JPS5854800B2 - コリン誘導体を用いるコリンエステラ−ゼ活性測定法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はコリン誘導体を基質として用いる新規なコリン
エステラーゼの活性測定法に関する。

更に詳しくは一般式（Ｉ） （式中、Ｙは同一もしくは異って炭素数１−５のアルキ
ル基、炭素数１−５のアルコキシ基、水酸基またはハロ
ゲン原子を表わし、ｎは１−５の整数を表わす）で表わ
される置換フェニル基を表わし、Ｂは−Ｒ−ＣＯＯ−（
式中、Ｒは炭素数２−６の低級アルケニル基を表わす〕
で表わされるアルケニルエステル基もしくは式−ＣＯＯ
−で表わ−されるカルボキシル基を表わし、Ｘはハロゲ
ン原子を表わす〕で表わされるコリン誘導体を基質とし
て用いることを特徴とする新規なコリンエステラーゼの
活性測定法に関する。

コリンエステラーゼの活性測定のために各種の方法が知
られている。

いずれの方法でもコリン誘導体がコリンエステラーゼの
基質として用いられている。

通常これら基質にコリンエステラーゼを作用させるとコ
リンおよび誘導体に由来する酸が生成することが知られ
ている。

既知の分析法を例示すると、アセチルコリン、ブ升しコ
リン、フ゛チリルコリン、アセチルチオコリン、 ブロ
ピルチオコリン、Ｏ−ニトロフェニルブチレート、イン
ドフェニルアセテートなどを基質として用い前記化合物
を含有する一定濃度の緩衝液にコリンエステラーゼを反
応させる。

反応によって生成する酸によって、緩衝液のｐＨが低下
する。

反応時間に対するｐＨの変化量（△ｐＨ）を求めること
によりコリンエステラーゼの活性を求める方法〔ガラス
電極法、Ｂａｎｍ Ｃ，ｃｌ ｉｎ、 ｃｈｉｍ、 Ａ
ｃｔａ、 ３６ 。

４０５（１９７２））が知られている。

しかし、上記のコリン誘導体は、安定性が悪く従って、
正確な測定値即ち、正確なコリンエステラーゼ活性を測
定することは極めて困難である。

又、ベンゾイルコリンを基質として用いるＫａｌｏｗ法
（Ｋａｌｏｗ、 、Ｇｅｎｏｔ、 Ｋ、 ：Ｃａｎａｄ
。

Ｊ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｐｈｙｓｉｏｌ、 ３５ 、
３４１（１９５７））が知られている。

この方法ではコリンエステラーゼの作用により、■基質
ベンゾイルコリンの分解生成物である安息香酸を測定し
、コリンエステラーゼ活性を測定する方法と、■生成す
るコリンを、更に反応系に添加したコリンオキシダーゼ
の作用により測定し、コリンエステラーゼ活性を測定す
る方法（日本特許公開昭和５２−１３０９８４号公報〕
がある。

いずれの場合も用いられる基質ベンゾイルコリンの安定
性が不良であるため、正確な測定値を求めることは困難
である。

更に血中のコリンエステラーゼ測定に際してはより多く
の困難がある。

たとえば、基質ベンゾイルコリンが低濃度の場合には、
コリンエステラーゼの基質を加水分解する反応速度が早
すぎるため用手法は勿論、機器分析でも加水分解反応を
正確に追跡することは非常に難しい。

従って、コリンエステラーゼの量を正確に測定すること
は困難である。

又、コリンエステラーゼの作用により生成するコリンを
、コリンオキシダーゼにより測定し、コリンエステラー
ゼの活性を測定する際には、生成コリンおよびコリンオ
キシダーゼと共に反応溶液中に、一定量の溶存酸量が必
要である。

しかし、測定液中の溶存酸素量は通常極く少量でしかも
、外部から酸素（又は空気）を吹き込む等して液中の溶
存酸素を増補することは、技術的に極めて困難で、実用
的には実施不能である。

一方、基質ベンゾイルコリンから、コリンエステラーゼ
の作用により極めて速やかにコリンが生成し、生成した
該コリンには酸素の存在下、コリンオキシダーゼにより
ベタインアルデヒドとなり、等モルの過酸化水素を発生
する。

（この過酸化水素を色素系に導き、コリンの生成量即ち
、コリンエステラーゼの活性を測定する）。

しかし、この反応は系中の溶存酸量が消費されると中断
する。

その場合、勿論、正確なコリン生成量は求められない。

従って・、ベンゾイルコリンを基質として用いる場合に
は、溶存酸素が消費される前、即ち極めて短時間内に測
定を行なう必要がある。

又、逆にベンゾイルコリンが高濃度の場合にはベンゾイ
ルコリン自身が血清中のコリンエステラーゼの阻害剤と
なり、反応が停止するので正確なコリンエステラーゼ量
が求められない。

又、ブチルチオコリンを基質として用いるコリンエステ
ラーゼの活性測定法（Ｓｅａｏｙ、 Ｚ、Ｃｌ１ｎ。

Ｃｈｉｍ、Ａｃｔａ；１９，１９１（１９６８））も知
られている。

この方法では、ブチルチオコリンにコリンエステラーゼ
を作用させ、反応生成物チオコリンに、５，５′−ジチ
オビスベンゾイックアシッド類縁体（２，２’−又は４
，４′−ジチオピリジンなど）を反応させ、生じる発色
化合物の吸光度を測定して、コリンエステラーゼの活性
を測定する。

しかしながら、この方法に用いるブチルチオコリンおよ
び５，５′−ジチオビスベンゾイックアシッド類縁体は
共に非常に不安定で特に自然酸化をうける。

又、種々の血液中のチオール誘導体（例えば、グルタチ
オン）と同じ反応を行ない、正確な測定値を与えない欠
点がある。

以上が従来より知られたコリンエステラーゼ活性の測定
法ならびに測定に用いられる基質用化合物である。

本発明者らは、上記基質用化合物および測定法の欠点な
らびに改良法について種々検討した結果、安定性の優れ
た、しかも、コリンエステラーゼによって適度な（反応
）速度で分解される基質化合物を見い出し、該化合物を
コリンエステラーゼの基質として用いる新規なコリンエ
ステラーゼの活性測定法を見い出し、本発明を完成した
。

次に本発明について詳細に説明する。

本発明は一般式（Ｉ）で表わされる化合物を基質として
用い、これにコリンエステラーゼを作用せしめ生成した
コリンもしくは酸を測定することによりコリンエステラ
ーゼ活性を測定する方法に関する。

勿論生成した酸に由来する溶液のｐＨの変化からコリン
エステラーゼの活性を測定することもできる。

生成したコリンの測定方法にはＮＡＤの存在下、コリン
デハイドロゲネスを作用させ色素系に導く方法や、コリ
ンオキシデースを作用させて生成した過酸化水素を色素
系に導く方法などがあげられる。

又生成した酸もしくは酸の変化を測定する方法としては
、既述のＫａｌｏｗ、に、らの方法や、高橋らの方法が
応用できる。

本発明に用いられる一般式（Ｉ）で表わされる化合物と
して具体的な化合物をその物性値と共に第１表に示す。

第１表に例示した化合物中、化合物Ｖは既知化合物であ
る。

化合物Ｉ、Ｉは新規化合物であるが１＊類似の化合物と
して式（ＩＩＤ わす〕で表わされる化合物は公知である。

（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔ、 ５８ 、
５９４０ｈ）しかし上記２化合物はコリンエステラーゼ
の阻害剤であって基質としては利用できない。

又式（曲においてＺ＝Ｈの化合物も公知であるが、この
化合物は後記第２表に見られる如くベンゾイルコリンに
比べて分解度が早く、不安定で基質としては実用的に利
用し難い。

化合物■は新規化合物であるが、化合物■は既知化合物
である。

（Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｂｓｔｒａｃｔ ７２゜５３９
７８ｔ）類似の化合物としては同文献に化合物■のＯ−
メチル基がＯ−三トロ基に代った化合物、化合物■のｍ
−メチル基がｍ−クロルに代った化合物が示されている
が、いずれの化合物も植物の成長抑制効果を示すのみで
、コリンエステラーゼの基質として用いられることを伺
んら示唆していない。

化合物■も新規化合物であるが、類似化合物として化合
物■のｍ−ハイドロキシ基がＯ−ハイドロキシ基に代っ
た化合物等が知られている。

（（Ｂｅｒｉｃｈｔｅ、６３．３１９０（１９３０）。

Ｈｏｐｐｅ−８ｅｙｌｅｒ”ｓ Ｚｅｉｔｓｃｈｒｉｆ
ｔ ｆｕｒ Ｐｈｙ−ｓｉｏｌｏｇｉｓｃｈｅ Ｃｈｅ
ｍｉｅ、Ｂｅｒｌｉｎ、 ２８８ 。

５１ （１９５１））Ｌかしこの既知化合物をコリンエ
ステラーゼの基質として用いた時には反応速度が遅く基
質としては使えないことが示されている。

尚第１表に示した化合物についてはその合成方法を参考
例として後記する。

次に一般式（１）で示される化合物をコリンエテラーゼ
の基質として用いるコリンエステラーゼ活性測定法のよ
り一層具体的な手法を例示すると、（４）コリンエステ
ラーゼの作用により生成したコリンにコリンオキシダー
ゼを作用させ生成した過酸化水素を色素系に導く方法（
以下Ａ方法と略す）および、（Ｂ）コリンエステラーゼ
を作用させると生成する酸によるｐＨの低下を電極によ
り測定する方法もしくは一指示薬ににより測定する方法
（以下Ｂ方法と略す）等が例示される。

Ａ方法について具体的な手法を例示すると、適当な緩衝
液、例えば０．０２〜０．１Ｍｔ−ＩＪスス−酸（ｐＨ
７，０〜８．０）緩衝液に適当な発色系に導くための適
当な発色試薬（例えば４−アミノアンチピリン、フェノ
ールなど）、コリンオキシダーゼ０特開昭５２−１３０
９８４号公報により得られるもの、後記参考例２に示す
如くにして得られるものなど）、パーオキシダーゼ、本
発明による基質などを夫々適当量含有せしめ、これに被
験サンプル（コリンエステラーゼもしくはコリンエステ
ラーゼ含有物、通常は血液、血清、同希釈液など）を接
触、反応せしめる。

基質はコリンエステラーゼにより分解され、生成したコ
リンオキシダーゼの作用によりベタインアルデヒドと過
酸化水素となる。

生成した過酸化水素はパーオキシダーゼの存在下フェノ
ール、４−アミノアンチピリンと反応してキノンイミン
系色素を生成し、このものの生成量を５００ ｎｍの吸
光度（ＯＤ値）を測定することによって求めることがで
き、この色素の生成量はコリンエステラーゼ活性に対応
する。

Ｂ方法について具体的な手法を例示すると、実践臨床化
学（北村元仕著、Ｐ、３６４、医歯薬出版社）記載の柴
田、・高橋法に準じ各種ｐＨ緩衡液中でのフェノールレ
ッド溶液の吸光度を基にし、コリンエステラーゼの作用
により生じた酸によるｐＨの変化を反応液中のフェノー
ルレッドの吸光度の変化を測定することにより間接的に
求め、コリンエステラーゼ活性を測定する方法がある。

次に本発明に用いられる一般式（Ｉ）で表わされる化合
物（基質）および既知の基質をコリンエステラーゼの基
質として用いた時の夫々の反応速度の比較を第２表に示
す。

表示は従来用いられている代表的基質ベンゾイルコリン
の反応速度を１として比反応速度で表わす。

測定方法は以下の通り。

４−アミノアンチピリン ３■、フェノール２．８■、
コリンオキシダーゼ＊１７．０５Ｕ、パーオキシダーゼ
＊２９．ＩＵを含有する３ｍｌの０．０５Ｍ Ｉ−ＩＪ
ス塩緩衡液（ｐＨ７，５）に第２表記載の各種基質を各
０．２■ずつ添加する。

３７℃で１０分間予備加温したのち標準血清を各々２０
μｌずつ加え、波長５００ ｎｍでの吸光度を経時的に
測定す本＊る。

得られた吸光度より単位時間（分）当りの上昇吸光度を
べ／ジイルコリンを１とした場合の比率で表わす。

＊１ コリンオキシダーゼは後記参考例２により得られ
たものを使用した。

（以下も同じ）。＊２ パーオキシダーゼはＷｏｒｔｈ
ｉｎｇｔｏｎ 社製（米国）のものを使用した。

（以下同じ）。又本発明に用いられる一般式（Ｉ）で表
わされる化合物（基質）および既知の基質の溶液安定性
を以下の如く測定し、ベンゾイルコリンを１として相対
比で表わした。

結果は第３表に示す。測定方法は以下の通り。

化合物０．６１５ ｍｍｏｌ／３ｙｎｌ （０，０５Ｍ
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５））溶液を作成し、３
７°Ｃで３日間放置した後、該化合物から生成したコリ
ン量を求めて分解速度を求めた。

生成したコリンの測定法は前記した如くコリンオキシダ
ーゼを作用させ生成した過酸化水素に４−アミノアンチ
ピリンを作用させ、生成したキノンイミン系色素を５０
０ ｎｍの吸光度を測定することにより求めた。

この色素量はコリンの生成量に対応する。

数字が小さい程、分解速度が遅い、即ち安定性が良好な
ことを示す。

第３表の結果より明らかな如く、ペンヅイルコリン、ア
セチルコリン等の既知基質は経時的に分解が進み、ブラ
ンク値が上昇する。

従って基質含有試薬液を調製後、日数が経過すると高値
を与える。

一方本願発明の基質はいずれも既知基質に比べて分解速
度が遅く、保存安定性が良好であることを示している。

これらの性質がコリンエステラーゼ活性の測定に好都合
であることは云うまでもないことである。

参考例 １ 本発明において用いられる各種化合物（基質）は下記の
如くに合成される。

イ）オイルソーメチルベンゾイルコリン塩酸塩の合成 オルソベンゾイル・クロライド２５ｇとコリン・塩酸塩
（塩化コリン） ２２．４ ｇを１２０１４０°Ｃで４
時間還流し、次いで反応液を濃縮乾固する。

ｎ−ヘキサン１００ｍ１を加えよく洗浄した後、ｎ−ヘ
キサンをｐ去し、ｔｅｒｔ−ブタノール４０ｒｒｔｌを
加え加熱溶解し、次いで冷蔵庫（５℃）中で一夜放置し
結晶化させる。

結晶を炉取し、３０ｍ１のｔｅｒｔ−ブタノール−エタ
ノール（容量比３：１）混合溶媒から再結晶し、結晶を
炉取、減圧乾燥する。

収量３３ｇ（収率約８０％）融点１４２−１４３℃他の
物性値は第１表記載の通りで、表記化合物と同定される
６他の基質も上記と同様に相当する酸クロライドおよび
塩化コリンを用いて合成され、夫々の物性値は第１表記
載の通りである。

参考例 ２ 本発明において用いるコリンオキシダーゼは以下の如く
に調製する。

尚、活性は、以下の如くに定める。

イ）活性測定法 コリンオキシダーゼによりコリンが酸化される際に生成
する過酸化水素をペルオキシダーゼで分解し、フェノー
ル−４−アミノアンチピリン発色系に導く方法により測
定する。

この測定法の詳細は次の通りである。

すなわち、４−アミノアンチピリン、フェノール各々０
．０１ｍｏｌ／１を含む０．０５ ｍｏ Ｉ ／１ ト
リスバッファー溶液（ｐＨ７，０）にパーオキシダーゼ
を該溶液１．００ｍ１あたり５００Ｕ含有させたものを
発色液とする。

該発色液３ｍｌに活性を測定すべき酵素溶液０．１ｍｌ
、 １ ／ ３０ｍａｌ／ｌ塩化コリン溶液０．１
ｍｌを添加し、３７°Ｃで２０分間反応後、５００ｍｍ
の吸光度を測定する。

活性の単位Ｕは１分間に１μｍｏｌの基質を分解する酵
素力価とする。

口）コリン・オキシダーゼ調製法 種菌としてブレビバクテリウム・アルバムＫＹ４３１９
（微工研寄託受理番号第３７７７号、ＮＲＲＬＢ−１１
０４６）を使用する。

塩化コリン２＆７ｄｌ、コーン・スチーフ・リカー０．
５ ｇ／ｄ ｌ、酵母エキス０．５ ｇ／ｄ Ｌグルタ
ミン酸ソーダ０．５ Ｖｄ ｌ、 リン酸二カリウム
０、１ Ｖｄ １１硫酸マグネシウム、７水塩０．０５
ｇ／ｄｌ（ｐＨ７，２）よりなる種培養培地を７０ｍ１
容大型試験管に１０ｍ１分注し、１２０℃で１５分殺菌
する。

該培地に前記菌株を１白金耳接種し、３０℃で４８時間
振盪培養する。

ついで得られる培養液のすべてを２１容三角フラスコに
分注した前記と同じ種培養培地３００ｍ１に接種し、３
０℃、４８時間振盪培養する。

培養終了後、培養液のすべてを５１シアーファーメンタ
−中の３．Ｏｌの同上培地に接種し、３０’Ｃ、５００
ｒ、ｐ、ｍ、、通気１ ｌ／ｌ （培地）／ Ｉｎ Ｉ
ｎ で本培養を行い、２４時間で培養を終了する。

コリン・オキシダーゼ生産量は培養液ＩＴＬｌあたり０
．６２Ｕである。

培養終了液からコリン・オキシダーゼを採取するため、
鉄液を遠心分離して菌体を得、υ停ｐ）ｌｓ、ｏの０．
０５ｍｏｌ／ｌトリス・バッファー１１に懸濁したのち
、ダイノ、ラボラトリ−・ミル（Ｄｙｎｏ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ ｍ１ｌｌ）ＫＤＬ型（Ｗｉ ｆｌｙ Ａ、
Ｂａｃｈｏｆｅｎ Ｉｎｃ、 ５ｗ１ｔｚｅ−ｒ
ａｎｄにより製造されている）にて菌体を破砕し、菌体
破砕液を得る。

菌体破砕液を遠心分離して上清液を得る（前記培養終了
液中のコリン・オキシダーゼの生産量はこの上清液を酵
素溶液としてコリン・オキシダーゼの活性を測定するこ
とにより求められたものである）。

この上清液に硫酸アンモニウム３０％飽和とし、沈澱物
を遠心分離により除き、上清液を得、この上清液に硫酸
アンモニウムを添加して、硫酸アンモニウム６０％飽和
とし、沈澱物を遠心分離により集める。

この沈澱物をｐ）（ｓ、ｏの０．０５ｍｏＡ／ｌのトリ
ス・バッファーに溶解し、同バッファーで一夜５°Ｃで
セロハン・チューブを透析膜として透析する。

透析チューブ内液を０．０５ｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム
を含むトリス・バッファー（ｐＨ８，０）で平衡にした
１１のＤＥＡＥセルロースカラムにチャーシン、０．０
５ ｎｏ ｌ／ｌ塩化ナトリウムを含むトリス・バッフ
ァー（ｐＨ８，０）１１で洗浄後、塩化すｌ−ＩＪウム
０．０５〜０，４５ｍａｌ／ｌの濃度勾配で溶出を行う
。

コリン・オキシダーゼの溶出区分を集め、硫酸アンモニ
ウム６０％飽和とし、沈澱物を遠心分離により集める。

この沈澱物をｐｔ−ｔ ｓ、 ０の０．０５ ｍｏｉｌ
／ｌトリス・バッファーに溶解し、ｐＨ８，０の０．０
５ｒｒＬｏｌ／ｌトリス・バッファーで平衡にした５０
０ｍ１のセファデックス（５ｅｐｈａｄｅｘ） Ｇ−１
５０（デキストラン誘導体よりなる分子節の商標名：Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ
Ｉｎｃ、。

Ｕ、Ｓ、Ａ、により製造されている）にチャージし、同
バッファーで溶出する。

コリン・オキシダーゼの溶出区分を集め、硫酸アンモニ
ウム６０％飽和とし、沈澱物を遠心分離により集める。

この沈澱物をｐＨ８，０の００５ｒｒＬｏｌ／ｌトリス
・バッファーに溶解し、同バッファーで一夜５８Ｃでセ
ロハンチューブを透析膜として透析する。

透析後、０．１ｍｏｌ／ｌ塩化すｌ−ＩＪウムを含む０
．０５ｍａｌ／ｌトリス・バッファー（ｐＨ８，０）で
平衡にしたＤＥＡＥ−セファデックスＡ−５０（弱塩基
性陰イオン交換樹脂の商標名＋Ｐｈａ−ｒｍａｃｉａ
Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ、、Ｕ、Ｓ、Ａ
。

により製造されている。

５００ＴｒＬｌにチャージし、０．１ ｎｏ ｌ／ｌ塩
化ナトリウムを含む０．０５ ｍｏｌトリス・バッファ
ー （ｐＨ８，０） ５００ｍｌで洗浄し、次に塩化ナ
トリウム０．１〜０．５ ｍｏ ｌ／／）の濃度勾配で
溶出を行う。

コリン・オキシダーゼ溶出区分を集め、ｐＨ８，０の０
．０５ｍｏｌ／ｌトリス・バッファーでセロハン・チュ
ーブを透析膜として透析後、凍結乾燥する。

約１０係の活性収率でコリン・オキシダーゼを採取する
。

活性２．２Ｕ／■蛋白。次に実施例を示す。

（実施例） く本願発明基質を使用して、コリン・オキシダーゼを用
いるコリンエステラーゼの活性測定法〉イ 試薬液の調
製 常法により０．０５ Ｍ−トＩＪス塩酸緩衡液（ｐ）（
７，５）３ｍｌ中に下記の成分を含有させた試薬液を作
成する。

４−アミノアンチピリン ３■フエノール
２．８■コリンオキシダーゼ
７．０５ Ｕ（参考例２で作成したもの
） パーオキシダーゼ ９．ＩＵ（Ｗｏｒ
ｔｈｉｎｇｔｏｎ社製） 基質（オルソ−メチルベンシイ ０．２■ルコリン
塩酸塩 口 分析法 上記の如く作成した各試薬液３７７１１に２０μｌの被
血清ならびに標準血清Ｑ−ＰＡＫＩ（ハイランド社製（
米国）、コリンエステラーゼ活性値１４５８ Ｕ／ｍｌ
のもの）２０μｌを入れ、３７℃で第４表記載の時間イ
ンキュベートし、ネオステイブミン２１ｎ９を加えて反
応を停止し、次いで分光々変針で、波長５００關での夫
々の吸収を測定する。

得られた夫々の測定値を第４表に示す。

尚参考の為に基質を既知のベンゾイルコリンに代えて測
定した時の結果を併せ示す。

尚ベンゾイルコリンを含む試薬液は常法により３ｍｌの
０．０５Ｍトリス塩酸緩衡液（ｐＨ７，５）中に下記の
成分を含有させて作成する。

４−アミノアンチピリン フェノール コリンオキシダーゼ パーオキシダーゼ 基質ベンゾイルコリン ０．５■ １．４■ ７．１５Ｕｎｉｔ １０．５Ｕｎｉｔ ０、５７Ｑ オルソ−メチルベンゾイルコリン塩酸塩を基質として用
いた場合、次式に示す如き比例配分法により患者血清（
１）中のコリンエステラーゼ活性は約８４１ ｍＵ／ｍ
ｌと求められた。

同様に患者血清（１）をベンゾイルコリン塩酸塩を基質
として用いた場合も同様に、４分目、１０分目の測定値
より比例配分法によりコリンエステラーゼ活性は約８４
４ｍＵ／ｍｌと求められた。

但し、２０分目、４０分目の測定値は正確な値を示さな
い。

同様に患者血清（２）をオルソーメチルベンヅイルコリ
ン塩酸塩を用いて測定した場合には、２２６０ｍ［Ｊ／
ｍｌと求められた。

一方、ベンゾイルコリン塩酸塩を基質として用いた場合
には、４分目の測定値のみ２２５０ｍＵ、４’と正確な
値を示すが、それ以後の測定値は吸光度が頭打ちとなり
正確な値を示さない。

これはベンゾイルコリンの反応が早すぎる為コリンオキ
シダーゼが必要とする溶存酸素が不足し、正常値を示さ
ないものと考えられる。

この場合は血清希釈を行なわないと正確な測定値は得ら
れないが、現実的には不可能に近い操作である。

又、実用的には４分間で測定を停止するのは誤差要因も
多く不利が多い。

一方本願発明による基質を用いると、コリンニスステラ
ーゼ活性値が高くても、相当長時間の反応でも、吸光度
が飽和しないで正確な測定値を与えるので、この有用性
は極めて大である。

尚参考の為に本発明基質およびベンゾイルコリンを含有
する試薬液中の各他成分の濃度を示すと次の如くである
。

第５表から明らかな如く、ベンゾイルコリンの濃度範囲
は本発明基質と比較して狭く、それだけ使用範囲が狭い
ことを意味する。

一方本発明基質を用いると使用範囲が広く使い易いこと
を意味する。

（実施例 ２） 実施例１と同様にして、用いる基質を０−メチルベンゾ
イルコリン塩酸塩に代えて第６表記載の化合物を用いて
、標準血清および肝疾患者血清を測定した時の測定値（
吸光度）を同様に第６表に示す。

いずれの基質を用いても測定値は飽和することなく、正
確な測定値を与えていることが判かる。

（実施例 ３） 〈本願発明基質を用い、柴田−高橋法に準じるコリンエ
ステラーゼの活性測定法〉 １、試薬の調製法 （１）ベロナール・β−グリセロリン酸緩衝液（ｐＨ，
８，３） ５．５−ジエチルバルビッール酸ナトリウム３００ｇを
約５００７７１１の水に溶解し、次に５．５−ジエチル
バルビッール酸１．０１を加え加温溶解する。

冷却後β−グリセロリン酸ナトリウム５．ＯＯｇを溶解
し、Ｈ２Ｏを加えて１０１００Ｏとする。

（２）基質溶液 イ）塩化アセチルコリン１ｇに水１０ＴＬｌを加えて溶
解する。

口）０−メチルベンジルコリン塩酸塩０．５ｇに水１０
ｍ１を加えて溶解する。

（３） フェノ−／Ｌ／Ｌ／ツド溶液（４０Ｔｎ９／
ｄｌ）フェノールレッド１００■に０． Ｉ Ｎ水酸化
すｌ−ＩＪウム液３． Ｏｔａｌおよび水７．５ ｍｌ
を加え６０’Ｃ＜らいの湯浴中で溶解する。

冷却後水を加えて２５０７ｄとする。

（４）エゼリン溶液（０，１ｆ！／ｄｌ ）サリチル酸
フィゾスチグミン０．１を水に溶解し１００ｍ１とする
。

（５） リン酸緩衝液（１７１５Ｍ） ■ リン酸二水素カリウムＫＨ２ＰＯ４９，Ｏｓ ｇを
水に溶かして１００ＴｒＬｌとする。

■ リン酸−水素ナトリウムＮ ａ ＨＰ Ｏ４・２Ｈ
２０１１，８８ｇを水に溶かして１０１００Ｏとする。

２、反応試薬の調製 １）ベロナール−β−クリセロリン 酸緩衝液 １．５ ＴＬ１２
）基質溶液 ０．２５ｍ１３）フ
ェノールレッド溶液 ０．１ ｍ１４）水
３．０５ｍ１ 上記の容量比で混合した溶液を反応試薬とする。

３、検量線作成 リン酸緩衝液（リン酸二水素カリウム、リン酸−水素す
ｌ−ＩＪウム）にてｐＨ５，５〜８．３の緩衝液系列を
作り、各ｐＨ緩衝液５．０ ｍｌにフェノールレッド溶
液０．１ ｒｕｌずつを加えて混合したのち２０℃±１
℃に溶液温を保ちながら水を対照として５７０ ｎｍに
おける吸光度を測定する。

この吸光度と表［相］ＨをプロットしｐＨ−吸光度検量
線を作る。

４、測定操作 盲検および検体（血清）用容器を用意し、反応試液４．
９ｒｕｌを分注し、３７℃５分間予備保温をする。

しかるのち盲検用に水０１１ｒｒＬｌ、検体用に血清０
．１−を加え混合したのち３７℃６０分間正確に反応を
行い、エゼリン溶液０．１ ｍｌずつを加え室温に放置
する。

しかるのち２０℃水槽にて試験管内の液温か２０℃（±
２℃）となるまで（約１０分間）放置抜水を対照に５７
０ｎｍの吸光度を測定する。

あらかじめ求めていた検量線よりｐｉ−ｉ Ｂｌａｎ
ｋ、ｐＨＳｅｒｕｍ を求め、ｐＨＢｌａｎｋよりｐＨ
８ｅｒｕｍを差し引いた値、＝ＨＨは次の如くであった
。

結果を第７表に示す。

第７表の結果から、アセチルコリン塩酸塩の△ｐＨとｏ
−メチル−ベンゾイルコリン塩酸塩の△ｐＨにけ極めて
よい相関が認められる。

相関係数 ０．９９３ 回帰直線 ｙ＝ｏ、９２８ ｘ＋０．５６４（但し
ｙは本発明の基質０−メチルベンジルコリン塩酸塩によ
る測定値、Ｘはアセチルコリン塩酸塩を用いる測定値を
表わす。

）従って、既に求められているアセチルコリン塩酸塩の
△ｐＨとコリンエステラーゼ活性（ＩＵ）との相関表よ
り、検体中のコリンエステラーゼ活性は簡単に求められ
ることが判る。

（実施例 ４） 実施例３で測定した検体（血清５）を用いて実施例３と
同様な操作で繰返し測定した値は第８表の通りであった
。

第８表の結果から明らかな如く、本発明基質を用いた場
合には変動系数が非常に小さく正確な分析値を与えるこ
とを示している。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （式中、Ｙは同じもしくは異なって低級アルキル基、低
   級アルコキシ基、水酸基またはハロゲン原子を表わし、
   ｎは１−５の整数を表わす）で表わされる置換フェニル
   基を表わし、Ｂは−Ｒ−ＣＯＯ−（式中、Ｒは低級アル
   ケニル基を表わす）で表わされるアルケニルエステル基
   もしくは式−ＣＯＯ−で表わされるカルボキシル基を表
   わし、Ｘはハロゲン原子を表わす〕で表わされるコリン
   誘導体を基質として用いることを特徴とするコリンエス
   テラーゼの活性測定法。