JPH0542272B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はメルカプト基（−SH）を含む化合物
の定量方法及び定量組成物に関する。 従来メルカプト基（−SH）を有する化合物
（以下SH化合物という）の定量はｐ−クロロマ
ーキユリ安息香酸（以下PCMB）等の有機水銀
化合物を用いて滴定する方法ニトロプルシドナ
トリウムを用いて比色定量する方法５，5′−ジ
チオビス（２−ニトロ安息香酸）（以下DTNB）
をはじめとするエールマン試薬類を用いて比色定
量する方法が知られている。 これらの方法において、の方法は有機水銀を
用い、さらに紫外部での吸光度測定であるため、
測定対象が生体である場合、來成分の影響を受け
やすい。 の方法は、発色液が温度等に不安定であり、
測定波長が低い。 の方法は、測定波長が低く、生体試料を測定
するには適さない。 より精度良く、簡便にSH化合物を定量する方
法の開発が望まれており、この目的のため検討の
結果、後述の一般式（）に示す化合物とSH化
合物とを反応させて生成する色素は極大吸収波長
が600nｍ前後にあり、試料中特に生体成分中の
成分の影響を受けにくいこと、可視部における測
定が可能であること、感度が優れており、試料が
少量で定量できること、水溶性であるため取扱い
易いこと等の優れた性質を有することが見出され
た。 本発明によればSH化合物はペルオキシダーゼ
の存在下下記一般式（）で表される化合物〔以
下、化合物（）という〕と反応させて生成する
色素を定量することにより定量される。 一般式（） 式中Ｙは水素もしくはヒドロキシルを示し、
R₁、R₂、R₃は同一もしくは異なつてよく、下記
一般式（）、（）又は（）で表される基を示
す。 Ｚは水素、ヒドロキシル、アミノ、置換アミ
ノ、アルキル、置換アルキリ、アルケニル、アリ
ール、置換アリール、アシル、ハロゲン原子、ニ
トロ、スルホ、カルボキシル、アルコキシを示
す。ｎは１、２又は３を示し、R₁、R₂、R₃の少
なくとも１つのＺはヒドロキシル、アミノ又は置
換アミノである。又、Znにおける各Ｚは同一も
しくは異なつてもよい。 上記各定義においてアルキルは炭素数１〜５の
アルキルを包含し、メチル、エチル、プロピル、
ブチル、ペンチル等を示し、アルケニルは炭素数
２〜５の基を包含し、ビニル、アリル、ブテニル
等が例示される。アルコキシは炭素数１〜４の基
を包含し、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブ
トキシ等が例示される。 アリールとしては、フエニル、ナフチルが例示
される。 アシルは炭素数２〜５のアシルを包含し、アセ
チル、プロピオニル、ブチリル等が例示される。
ハロゲンは塩素原子、臭素原子、フツ素原子を包
含する。 置換アミノ、置換アルキル、置換アリールにお
ける置換基としては、アルキル、アルケニル、ア
リール、アルコキシ、ヒドロキシル、カルボキシ
ル、スルホ、スルホニル、ハロゲン原子、アミ
ノ、アルコキシカルボニルアミノ、アルコキシカ
ルボニル、アミノアルキル、アシル、ニトロ等が
例示される。 該置換基中アルキル、アルケニル、アリール、
アルコキシ、ハロゲン、アシル等は前記と同義を
有する。 本発明方法で定量できるSH化合物としては−
SH基を構造式に含む化合物であればいずれも含
まれ、例えばＬ−システイン、グルタチオン、補
酸素Ａ（CoA）、メタネチオール、ジヒドロリポ
アミド、チオコリン等である。 本発明を実施するに際しては一般に緩衝液例え
ばグツドバツフアー、リン酸バツフアー、ホウ酸
バツフアー、酢酸バツフアー、トリスバツフアー
等にペルオキシダーゼ及び化合物（）を加えて
試薬液とする。 試料の試薬液を加え30〜50℃酸素が失活しない
温度で反応させ、生成した色素によつて着色した
反応液の吸収を色素の極大吸収波長で試薬ブラン
クを対照として測定し、あらかじめ既知量につい
てのテストから求めた検量線から試料中のSH化
合物を定量することができる。 本発明方法は後述の如く反応によつてSH化合
物を生成する反応系に係る反応物質あるいは酵素
活性を定量する方法に適用できる。定量されるべ
き因子が化合物である場合には一般に上記吸収測
定に際して反応を約５〜10分行わせた後反応液の
吸収を比色によつて測定することによつて目的因
子を定量できる。因子が酵素活性である場合には
一般に反応開始後の適当な時間における色素生成
速度を反応液の吸光度の変化から求めることによ
つて該活性が定量できる。 緩衝液は10ｍＭ〜1Mの濃度で用いられる。ペ
ルオキシダーゼは１〜500U／mlで用いられる。
化合物（）は反応するSH化合物と等モル以上、
通常0.001〜１mg／mlで用いられる。 反応に際してSH化合物は通常試料中の濃度が
0.001〜１mg／mlとなる様に試薬液もしくは蒸留
水で調整される。 SH化合物を生成する反応系で本発明が適用さ
れる場合には、反応に関与する基質のような反応
物質、酵素、等は、測定すべき対象であるか否か
によつて用いられる量が異なる場合が多いが、一
般にそれぞれ0.0001〜100mg／ml、10〜1000U／
mlで用いられる。 又、必要に応じてTriton Ｘ−100等の界面活
性剤が用いられる。 本発明で用いられる化合物（）の具体例とそ
の極大吸収波長（λmax）、感度が第１〜４表に
示される。 表中の略号は下記基を示す。又第１〜３表にお
いて○内は位置を示し、基の表示のない位置はい
ずれも水素を示す。 第４表におけるλmax、感度の測定は試料20μ
に対して試薬液３mlの割合で混合し、反応後
各々のλmaxにおけるOD値を測定する。感度欄
の数値はエールマン試薬としてSH基の定量に広
く用いられている５，5′−ジチオビス（２−ニト
ロ安息香酸）（DTNB）を色源体として用いた場
合のOD値を100としたときの相対値である。 試料：Ｌ−システイン水溶液 Ｌ−システイン塩酸塩を20mg／dlとなるよう
に蒸留水に溶解する。用時調整。 試薬液：50ｍＭリン酸緩衝液PH7.0にペルオキシ
ダーゼ10U／ml、トリトンＸ−100を0.1％の濃
度となるように加え、各発色剤を0.2mg／mlと
なるように溶解する。

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】 本発明で用いられる化合物（）は染料合成の
中間体として公知の化合物であるが第１〜３表に
記載の化合物は例えば以下の方法によつて合成で
きる。 下記表に記載の化合物No.の化合物については
4.4′−ビス（ジメチルアミノ）ベンズヒドロー
ルと目的化合物における下記に示される置換ベ
ンゼンもしくは置換ナフタレンとを等モルづつ
約原料の２〜10倍量の60％硫酸中で反応させ
る。反応は50〜100℃で撹拌して行われ２〜３
時間で完了する。さらに反応液の５〜６倍の５
℃前後の冷水を加えて一夜撹拌を続ける。 反応物を濾過し、８％硫酸で洗浄後真空乾燥
して目的物を得る。アルカリ例えば水酸化ナト
リウムを反応液に加えることによつて沈澱が生
成し易くなるので必要に応じて加える。 A₁： A₂：

【表】

【表】

【表】 上記以外の位置はいずれも水素を示す。 下記表に掲げる各化合物No.に対応する公知の
色素を原料とし、原料色素を色素重量の80倍量
の蒸留水で溶解する。この色素溶液を撹拌しな
がら、原料色素の２倍mol量の水素化ホウ素ナ
トリウムを徐々に添加し、還元版応を行う。室
温で約２時間撹拌後、この反応液をロータリー
エバポレーターで濃縮乾固する。次にこの乾固
物を溶解しうる最低必要量の蒸留水にて溶解す
る。この溶解液の15〜20倍容量のレジンHP−
20をガラスカラムに充填し、コンデイシヨニン
グ後、前述の溶解液を充填し、使用レジンの３
〜４倍容量の蒸留水を流し、残存する水素化ホ
ウ素ナトリウムを除去する。この時目的物は
HP−20に吸着されている。次にメタノール／
蒸留水＝１／１の展開溶媒を流し、溶出液を適
量づつ分取する。溶出液中の目的物をUVモニ
ターあるいはTLCにて確認後、必要なフラク
シヨンを集め、ロータリーエバポレーターで濃
縮乾固し、目的物を得る。

【表】

【表】 化合物No.９、10、67、68の製法 4.4−ビス（ジメチルアミノ）ベンズヒドロ
ールとクロルベンゼン（化合物No.９、10）ある
いは１−ナフトール−3.5−ジスルホン酸（化
合物No.67、68）とを60％硫酸を用いて前述の
方法にて縮合させる。得られた化合物を適量の
酢酸に溶解し、酸化鉛を解媒として、ジメチル
アミノ基の２つのメチル基の一方を脱離させ、
目的物を得る。 化合物No.11、12の製法 ２−メチル−５−ニトロベンズアルデハイド
とα−（Ｎ−メチルアニリノ）−ｍ−トルエンス
ルホン酸とをモル比１：２で原料化合物総重量
の10倍量の硫酸に加え、100℃前後で120時間撹
拌する。沈澱を熱いままグラスフイルターにて
濾過し、５％硫酸で濾洗後真空乾燥を行い目的
物を得る。 化合物No.19、20の製法 ２−ヒドロキシベンズアルデハイドとＮ，Ｎ
−ジメチルアニリンおよびＮ−フエニル−ジベ
ンジルアミンとをモル比１：１：１で原料化合
物総重量の10倍量の80％硫酸に加え、190℃前
後で120時間撹拌する。沈殿を熱いままグラス
フイルターにて濾過し、５％硫酸で濾洗後真空
乾燥を行い、目的物を得る。 化合物No.21、22の製法 2.5−ジクロロベンズアルデハイドとα−（Ｎ
−メチルアニリノ）−ｍ−トルエンスルホン酸
とをモル比１：２で原料化合物総重量の10倍量
の硫酸に加え、100℃前後で120時間撹拌する。
沈殿を熱いままグラスフイルターにて濾過し、
５％硫酸で濾洗後真空乾燥を行い、目的物を得
る。 化合物No.23、24、25、26の製法 ２−ヒドロキシベンズアルデハイドとＮ−フ
エニルジベンジルアミン（No.23、24）、あるい
はＮ−ブチル−Ｏ−トルイジン（No.25、26）と
をモル比１：２で原料化合物総重量の10倍量の
硫酸に加え、100℃前後で120時間撹拌する。沈
殿を熱いままグラスフイルターにて濾過し、５
％硫酸で濾洗後真空乾燥を行い目的物を得る。 上記以外の化合物についても、上記の方法にお
いて原料を目的化合物に応じて選ぶことによつて
あるいは公知文献例えばColor Index4巻に記載
な方法によつて製造できる。 本発明方法は、反応によつてSH化合物を化学
量論的に生成する反応系における反応物質あるい
は酵素活性の測定に適用できる。かかる物質とし
てＬ−アスパラギン酸、クロラムフエニコール、
ゲンタマイシンC_1a、ゲンタマイシンC₁、コリン、
コレステロール、Ｌ−メチオニン、NADH等が
あげられる。また酵素活性が測定できる酵素とし
ては、コリンエステラーゼ、アミノ酸アセチルト
ランスフエラーゼ等があげられる。これらの反応
系が図式的に次に示され、反応系における基質、
酵素活性が測うできる。 １ Ｌ−アスパラギ酸 Ｌ−アスパラギン酸＋アセチルCoAアスパラギン酸アセ
チル トランスフエラーゼ ―――――――――――→ Ｎ−アセチル−Ｌ−アスパラギン酸＋CoA ２ クロラムフエニコール クロラムフエニコール＋アセチルCoAクロラムフ
エニコールアセチル トランスフエラーゼ ―――――――――――――――→ クロラムフエニコール３−アセテート＋CoA ３ ゲンタマイシンC_1a ケンタマイシンC_1a＋アセチルCoAゲンタマイシン2′− アセチルトランスフエラーゼ ―――――――――――――→ N²−アセチルゲンタマイシンC₁＋CoA ４ ゲンタマイシンC₁ ケンタマイシンC₁＋アセチルCoAゲンタマイシン３− アセチルトランスフエラーゼ ―――――――――――――――→ N³−アセチルゲンタマイシンＣ＋CoA ５ コリン コリン＋アセチルCoAコリンアセチル トランスフエラーゼ ―――――――――→ アセチルコリン＋CoA ６ コレステロール コレステロール＋アシルCoAコレステロールアシルトラ
ンスフエラーゼ ――――――――――――――――――――→ コレステロール＋CoA ７ Ｌ−メチオンニン Ｌ−メチオニン＋H₂OＬ−メチオニンγ−リアーゼ ――――――――――――――――→ ２−オキシブルチレート＋メタネチオール＋NH₃ ８ NIDH NADH＋DL−リポアミドリポアミドデヒドロゲナーゼ ――――――――――――――――→ NAD⁺DL−ジヒドロリポアミド ９ コリンエステラーゼ ブチリルチオコリン＋H₂Oコリンエステラーゼ ――――――――――→ ｎ−酪酸＋チオコリン 10 アミノ酸アセチルトランスフエラーゼ Ｌ−グリタミン酸＋アセチルオーCoAアミノ酸アセチル トランスフエラーゼ ―――――――――――→ Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン酸＋CoA 本発明で用いられるSH化合物定量用組成物は
(イ)ペルオキシダーゼ(ロ)化合物（）からなり、こ
れらが前述の量比に調製されたものは使用に便利
である。さらに必要に応じて緩衝剤をこの組成物
に組合せることができる。 測定されるべき因子によつて必要な基質あるい
は酵素を加えた組成物あるいは別に用意して組合
せたキツトは種々の物質もしくは酵素活性の定量
に極めて便利で有用である。 以下に本発明の態様を実施例によつて示す。 実施例 １ コリンエステラーゼ活性の測定 50ｍＭトリス緩衝液（PH7.5）100mlにペルオキ
シダーゼ1000単位、ブリルチオコリン300mg、ト
リトンＸ−100を100mg、および発色化合物として
の化合物No.41を20mg、化合物No.53を20mg、
化合物No.59を20mg、化合物No.63を20mgをそれぞ
れ溶解し試薬液とする。 試薬液を予め37℃で10分間加温した後、血清
10μを添加し、正確に２分後と５分後の吸光後
を発色剤のλmaxにおいて試薬盲検を対照として
測定する。５分後と２分後の吸光度差を計算し、
予め作成した検量線より、血清中のコリンエラー
ゼ活性を算出する。 試薬液として上記緩衝液にペルオキシダーゼ、
プチリルチオコリン、390mgのDTNBを溶解した
液を用いる他は上記の同様に実施する。結果をオ
ルソトルオイルコリンを基質とし、コリンオキシ
ダーゼ、ペルオキシダーゼを使用した系(A)で測定
した数値と対比して第５表に併記する。なお第５
表の数値は△PH法に換算した数値である。

【表】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 下記一般式（）で表される化合物とメルカ
   プト基含有化合物とをペルオキシダーゼの存在下
   に反応させて生成する色素を定量することを特徴
   とするメルカプト基含有化合物の定量方法 一般式（） 〔式中Ｙは水素もしくはヒドロキシルを示し、
   R₁、R₂、R₃は同一もしくは異なつてよく下記一
   般式（）、（）又は（）で表される基を示
   す。 Ｚは水素、ヒドロキシル、アミノ、置換アミ
   ノ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、アリ
   ール、置換アリール、アシル、ハロゲン、ニト
   ロ、スルホ、カルボキシル、アルコキシを示す。
   ｎは１、２又は３を示し、R₁、R₂、R₃の少なく
   とも１つのＺはヒドロキシル、アミノ又は置換ア
   ミノである。又、Znにおける各Ｚは同一もしく
   は異なつていてもよい。〕 ２ (イ) ペルオキシダーゼ (ロ) 一般式（）で表される化合物 からなるメルカプト基含有化合物定量用組成物。