KR900005623B1 - Nag 아제의 측정 방법 및 그의 시약 - Google Patents

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Abstract

내용 없음.

Description

NAG 아제의 측정방법 및 그의 시약
제1도는 공지의 활성을 갖는 NAG 아제에 대한 자료로부터 설명되는 본 발명에 의해 얻어진 보정 곡선이고 NAG 아제 활성과 수득된 3,3'-디클로로페놀설폰프탈레인(클로로페놀 레드 : 이하 CPR로 약칭함)간의 관계를 나타낸다. 가로축은 NAG 아제(IU/ι)의 농도를 나타내고, 세로측은 흡광도에 의한 CPR의 생성 속도(△A540nm/min)를 나타낸다.
제2도는 MCP-NAG 방법과 본 발명의 CPR-NAG 방법간의 상호 관계를 나타낸다. 가로축 및 세로축은 각각 MCP-NAG 방법에 의해 얻어진 NAG 아제 농도(IU/ι) 및 CPR-NAG 방법에 의해 얻어진 NAG 아제 농도(IU/ι)를 나타낸다.
직선 회귀 : Y=0.97x+1.84
상관 계수 : r=0.99
제3도는 CPR-NAG 방법(본 발명의 방법) 및 CNP-NAG 방법(종래 기술)에 대한 보정 곡선을 나타낸다. 가로축은 NAG 아제의 농도(IU/ι)를 나타내고 세로축은 30분간의 흡광도 증가를 나타내는데, 곡선 ●-●는 CPR-NAG 방법(△A540nm/min)에 대한 것이다.
본 발명은 신장 이기능의 중요한 표시중의 하나인 N-아세틸-β-D-글루코사미니다아제(이하 NAG 아제로 약칭함)의 활성 측정용 키트(kit) 및 그것을 사용한 활성의 측정 방법을 제공한다.
4-메틸움벨리페릴 N-아세틸-β-D-글루코사미나이드(이하 4MU-NAG로 약칭함) 및 p-니트로페닐 N-아세틸-β-D-글루코사미나이드(이하 PNP-NAG로 약칭함)는 오랫동안 NAG 아제 활성 측정용 기질로 공지되어 왔다. 그러나, 그것을 사용하는 방법은 각 시험에서 요 블랭크(urine blank) 및 기질 블랭크가 요구되고, 요내의 억제제에 의해 영향 받기 쉽고, 측정에 오랜 시간이 필요하다는 단점을 갖는다.
메타-크레졸설폰프탈레인(이하 MCP로 약칭함)이 지시약인 소디오-메타-크레졸설폰프탈레이닐 N-아세틸-β-D-글루코사미나이드(이하 MCP-NAG로 약칭함)가 상기와 같은 단점을 줄일 수 있는 기질로서 개발되어 일본국 특허출원 공개 제58-994호에 기재되었다. 그러나, 여전히 기질 블랭크 및 NAG 아제 활성을 측정하기 위해 알칼리 시약을 첨가하는 종결 단계가 필요하다(일점법)는 단점을 갖는다.
최근에, 2-클로로-4-니트로페닐-N-아세틸-β-D-글루코사미나이드(이하 CNP-NAG로 약칭함)가 반응은 종결하지 않고 NAG 아제 활성을 결정(연속법) 할 수 있는 시약으로서 개발되어 일본국 특허출원 공개 제61-112092호에 기재되었다. 이 방법에서는, 효소 활성이 계속해서 기록되고 방법을 쉽게 자동 분석기에 적용할 수 있다. 그러나, 이것은 기질이 물에 거의 용해되지 않기 때문에, 계면활성제의 존재하에서도, CNP-NAG를 완전히 용해시키는데 수분이 걸린다는 단점을 여전히 갖는다. 더군다나, 그것은 소량의 NAG 아제의 활성을 결정하는데 많은 시간이 소요된다.
본 발명은 실질적으로 알칼리 시약없이 하기 시약(a) 및 (b)를 함유하는 NAG 아제 활성 측정용 키트를 제공한다: (a) 하기 일반식의 소디오-3,3'-디클로로페놀설폰프탈레이닐 N-아세틸-β-D-글루코사미나이드(이하 CPR-NAG로 약칭함)를 함유하는 기질 시약:
Figure kpo00001
및 (b) 완충제.
본 발명가들은 문제를 해결하기 위해 시도한 결과, 새로운 기질, 고용해도 및 취급 용이성을 제공하는 본 발명을 완성하였다. 본 발명의 키트는 요 블랭크를 요구하지 않으며 연속법으로 활성을 결정할 수 있다. 더군다나, NAG 아제 활성의 측정은, 본 발명의 방법이 매우 고민감성을 갖기 때문에 NAG 아제가 극히 소량인 경우에도 정확하고 빠르게 수행할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 소디오-3,3'-디클로로페놀-설폰프탈레이닐 N-아세틸-β-D-글루코사미나이드(CPR-NAG)는 일본국 특허출원 공개 제58-994호에 기재된 방법에 따라서, 3,3'-디클로로페놀설폰프탈레인(CPR) 및 1-클로로-1-데옥시-2,3,4,6-테트라아세틸-α-D-글루코사민으로부터 쉽게 제조할 수 있다.
CNP-NAG와는 달리, 전술한 CPR-NAG는 물에 자유롭고 빠르게 용해되어, 계면 활성제와 같은 특정부가제가 필요없다. 따라서 기질 용액은 매우 빠르게 제조할 수 있다.
기질의 분해는 효소 활성의 측정 가능 한계를 더 좁히기 때문에 기질을 안정화시키는 것이 매우 중요하다. 본 발명에서 사용되는 CPR-NAG는 어떤 안정제 없이도 매우 안정하므로, 그대로 조제할 수 있다.
더군다나, 측정 가능 한도의 감소없이 냉장고에서 오랜기간 동안 저장 가능하다. 훨씬 더 긴 저장 수명을 원한다면, 보랙스(Borax)를 안정제로 첨가할 수 있다. 보랙스는 CPR-NAG 1부에 대하여 약 0.02~약 2.0부, 더 바람직하게는 약 0.6~1.2부의 양으로 첨가할 수 있다.
시약을 키트로 조제하는데 있어서, 기질 시약 및 완충제를 분할 제제 또는 단일 제제로서 조제할 수 있다. 그 외형 및 안정성을 고려해볼 때 동결 건조액으로 조제하는 것이 바람직하다.
NAG 아제가 pH 약 4.5~약 5.0에서 최대 활성을 나타내지만, CPR-NAG를 사용하는 본 발명에서는 pH 약 6.25에서 겉보기 반응 속도가 최대가 된다. 따라서, 반응 pH가 약 4.5~약 8.0의 범위로 유지될 수 있는 한 어떤 완충제를 사용해도 무방하다. 더 바람직하게는, pH가 약 6.0~6.5로 유지될 수 있는 완충액 및 가장 바람직하게는 pH가 약 6.2~6.3으로 유지될 수 있는 완충액을 사용한다. 예를들면, 시트레이트 완충액, 보랙스-시틀이트 완충액, 시트레이트-인산염 완충액, 인산염 완충액, 보랙스-인산염 완충액, 소듐 바르비테이트-소듐 아세테이트 완충액, 굳스 완충액(Good's buffer) 등을 사용할 수 있다.
전술한 MCP-NAG를 사용하는 방법에서는, 효소는 기질과 잘 반응해야만 하고 효소 비활성화 및 발색(color development)을 위해 알칼리 시약이 첨가된다. 이 방법은 본 발명의 방법과 비교하여 이러한 첨가단계가 필요하다. 더군다나, 반응에 빠른 발색을 관찰할 수 없기 때문에, 반응이 진행되기전에 알칼리 시약을 첨가한다면 측정을 다시 반복해야만 한다.
한편, 본 발명의 키트를 사용한 활성의 측정은 효소 반응의 진행이 흡광도 변화에 의해 직접 추적될 수 있으므로 전술한 실수없이 쉽게 행할 수 있다. 최근 분석 기구의 대부분이 연속 방법용으로 고안되기 때문에, 효소 활성을 자동적으로 측정하는 것은 아주 쉽다.
[측정 원리]
기질 시약 CPR-NAG를 NAG 아제로 가수분해시켜 pH 약 4.5~8.0 완충액내에 용해된 CPR을 수득한다. pKa가 약 5.8인 생성된 CPR이 즉시 적자색을 나타낸다. NAG 아제 활성은 단위 시간의 경과에 대한 흡광도의 변화로 측정된다.
[연속 방법의 절차]
1.0ml의 기질 완충액(2~6mM CPR-NAG, pH 약 4.5~8.0)에 50㎕의 시험 시료*를 첨가한다. 파장 575mm에서 혼합 용액의 흡광도 A1및 A2는 시험 시료의 첨가 후 각각 시간 t1및 시간 t2에서 등온 셀(constant-temperature cell)의 장비를 갖춘 스펙트로포토미터로 측정한다.
주 : 시험 시료*는 인간 또는 동물에서 수거된 요 도는 혈청을 의미하는데, 수거 후 즉시 측정하는 것이 바람직하다. 오랜 기간 동안 보존할 필요가 있을때에는, 시료 pH를 2N-HCL 또는 2N-KOH를 이용하여 6.5로 조정하는 것이 좋다. 이러한 조건하에서, 시험 시료내의 NAG 아제 활성이 실온에서는 하룻동안 및 -20℃
에서는 4개월 동안 안정하다.
[효소 활성의 정의]
측정 조건에서, 분당 1μM의 CPR을 만들 수 있는 NAG 아제의 양을 1IU로 정의한다.
[효소 활성의 계산]
NAG 아제 활성은 하기 식에 따라 계산할 수 있다.
Figure kpo00002
ε=사용된 파장 및 pH에서의 CPR의 흡광계수(㎠/μM)
d=광로의 길이(㎝)
△t, 즉(t2-t1)은 보통 1~20분, 및 바람직하게는 5~10분이다.
본 발명은 본 발명의 범위를 제한하지 않는 하기 실시예 및 시험예에서 더 자세히 설명된다.
[제조예 1]
3,3'-디클로로페놀설폰프탈레이닐 N-아세틸-β-D-글루코사미나이드 펜타아세테이트(1)의 제조
메탄올(4ml)에 용해된 클로로페놀 레드(1.4g,3.3mmol)의 교반 용액에 소듐 메톡시드(6.8ml, 3.3×2mmol)을 첨가하고 용액을 15분간 더 교반한다. 용매를 35℃ 이하 감암합에서 제거하고 생성된 잔류물을 톨루엔으로 연화시키고 용매를 감압하에서 제거한다. 톨루엔 (×2)으로 반복해서 공동-증류한후, 잔류물을 감압하에서 건조시킨다.
7ml의 디메틸포름아미드(DMF)에 용해된 상기 수득된 이나트륨염의 용액에 아세토클로로글루코사민(1.1g,3mmol)을 첨가하고 용액을 21시간 동안 교반한다. 그런 후 용액을 10ml의 앰버라이트
Figure kpo00003
IRC-50(Amberlite
Figure kpo00004
IRC-50, Rohn & Hass Co. 제품)과 합하고 생성된 혼합물을 30분간 교반한다. 수지를 여과하고 메탄올로 세척한다. 여액 및 세척액을 수거하고 증발 건조시킨다.
잔류물을 피리딘(20ml)에 용해시킨 후 아세트산 무수물(10ml)을 첨가하고 용액을 실온에서 밤새도록 방치시킨다. 용매 및 시약을 진공에서 제거한 후, 톨루엔을 잔류물에 첨가하고 용액을 다시 진공에서 증발 건조시킨다. 잔류물을 실리카겔(3% 물을 함유하는 10g의 SiO2, 0.063~0.2mm) 크로마토그래피하여 디클로로메탄 분획(160ml)로부터 2.1g의 무색 고무 물질을 수득한다. 이것을 컬럼크로마토그래피(Lober B, 용매계:아세트산)로 다시 정제하여 0.98g의 목적 화합물을 4/9분획(분획당 15g)으로 수득한다. 이것을 에틸 아세테이트/에테르에서 재결정화시켜 0.8g(36.9% 수율)의 표제 화합물(1)을 수득한다. 융점 142~143℃.
IRνmax(Nujol):3265,3090,1750,1663,1604,1556,1352㎝-1.
NMR(90MHz,CDCl3)δ:1.85(3H,s),2.00(9H,s),2.32(3H,s).
원소분석 C35H33NO14Cl2S.1/2H2O;
계산치:C;52.32, H;4.27, N;1.74, Cl;8.83, S;3.99
실측치:C;52.33, H;4.25, N;1.73, Cl;8.34, S;3.84
[제조예 2]
소디오-3,3'-디클로로페놀설폰프탈레이닐 N-아세틸-β-D-글루코사미나이드(2)의 제조
18ml의 메탄올에 용해된 제조예 1에서 제조된 2.057g(2.56mmol)의 화합물(1)의 교반 용액에 메탄올(5.3ml)에 용해된 0.9717M 소듐 메톡시드(2.58×2mmol)의 용액을 첨가한다. 질소 대기하에서 3시간 방치한후, 앰버라이트
Figure kpo00005
IRC-50(10ml)를 첨가하고 혼합물을 한시간 교반한후, 수지를 여과하고 메탄올로 세척한다. 여액 및 세척액을 수거하고 35℃ 이하 진공에서 증발 건조시켜 황색 거품을 수득한다. 이것을 5ml의 물에 용해시키고, DEAE-세파로오스
Figure kpo00006
CL-6B(DEAE-Sepharose
Figure kpo00007
CL-6B, 10ml; Pharmacia Co. 사제품) 크로마토그래피하고, 분획을 수거한다. 분획을 동결 건조시켜 1.735g(98.1% 수율)의 목적 화합물(2)를 무정형 분말로 수득한다.
원소분석 C35H33NO14Cl2S.1/2H2O;
계산치:C;49.24, H;4.28, N;2.03, Cl;10.26, S;4.64
실측치:C;48.87, H;4.61, N;2.05, Cl;9.81, S;4.38
[실시예 1]
CPR-NAG를 50mM 보랙스를 함유하는 물에 용해시켜 30mM CPR-NAG를 함유하는 수용액을 제조하고, 각각 2ml씩을 20ml 유리 바이알에 담고 동결 건조시켜 기질 시약을 제조한다.
디포타슘 시트레이트(502.9g) 및 포타슘 시트레이트(1014.0g)을 분말로 분쇄하고, 서로 혼합하고, 입자 크기를 균일화한 후, 각각 304.4mg씩을 25ml 플라스틱 병에 담아 완충제를 수득한다.
증류수(20ml)를 완충제에 가하여 완충 용액을 제조한 후, 기질 시약을 가하여 시약 용액(pH 6.25)을 수득한다.
[실시예 2]
500mM(pH 6.10)의 비스-트리스*완충 용액에 30mM CPR-NAG, 50mM 보랙스, 및 1.5M 염화나트륨을 용해시키고 용액을 각각 2ml씩 20ml 유리 바이알에 담은 후 동결 건조시켜 완충 시약을 함유하는 측정용 시약을 수득한다.
주) 비스-트리스*는 비스(2-히드록시에틸)이미노트리스(히드록시메틸) 메탄을 의미한다.
증류수(200ml)를 여기에 첨가하여 측정용 시약 용액(pH 6.25)을 수득한다.
[실시예 3]
50mM 보랙스를 함유하는 pH 5.84의 500mM 포타슘 시트레이트 완충액에 30mM CPR-NAG를 용해시키고, 용액을 1.1ml씩 분할하고 14ml 유리 바이알에 담은 후 동결 건조시킨다.
동결 건조된 기질에 11ml의 증류수를 첨가하여 기질 용액(pH 6.25)를 수득한다.
[실험예 1]
96-웰 평판 마이크로 타이터플레이트의 각 웰에 실시예 1에서 제조된 100μ1의 시약 용액(pH 6.25)을 담고 여기에 각각의 시험 시료 10㎕씩을 가한다. 540nm의 파장에서의 흡광도 A1을 마이크로플레이트 스펙트로포토미터(MCC 340형, Ti-tertech Co. 제품)로 측정한다. 시험 시료를 실온에서 방치하고, 정확히 10분 후에, 540nm에서 A2를 다시 측정한다.
시험 시료 대신에 10㎕의 증류수를 가하여 제조한 블랭크의 흡광도(△B=B2-B1)를 상기와 동일한 방법으로 측정한다.
시험 시료에서와 동일한 방법으로, 보정 곡선은 공지된 활성을 갖는 NAG 아제 표본에 대한 흡광도로부터 설명된다. NAG 아제 활성은 분당 흡광도의 변화에서 계산된다.
Figure kpo00008
제1도는 보정 곡선을 나타내고, 제2도는 본 발명에 의한 방법과 통상의 MCP-NAG(NAG Test Shionogi:상품명)에 의한 일점법간의 상호 관계를 나타낸다.
[실험예 2]
시판되는 NAG 아제 활성용 키트를 사용하여 (CNP-NAG 연속 방법), 시약 용액을 지시용법에 따라 제조한다. 시약 용액(각각 50㎕씩)을 96-웰 평판 마이크로타이터플레이트의 웰에 담는다. 또한 웰에 공지된 활성을 갖는 NAG 아제의 표준 용액 10㎕씩을 가한다. 405nm의 파장에서의 흡광도 A1을 마이크로플레이트 스펙트로포토미터(MCC 340형, Titertech Co. 제품)으로 측정한다. 시험 시료를 실온에서 방치하고, 정확히 30분 후에 405nm에서의 A2를 다시 측정하여 CNP-NAG법에 대한 보정 곡선(○-○)을 설명한다(제3도).
실시예 1에서 제조한 시약 용액(각각 100㎕씩, pH 6.25)을 96-웰 평판 마이크로타이터플레이트의 웰에 담고, 또한 시험 시료를 각각 10㎕씩 가한다. 540nm에서의 흡광도 A1을 마이크로플레이트 스펙트로포토미터(MCC 340형, Titertech Co. 제품)으로 측정한다. 시험 시료를 실온에서 방치하고, 정확히 10분 후에 540nm에서의 A2를 측정하여 본 발명의 CPR-NAG법에 대한 보정 곡선(●-●)을 설명한다(제3도).
제3도에서 명백히 볼 수 있듯이, 본 발명의 방법은 통상의 방법과 비교하여 대략 3~4배 민감하다. NAG 아제의 농도가 매우 낮다면, 저민감성을 갖는 방법으로는 정확히 측정하기 위해 장시간이 요구된다; 반면에 본 발명이 제공하는 고민감성을 갖는 방법은 매우 단시간내에 정확히 측정할 수 있게 한다. 이점이 장점이다.

Claims (7)

  1. 실질적으로 알칼리 시약없이 (a) 하기 일반식의 소디오-3,3'-디클로로페놀설폰프탈레이닐 N-아세틸-β-D-글루코사미나이드를 함유하는 기질 시약: 및 (b) 완충제를 함유함을 특징으로 하는 N-아세틸-β-D-글루코사미니다아제 활성의 측정용 키트.
    Figure kpo00009
  2. 제1항에 있어서, 시약(a) 및 (b)를 단일 용기에 함께 담는 키트.
  3. 제2항에 있어서, 소디오-3,3'-디클로로페놀설폰프탈레이닐 N-아세틸-β-D-글루코사미나이드, 보랙스, 및 완충제의 동결 건조 혼합물을 함유하는 키트.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 완충제가 시트레이트인 키트.
  5. 제1항에 있어서, 시약(a) 및 (b)을 각각 개별 용기에 담는 키트.
  6. 제5항에 있어서, 기질 시약(a)가 소디오-3,3'-디클로로페놀설폰프탈레이닐 N-아세틸-β-D-글루코사미나이드 및 보랙스의 동결 건조 혼합물인 키트.
  7. 하기 일반식의 소디오-3,3'-디클로로페놀 설폰프탈레이닐 N-아세틸-β-D-글루코사미나이드를 함유하는 시약을 완충액에 용해시켜 pH 6.0~pH 6.5의 기줄 용액을 수득하고, 시험 시료를 기질 용액에 가하고, 생성된 3,3'-디클로로페놀설폰프탈레인을 연속적으로 비색측정함을 특징으로 하는 N-아세틸-β-D-글루코사미니다아제 활성의 측정 방법.
    Figure kpo00010
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