中NAGase測定に用いうること
が特開昭51−114990などに記載されているが、反
応に用いる試薬が緩衝液に溶解せず、可溶化剤を
加えて可溶化した後に反応させてもその発色は不
安定であり退色しやすいなどの欠点を有してい
る。本発明の化合物は、こういつた欠点をも克服
したものである。 Ｃ 構成 上記定義中（）式において、R1〜R3で示さ
れる低級アルキルとは炭素数１〜４の直鎖状また
は分岐したアルキルを意味し、たとえばメチル、
エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソ
ブチルなどを包含するが、メチルおよびイソプロ
ピルがより好ましい。ハロゲンとはフルオロ、ク
ロロ、ブロモ、ヨードなどを意味するが、クロロ
またはブロモがより好ましい。Y2とはリチウム、
ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属を意味す
る。 本発明の化合物（）は、式（）で示される
１−クロロ−１−デオキシ−２・３・４・６−テ
トラアセチル−α−Ｄ−グルコサミンと式（）
で示されるアグリコンより容易に合成される。
ミン誘導体およびこれを基質として用いるＮ−ア
セチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ活性測定法
およびその試薬に関する。本発明における新規Ｎ
−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン誘導体は下記
一般式で示される。 （式中、R1〜R3は水素、低級アルキル、または
ハロゲンを示し、Y2はアルカリ金属を示す） Ｂ 先行技術および発明の目的 Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ
（以下NAGaseと略す）は、腎尿細管上皮に多く
含まれるリゾソーム（lysosome）中の酵素の１
つであり、ムコ多糖類や糖蛋白の分解に関与して
いる。尿中NAGaseは各種腎疾患や腎臓の術後に
おいては上昇し、また糖糖病においては尿中ばか
りでなく血清中NAGaseも上昇することが認めら
れており、こういつた各種腎疾患の検出の一助と
して、また薬物の腎毒性検討の指標としても、臨
床および動物実験面でNAGaseの測定が注目され
ている。 NAGaseの活性測定としては従来ｐ−ニトロフ
エニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミナイ
ド〔Biochemical Preparations、10、118
（1963）〕および４−メチルウンベリフエリル−Ｎ
−アセチル−β−Ｄ−グルコサミナイド
〔Clinica Chimica Acta、69(1)、85〜91（1976）〕
が広く用いられているが、前者は測定波長におい
てビリルビン、溶血ヘモグロビンなどの生体成分
の影響を受けやすく、検体ごとにブランクを測定
する必要があり、測定操作が煩雑であるなどの欠
点を、また後者はけい光光度計のような特殊な機
器が必要であるなどの欠点を有している。本発明
者らは、前記欠点を克服し、高感度で精密に、か
つ迅速に測定が可能なNAGase測定用基質を見出
すべく鋭意研究した結果、本発明を完成するにい
たつた。本発明の化合物と類似のフエノールフタ
レイニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミナ
イドが妊婦の唾液中NAGase測定に用いうること
が特開昭51−114990などに記載されているが、反
応に用いる試薬が緩衝液に溶解せず、可溶化剤を
加えて可溶化した後に反応させてもその発色は不
安定であり退色しやすいなどの欠点を有してい
る。本発明の化合物は、こういつた欠点をも克服
したものである。 Ｃ 構成 上記定義中（）式において、R1〜R3で示さ
れる低級アルキルとは炭素数１〜４の直鎖状また
は分岐したアルキルを意味し、たとえばメチル、
エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソ
ブチルなどを包含するが、メチルおよびイソプロ
ピルがより好ましい。ハロゲンとはフルオロ、ク
ロロ、ブロモ、ヨードなどを意味するが、クロロ
またはブロモがより好ましい。Y2とはリチウム、
ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属を意味す
る。 本発明の化合物（）は、式（）で示される
１−クロロ−１−デオキシ−２・３・４・６−テ
トラアセチル−α−Ｄ−グルコサミンと式（）
で示されるアグリコンより容易に合成される。
【式】
ある特定の酸性PH（PH3.5〜6.0、特にPH4.0〜
5.5）を維持する緩衝液中で、化合物（Ｉ）を基
質として検体と共に一定時間インキユベートする
と、下記に示すように、検体中のNAGaseの作用
により基質（）が開裂してアグリコン（）と
Ｎ−アセチル−グリコサミン（）が遊離する。
これをアルカリ液でPH10〜11に調整してアグリコ
ン（）を式（）に示すようなニアルカリ金属
塩に変換させて発色させ、分光光度計で比色定量
する。 〔測定操作〕 10ml試験管に基質溶液（２〜６ｍＭ／）1.0
mlをとり、37℃で５分間予備加温した後、検体(注)
50μを加えて37℃で反応させる。ｘ分後にアル
カリ溶液2.0mlを加えて反応を停止し、遊離する
アグリコンの最大吸収波長における吸光度を蒸留
水または空気を対照として１時間以内に測定す
る。基質ブランクは検体の代りに蒸留水50μを
用い、同様に操作したものを測定する。 (注) 検休：ヒトもしくは動物由来の尿または血精
であり、採取後直ちに測定するのが好ましい。
しかし長時間保存する時は2N塩酸または2N水
酸化カリウムを用いてPHを6.5に調整しておく。
こうすれば、検体中のNAGase活性は室温で１
日、−20℃で約４ケ月安定である。 ここで、１分間に１マイクロモルのアグリコン
（）を生成するNAGase量を１ユニツト（ｕ）
とする。 〔酸素濃度の計算〕 検体中のNAGase濃度は次式より算出する。 検体中のNAGase濃度（ｕ／）＝ΔE／ε×ｄ× 3.05×１／ｘ×1000／0.05 ΔE＝E1−E2 E1＝検体の吸光度 E2＝基質ブランクの吸光度 ｄ＝光路長（cm） ε＝アグリコン（）の測定波長における吸光係
数（cm2／μM） ｘ＝反応時間（分） 本法においては10〜30分、より好ましくは10
〜15分が適当である。 〔標準曲線〕 測定操作の項に記載したように、化合物（）
を基質とする溶液に所定量のNAGaseを加えて反
応せしめ、遊離したアグリコン（）とNAGase
の関係をプロツトして標準曲線を作成する。たと
えば、ソジオ−ｍ−クレゾールスルホンフタレイ
ニル−β−Ｄ−グルコサミナイド（）（R′＝
CH3、R2＝R3＝Ｈ、Y2＝Na）（MCP−NAGと
略記）を基質としたキツト（MCP−NAG法）を
用いてNAGase活性の測定を行ない、NAGaseと
遊離するMCP〔メタクレゾールパープル（ｍ−ク
レゾールスルホンフタレイン）〕との量の関係を
図１に示す。図１に示すように、MCP−NAGの
場合には、本発明方法により200u／までの
NAGaseが定量的に測定可能である。 〔精度〕 NAGase溶液を用いて同時再現性を検討したと
ころ、変動係数は1.95％で高い再現性を示した。 〔正常値〕 健常人26名（男子14名、女子12名）について、
尿中NAGase活性をMCP−NAG法で測定する
と、その測定値はそれぞれ男子1.13〜13.10u／
、女子0.68〜5.20u／であつた。Clinica
Chimica Acta 73、453（1976）によれば、早朝
３時間尿についての平均値は8.1u／（1.5〜
29.8u／）と報告されている。 〔公知方法との比較〕 公知のｐ−ニトロフエニル−Ｎ−アセチル−β
−Ｄ−グルコサミナイドを基質としたキツト
（PNP−NAG法）と本願発明のMCP−NAG法
により測定したウシ腎臓のNAGase活性の相関を
図２に示す。なお、PNP−NAG法による
NAGase活性の測定は下記のとおりにして行つ
た。 10ml試験管に試薬−溶液(i)1.0mlをとり、37℃
で約10分間予備加温した後、検体尿50μを加え
て37℃で反応させる。30分後に試薬−溶液(ii)
2.0mlを加えて反応を停止し、405nｍにおける吸
光度を蒸留水または空気を対照として２時間以内
に測定する。検体毎にブランクを必要とするが、
これには試薬−溶液のかわりに試薬−溶液(iii)
1.0mlを用いて、以下同様に操作する。基質ブラ
ンクとしては試薬−溶液1.0ml、蒸留水50μ、
試薬−溶液2.0mlを同様に順次操作したものを
１本用いる。 (注) (i) ５ｍＭ基質溶液（0.05Mクエン酸・リン酸緩
衝液PH4.40） (ii) 0.2Mホウ・炭酸ナトリウム緩衝液（PH10.5） (iii) 0.05Mクエン酸・リン酸緩衝液（PH4.40）検
体中のNAGase濃度は次式より算出する。 検体中のNAGase濃度（ｕ／）＝ΔE×3.05／18.19×
ｄ ×１／30×1000／0.05 ΔE＝E1−（E2＋E3） E1＝検体の吸光度 E2＝尿ブランクの吸光度 E3＝基質ブランクの吸光度 ｄ＝光路長（cm） 図２によりMCP−NAG法とPNP−NAG法と
は良好な相関を示すことが明らかであるが、同じ
検体についてのMCP−NAG法による測定は
PNP−NAG法よりも約４％高い活性値が得られ
る。 以下に実施例を示して本発明の態様を明らかに
する。 実施例 １ ソジオ−フエノールスルホンフタレイニル−Ｎ
−アセチル−β−Ｄ−グルコサミナイド (1) フエノールスルホンフタレイン１373mg
（1.05ミリモル）を1Nナトリウムメトキシド−
メタノール溶液2.0ml（2.0ミリモル）に溶か
し、次いでメタノールを35℃以下で減圧留去す
る。残渣にベンゼンを加えて磨砕した後、35℃
以下で濃縮する。この操作を更に２度繰り返
し、次いで減圧下で３時間乾燥すると、フエノ
ールスルホンフタレインのニナトリウム塩２を
得る。 (2) 上記(1)で得たニナトリウム塩２をDMF（10
ml）に可及的に溶かすと青味がかつた紫色の液
となる。これに１−クロロ−１−デオキシ−
２・３・４・６−テトラアセチル−α−Ｄ−グ
ルコサミン３〔Biochemical Preparations10、
118（1963）〕366mg（1.0ミリモル）を撹拌下に
加えると、赤味がかつた紫色の殆ど溶液状態と
なる。約30分間室温で撹拌し、５℃で一夜（18
時間）放置する。これに、メタノールで洗浄し
たアンバーライトIRC−50（２ml）を加え、
30分間撹拌した後、過し、ついでメタノール
で洗浄する。液および洗液を合わせて減圧濃
縮し、残渣にトルエンを加えて再び減圧下で濃
縮乾固する。残渣をメタノールに溶かし、シリ
カゲル３ｇを吸着させ、メタノールを除いた
後、カラムクロマトグラフ〔固定相：シリカゲ
ル30ｇ、溶媒系：酢酸エチル〜酢酸エチル−メ
タノール＝３：１）処理して分離すると、ソジ
オフエノールスルホンフタレイニル−２・３・
４・６−テトラアセチル−β−Ｄ−グルコサミ
ナイド４を主成分として含む画分540mgを得る。 (3) 上記画分を、無水酢酸4.5mlおよびピリジン
ク７mlの混液中一夜放置する。これに、冷却撹
拌下にメタノール２mlを加え、１時間放置後、
減圧下で溶媒留去する。残渣にトルエンを加
え、減圧下に濃縮乾固する。この操作を２度繰
り返し、残渣に塩化メチレンを加え、可溶部分
（約540mg）を分取する。これは薄層クロマトグ
ラフイー上、２つの主スポツトを与えるため、
カラムクロマトグラフ（固定相：シリカゲル
8.5ｇ、溶媒系：ベンゼン−酢酸エチル＝１：
２）処理して分離すると、第一画分からは０・
０−ジアセチルフエノールスルホンフタレイン
を得、また第二画分からは０−アセチルフエノ
ールスルホンフタレイニル−２・３・４・６−
テトラアセチル−β−Ｄ−グルコサミナイド５
を殆ど無色の泡状物として得る。収率42％。 この生成物５を再度カラムクロマトグラフ
（固定相：シリカゲル、溶媒系：ベンゼン−酢
酸エチル＝１：２）処理して精製すると、純粋
な生成物５を得る。 IR：νCHCl3 nax1750、1689cm-1。 NMR：δCDCl31.86（ｓ、3H）、2.03（ｓ、9H）、
2.29（ｓ、3H）、3.7〜4.4（4H）、5.10（ｔ、Ｊ
＝9.5Hz、1H）、5.36（ｄ、Ｊ＝8.0Hz、1H）、
5.43（ｔ、Ｊ＝9.5Hz、1H）、6.24（ｄ、Ｊ＝9.0
Hz、1H）6.8〜8.0（12H）。 〔α〕D−6.3±0.3°（Ｃ＝1.956、CHCl3） (4) 上記(3)で得た生成物５308mg（0.424ミリモ
ル）を乾燥メタノール４mlに溶かし、これに
1Nナトリウムメトキシド−メタノール溶液
0.85ml（0.85ミリモル）を加える。得られた赤
色溶液を５℃で15時間放置し、メタノールで湿
らせたアンバーライトIRC−50（1.5ml）を加
え、1.5時間撹拌後、過し、メタノールで洗
う。液および洗液を合わせ、減圧濃縮する
と、橙色の粉末状残渣を得る。これをカラムク
ロマトグラフ〔固定相：シリカゲル1.5ｇ、溶
媒系：酢酸エチル−メタノール＝２：１〕処理
して精製すると、ソジオ−フエノールスルホン
フタレイニル Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコ
サミナイド６209ｇを吸湿性の高い橙色粉末と
して得る。収率89％。 IR：νKBr nax〜3350（br）、1665（sh）、1625cm-1。 NMR：δCD3OD1.95（ｓ、3H）、3.3〜4.2（6H）、
512（ｄ、Ｊ＝8.0Hz、1H）、6.0〜6.6（2H）、
6.8〜7.8（9H）、7.9〜8.3（1H）。 UV：λH2O nax262nｍ（ε＝10300）、408nｍ（ε＝
22400）（Ｃ＝16.94μｇ／ml）。 TLC（メルク社製プレコーテツド・キーゼル ゲル、酢酸エチル：メタノール＝２：１） Rf値約0.14。 〔α〕23 D＋35.9±0.8゜（Ｃ＝1.39、メタノール）。 実施例 ２ ソジオ−ｍ−クレゾールスルホンフタレイニル
−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミナイド (1) ｍ−クレゾールスルホンフタレイン７4.02ｇ
（10.5ミリモル）および1Nナトリウムメトキシ
ド−メタノール溶液20ml（20ミリモル）から、
実施例１(1)に従つてｍ−クルゾールスルホンフ
タレインのニナトリウム塩８を得る。 (2) 上記ニナトリウム塩８をDMF50mlに可及的
に溶かし、ついで１−クロロ−１−デオキシ−
２・３・４・６−テトラアセチル−α−Ｄ−グ
ルコサミン３3.66ｇ（10ミリモル）を撹拌下に
加えると、赤味がかつた紫色のほとんど完全な
溶液となる。これを５℃で16.5時間放置し、メ
タノールで湿らせたアンバーライトIRC−50
（25ml）を加えると赤味がかつた褐色に変化す
る。30分間撹拌後、過し、メタノールで洗
う。液と洗液を合わせて濃縮し、更にトルエ
ンとの共沸によりDMFを留去し、残渣をメタ
ノール25mlに溶かし、シリカゲル25ｇに吸着さ
せてメタノールをよく除いた後、カラムクロマ
トグラフ（固定相：シリカゲル処理する。酢酸
エチル2.3で溶出する分画は捨て、ついでメ
タノール0.8で溶出すると、ソジオ−ｍ−ク
レゾールスルホンフタレイニル−２・３・４・
６−テトラアセチル−β−Ｄ−グルコサミナイ
ド９を主成分として含む分画を得る。 (3) 上記分画を無水酢酸50mlおよびピリジン70ml
の混液中、一夜放置し、実施例１(3)と同様に後
処理する。得られた残渣8.33ｇは薄層クロマト
グラフ上に２つの主スポツトを与えるため、カ
ラムクロマトグラフ（固定相：シリカゲル100
ｇ、溶媒系：ベンゼン−酢酸エチル＝１：２）
処理して分離すると、第一分画からは０・０−
ジアセチル ｍ−クレゾールスルホンフタレイ
ンを得、また第二画分からはＯ−アセチル−ｍ
−クレゾールスルホンフタレイニル−２・３・
４・６−テトラアセチル−β−Ｄ−グルコサミ
ナイド104.50ｇを淡黄色泡状物として得る。収
率60％。 IR：νCHCl3 nax1747、1688cm-1。 NMR：δCDCl31.88（ｓ、3H）、2.02（ｓ、9H）、
2.12s、6H）、2.27（ｓ、3H）、3.7〜4.4（4H）、
5.10（ｔ、Ｊ＝9.5Hz、1H）、5.32（ｄ、Ｊ＝8.0
Hz、1H）、5.43（ｔ、Ｊ＝9.5Hz、1H）、5.98
（ｄ、Ｊ＝9.0Hz、1H）、6.8〜8.0（10H）。 〔α〕24.5 D0.0（Ｃ＝0.977、CHCI3） 〔α〕24.5 365＋2.8±0.4（Ｃ＝0.977、CHCl3） (4) 上記(3)で得た生成物104.42ｇ（5.86ミリモ
ル）を乾燥メタノール100mlに溶かし、これに
1Nナトリウムメトキシド−メタノール溶液
11.72ml（11.72ミリモル）を加える。得られた
暗褐色溶液を５℃で一夜放置し、メタノールで
湿らせたアンバーライトIRC−50（30ml）を
加え、30分撹拌後、過し、メタノールで洗
う。液と洗液を合わせ、減圧濃縮し、得られ
た残渣をカラムクロマトグラフ（固定相：シリ
カゲル120ｇ、溶媒系：酢酸エチル−メタノー
ル＝２：１）処理して精製すると、ソジオ−ｍ
−クルゾールスルホンフタレイニル−Ｎ−アセ
チル−β−Ｄ−グルコサミナイド112.77ｇを吸
湿性の高い橙色粉末として得る。 IR：νKBr nax〜3400（br）、1660（sh）、1620cm-1。 NMR：δCD3OD1.6〜2.4（9H）、3.3〜4.2（6H）、
4.9〜5.2（1H）、5.9〜8.4（10H）。 〔α〕23.5 D＋52.6±0.9゜（Ｃ＝1.032、 CH3OH）、UVおよびVISIBLE：λH2O nax269nｍ
（ε＝12200）、414nｍ（ε＝24000）、（Ｃ＝
11.80μｇ／ml） 実施例 ３ MCP−NAGとホウ砂の凍結乾燥品を0.05Mク
エン酸緩衝液（PH4.15）50mlで溶かし、基質溶液
とする（MCP−NAG5.13ミリモル濃度、PH4.4）。
10ml試験管に基質溶液1.0mlをとり37℃で５分間
予備加温した後、検体尿50μを加えて37℃で反
応させる。15分後に0.3M炭酸ナトリウム水溶液
2.0mlを加えて遊離したMCPを発色させ、580nｍ
における吸光度（E1）を蒸留水または空気を対
照として、１時間以内に測定する。基質ブランク
は、検体の代りに蒸留水50μを同様に操作した
ものを用いて吸光度（E2）を測定し、NAGase
濃度を計算により求める。 NAGase濃度（ｕ／）＝ ΔE／38×１×3.05×１／15×1000／0.05 ＝ΔE×107.0 実施例 ４ ソジオ−フエノールスルホンフタレイニル−Ｎ
−アセチル−β−Ｄ−グルコサミナイド（PR−
NAG）の凍結乾燥品を0.05Mホウ砂−クエン酸
緩衝液（PH4.4）に溶かし（５ミリモル濃度）、基
質溶液とする。10ml試験管に基質溶液1.0mlをと
り、37℃の恒温槽で５分間予備加温した後、ヒト
血清50μを加えて直ちに撹拌し、37℃で反応さ
せる。10分後に0.2Mホウ酸−炭酸ナトリウム緩
衝液（PH10.5）20mlを加えて酵素を生活させると
同時に、遊離したPR〔フエノールレツド（フエノ
ールスルホンフタレイン）〕を発色させ、557nｍ
における吸光度（E1）を蒸留水または空気を対
照として測定する。基質ブランクは蒸留水50μ
をを同様に操作したものについての吸光度（E2）
を測定し、NAGase濃度を計算により求める。 MAGase濃度ｕ／＝ ΔE／63×１×3.05×１／10×1000／0.05 ＝ΔE×96.8 実施例 ５ PR−NAGを0.25Mホウ砂−クエン酸緩衝液
（PH4.4）で25ミリモル濃度に溶解し、50mlガラス
製バイアルに10mlずつ分注し、凍結乾燥して基質
溶液凍結乾燥品とする。 ホウ酸93.7ｇと炭酸ナトリウム706.3ｇを粉砕
後混合して粒度を揃えた後、粉末充填機で1.98ｇ
ずつ120mlポリ瓶に粉末充填する。 実施例 ６ 実施例５で得たPR−NAGの基質溶液凍結乾燥
品を蒸留水50mlで溶かし、このうちの１mlを基質
溶液として用い、実施例５で得た粉末充填したポ
リ瓶に蒸留水100mlを加えて溶かし、このうちの
2.0mlをアルカリ溶液として用いて実施例４と同
様に操作し、NAGase濃度を求める。 NAGase（ｕ／）＝ ΔE／63×１×3.05×１／10×1000／0.05 ＝ΔE×96.8 実施例 ７ 実施例５と同様にしてMCP−NAGの基質溶液
凍結乾燥品を製造し、これを蒸留水50mlに溶解し
たもの１mlを基質溶液として用い、実施例５で得
た粉末述填したポリ瓶に蒸留水100mlを加えて溶
かしたもの２mlをアルカリ溶液として用いて実施
例３と同様に操作する。 580nｍで測定： NAGase濃度（ｕ／）＝ ΔE／38.2×3.05×１／15×1000／0.05＝ΔE×106.46
5.5）を維持する緩衝液中で、化合物（Ｉ）を基
質として検体と共に一定時間インキユベートする
と、下記に示すように、検体中のNAGaseの作用
により基質（）が開裂してアグリコン（）と
Ｎ−アセチル−グリコサミン（）が遊離する。
これをアルカリ液でPH10〜11に調整してアグリコ
ン（）を式（）に示すようなニアルカリ金属
塩に変換させて発色させ、分光光度計で比色定量
する。 〔測定操作〕 10ml試験管に基質溶液（２〜６ｍＭ／）1.0
mlをとり、37℃で５分間予備加温した後、検体(注)
50μを加えて37℃で反応させる。ｘ分後にアル
カリ溶液2.0mlを加えて反応を停止し、遊離する
アグリコンの最大吸収波長における吸光度を蒸留
水または空気を対照として１時間以内に測定す
る。基質ブランクは検体の代りに蒸留水50μを
用い、同様に操作したものを測定する。 (注) 検休：ヒトもしくは動物由来の尿または血精
であり、採取後直ちに測定するのが好ましい。
しかし長時間保存する時は2N塩酸または2N水
酸化カリウムを用いてPHを6.5に調整しておく。
こうすれば、検体中のNAGase活性は室温で１
日、−20℃で約４ケ月安定である。 ここで、１分間に１マイクロモルのアグリコン
（）を生成するNAGase量を１ユニツト（ｕ）
とする。 〔酸素濃度の計算〕 検体中のNAGase濃度は次式より算出する。 検体中のNAGase濃度（ｕ／）＝ΔE／ε×ｄ× 3.05×１／ｘ×1000／0.05 ΔE＝E1−E2 E1＝検体の吸光度 E2＝基質ブランクの吸光度 ｄ＝光路長（cm） ε＝アグリコン（）の測定波長における吸光係
数（cm2／μM） ｘ＝反応時間（分） 本法においては10〜30分、より好ましくは10
〜15分が適当である。 〔標準曲線〕 測定操作の項に記載したように、化合物（）
を基質とする溶液に所定量のNAGaseを加えて反
応せしめ、遊離したアグリコン（）とNAGase
の関係をプロツトして標準曲線を作成する。たと
えば、ソジオ−ｍ−クレゾールスルホンフタレイ
ニル−β−Ｄ−グルコサミナイド（）（R′＝
CH3、R2＝R3＝Ｈ、Y2＝Na）（MCP−NAGと
略記）を基質としたキツト（MCP−NAG法）を
用いてNAGase活性の測定を行ない、NAGaseと
遊離するMCP〔メタクレゾールパープル（ｍ−ク
レゾールスルホンフタレイン）〕との量の関係を
図１に示す。図１に示すように、MCP−NAGの
場合には、本発明方法により200u／までの
NAGaseが定量的に測定可能である。 〔精度〕 NAGase溶液を用いて同時再現性を検討したと
ころ、変動係数は1.95％で高い再現性を示した。 〔正常値〕 健常人26名（男子14名、女子12名）について、
尿中NAGase活性をMCP−NAG法で測定する
と、その測定値はそれぞれ男子1.13〜13.10u／
、女子0.68〜5.20u／であつた。Clinica
Chimica Acta 73、453（1976）によれば、早朝
３時間尿についての平均値は8.1u／（1.5〜
29.8u／）と報告されている。 〔公知方法との比較〕 公知のｐ−ニトロフエニル−Ｎ−アセチル−β
−Ｄ−グルコサミナイドを基質としたキツト
（PNP−NAG法）と本願発明のMCP−NAG法
により測定したウシ腎臓のNAGase活性の相関を
図２に示す。なお、PNP−NAG法による
NAGase活性の測定は下記のとおりにして行つ
た。 10ml試験管に試薬−溶液(i)1.0mlをとり、37℃
で約10分間予備加温した後、検体尿50μを加え
て37℃で反応させる。30分後に試薬−溶液(ii)
2.0mlを加えて反応を停止し、405nｍにおける吸
光度を蒸留水または空気を対照として２時間以内
に測定する。検体毎にブランクを必要とするが、
これには試薬−溶液のかわりに試薬−溶液(iii)
1.0mlを用いて、以下同様に操作する。基質ブラ
ンクとしては試薬−溶液1.0ml、蒸留水50μ、
試薬−溶液2.0mlを同様に順次操作したものを
１本用いる。 (注) (i) ５ｍＭ基質溶液（0.05Mクエン酸・リン酸緩
衝液PH4.40） (ii) 0.2Mホウ・炭酸ナトリウム緩衝液（PH10.5） (iii) 0.05Mクエン酸・リン酸緩衝液（PH4.40）検
体中のNAGase濃度は次式より算出する。 検体中のNAGase濃度（ｕ／）＝ΔE×3.05／18.19×
ｄ ×１／30×1000／0.05 ΔE＝E1−（E2＋E3） E1＝検体の吸光度 E2＝尿ブランクの吸光度 E3＝基質ブランクの吸光度 ｄ＝光路長（cm） 図２によりMCP−NAG法とPNP−NAG法と
は良好な相関を示すことが明らかであるが、同じ
検体についてのMCP−NAG法による測定は
PNP−NAG法よりも約４％高い活性値が得られ
る。 以下に実施例を示して本発明の態様を明らかに
する。 実施例 １ ソジオ−フエノールスルホンフタレイニル−Ｎ
−アセチル−β−Ｄ−グルコサミナイド (1) フエノールスルホンフタレイン１373mg
（1.05ミリモル）を1Nナトリウムメトキシド−
メタノール溶液2.0ml（2.0ミリモル）に溶か
し、次いでメタノールを35℃以下で減圧留去す
る。残渣にベンゼンを加えて磨砕した後、35℃
以下で濃縮する。この操作を更に２度繰り返
し、次いで減圧下で３時間乾燥すると、フエノ
ールスルホンフタレインのニナトリウム塩２を
得る。 (2) 上記(1)で得たニナトリウム塩２をDMF（10
ml）に可及的に溶かすと青味がかつた紫色の液
となる。これに１−クロロ−１−デオキシ−
２・３・４・６−テトラアセチル−α−Ｄ−グ
ルコサミン３〔Biochemical Preparations10、
118（1963）〕366mg（1.0ミリモル）を撹拌下に
加えると、赤味がかつた紫色の殆ど溶液状態と
なる。約30分間室温で撹拌し、５℃で一夜（18
時間）放置する。これに、メタノールで洗浄し
たアンバーライトIRC−50（２ml）を加え、
30分間撹拌した後、過し、ついでメタノール
で洗浄する。液および洗液を合わせて減圧濃
縮し、残渣にトルエンを加えて再び減圧下で濃
縮乾固する。残渣をメタノールに溶かし、シリ
カゲル３ｇを吸着させ、メタノールを除いた
後、カラムクロマトグラフ〔固定相：シリカゲ
ル30ｇ、溶媒系：酢酸エチル〜酢酸エチル−メ
タノール＝３：１）処理して分離すると、ソジ
オフエノールスルホンフタレイニル−２・３・
４・６−テトラアセチル−β−Ｄ−グルコサミ
ナイド４を主成分として含む画分540mgを得る。 (3) 上記画分を、無水酢酸4.5mlおよびピリジン
ク７mlの混液中一夜放置する。これに、冷却撹
拌下にメタノール２mlを加え、１時間放置後、
減圧下で溶媒留去する。残渣にトルエンを加
え、減圧下に濃縮乾固する。この操作を２度繰
り返し、残渣に塩化メチレンを加え、可溶部分
（約540mg）を分取する。これは薄層クロマトグ
ラフイー上、２つの主スポツトを与えるため、
カラムクロマトグラフ（固定相：シリカゲル
8.5ｇ、溶媒系：ベンゼン−酢酸エチル＝１：
２）処理して分離すると、第一画分からは０・
０−ジアセチルフエノールスルホンフタレイン
を得、また第二画分からは０−アセチルフエノ
ールスルホンフタレイニル−２・３・４・６−
テトラアセチル−β−Ｄ−グルコサミナイド５
を殆ど無色の泡状物として得る。収率42％。 この生成物５を再度カラムクロマトグラフ
（固定相：シリカゲル、溶媒系：ベンゼン−酢
酸エチル＝１：２）処理して精製すると、純粋
な生成物５を得る。 IR：νCHCl3 nax1750、1689cm-1。 NMR：δCDCl31.86（ｓ、3H）、2.03（ｓ、9H）、
2.29（ｓ、3H）、3.7〜4.4（4H）、5.10（ｔ、Ｊ
＝9.5Hz、1H）、5.36（ｄ、Ｊ＝8.0Hz、1H）、
5.43（ｔ、Ｊ＝9.5Hz、1H）、6.24（ｄ、Ｊ＝9.0
Hz、1H）6.8〜8.0（12H）。 〔α〕D−6.3±0.3°（Ｃ＝1.956、CHCl3） (4) 上記(3)で得た生成物５308mg（0.424ミリモ
ル）を乾燥メタノール４mlに溶かし、これに
1Nナトリウムメトキシド−メタノール溶液
0.85ml（0.85ミリモル）を加える。得られた赤
色溶液を５℃で15時間放置し、メタノールで湿
らせたアンバーライトIRC−50（1.5ml）を加
え、1.5時間撹拌後、過し、メタノールで洗
う。液および洗液を合わせ、減圧濃縮する
と、橙色の粉末状残渣を得る。これをカラムク
ロマトグラフ〔固定相：シリカゲル1.5ｇ、溶
媒系：酢酸エチル−メタノール＝２：１〕処理
して精製すると、ソジオ−フエノールスルホン
フタレイニル Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコ
サミナイド６209ｇを吸湿性の高い橙色粉末と
して得る。収率89％。 IR：νKBr nax〜3350（br）、1665（sh）、1625cm-1。 NMR：δCD3OD1.95（ｓ、3H）、3.3〜4.2（6H）、
512（ｄ、Ｊ＝8.0Hz、1H）、6.0〜6.6（2H）、
6.8〜7.8（9H）、7.9〜8.3（1H）。 UV：λH2O nax262nｍ（ε＝10300）、408nｍ（ε＝
22400）（Ｃ＝16.94μｇ／ml）。 TLC（メルク社製プレコーテツド・キーゼル ゲル、酢酸エチル：メタノール＝２：１） Rf値約0.14。 〔α〕23 D＋35.9±0.8゜（Ｃ＝1.39、メタノール）。 実施例 ２ ソジオ−ｍ−クレゾールスルホンフタレイニル
−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミナイド (1) ｍ−クレゾールスルホンフタレイン７4.02ｇ
（10.5ミリモル）および1Nナトリウムメトキシ
ド−メタノール溶液20ml（20ミリモル）から、
実施例１(1)に従つてｍ−クルゾールスルホンフ
タレインのニナトリウム塩８を得る。 (2) 上記ニナトリウム塩８をDMF50mlに可及的
に溶かし、ついで１−クロロ−１−デオキシ−
２・３・４・６−テトラアセチル−α−Ｄ−グ
ルコサミン３3.66ｇ（10ミリモル）を撹拌下に
加えると、赤味がかつた紫色のほとんど完全な
溶液となる。これを５℃で16.5時間放置し、メ
タノールで湿らせたアンバーライトIRC−50
（25ml）を加えると赤味がかつた褐色に変化す
る。30分間撹拌後、過し、メタノールで洗
う。液と洗液を合わせて濃縮し、更にトルエ
ンとの共沸によりDMFを留去し、残渣をメタ
ノール25mlに溶かし、シリカゲル25ｇに吸着さ
せてメタノールをよく除いた後、カラムクロマ
トグラフ（固定相：シリカゲル処理する。酢酸
エチル2.3で溶出する分画は捨て、ついでメ
タノール0.8で溶出すると、ソジオ−ｍ−ク
レゾールスルホンフタレイニル−２・３・４・
６−テトラアセチル−β−Ｄ−グルコサミナイ
ド９を主成分として含む分画を得る。 (3) 上記分画を無水酢酸50mlおよびピリジン70ml
の混液中、一夜放置し、実施例１(3)と同様に後
処理する。得られた残渣8.33ｇは薄層クロマト
グラフ上に２つの主スポツトを与えるため、カ
ラムクロマトグラフ（固定相：シリカゲル100
ｇ、溶媒系：ベンゼン−酢酸エチル＝１：２）
処理して分離すると、第一分画からは０・０−
ジアセチル ｍ−クレゾールスルホンフタレイ
ンを得、また第二画分からはＯ−アセチル−ｍ
−クレゾールスルホンフタレイニル−２・３・
４・６−テトラアセチル−β−Ｄ−グルコサミ
ナイド104.50ｇを淡黄色泡状物として得る。収
率60％。 IR：νCHCl3 nax1747、1688cm-1。 NMR：δCDCl31.88（ｓ、3H）、2.02（ｓ、9H）、
2.12s、6H）、2.27（ｓ、3H）、3.7〜4.4（4H）、
5.10（ｔ、Ｊ＝9.5Hz、1H）、5.32（ｄ、Ｊ＝8.0
Hz、1H）、5.43（ｔ、Ｊ＝9.5Hz、1H）、5.98
（ｄ、Ｊ＝9.0Hz、1H）、6.8〜8.0（10H）。 〔α〕24.5 D0.0（Ｃ＝0.977、CHCI3） 〔α〕24.5 365＋2.8±0.4（Ｃ＝0.977、CHCl3） (4) 上記(3)で得た生成物104.42ｇ（5.86ミリモ
ル）を乾燥メタノール100mlに溶かし、これに
1Nナトリウムメトキシド−メタノール溶液
11.72ml（11.72ミリモル）を加える。得られた
暗褐色溶液を５℃で一夜放置し、メタノールで
湿らせたアンバーライトIRC−50（30ml）を
加え、30分撹拌後、過し、メタノールで洗
う。液と洗液を合わせ、減圧濃縮し、得られ
た残渣をカラムクロマトグラフ（固定相：シリ
カゲル120ｇ、溶媒系：酢酸エチル−メタノー
ル＝２：１）処理して精製すると、ソジオ−ｍ
−クルゾールスルホンフタレイニル−Ｎ−アセ
チル−β−Ｄ−グルコサミナイド112.77ｇを吸
湿性の高い橙色粉末として得る。 IR：νKBr nax〜3400（br）、1660（sh）、1620cm-1。 NMR：δCD3OD1.6〜2.4（9H）、3.3〜4.2（6H）、
4.9〜5.2（1H）、5.9〜8.4（10H）。 〔α〕23.5 D＋52.6±0.9゜（Ｃ＝1.032、 CH3OH）、UVおよびVISIBLE：λH2O nax269nｍ
（ε＝12200）、414nｍ（ε＝24000）、（Ｃ＝
11.80μｇ／ml） 実施例 ３ MCP−NAGとホウ砂の凍結乾燥品を0.05Mク
エン酸緩衝液（PH4.15）50mlで溶かし、基質溶液
とする（MCP−NAG5.13ミリモル濃度、PH4.4）。
10ml試験管に基質溶液1.0mlをとり37℃で５分間
予備加温した後、検体尿50μを加えて37℃で反
応させる。15分後に0.3M炭酸ナトリウム水溶液
2.0mlを加えて遊離したMCPを発色させ、580nｍ
における吸光度（E1）を蒸留水または空気を対
照として、１時間以内に測定する。基質ブランク
は、検体の代りに蒸留水50μを同様に操作した
ものを用いて吸光度（E2）を測定し、NAGase
濃度を計算により求める。 NAGase濃度（ｕ／）＝ ΔE／38×１×3.05×１／15×1000／0.05 ＝ΔE×107.0 実施例 ４ ソジオ−フエノールスルホンフタレイニル−Ｎ
−アセチル−β−Ｄ−グルコサミナイド（PR−
NAG）の凍結乾燥品を0.05Mホウ砂−クエン酸
緩衝液（PH4.4）に溶かし（５ミリモル濃度）、基
質溶液とする。10ml試験管に基質溶液1.0mlをと
り、37℃の恒温槽で５分間予備加温した後、ヒト
血清50μを加えて直ちに撹拌し、37℃で反応さ
せる。10分後に0.2Mホウ酸−炭酸ナトリウム緩
衝液（PH10.5）20mlを加えて酵素を生活させると
同時に、遊離したPR〔フエノールレツド（フエノ
ールスルホンフタレイン）〕を発色させ、557nｍ
における吸光度（E1）を蒸留水または空気を対
照として測定する。基質ブランクは蒸留水50μ
をを同様に操作したものについての吸光度（E2）
を測定し、NAGase濃度を計算により求める。 MAGase濃度ｕ／＝ ΔE／63×１×3.05×１／10×1000／0.05 ＝ΔE×96.8 実施例 ５ PR−NAGを0.25Mホウ砂−クエン酸緩衝液
（PH4.4）で25ミリモル濃度に溶解し、50mlガラス
製バイアルに10mlずつ分注し、凍結乾燥して基質
溶液凍結乾燥品とする。 ホウ酸93.7ｇと炭酸ナトリウム706.3ｇを粉砕
後混合して粒度を揃えた後、粉末充填機で1.98ｇ
ずつ120mlポリ瓶に粉末充填する。 実施例 ６ 実施例５で得たPR−NAGの基質溶液凍結乾燥
品を蒸留水50mlで溶かし、このうちの１mlを基質
溶液として用い、実施例５で得た粉末充填したポ
リ瓶に蒸留水100mlを加えて溶かし、このうちの
2.0mlをアルカリ溶液として用いて実施例４と同
様に操作し、NAGase濃度を求める。 NAGase（ｕ／）＝ ΔE／63×１×3.05×１／10×1000／0.05 ＝ΔE×96.8 実施例 ７ 実施例５と同様にしてMCP−NAGの基質溶液
凍結乾燥品を製造し、これを蒸留水50mlに溶解し
たもの１mlを基質溶液として用い、実施例５で得
た粉末述填したポリ瓶に蒸留水100mlを加えて溶
かしたもの２mlをアルカリ溶液として用いて実施
例３と同様に操作する。 580nｍで測定： NAGase濃度（ｕ／）＝ ΔE／38.2×3.05×１／15×1000／0.05＝ΔE×106.46
図１、MCP−NAG法によるNAGase活性と生
成するMCPとの関係を示す。横軸はNAGase濃
度（ｕ／）であり、縦軸は生成するMCPの量
（ΔE580nｍ／15分）である。これより本法により
約200u／まで定量的に測定できることがわか
る。図２、PNP−NAG法とMCP−NAG法の相
関関係を示す。横軸はPNP−NAG法による
MAGase濃度（ｕ／）であり、縦軸はMCP−
NAG法によるNAGase濃度（ｕ／）である。
直線回帰 Ｙ＝1.04×＋0.02、ｒ＝0.9997。
成するMCPとの関係を示す。横軸はNAGase濃
度（ｕ／）であり、縦軸は生成するMCPの量
（ΔE580nｍ／15分）である。これより本法により
約200u／まで定量的に測定できることがわか
る。図２、PNP−NAG法とMCP−NAG法の相
関関係を示す。横軸はPNP−NAG法による
MAGase濃度（ｕ／）であり、縦軸はMCP−
NAG法によるNAGase濃度（ｕ／）である。
直線回帰 Ｙ＝1.04×＋0.02、ｒ＝0.9997。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 下記一般式で示されるＮ−アセチル−β−Ｄ
−グルコサミン誘導体。 （式中、R1〜R3は水素、低級アルキル、または
ハロゲンを示し、Y2はアルカリ金属を示す） ２ 基質試薬として下記一般式で示されるＮ−ア
セチル−β−Ｄ−グルコサミン誘導体を含むＮ−
アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ測定試
薬。 （式中、R1〜R3は水素、低級アルキル、または
ハロゲンを示し、Y2はアルカリ金属を示す） ３ 緩衝剤およびアルカリ試薬を含む特許請求の
範囲２に記載の試薬。 ４ 基質試薬がソジオ−ｍ−クレゾールまたはフ
エノール−スルホンフタレイニル−Ｎ−アセチル
−β−Ｄ−グルコサミナイドとホウ砂の凍結乾燥
品であることを特徴とする特許請求の範囲２に記
載の試薬。 ５ 緩衝剤がクエン酸緩衝剤粉末であることを特
徴とする特許請求の範囲２に記載の試薬。 ６ アルカリ試薬がホウ酸と炭酸ナトリウムの粉
末であることを特徴とする特許請求の範囲２に記
載の試薬。 ７ アルカリ試薬が炭酸ナトリウムの粉末である
ことを特徴とする特許請求の範囲２に記載の試
薬。 ８ 下記一般式で示されるＮ−アセチル−β−Ｄ
−グルコサミン誘導体を含む基質試薬を緩衝液で
溶解し、これに検体を加えてインキユベートし、
アルカリ溶液で発色させて比色定量することを特
徴とするＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダ
ーゼの活性測定法。 （式中、R1〜R3は水素、低級アルキル、または
ハロゲンを示し、Y2はアルカリ金属を示す） ９ 緩衝液のPHが3.5〜6.0であることを特徴とす
る特許請求の範囲８に記載の測定法。 １０ 緩衝液がクエン酸緩衝液であることを特徴
とする特許請求の範囲８に記載の測定法。 １１ インキユベートを10〜15分間行なうことを
特徴とする特許請求の範囲８に記載の測定法。 １２ アルカリ溶液がホウ酸−炭酸ナトリウム緩
衝液であることを特徴とする特許請求の範囲８に
記載の測定法。 １３ 検体がヒトまたは動物の尿または血清であ
ることを特徴とする特許請求の範囲８に記載の測
定法。
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56039104A JPS58994A (ja) | 1981-03-17 | 1981-03-17 | 新規Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン誘導体およびこれを基質として用いるＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダ−ゼ活性測定法 |
| US06/357,317 US4433139A (en) | 1981-03-17 | 1982-03-11 | N-Acetyl-β-D-glucosamnides for determining N-acetyl-β-D-glucosaminidase activity |
| EP82400485A EP0060793B1 (en) | 1981-03-17 | 1982-03-16 | N-acetyl-beta-d-glucosaminides for determining n-acetyl-beta-d-glucosaminidase activity |
| DE8282400485T DE3260690D1 (de) | 1981-03-17 | 1982-03-16 | N-acetyl-beta-d-glucosaminides for determining n-acetyl-beta-d-glucosaminidase activity |
| DK115282A DK163516C (da) | 1981-03-17 | 1982-03-16 | N-acetyl-beta-d-glucosaminider, deres anvendelse til bestemmelse af n-acetyl-beta-d-glucosaminidaseaktivitet og et diagnostisk udstyr, som kan benyttes hertil |
| GB8207797A GB2095666B (en) | 1981-03-17 | 1982-03-17 | N-acetyl- -d-glucosaminides |
| KR8201133A KR870001924B1 (ko) | 1981-03-17 | 1982-03-17 | N-아세틸- β-D-글루코사미니다아제 활성 측정을 위한 N-아세틸-β -D-글루코사미니드류의 제조방법 |
| US06/487,703 US4552841A (en) | 1981-03-17 | 1983-04-21 | N-Acetyl-β-D-glucosaminides for determining N-acetyl-β-D-glucosaminidase activity |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56039104A JPS58994A (ja) | 1981-03-17 | 1981-03-17 | 新規Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン誘導体およびこれを基質として用いるＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダ−ゼ活性測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58994A JPS58994A (ja) | 1983-01-06 |
| JPS637196B2 true JPS637196B2 (ja) | 1988-02-15 |
Family
ID=12543756
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56039104A Granted JPS58994A (ja) | 1981-03-17 | 1981-03-17 | 新規Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン誘導体およびこれを基質として用いるＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダ−ゼ活性測定法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4433139A (ja) |
| EP (1) | EP0060793B1 (ja) |
| JP (1) | JPS58994A (ja) |
| KR (1) | KR870001924B1 (ja) |
| DE (1) | DE3260690D1 (ja) |
| DK (1) | DK163516C (ja) |
| GB (1) | GB2095666B (ja) |
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