JPS63309199A - ＮＡＧａｓｅ活性測定用試薬および測定方法 - Google Patents

ＮＡＧａｓｅ活性測定用試薬および測定方法

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JPS63309199A JP62146143A JP14614387A JPS63309199A JP S63309199 A JPS63309199 A JP S63309199A JP 62146143 A JP62146143 A JP 62146143A JP 14614387 A JP14614387 A JP 14614387A JP S63309199 A JPS63309199 A JP S63309199A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 星１」Ｊｌ先肚立ヱ 本発明は腎臓障害を鋭敏に反映するＮ−アセチル−β−
Ｄ−グルフサミニダーゼ（以下、ＮＡＧａｓｅという）
の活性測定用試薬およびそれを用いた測定方法誉提供す
る。
ｋ米韮オ Ｎ、Ａｃａｓｅ活性測定用基質としては、４−メチルウ
ンベリフェリルＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド
（４−Ｍａｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆａｒｙｌ　Ｎ−ａ
ｃａｔ−ｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓａａ＋１ｎｉｄｅ
：　４　Ｍ　Ｕ　−Ｎ　Ａ　Ｇ　）、バラニトロフェニ
ルＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド（ＰＮＰ−Ｎ
ＡＧ）が古くから知られていたが、これらは各検体毎に
基質ブランク及びｌブランクが必要であったり、尿中阻
害物質の影響を受は易い、反応に長時間を要する等の欠
点がある。
また、メタクレゾールスルホンフタレイン（以下、ＭＣ
Ｐという）を呈色物質とするソジオーメタクレゾールス
ルホンフタレイニルＮ−７セチルーβ−Ｄ−グルコサミ
ニド（以下、ＭＣＰ−ＮＡＧという）が開発され、これ
らの欠点を解決する基質として特開昭５８−９９４に開
示されているが、基質ブランクが必要であり、またアル
カリ試薬で一旦酵素反応を停止させなければＮＡＧａｓ
ｅ活性を測定できない（ワンポイント測定法）等の欠点
があった。
Ｒ近、２−’）フロー４−ニトロフェニル−Ｎ　−アセ
チル−β−Ｄ−グルコサミニド（以下、ＣＮＰ−ＮＡＧ
という）が開発され、反応を停止することなくＮＡＧａ
ｓｅ活性を測定する（連続測定法）試薬が特開昭６１−
１１２０９２に開示されている。これは反応速度を連続
的に測定して酵素活性を測定する方法で自動測定が容易
である。しかし、ＧＮＰ−ＮＡＧは水に難溶性である為
、界面活性剤を添加しても、尚、使用時に基質を完全に
溶解するのに数分を要する等の欠点がある。また、微量
のＮＡＧａｓｅの測定には長時間を要する等の欠点もあ
る。
ｉ区工二に１羞 本発明者らは以上の点に鑑み、水に易溶性の取り扱い易
い基質を見出すべく研究を重ねた結果、本発明を完成し
た０本発明が提供する測定用試薬は、尿ブランクを必要
とせず、連続測定が可能である。また、非常に高感度で
ある為、微量のＮＡＧａｓｅでも短時間で正確に測定で
きる。
シ　、を　する　の段 本発明で使用するソジオ−３，３゛−ジクロロフエノー
ルスルホンフタレイニル　Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グル
コサミニド（以下、ＣＰＲ−ＮＡＧといつ）は３．３゛
−ジクロロフェノールスルホンフタレイン（クロロフェ
ノールレッド二〇ＰＲと略記する）と１−クロロ−１−
デオキシ−２，３゜４．６−チトラアセチルーα−Ｄ−
グルコサミンとから特開昭５８−９９４記載の方法に従
って、容易に合成することができる。
該ＣＰＲ−ＮＡＧは水に任意の割合で速やかに溶解する
ので、前記ＧＮＰ−ＮＡＧの様に界面活性剤等の特別な
添加剤を必要としない、従って、基質溶液を極めて短時
間で調製することができる。
基質化合物の分解は、酵素活性の測定限界を低下させる
ことに成る為、基質化合物の安定化は重要な課題である
０本発明で使用するＣＰＲ−ＮＡＧは、格別の安定化剤
を添加しなくてもかなり安定であり、その債、製剤化し
うる。また、冷暗所で保存すれば、測定限界を低下させ
ること無く、相当期間保存しうる。更に長期間の安定性
を欲すれば、安定化剤としてホウ砂を少量添加すること
ができる。ホウ砂の添加量は、ＣＰＲ−ＮＡＧＩ重量部
に対して約０．０２〜約２．０重量部、更に好ましくは
約０．６〜約１．２重量部である。
また試薬の製剤化に際しては、基質試薬と緩衝剤とを別
々の製剤として調製してもよいし、これらを−個の製剤
としてもよい、製剤の美観や安定性を考慮すれば、これ
らは凍結乾燥品とするのが好ましい。
本来、ＮＡＧａｓｅの活性は反応ｐＨが約４．５〜約５
．０の時に極大となるが、該ＣＰＲを発色物質として使
用すれば、反応速度は見かけ上ｐＨ約６．２５付近で最
大になる。従って、使用する緩衝剤はＮＡＧａｓｅの反
応ｐＨを約４．５〜約８．０に保つことができれば全て
使用される。更に好ましくは、該ｐＨが約６．０〜約６
．５、最も好ましくは約６．２〜約６．３である緩衝剤
を使用する０例えば（クエン酸、ホウ砂／クエン酸、ク
エン酸／リン酸、リン酸、ホウ砂／リン酸、バルビター
ル・ナトリウム／酢酸ナトリウム、グツド緩衝剤等が例
示され、適宜、精製水に溶解して使用する。
前記ＭＣＰ−ＮＡＧの測定法では、酵素反応を充分に進
行させた後、アルカリ試薬を添加して酵素を失活させる
と共に、生成したアグリコン（ＭＣＰ）を発色させなけ
ればならない、この方法では操作が１つ増すばかりでな
く、反応の進行を呈色によって知ることができないので
、反応不充分でアルカリ試薬を添加した場合には、再度
測定を行なわなければならない。
一方、本発明測定用試薬に於ては、酵素反応を吸光度変
化として直接追跡できるので、操作が簡便であるのみな
らず、前記のようなミスは生じない、更に、最近の自動
測定器の多くは、連続測定用に設計されており、測定の
自動化が容易である。
（測定原理） ｐＨ約４．５〜約８．０の緩衝液中で、基質化合物ＣＰ
Ｒ−ＮＡＧはＮＡＧａｓｅにより加水分解されてＣＰＲ
を生成する。ＣＰＲのｐＫａは約５．８であり、生成し
たＣＰＲは直ちに赤紫色（入ｉａａｘ−５７５ｎｍ）を
呈する。単位時間後の吸光度差からＮＡＧａ　ｓ　ｅ活
性を求める。
（連続測定法測定操作） 基質溶液（２〜、６ｍＭ、ｐＨ約４．５〜約８．０）１
　、０　ｍｌに検体１１５０μ夕を加えて、３７℃にて
恒温セルホルダー付分光光度計で検体添加ｔ１分後とｔ
２分後の５７５ｎｍにおける吸光度Ａ１及びＡ２をそれ
ぞれ測定する。
注）検体： ヒトまたは動物由来の尿または血清であり、採取後直ち
に測定するのが好ましい、しかし、長時間保存するとき
は２Ｎ塩酸または２Ｎ水酸化カリウムを用いてｐＨを６
．５に調整しておく、こうすれば、検体中のＮＡＧａａ
ｅ活性は室温で約１日、−２０℃で約４ケ月間安定であ
る。
（酵素活性の定義） 測定条件下、１分間に１μＨのＣＰＲを生成移せるＮＡ
Ｇａｓｅの量をＩ　ＩＵ／４とする。
（酵素活性の求め方） ＮＡＧａｓｅ活性は次式より算出される。
ΔＡ”Ａ２−Ａｌ ε−ＣＰＨの測定ｐＨ１測定波長における吸光係数（ａ
ｍ’／μＭ） ｄ−光路長（ｃｍ） Δｔ（ｔ２−ｔ’）は通常１〜２０分、特に５〜１０分
が好ましい。
以下の諸実施例、諸実験例により本発明を更に詳しく説
明するが、これらは何等、本発明を限定するものではな
い。
（以下余白） 参考例　１ クロロフェノールレッド（１、４ｇ　、　３．３ｍｍｏ
ｌ）のメタノール（４１１１１）溶液に０．９７１７Ｍ
のナトリウムメチラート（６，８ａＦ！、　　３．３　
Ｘ　２ｍｍｏｌ）を加えて１５分間攪拌した後、３５℃
以下でメタノールを減圧留去する。残渣にトルエンを加
えて摩砕したのち減圧乾固する。同操作を更に２回繰り
返し、次いで減圧乾燥する。
この様にして得たニナトリウム塩をＤＭＦ（７ｍｌ）に
溶解し、アセトクロログルフサミン（１゜１　ｇ、　　
３ｎ＋ｍｏｌ）を加えて２１時間攪拌する。これニアン
バーライト＠ＩＲＣ−５０（１０ｍｌ　）を加えて３０
分攪拌した後、濾過し、メタノールで洗浄する。濾液お
よび洗液を合し、減圧乾固する。
残渣をピリジン（２０ｍｆ）に溶解後、無水酢酸（１０
ｍ１）を加えて室温にて一夜放置する。
反応混液を減圧濃縮し、トルエンを加えて更に減圧濃縮
する。残渣をカラムクロマトグラフィー（水３％含有５
ｉｎｓ　１０　ｇ　、　０．０６３−０．２ｍｍφ）に
付してジクロルメタンの画分（１６０ｍｊりから２゜１
ｇの無色あめ状物を得る。これを更にカラムクロマトグ
ラフィー（ローバーカラムＢ、溶媒系：酢酸エチル）に
付して第４〜９画分（１５ｇ／画分〉を集め、目的物を
０．９８ｇ得る。これを酢酸エチル／エーテルより再結
晶して標題化合物（１）ｏ、ｓ　ｇ（収率３６．９％）
を得る。　ｍｐ　１４２〜１４３℃。
ＩＲνｍａｘ（Ｎｕｊｏｌ）　：　３２６５．３０９０
．１７５０．１６６３゜１６０４、１５５６．１３５２
　ｃｍ−１゜ＮＭＲ（９０ＭＨｚ、　ＣＤＣｌ５）δ：
　１．８５　（３Ｈ，ｓ）、　２．００（９Ｈ，ｓ）、
　２．３２　（３Ｈ，ｓ）。
元素分析Ｃｓ　＊Ｈｓ　ｓＮＯ＋−Ｃ１＊Ｓ−にＨ，Ｏ
として、（計算値） Ｃ；　５２．３２．　Ｈ：　４．２７．　Ｎｉ　１．７
４．　ａｌ；　８．８３゜５；３．９９゜ （実測値） Ｃ；　５２．３３．　Ｈ；　４．２５．　Ｎ；　１．７
３．　Ｃ１；　８．３４゜５；　３．８４゜ 参考例　２ 参考例１で得た化合物（１）２．０５７　ｇ　（２，５
６ｍｍｏｌ　）をメタノール１８ｍｊ！に溶解し、０．
９７１７Ｍのナトリウムメチラート５．３１１１　（２
，５８Ｘ２　ｍｍｏｌ　）を加えて、窒素気流中で３時
間反応させる０反応液にアンバーライト・ＩＲＣ−５０
（１０ｍｊ！　）を加えて１時間攪拌した後、濾過し、
メタノールで洗浄する。濾液および洗液を合し、３５℃
以下で減圧乾固する。得られた黄色泡状物を５ｍｌの水
に溶解し、これをＤＥＡＥ−セファロース＠ＣＬ−６Ｂ
（１０ｍｊ！、ファルマシア社製）のカラムに通じて、
流出液を集める。流出液を凍結乾燥して目的化合物（２
）１７３５ｇ（収率９８．１％）を非晶状粉末として得
る。
元素分析Ｃ＊　ｔＨ＊　ａＮＯ＋　ｅｃｌ、ｓＮａ−Ｍ
ｅＯＨＨ％　ＨｔＯとして、 （計算値） Ｃ：　　４９．２４．Ｈ；　　４．２８．Ｎｉ　　２．
０３．Ｃ１ｉ　　１０．２６゜５；　　４．６４゜ （実測値） Ｃ；　４ｇ、８７．　Ｈ；４．６１．　Ｎ；　２．０５
．　Ｃ１ｉ　９．８１゜Ｓｉ　４．３ｇ。
実施例　Ｉ ＣＰＲ−ＮＡＧを５０ｍＭホウ砂含有の水溶液で３０ｍ
Ｍ濃度に溶解し、２０ｍ１ガラスバイアルに２ｍ１２ず
つ分注した後、凍結乾燥して基質試薬とする。
クエン酸二カリウム塩５０２．９　ｇとクエン酸三カリ
ウム塩１０１４．０　ｇを続砕後、混合して粒度を揃え
て粉末充填機で３０３．４ｍｇずつ２５ｔｎｅポリ容器
に充填して緩衝剤とする。
用時、蒸留水２０ｍｊ！を加えて緩衝溶液を調製し、そ
の全量を基質試薬に加えて測定用試薬溶液（ｐＨ６，２
５）を調製する。
実施例　２ ＣＰＲ−ＮＡＧ３０ｍＭ、ホウ砂５０ｍＭおよび塩化ナ
トリウム１．５ＭをＢ１５−Ｉｒｉｓ”緩衝液５００ｍ
Ｍ（ｐＨ６，１０）に溶解し、これを２０ｍｆガラスバ
イアルに２ｍｆずつ分注した後、凍結乾燥して緩衝剤を
含有する測定用試薬とする。
注）＊：ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（
ヒドロキシメチル）メタン。
用時、蒸留水２０ｍｆｆ１を加えて測定用試薬溶液（ｐ
Ｈ６，２５）を調製する。
実験例　１ 実施例１″′Ｃ−調製した測定用試薬溶液（ｐＨ６，２
５）１００μ２を９６穴平底マイクロプレートの各穴に
取り、各々に検体１０μｉずつを加える。
マイクロプレート分光光度計（ＭＣＣ３４０型：タイタ
ーチック社製）で５４０ｎｏ＋における吸光度ＡＩを測
定する。室温下で放置し、正確に１０分後、再び５４０
ｎｗ＋における吸光度Ａ２を測定する。
ブランクとして検体の替わりに蒸留水１０μｋを加えた
ものを前記と同様に操作して、ブランクの吸光度をそれ
ぞれ求める（ΔＢＭＢ’−Ｂ’）ｅ検体と同様に、活性
既知のＮＡＧａｓｅを同様に反応させて検量線を作成し
、１分間あたりの吸光度変化からＮＡＧａｓｅ活性を求
める。
検量線を第１図に示し、従来のＭＣＰ−ＮＡＧワンポイ
ント測定法（ＮＡＧテストジオツギ：商標）との相関関
係を第２図に示す。
実験例　２ 市販のＮＡＧａｓｅ活性測定用試薬（ＧＮＰ−ＮＡＧ連
続測定法）を求め、記載の使用方法に従って試薬溶液を
調製する。試薬溶液５０ａｌを９６穴平底マイクロプレ
ートの各穴に取り、各々に活性既知のＮＡＧａｓｅ標準
液を１０μにずつ加える。マイクロプレート分光光度計
（ＭＣＣ３４０型：タイターチック社製）で４０５ｎｍ
における吸光度ＡＩを測定する。室温下で放置し、正確
に３０分後、再び４０５ｎｍにおける吸光度Ａ２を測定
して、ＧＮＰ−ＮＡＧ法の検量線（Ｏ−○）を作成する
。第３図。
実施例１で調製した本発明の測定用試薬溶液（ｐＨ６，
２５）　１００μ！を９６穴平底マイクロプレートの各
穴に取り、各々に検体１０μ２ずつを加える。マイクロ
プレート分光光度計（ＭＣＣ３４０型：タイターチック
社製）で５４０ｎｍにおける吸光度Ａ１を測定する。室
温下で放置し、正確に１０分後、再び５４０ｎｍにおけ
る吸光度Ａ２を測定して、ＣＰＲ−ＮＡＧ法（本発明）
の検量、＊（・−・）を作成する。第３図。
第３図から明らかな様に、本発明による方法は先行技術
のものと比較して、測定感度が約３〜４倍高い＠　Ｎ　
Ａ　Ｇ　ａ　ｓ　ｅの濃度が非常に低い場合には、感度
が低ければ反応に長時間を費やさなければ正確な測定が
できないが、本発明方法の様に感度が高ければ、短時間
で正確な測定ができるので便利である。
【図面の簡単な説明】
第１図は、活性既知のＮＡＧａａｅから求めた本発明試
薬の検量線であり、ＮＡＧａｓｅ活性と生成するＣＰＲ
との関係を示す、横軸はＮＡＧａｓｅｄ１度（ＩＵ／ｌ
を示し、縦軸は生成するＣＰＲの量を吸光度（ΔＡｓａ
＊ｎ１１１／分）で示す。 第２図は、ＭＣＰ−ＮＡＧ法と本発明方法（ＣＰＲ−Ｎ
ＡＧ法）の相関関係を示す、横軸はＭＣＰ−ＮＡＧ法に
よるＮＡＧａｓｅ濃度（ＩＵ／ｉを示し、縦軸はＣＰＲ
−ＮＡＧ法によるＮＡＧｉｓｅａ度（ＩＵ／ｌ）を示す
。 直線回帰　Ｙ＝０．９７ｘ　Ｘｌ、８４相関係数　ｒ＝
０．９９ 第３図は、本発明方法（ＣＰＲ−ＮＡＧ法）および先行
技術の方法（ＧＮＰ−ＮＡＧ法）によるそれぞれのＮＡ
Ｇａｓｅ検量線を示す図、横軸はＮＡＧａｉｅ濃度（Ｉ
Ｕ＃りを示し、縦軸は３０分あたりの吸光度変化を示す
６図中、・−・はＣＰＲ−ＮＡＧ法（ΔＡｓ４＊ｎａ／
分）を、Ｏ−ＯはＣＮＰ−ＮＡＧ法（ΔＡａｅａｎｌｌ
／分）を示す。 第１図 Ｎ　Ａ　Ｇａ５ｅ　（ＩＵ／ｊり 第２図 ｔｏ　　　２０　　３０　　４０　　５０　　６０ＭＣ
Ｐ−ＮＡＧ　　（ＩＵ＃り 第３図 ｏ　　　ｓｏ　　　ｔｏ。 Ｎ　Ａ　Ｇａ５５　（ＩＵ／ｌ） 昭和６３年　４月２２日

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）下記試薬ａおよびｂより成り、実質的にアルカリ
    試薬を含まないＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダ
    ーゼ活性測定用試薬。 ａ、次式： ▲数式、化学式、表等があります▼ で示されるソジオ−３，３′−ジクロロフェノールスル
    ホンフタレイニルＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニ
    ドを含有する基質試薬、 ｂ、緩衝剤。
  2. （２）前記試薬ａおよびｂが、それぞれ別々の容器に充
    填されている特許請求の範囲第１項記載の測定用試薬。
  3. （３）基質試薬ａがソジオ−３，３′−ジクロロフェノ
    ールスルホンフタレイニルＮ−アセチル−β−Ｄ−グル
    コサミニドとホウ砂との凍結乾燥品である特許請求の範
    囲第２項記載の測定用試薬。
  4. （４）前記試薬ａおよびｂが、一の容器に充填されてい
    る特許請求の範囲第１項記載の測定用試薬。
  5. （５）該測定用試薬がソジオ−３，３′−ジクロロフェ
    ノールスルホンフタレイニルＮ−アセチル−β−Ｄ−グ
    ルコサミニド、ホウ砂および緩衝剤の凍結乾燥品である
    特許請求の範囲第４項記載の測定用試薬。
  6. （６）次式： ▲数式、化学式、表等があります▼ で示されるソジオ−３，３′−ジクロロフェノールスル
    ホンフタレイニルＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニ
    ドを含有する試薬に緩衝剤を加えてｐＨ６．０〜ｐＨ６
    ．５の基質溶液を調製し、これに検体を加えて遊離する
    ３，３′−ジクロロフェノールスルホンフタレインを比
    色定量することを特徴とする実質的にアルカリ試薬を使
    用しないＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ活
    性の測定方法。
  7. （７）単位時間あたりの吸光度の変化量を測定すること
    を特徴とする特許請求の範囲第６項記載の測定方法。
JP62146143A 1987-06-11 1987-06-11 ＮＡＧａｓｅ活性測定用試薬および測定方法 Expired - Lifetime JPH0650991B2 (ja)

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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5274086A (en) * 1990-12-20 1993-12-28 Kikkoman Corporation N-acetyl-β-d-glucosamine derivatives and reagents for determining n-acetyl-β-d-glucosaminidase activity containing the same as effective ingredients

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3345748A1 (de) * 1983-12-17 1985-08-29 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Phenolsulfonphthaleinyl-ss-d-galactoside, verfahren zu deren herstellung sowie deren verwendung zur bestimmung der ss-d-galactosidase
JP2722874B2 (ja) * 1991-08-01 1998-03-09 日東紡績株式会社 新規Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン誘導体及びこれを基質に用いたＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ活性測定法
US20050187532A1 (en) * 2004-02-24 2005-08-25 Medex, Inc. Diaphragm-based reservoir for a closed blood sampling system
CN111850092A (zh) * 2020-07-01 2020-10-30 甘肃省地质矿产勘查开发局第三地质矿产勘查院(甘肃遥感地质中心、甘肃地质灾害防治工程勘查设计院、甘肃省地质遗迹评估中心、甘肃省中心实验室) 基于土壤酶活性测定的土壤生物学活性和生产力评价方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4552841A (en) * 1981-03-17 1985-11-12 Shionogi & Co., Ltd. N-Acetyl-β-D-glucosaminides for determining N-acetyl-β-D-glucosaminidase activity
JPS58994A (ja) * 1981-03-17 1983-01-06 Shionogi & Co Ltd 新規Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン誘導体およびこれを基質として用いるＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダ−ゼ活性測定法
AU1498883A (en) * 1982-06-21 1984-01-05 State Of Queensland, The Method for diagnosis of mastitis using enzyme, n-acetyl-b-d -glucosaminidase
DE3345748A1 (de) * 1983-12-17 1985-08-29 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Phenolsulfonphthaleinyl-ss-d-galactoside, verfahren zu deren herstellung sowie deren verwendung zur bestimmung der ss-d-galactosidase
JPS61112092A (ja) * 1984-11-07 1986-05-30 Meiji Seika Kaisha Ltd 新規グルコサミン誘導体及びこれを基質として用いるＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダ−ゼの活性測定試薬

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5274086A (en) * 1990-12-20 1993-12-28 Kikkoman Corporation N-acetyl-β-d-glucosamine derivatives and reagents for determining n-acetyl-β-d-glucosaminidase activity containing the same as effective ingredients

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