JP3036806B2 - 体液中の微量成分定量法 - Google Patents
体液中の微量成分定量法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は体液中の微量成分の定量法及びこれに使用す
る定量用組成物に関するものである。
る定量用組成物に関するものである。
昨今、ますます臨床検査における体液中の微量成分の
測定法で酵素学的分析法が普及し、注目されている。こ
れは、例えば血液中の定量すべき目的成分の尿酸、グル
コース、コレステロール、コリンエステラーゼ、トラン
スアミナーゼ、トリグリセライド、遊離脂肪酸等に特異
的に作用する酵素を用いて酵素反応を行い、これによる
生成物を測定して目的成分を定量するものである。就
中、過酸化水素生成酵素としての酸化酵素を作用させて
過酸化水素を生成させ、これをパーオキシダーゼの存在
下で発色剤と共に反応させて、その呈色を定量すること
により目的成分量を求める方法が普及している。
測定法で酵素学的分析法が普及し、注目されている。こ
れは、例えば血液中の定量すべき目的成分の尿酸、グル
コース、コレステロール、コリンエステラーゼ、トラン
スアミナーゼ、トリグリセライド、遊離脂肪酸等に特異
的に作用する酵素を用いて酵素反応を行い、これによる
生成物を測定して目的成分を定量するものである。就
中、過酸化水素生成酵素としての酸化酵素を作用させて
過酸化水素を生成させ、これをパーオキシダーゼの存在
下で発色剤と共に反応させて、その呈色を定量すること
により目的成分量を求める方法が普及している。
従来、このような発色反応系には、主として４−アミ
ノアンチピリンとの縮合対象物としてフェノールもしく
はその誘導体又はアニリンもしくはその誘導体等が用い
られている。ところが、この反応による発色系は微量成
分の定量に際しては感度が低く、かつ極大吸収波長が50
0〜600nmであり、ビリルビン、ヘモグロビン等の色素の
影響を受ける欠点がある。
ノアンチピリンとの縮合対象物としてフェノールもしく
はその誘導体又はアニリンもしくはその誘導体等が用い
られている。ところが、この反応による発色系は微量成
分の定量に際しては感度が低く、かつ極大吸収波長が50
0〜600nmであり、ビリルビン、ヘモグロビン等の色素の
影響を受ける欠点がある。
近年、このような欠点を解消する発色剤としてトリフ
ェニルメタン系もしくはジフェニルナフチルメタン系の
ロイコ色素を用いる方法が数多く報告されている〔特開
昭56−26199号、特開昭56−31641号、特開昭60−194363
号、特開昭60−218069号、特開昭60−256056号、特開昭
62−296号、特開昭62−93261号等〕。
ェニルメタン系もしくはジフェニルナフチルメタン系の
ロイコ色素を用いる方法が数多く報告されている〔特開
昭56−26199号、特開昭56−31641号、特開昭60−194363
号、特開昭60−218069号、特開昭60−256056号、特開昭
62−296号、特開昭62−93261号等〕。
しかしながら、それらのロイコ色素は発色系に用いた
場合、次の問題点を有している。
場合、次の問題点を有している。
現在普及している自動分析機における使用測定波長
が固定式であり、殆どの機種が600nm,660nm,700nmであ
るのに対して、それらロイコ色素を用いる発色系は極大
吸収波長が630nm付近もしくは750nm付近であるため、感
度的に不利であり、吸収スペクトルの肩で測定するこ
と。
が固定式であり、殆どの機種が600nm,660nm,700nmであ
るのに対して、それらロイコ色素を用いる発色系は極大
吸収波長が630nm付近もしくは750nm付近であるため、感
度的に不利であり、吸収スペクトルの肩で測定するこ
と。
pHによって測定感度が大きく変化すること。
水溶性が不充分であること。
ヘモグロビン、タンパク、尿酸等の血中共存物質の
影響を受けること。
影響を受けること。
また、同様の目的でトリフェニルメタン系のトリアミ
ノ誘導体としてロイコクリスタルバイオレットも報告さ
れているが、この色素は中性付近では水に難溶であり、
所望の濃度に溶解させるのが困難なため、微量成分の測
定には適当でない〔Analytical Chem.,Vol.42,No.3 p41
0〜411,（1970）〕。
ノ誘導体としてロイコクリスタルバイオレットも報告さ
れているが、この色素は中性付近では水に難溶であり、
所望の濃度に溶解させるのが困難なため、微量成分の測
定には適当でない〔Analytical Chem.,Vol.42,No.3 p41
0〜411,（1970）〕。
上記のような従来のロイコ色素が有する問題点を解決
すべく、本発明者は種々検討を重ねた結果、トリフェニ
ルメタン系のトリアミノ誘導体に親水基を導入すること
で、それらの問題が解決されることを見い出し、本発明
を完成させるに到った。
すべく、本発明者は種々検討を重ねた結果、トリフェニ
ルメタン系のトリアミノ誘導体に親水基を導入すること
で、それらの問題が解決されることを見い出し、本発明
を完成させるに到った。
〔課題を解決するための手段〕 本発明は下記の式（Ｉ）： 〔式中、Ｈは、水素を示し、R1〜R6は同一もしくは異な
ってよく、水素、置換フェニル基、整数１〜５のアルキ
ル基又は置換アルキル基を示し、Ａ〜Ｃは同一もしくは
異なってよく、スルホン基、カルボキシル基、水酸
基、、ニトロ基、ハロゲン、整数１〜５のアルキル基又
はアルコキシ基っを示し、ｎは0,1,2,3又は４を示
す。〕 で表される化合物を発色剤として用いることを特徴とす
る体液中の微量成分の定量法である。更に、本発明は、
式（Ｉ）の化合物を含有する体液中の微量成分の定量用
組成物にある。
ってよく、水素、置換フェニル基、整数１〜５のアルキ
ル基又は置換アルキル基を示し、Ａ〜Ｃは同一もしくは
異なってよく、スルホン基、カルボキシル基、水酸
基、、ニトロ基、ハロゲン、整数１〜５のアルキル基又
はアルコキシ基っを示し、ｎは0,1,2,3又は４を示
す。〕 で表される化合物を発色剤として用いることを特徴とす
る体液中の微量成分の定量法である。更に、本発明は、
式（Ｉ）の化合物を含有する体液中の微量成分の定量用
組成物にある。
本発明の原理は式（Ｉ）で示される化合物〔還元体〕
と過酸化水素がパーオキシダーゼ存在下に化学量論的に
反応し、色素〔酸化体〕を生成し、この色素の生成量は
過酸化水素の含有量に比例することに基づくものであ
る。
と過酸化水素がパーオキシダーゼ存在下に化学量論的に
反応し、色素〔酸化体〕を生成し、この色素の生成量は
過酸化水素の含有量に比例することに基づくものであ
る。
本発明によれば定量すべき目的成分が基質である場合
には、これを分解して過酸化水素を生成するのに必要な
酵素を、目的成分が酵素活性である場合には、その酵素
の基質及び過酸化水素を生成するのに必要な酵素を、パ
ーオキシダーゼの存在下に式（Ｉ）で示される化合物の
発色剤と共に反応させ、その呈色を測定することにより
目的物質と定量することができる。更に、酵素免疫測定
法（EIA法）において抗原もしくは抗体がパーオキシダ
ーゼで標識されている場合には、過剰の過酸化水素の存
在下に式（Ｉ）で示される化合物の発色剤と共に反応さ
せ、その呈色を測定することにより目的成分を定量する
ことができる。
には、これを分解して過酸化水素を生成するのに必要な
酵素を、目的成分が酵素活性である場合には、その酵素
の基質及び過酸化水素を生成するのに必要な酵素を、パ
ーオキシダーゼの存在下に式（Ｉ）で示される化合物の
発色剤と共に反応させ、その呈色を測定することにより
目的物質と定量することができる。更に、酵素免疫測定
法（EIA法）において抗原もしくは抗体がパーオキシダ
ーゼで標識されている場合には、過剰の過酸化水素の存
在下に式（Ｉ）で示される化合物の発色剤と共に反応さ
せ、その呈色を測定することにより目的成分を定量する
ことができる。
本発明の式（Ｉ）で表される化合物は、トリフェニル
メタントリアミノ誘導体であり、これらの化合物はAcid
Violet 6BあるいはBrilliant Blue Gなどの市販色素を
水素化ホウ素ナトリウム等を用いて還元し、シリカゲル
カラムクロマトグラフィーにより精製して得るか、ある
いはカラーインデックス記載のｐ−アミノベンズアルデ
ヒド誘導体とアニリン誘導体との縮合反応もしくは4,
4′−ジアミノベンズヒドロール誘導体とアニリン誘導
体との縮合反応等の合成法により得ることができる。
メタントリアミノ誘導体であり、これらの化合物はAcid
Violet 6BあるいはBrilliant Blue Gなどの市販色素を
水素化ホウ素ナトリウム等を用いて還元し、シリカゲル
カラムクロマトグラフィーにより精製して得るか、ある
いはカラーインデックス記載のｐ−アミノベンズアルデ
ヒド誘導体とアニリン誘導体との縮合反応もしくは4,
4′−ジアミノベンズヒドロール誘導体とアニリン誘導
体との縮合反応等の合成法により得ることができる。
このようにして得られる化合物を第１表に例示する
が、これらの例示に限定されるものではない。なお、第
１表中の記号は下記定義を有し、○内の数字は置換基の
位置を示す。
が、これらの例示に限定されるものではない。なお、第
１表中の記号は下記定義を有し、○内の数字は置換基の
位置を示す。
M:−CH3 CM:−CH2COOH E:−C2H5 CE:−C2H4COOH P:n−C3H7 CP:n−C3H6COOH S:−SO3H SP:n−C3H6SO3H HP:n−C3H6OH これらの化合物を発色剤として用いた場合の極大吸収
波長（λmax）、感度（分子吸光係数）及びpHによる影
響（吸光度の百分率）を第２表に示す。感度の測定は次
の方法で行った。
波長（λmax）、感度（分子吸光係数）及びpHによる影
響（吸光度の百分率）を第２表に示す。感度の測定は次
の方法で行った。
（１）試薬の調製 5000U/lのパーオキシダーゼ及び発色剤としての化合
物No.1〜42をそれぞれ各0.4mmol/lずつ、また比較例と
して公知発色剤No.1〜４（但し、No.4のみ0.1％トリト
ンＸ−100含有）をそれぞれ各0.025mmol/lずつ50mmol/l
PIPES−KOH緩衝液（pH7.0）に溶解し、試薬液とした。
なお、pHの影響は上記試薬液の緩衝液を50mmol/lクエン
酸−リン酸−ホウ酸緩衝液（pH5.0,pH7.0及びpH9.0）に
代えて調製した。
物No.1〜42をそれぞれ各0.4mmol/lずつ、また比較例と
して公知発色剤No.1〜４（但し、No.4のみ0.1％トリト
ンＸ−100含有）をそれぞれ各0.025mmol/lずつ50mmol/l
PIPES−KOH緩衝液（pH7.0）に溶解し、試薬液とした。
なお、pHの影響は上記試薬液の緩衝液を50mmol/lクエン
酸−リン酸−ホウ酸緩衝液（pH5.0,pH7.0及びpH9.0）に
代えて調製した。
（２）測定方法 上記にて調製した化合物No.1〜42の試薬液をそれぞれ
各3ml、また比較例No.1〜４の試薬液をそれぞれ各3mlを
別々に試験管に取り、これに0.62mmol/l過酸化水素水溶
液50μｌを加え、混合後37℃で５分間加温し、発色させ
る。同時に、蒸留水（試薬盲検用）を用いて同様の操作
を行う。発色後、試薬盲検を対照として吸光度を測定す
る。
各3ml、また比較例No.1〜４の試薬液をそれぞれ各3mlを
別々に試験管に取り、これに0.62mmol/l過酸化水素水溶
液50μｌを加え、混合後37℃で５分間加温し、発色させ
る。同時に、蒸留水（試薬盲検用）を用いて同様の操作
を行う。発色後、試薬盲検を対照として吸光度を測定す
る。
また、本発明の式（Ｉ）で表される代表的な化合物の
溶解性について、従来の発色剤と比較した結果を表３に
示す。この実験は次の方法で行った。
溶解性について、従来の発色剤と比較した結果を表３に
示す。この実験は次の方法で行った。
各化合物の60mM DMF溶解液0.05mlを50mMクエン酸−リ
ン酸−ホウ酸緩衝液（pH4〜９）3mlに添加し、混合後、
該緩衝液を対照に波長800nmで吸光度を測定した。各化
合物及びその酸化体の該緩衝液は波長800nmには吸収を
もたないため、濁度のみが吸光度に反映する。
ン酸−ホウ酸緩衝液（pH4〜９）3mlに添加し、混合後、
該緩衝液を対照に波長800nmで吸光度を測定した。各化
合物及びその酸化体の該緩衝液は波長800nmには吸収を
もたないため、濁度のみが吸光度に反映する。
本発明の方法により測定可能な生体試料中の成分とし
ては、酵素反応により生成する過酸化水素を測定するこ
とによって定量が可能な生体成分あるいは酵素免疫測定
法における標識酵素の酵素活性を測定することによって
定量が可能な生体成分は全て定量可能であるが、特に微
量の生体成分の定量に有利である。
ては、酵素反応により生成する過酸化水素を測定するこ
とによって定量が可能な生体成分あるいは酵素免疫測定
法における標識酵素の酵素活性を測定することによって
定量が可能な生体成分は全て定量可能であるが、特に微
量の生体成分の定量に有利である。
このような微量の生体成分としては、例えばコレステ
ロール、胆汁酸、グルコース、トリグリセライド、遊離
脂肪酸、尿酸、リン脂質、シアル酸、ピルビン酸、無機
リン、クレアチニン、クレアチン、ポリアミン、尿素窒
素、アンモニア、GOT、GPT、モノアミンオキシダーゼ、
グアナーゼ、コリンエステラーゼ、HBウイルス、α−F
P、CEA、CRP等が挙げられる。
ロール、胆汁酸、グルコース、トリグリセライド、遊離
脂肪酸、尿酸、リン脂質、シアル酸、ピルビン酸、無機
リン、クレアチニン、クレアチン、ポリアミン、尿素窒
素、アンモニア、GOT、GPT、モノアミンオキシダーゼ、
グアナーゼ、コリンエステラーゼ、HBウイルス、α−F
P、CEA、CRP等が挙げられる。
本発明による生体成分の定量において、過酸化水素を
生成させる酵素として用いられる酸化酵素及びその他の
目的で用いられる酵素類並びに酵素反応に関与する基質
及びその他の物質の種類及び使用量は、上記の測定対象
に応じた被酸化性呈色試薬を用いる自体公知の定量法に
準じて適宜選択すればよい。
生成させる酵素として用いられる酸化酵素及びその他の
目的で用いられる酵素類並びに酵素反応に関与する基質
及びその他の物質の種類及び使用量は、上記の測定対象
に応じた被酸化性呈色試薬を用いる自体公知の定量法に
準じて適宜選択すればよい。
本発明による式（Ｉ）で表される化合物、パーオキシ
ダーゼの使用量及びパーオキシダーゼ活性測定の際の過
酸化物、例えば過酸化水素の使用量は、測定対象物質の
種類、量、各種の測定法、即ち単位時間当たりの吸光度
変化を測定するレートアッセイ法あるいは一定時間後の
吸光度を測定するエンドポイント法等によりそれぞれ異
なり、それらに応じて適宜選択し決定される。一般的に
は、本発明の式（Ｉ）で表される化合物は0.001〜10m
M、好ましくは0.01〜1mMであり、パーオキシダーゼは0.
01〜100U/ml、好ましくは１〜20U/mlの範囲である。ま
た、パーオキシダーゼについては、その起源、由来に特
に限定はなく植物、動物、微生物起源のパーオキシダー
ゼ又はパーオキシダーゼ様物質がどれでも使用し得る
が、通常は西洋ワサビ由来が用いられる。パーオキシダ
ーゼ様物質としては、ヘモグロビンその他のヘム化合物
等が挙げられる。
ダーゼの使用量及びパーオキシダーゼ活性測定の際の過
酸化物、例えば過酸化水素の使用量は、測定対象物質の
種類、量、各種の測定法、即ち単位時間当たりの吸光度
変化を測定するレートアッセイ法あるいは一定時間後の
吸光度を測定するエンドポイント法等によりそれぞれ異
なり、それらに応じて適宜選択し決定される。一般的に
は、本発明の式（Ｉ）で表される化合物は0.001〜10m
M、好ましくは0.01〜1mMであり、パーオキシダーゼは0.
01〜100U/ml、好ましくは１〜20U/mlの範囲である。ま
た、パーオキシダーゼについては、その起源、由来に特
に限定はなく植物、動物、微生物起源のパーオキシダー
ゼ又はパーオキシダーゼ様物質がどれでも使用し得る
が、通常は西洋ワサビ由来が用いられる。パーオキシダ
ーゼ様物質としては、ヘモグロビンその他のヘム化合物
等が挙げられる。
本発明によるpHは４〜10の広範囲の域で実施可能であ
り、被検体中の各種の測定対象物質の至適pHあるいは測
定方法の至適pHに合わせて測定することができる。用い
られる緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、
ホウ酸塩、炭酸塩、トリス、グッド緩衝液などが挙げら
れるが、特にこれらに限定されない。また、必要に応じ
てトリトンＸ−100等の界面活性剤を用いる。
り、被検体中の各種の測定対象物質の至適pHあるいは測
定方法の至適pHに合わせて測定することができる。用い
られる緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、
ホウ酸塩、炭酸塩、トリス、グッド緩衝液などが挙げら
れるが、特にこれらに限定されない。また、必要に応じ
てトリトンＸ−100等の界面活性剤を用いる。
本発明によれば、式（Ｉ）で表される化合物は微量生
体成分の定量用の発色剤として使用すれば次のような利
点がある。
体成分の定量用の発色剤として使用すれば次のような利
点がある。
極大吸収波長が600nm近辺にあり、かつ非常に高感
度であり、従来の発色剤と比べて汎用の自動分析機を用
いる場合に特に有利である。
度であり、従来の発色剤と比べて汎用の自動分析機を用
いる場合に特に有利である。
pHによる影響が少なく、広範囲のpH域で高感度に測
定できる。
定できる。
従来の発色剤と比べて、発色剤の濃度を増大しても
発色感度の低下は見られず、直線性も良好であり、使用
濃度範囲は非常に広く、それ故、製造上非常に有利であ
る。
発色感度の低下は見られず、直線性も良好であり、使用
濃度範囲は非常に広く、それ故、製造上非常に有利であ
る。
ヘモグロビン、タンパク、尿酸等の血中共存物質の
影響を殆ど受けない。
影響を殆ど受けない。
水溶性が優れている。
以下、本発明を参考例及び実施例によって説明する。
参考例1.化合物No.1の合成 水酸化ホウ素ナトリウム10gを純水100mlに溶解し、Ac
id Violet 6B（カラーインデックスNo.42640）の水溶液
〔Acid Violet 6B 15gを純水800mlに溶解〕を窒素気流
下、室温で攪拌しながら滴下して加えた。滴下後、窒素
気流下、室温で３時間攪拌を行い、Acid Violet 6Bを還
元した。反応後、窒素気流下、5N塩酸を徐々に加えてpH
1とし過剰の水素化ホウ素ナトリウムを分解した。5NNaO
Hを加えてpH7とし、減圧下、濃縮乾固した。シリカゲル
カラムクロマトグラフィー、展開溶媒エタノール：アセ
トニトリル＝1:1.5により化合物No.1を含有するフラク
ションを集め、減圧下、濃縮乾固して目的物を得た。
id Violet 6B（カラーインデックスNo.42640）の水溶液
〔Acid Violet 6B 15gを純水800mlに溶解〕を窒素気流
下、室温で攪拌しながら滴下して加えた。滴下後、窒素
気流下、室温で３時間攪拌を行い、Acid Violet 6Bを還
元した。反応後、窒素気流下、5N塩酸を徐々に加えてpH
1とし過剰の水素化ホウ素ナトリウムを分解した。5NNaO
Hを加えてpH7とし、減圧下、濃縮乾固した。シリカゲル
カラムクロマトグラフィー、展開溶媒エタノール：アセ
トニトリル＝1:1.5により化合物No.1を含有するフラク
ションを集め、減圧下、濃縮乾固して目的物を得た。
収量 3.0g、収率20％ 融点 315℃（分解） 参考例2.化合物No.4の合成 Brilliant Blue R（カラーインデックスNo.42660）15
gを用いて化合物No.1の合成と同様に行って合成した。
gを用いて化合物No.1の合成と同様に行って合成した。
収量 3.8g、収率25％ 融点 225℃（分解） 参考例3.化合物No.5の合成 Brilliant Blue G（カラーインデックスNo.42655）15
gを用いて化合物No.1の合成と同様に行って合成した。
gを用いて化合物No.1の合成と同様に行って合成した。
収量 3.0g、収率20％ 融点 215℃（分解） 参考例4.化合物No.20の合成 〔参考文献:Acta Chem.Scand.,Vol.19,No.6,p1381〜139
0,（1965）．〕 36％（w/w）塩酸1.3ml,エタノール30mlの混液に尿素
0.30g（5mmol）,P−ジエチルアミノベンズアルデヒド0.
89g（5mmol）,N−エチル−Ｎ−スルホプロピルアニリン
ナトリウム塩4.0g（15mmol）を順次加えて溶解した。窒
素気流下、90〜100℃で24時間攪拌しながら還流した。
反応後、純水50mlを加え希NaOH水溶液を用いてpH7と
し、減圧下、濃縮乾固した。シリカゲルカラムクロマト
グラフィー、展開溶媒エタノール：クロロホルム＝5:1
により化合物No.20を含有するフラクションを集め、減
圧下、濃縮乾固して目的物を得た。
0,（1965）．〕 36％（w/w）塩酸1.3ml,エタノール30mlの混液に尿素
0.30g（5mmol）,P−ジエチルアミノベンズアルデヒド0.
89g（5mmol）,N−エチル−Ｎ−スルホプロピルアニリン
ナトリウム塩4.0g（15mmol）を順次加えて溶解した。窒
素気流下、90〜100℃で24時間攪拌しながら還流した。
反応後、純水50mlを加え希NaOH水溶液を用いてpH7と
し、減圧下、濃縮乾固した。シリカゲルカラムクロマト
グラフィー、展開溶媒エタノール：クロロホルム＝5:1
により化合物No.20を含有するフラクションを集め、減
圧下、濃縮乾固して目的物を得た。
収量 2.4g、収率70％ 融点 217−223℃ 参考例5.化合物No.40の合成 Ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド0.75g（5mmol）
を用いて化合物No.20の合成（参考例４）と同様に行っ
て合成した。
を用いて化合物No.20の合成（参考例４）と同様に行っ
て合成した。
収量 2.6g、収率78％ 融点 220−225℃ 参考例6.化合物No.41の合成 ４−ジプロピルアミノ−２−フルオロベンズアルデヒ
ド1.11g（5mmol）を用いて化合物No.20の合成（参考例
４）と同様に行って合成した。
ド1.11g（5mmol）を用いて化合物No.20の合成（参考例
４）と同様に行って合成した。
収量 1.6g、収率45％ 融点 228−233℃ 参考例7.化合物No.42の合成 ４−ジプロピルアミノ−２−メチルベンズアルデヒド
1.09g（5mmol）を用いて化合物No.20の合成（参考例
４）と同様に行って合成した。
1.09g（5mmol）を用いて化合物No.20の合成（参考例
４）と同様に行って合成した。
収量 1.3g、収率37％ 融点 208−216℃ 参考例8.発色後の吸収スペクトル （１）試薬の調製 5000U/lのパーオキシダーゼ及び発色剤としての化合
物No.1,20,41,42をそれぞれ各0.5mmol/lずつ、また比較
例として公知発色剤No.1,4,（但し、No.4のみ0.1％トリ
トンＸ−100含有）をそれぞれ各0.025mmol/lずつ50mmol
/l Bis−Tris緩衝液（pH7.0）に溶解し、試薬液とし
た。
物No.1,20,41,42をそれぞれ各0.5mmol/lずつ、また比較
例として公知発色剤No.1,4,（但し、No.4のみ0.1％トリ
トンＸ−100含有）をそれぞれ各0.025mmol/lずつ50mmol
/l Bis−Tris緩衝液（pH7.0）に溶解し、試薬液とし
た。
（２）測定方法 上記にて調製した化合物No.1,20,41,42の試薬液をそ
れぞれ各3ml、また比較例No.1,4の試薬液をそれぞれ各3
mlを別々に試験管に取り、これに0.62mmol/l過酸化水素
水溶液50μｌを加え、混合後37℃で５分間加温し、発色
させる。同時に、蒸留水（試薬盲検用）を用いて同様の
操作を行う。発色後、試薬盲検を対照として吸収スペク
トルを測定する。この測定結果を第１図に示す。
れぞれ各3ml、また比較例No.1,4の試薬液をそれぞれ各3
mlを別々に試験管に取り、これに0.62mmol/l過酸化水素
水溶液50μｌを加え、混合後37℃で５分間加温し、発色
させる。同時に、蒸留水（試薬盲検用）を用いて同様の
操作を行う。発色後、試薬盲検を対照として吸収スペク
トルを測定する。この測定結果を第１図に示す。
実施例1.遊離脂肪酸の定量 （１）試薬の調製 MgCl2 1mmol/l、ATP 1mmol/l、CoA 0.1mmol/l、アシ
ルCoAシンセターゼ400U/l、パーオキシダーゼ10000U/
l、トライトンＸ−100 0.03％の濃度になるように50mmo
l/l PIPES−KOH緩衝液（pH7.0）に溶解し、試薬１とし
た。
ルCoAシンセターゼ400U/l、パーオキシダーゼ10000U/
l、トライトンＸ−100 0.03％の濃度になるように50mmo
l/l PIPES−KOH緩衝液（pH7.0）に溶解し、試薬１とし
た。
FAD 4μmol/l、アシルCoAオキシダーゼ5000U/l、トリ
トンＸ−100 0.03％、発色剤として化合物No.1,20,39,4
2をそれぞれ各0.8mmol/lずつ50mmol/l PIPES−KOH緩衝
液（pH7.0）に溶解し、試薬２とした。
トンＸ−100 0.03％、発色剤として化合物No.1,20,39,4
2をそれぞれ各0.8mmol/lずつ50mmol/l PIPES−KOH緩衝
液（pH7.0）に溶解し、試薬２とした。
（２）測定操作 試験管に血清20μｌを取り、これに上記試薬１を1.3m
l加え、混合後、37℃で５分間加温し、その後、上記化
合物No.1,20,39,42の試薬２をそれぞれ各1.3mlを別々に
加え、混合後37℃で５分間加温し、発色させる。同時に
蒸留水（試薬盲検用）及び標準液を用いて同様の操作を
行う。発色後、試薬盲検を対照として波長600nmで吸光
度を測定し、予め作成した検量線（第２図に示す）より
血清中の遊離脂肪酸濃度を求める。この測定結果を従来
法の値と併せて第3,4,5,6図に示す。
l加え、混合後、37℃で５分間加温し、その後、上記化
合物No.1,20,39,42の試薬２をそれぞれ各1.3mlを別々に
加え、混合後37℃で５分間加温し、発色させる。同時に
蒸留水（試薬盲検用）及び標準液を用いて同様の操作を
行う。発色後、試薬盲検を対照として波長600nmで吸光
度を測定し、予め作成した検量線（第２図に示す）より
血清中の遊離脂肪酸濃度を求める。この測定結果を従来
法の値と併せて第3,4,5,6図に示す。
実施例2.尿酸の定量 （１）試薬の調製 KCl 50mmol/l、トライトンＸ−100 0.03％、発色剤と
して化合物No.2,40,41をそれぞれ各0.5mmol/lずつ50mmo
l/l PIPES−KOH緩衝液（pH7.0）に溶解し、試薬１とし
た。
して化合物No.2,40,41をそれぞれ各0.5mmol/lずつ50mmo
l/l PIPES−KOH緩衝液（pH7.0）に溶解し、試薬１とし
た。
KCl 50mmol/l、パーオキシダーゼ12500U/l、ウリカー
ゼ2500U/l、トライトンＸ−100 0.03％の濃度になるよ
うに50mmol/l PIPES−KOH緩衝液（pH7.0）に溶解し、試
薬２とした。
ゼ2500U/l、トライトンＸ−100 0.03％の濃度になるよ
うに50mmol/l PIPES−KOH緩衝液（pH7.0）に溶解し、試
薬２とした。
（２）測定操作 試験管に血清20μｌを取り、これに上記化合物No.2,4
0,41の試薬１をそれぞれ各2.0mlを別々に加え、混合後3
7℃で５分間加温し、その後上記で調製した試薬２を0.5
ml加え、混合後37℃で５分間加温し、発色させる。同時
に蒸留水（試薬盲検用）及び標準液を用いて同様の操作
を行う。発色後、試薬盲検を対照として波長600nmで吸
光度を測定し、予め作成した検量線（第７図に示す）よ
り血清中の尿酸濃度を求める。この測定結果を従来法の
値と併せて第8,9,10図に示す。
0,41の試薬１をそれぞれ各2.0mlを別々に加え、混合後3
7℃で５分間加温し、その後上記で調製した試薬２を0.5
ml加え、混合後37℃で５分間加温し、発色させる。同時
に蒸留水（試薬盲検用）及び標準液を用いて同様の操作
を行う。発色後、試薬盲検を対照として波長600nmで吸
光度を測定し、予め作成した検量線（第７図に示す）よ
り血清中の尿酸濃度を求める。この測定結果を従来法の
値と併せて第8,9,10図に示す。
実施例3.HBs抗原の測定 （１）試薬の調製 抗HBs抗体感作96穴平底プレートの調製PBSで５μg/ml
に調製した精製抗HBsマウスモノクロナール抗体を50μ
ｌずつ96穴平底マイクロプレート（ヌンク社製）の各穴
に分注した。これを37℃で３時間放置後、PBSで洗浄
し、0.5％（w/v）カゼインを含む50mmol/lトリス−塩酸
緩衝液（pH8.0）300μｌを加え、４℃で１晩放置し、抗
HBs抗体感作96穴平底プレートを調製した。
に調製した精製抗HBsマウスモノクロナール抗体を50μ
ｌずつ96穴平底マイクロプレート（ヌンク社製）の各穴
に分注した。これを37℃で３時間放置後、PBSで洗浄
し、0.5％（w/v）カゼインを含む50mmol/lトリス−塩酸
緩衝液（pH8.0）300μｌを加え、４℃で１晩放置し、抗
HBs抗体感作96穴平底プレートを調製した。
パーオキシダーゼ標識抗HBs抗体の調製 パーオキシダーゼ5mgを1mlの0.3mol/lの炭酸水素ナト
リウムに溶解し、これに0.2mlの１％2,4−ジニトロフル
オロベンゼンを加えて１時間攪拌した後、1mlの0.06mol
/l過ヨウ素酸ナトリウムを加え、30分攪拌、さらに1ml
の0.16mol/lエチレングリコールを加えて１時間攪拌す
る。これを炭酸緩衝液（pH9.5）で一昼夜透析する。こ
れを炭酸緩衝液（pH9.5）に溶解した抗HBsモノクロナー
ル抗体（5mg/ml）1mlと混合し、室温で３時間反応後、
（PBS透析）セファクリルＳ−200でゲル濾過してパーオ
キシダーゼ標識抗HBs抗体を得る。
リウムに溶解し、これに0.2mlの１％2,4−ジニトロフル
オロベンゼンを加えて１時間攪拌した後、1mlの0.06mol
/l過ヨウ素酸ナトリウムを加え、30分攪拌、さらに1ml
の0.16mol/lエチレングリコールを加えて１時間攪拌す
る。これを炭酸緩衝液（pH9.5）で一昼夜透析する。こ
れを炭酸緩衝液（pH9.5）に溶解した抗HBsモノクロナー
ル抗体（5mg/ml）1mlと混合し、室温で３時間反応後、
（PBS透析）セファクリルＳ−200でゲル濾過してパーオ
キシダーゼ標識抗HBs抗体を得る。
基質−発色液の調製 過酸化水素1.45mmol/l、化合物No.1 0.5mmol/lの濃度
になるように0.1mol/lリン酸緩衝液（pH7.0）に溶解
し、基質−発色液とした。
になるように0.1mol/lリン酸緩衝液（pH7.0）に溶解
し、基質−発色液とした。
（２）測定操作 抗HBs抗体感作96穴平底プレートに200ng/ml,400ng/m
l,600ng/ml,800ng/ml,1000ng/ml,1200ng/mlの各濃度のH
Bs抗原含有試料50μｌを取り、37℃で３時間加温し、PB
Sで洗浄した。次いで、パーオキシダーゼ標識抗HBs抗体
50μｌを加え、37℃で２時間加温し、PBSで洗浄した。
その後、基質−発色液100μｌを加え、37℃で30分間加
温し、発色させる。同時に抗HBs抗体を感作してない96
穴平底プレートを用いて同様の操作を行う（盲検用）。
発色後、盲検を対照として波長600nmでマイクロプレー
トリーダー（コロナ電気社製MTP−32）を用いて吸光度
を測定した。この結果を第11図に示す。
l,600ng/ml,800ng/ml,1000ng/ml,1200ng/mlの各濃度のH
Bs抗原含有試料50μｌを取り、37℃で３時間加温し、PB
Sで洗浄した。次いで、パーオキシダーゼ標識抗HBs抗体
50μｌを加え、37℃で２時間加温し、PBSで洗浄した。
その後、基質−発色液100μｌを加え、37℃で30分間加
温し、発色させる。同時に抗HBs抗体を感作してない96
穴平底プレートを用いて同様の操作を行う（盲検用）。
発色後、盲検を対照として波長600nmでマイクロプレー
トリーダー（コロナ電気社製MTP−32）を用いて吸光度
を測定した。この結果を第11図に示す。
上記の如く、本発明の式（Ｉ）で表される化合物は、
いずれもその呈色時の極大吸収波長が600nm付近にある
ため、汎用の自動分析機に特別適しており、pHによる影
響が少なく広範囲のpH域で高感度に測定が可能になり、
かつ水溶解性が極めて良好である等、微量の生体成分の
測定の発色剤として用いた場合、その効果は顕著なるも
のである。
いずれもその呈色時の極大吸収波長が600nm付近にある
ため、汎用の自動分析機に特別適しており、pHによる影
響が少なく広範囲のpH域で高感度に測定が可能になり、
かつ水溶解性が極めて良好である等、微量の生体成分の
測定の発色剤として用いた場合、その効果は顕著なるも
のである。
第１図は、参考例８における吸収スペクトルを表し、第
２図及び第3,4,5,6,図は実施例１における検量線及び相
関図を表し、第７図及び第8,9,10図は、実施例２におけ
る検量線及び相関図を表し、第11図は、実施例３におけ
る検量線を表すものである。
２図及び第3,4,5,6,図は実施例１における検量線及び相
関図を表し、第７図及び第8,9,10図は、実施例２におけ
る検量線及び相関図を表し、第11図は、実施例３におけ
る検量線を表すものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/00 - 1/52 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
Claims (3)
- 【請求項１】次式（Ｉ）： 〔式中、Ｈは、水素を示し、R1〜R6は同一もしくは異な
ってよく、水素、置換フェニル基、整数１〜５のアルキ
ル基又は置換アルキル基を示し、但し、R1〜R6の少なく
とも一つは親水基で置換されたフェニル基又は親水基で
置換された整数１〜５のアルキル基であり、Ａ〜Ｃは同
一もしくは異なってよく、スルホン基、カルボキシル
基、水酸基、ニトロ基、ハロゲン、整数１〜５のアルキ
ル基又はアルコキシ基を示し、ｎは0,1,2,3又は４を示
す。〕 で表される化合物を発色剤として用いることを特徴とす
る、体液中の微量成分の定量法。 - 【請求項２】親水基が、スルホン基、カルボキシル基、
又は水酸基である、請求項１記載の体液中の微量成分の
定量法。 - 【請求項３】式（Ｉ）で表される化合物を含有すること
を特徴とする、体液中の微量成分の定量用組成物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23304789 | 1989-09-11 | ||
| JP1-233047 | 1989-09-11 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03206896A JPH03206896A (ja) | 1991-09-10 |
| JP3036806B2 true JP3036806B2 (ja) | 2000-04-24 |
Family
ID=16948968
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP02237226A Expired - Fee Related JP3036806B2 (ja) | 1989-09-11 | 1990-09-10 | 体液中の微量成分定量法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3036806B2 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4489400B2 (ja) * | 2003-10-02 | 2010-06-23 | アークレイ株式会社 | 試薬の安定化方法 |
| BR112013001393A2 (pt) | 2010-08-11 | 2016-05-24 | Kyowa Medex Co Ltd | métodos para medir hemoglobina glicada em uma amostra, para conservar uma solução aquosa contendo um leuco-cromogênio e para estabilizar um leuco-cromogênio, reagente de medição de hemoglobina glicada em uma amostra e kit para medir hemoglobina glicada em uma amostra |
| CN103080239B (zh) | 2010-08-11 | 2015-03-25 | 协和梅迪克斯株式会社 | 含有无色型色原体的水溶液的保存方法 |
| KR20140005890A (ko) | 2010-12-13 | 2014-01-15 | 교와 메덱스 가부시키가이샤 | 류코형 색원체 함유 수용액의 보존 방법 |
-
1990
- 1990-09-10 JP JP02237226A patent/JP3036806B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｇｒａｐｈｙ，（１９８１）Ｖｏｌ．２１６，ｐ．４１３−４１６ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH03206896A (ja) | 1991-09-10 |
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