JPH04504467A - アルブミン―テトラゾリウム相互作用を使用するアッセイ - Google Patents
アルブミン―テトラゾリウム相互作用を使用するアッセイInfo
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
アルブミン−テトラゾリウム 互 るアッセイ本発明は、テトラゾリウム化合物
を着色ホルマザンに還元する改善された方法と、この方法を分析物質(ln@1
ytes)、特にアルブミンのアッセイ(即ち検出及び/または定量分析)に使
用することとに係わる。
テトラゾリウム塩はカチオン性テトラゾリウム核:を含んでおり、これが還元に
よって開裂されると、開環基:を含むホルマザンが生成される。
テトラゾリウム塩は多くは無色であるが、ホルマザンが生成されると、ホルマザ
ン基は強力な着色発色団であるので色の変化を惹起する。従って生成されたホル
マザンの存在及び/または量は、例えば505〜660nmの範囲、特に590
nm近傍における吸収変化を観察することにより目視または比色分析によって都
合良く検出することができる。一般に弱還元荊は、タンパク質性物質の不在下で
はテトラゾリウム塩をホルマザンに還元するのみである。この還元時の色変化は
、例えば特許第WO38108882号に記載のごときアッセイ方法に使用する
ことができる。
アルブミンは、1つの形態においては相対分子量67000を有し、584個の
アミノ酸単鎖からなるタンパク質である。アルブミンは、他のどの単一のタンパ
ク質よりも高い濃度でヒト血清中に存在する。血清中のアルブミンの主な機能と
しては、浸透圧を維持することと、ビリルビンのような代謝物、脂肪酸、カルシ
ウムのような無機化合物、ホルモン及び多くの薬剤のための担体タンパク質とし
て作用することとを挙げることができる。更にアルブミンはアミノ酸源をも提供
する。 。
幾つかの理由により、アルブミンは臨床生化学検査室において分析されることが
多い1例えばアルブミンは、肝疾患の指標として使用されたり、アルブミン置換
療法における必須要因であったり、未結合(未抱合)ビリルビンのレベルを指示
できたり、骨髄種の症例を指示できたり、栄養療法レジンに使用することもでき
る(Whicher及び5pence r、Ann、CI i n、B i o
chem、24572(1987))。
血清アルブミンを定量的に測定する方法としては幾つがが公知である。血清アル
ブミンは、電気泳動によってまたは免疫学的方法によって測定することができる
。しがしながら最も一般に使用されている方法の1つは、ブロモクレゾールグリ
ーン(BCG)(Rodkey、F、L、、C1jn、chem、よユ 478
(1965))またはブロモクレゾールパープル(BCP)(Loude rb
ack、A、。
Mea Iey、E、H,、&Taylor、N、A、、CI in、Chem
、14 793(1968))のいずれがを使用する染料結合に基づくものであ
る。ブロモクレゾールグリーン法は、高アルブミン濃度においては回収量が低く
、また低アルブミン濃度においては回収量が高((Webster、D、、Bi
gnel l、A、H,C,&Atwood。
E、C,、Cl1n、Chem、Acta、53 101(1974))、一般
に非特異的である(Slater、L、、Carter、P、M、&Hobbs
、J、R,,Ann、Chin、Biochim、上ユ 33(1975))、
ブロモクレゾールパープルに基づく方法は一般により特異的である(Pfnne
l l、A、E、&Northam、B、E、。
Cl i n、Chem、24 80(1978))、Lかしながらブロモクレ
ゾールパープルは種間のアルブミン特異性を示さず、多くのカリブレーターは、
重要なヒトアルブミンよりずっと低い吸収しか示さないウシまたはウマいずれか
のアルブミン基準を含む。更にヘパリンは干渉すると報告されており(Perr
y、B、W、&Douman、B、T、。
C1in、Chem、 151520(1979))、従ってヘパリン化血液の
使用は除外される。ビリルビンも干渉すると考えられている。
従って、着色生成物の形成が試料中に存在し得る他の成分の干渉を受けることな
くアルブミンの存在及び濃度に応答していることに基づく方法は、実用的に極め
て有利となろう。本発明の目的は、上述の欠点を有さず、着色生成物を生成する
作業によるアルブミンの定量化に使用し得る新規の方法を提供することである。
本発明の他の目的及び長所は以下の説明から明らかとなるであろう。
本発明の第1の態様によれば、カチオン性核:を含むテトラゾリウム化合物を還
元し、基:を含む開環ホルマザン化合物を生成する方法は、テトラゾリウム化合
物をアルブミンと相互作用させ、テトラゾリウム化合物−アルブミン相互作用生
成物をpH6〜10の水溶液中で還元剤を用いて還元するステップを特徴とする
。
本発明は、弱還元剤はアルブミンの不在下且つ10以上のpHでのみ多くのテト
ラゾリウムを還元し得るが、本発明のより低い範囲のPHにおいては、アルブミ
ンとの相互作用によりテトラゾリウム塩の還元が実質的に増強されるという予想
外の発見に基づく0本発明の方法は特に、2−(2′−ベンゾチアゾリル)−5
−スチリル−3−(4°−フタルヒドラジジル)−テトラゾリウム(本明細書中
“BSPT”と略記する)のロイコ形態、特に塩酸塩の還元に適用し得る。
BSPTはテトラゾリウムカチオン:
を含む、テトラゾリウム塩とアルブミンとの相互作用は、テトラゾリウム塩の着
色ホルマザン染料への還元作用を増強、加速または触媒する結果を与えるもので
ある1本発明の方法におけるテトラゾリウム塩とアルブミンとの相互作用の厳密
な特性は完全には理解されていないが、この相互作用は塩とアルブミンとの間の
複合体形成を含み得ると考えられる。相互作用及び/または複合体形成は、テト
ラゾリウム核上の置換基の存在から生じ得る。従って本発明の方法は、その核が
、BSPT中に存在する1つ以上の置換基、即ちそれ自体が環系上に1換基を有
するベンゾチアゾリル、スチリルもしくはフタルヒドラジジル基またはこれらの
基の組合せによって置換されているテトラゾリウム塩に適用し得る。
多くの還元剤が本発明の方法に使用するのに適しているが、弱還元剤を使用する
のが好ましい、適していると判明している還元剤の例としてはジチオトレイトー
ル(“DTT″)、メルカプトエタノール(例えばベータメルカプトエタノール
)、システィン、ニコチンアミドアデニンジヌクに好ましい還元剤はNADHに
コチンアミドアデニンジヌクレオチドの還元形’Iりである。
還元剤とテトラゾリウム塩との間の電子伝達の速度を増強するために、本発明の
方法の反応媒質中に電子伝達体を使用することもできる。好ましい電子伝達体は
ツェナジニウム塩、即ちカチオン性核二
〔式中、Rは水素またはアルキルである〕を含む化合物である。好ましいツェナ
ジニウム塩はメトキシ−N−メチルツェナジニウムメチルサルフェート(“MP
MS” )、即ち
であるが、他の適してはいるがやや好ましくないツェナジニウム塩としては、ツ
ェナジニウムメトサルフェート(“PMS” )及びツェナジニウムエトサルフ
ェート(PE52)を挙げることができる。
pHを6〜10に維持し得る任意のmW液を使用することができるが、好ましい
緩衝液は、トリスしドロキシメチルアミノメタンHCI(“Trys−HCI”
)である。
溶液の好ましいpHは8.5である。
界面活性剤は生成されたホルマザンの溶解を助成するので、本発明の方法の反応
溶液中には界面活性剤を含むことも好ましい、好ましい界面活性剤は非イオン性
界面活性剤、特にポリオキシエチレンソルビトールエステル、なかでもTwee
n 80(登録商標)である。
テトラゾリウム化合物の還元及びその結果のホルマザン形成の程度は、反応溶液
中に存在するアルブミン及び/または還元剤の量に定量的に関係し、従ってこれ
ら2つのうち1つが反応における制限因子となると、即ち他の全ての反応物質を
過剰に存在させると、アルブミンまたは還元剤に対するアッセイのベースとして
本発明の方法を使用することができる。
従って第2の態様において、本発明は、アルブミンと相互作用し得るテトラゾリ
ウム塩を、pH,6〜10の水溶液中で試料の存在下に還元剤と反応させてホル
マザンを生成し、生成されたホルマザンの存在及び/または量を試料中のアルブ
ミンの存在及び/または量と関係づけることからなる、試料中のヒトまたは哺乳
動物アルブミンをアッセイする方法を提供する。
アルブミンと相互作用した後にpH6〜10中で弱還元剤によって(臨床分析に
容認され得る時間内に)実質的に還元され得る他のテトラゾリウム塩を使用する
こともできるが、好ましいテトラゾリウム塩はBSPT、特にその塩酸塩、また
は、その核が、それ自体が環系上に置換基を有し得る前述のごときBSPT中に
存在する1つ以上の置換基またはかかる基の組合せで置換されている他のテトラ
ゾリウム塩である。
上記アルブミンアッセイ方法は、試料液が水溶液となっていなくとも、そこに含
まれるアルブミンの少なくとも一部分が溶解して必要な水溶液を形成し得るとい
う条件で、アルブミンを含むと考えられるいかなる試料に使用するのにも適して
いる。即ち該方法は、アルブミンを含むと考えられる水性試料、特に体液のよう
な生物学試料、なかでも何の前処理もなく直接使用し得る血清、または尿などの
アッセイに最も適している。
該アッセイ方法を実施する際には、反応混合物中に存在させるテトラゾリウム塩
及び還元剤の量は、存在するアルブミンの量が制限因子となるように、試料中の
アルブミンと相互作用すると推定される量より過剰であるのが望ましい。
本発明のアルブミンアッセイ方法に適当で好ましい反応条件及び試薬は、還元剤
の選択、電子伝達体の使用、緩衝液及びPH1並びに界面活性剤の使用など本発
明の第1の態様に照らして上述したものと同様である。これらのパラメーターを
下記の表1にまとめて示す。
表1
テトラゾリウム塩の濃度 iopm−10hH75−95uN還元剤の濃度 1
uH−100mM O,05−0,2mM電子伝達体の濃度 1μN−1@H5
&1M−0,5m14pHIl[衝液(7)濃度tmM −LM 50−150
mM界面活性剤の濃度(w/v) 0.01−5% 0.2−0.5%温度 5
−60℃ 20−37℃
上記条件下で、テトラゾリウム塩の還元は、アッセイが臨床用途に都合の良い時
間スケールである数分の間に実施されるのに十分に迅速に行われる。
本発明の方法は臨床的に有意なレベル以下のアルブミンレベルに高感度を示し、
比色分析は、元の血清試料の約100 m g / m 1までの初期アルブミ
ンレベルと直線関係を有する。血清自体は測定に使用される範囲の波長において
実質的に吸収しないので、通常はブランク試料は必要でない、この方法はアルブ
ミンに特異的と見られ、血清試料を前処理する必要もなく、実質的に干渉を受け
ることもない。
本発明のアルブミンを測定する方法は多くの用途を有するが、とりわけ臨床化学
の分野において迅速で且つ日常的な分析方法が必要とされる場合に特に有効であ
る。他の用途としては、アルブミン生産における品質管理測定、他の血液製剤中
のアルブミン含有量の評価及びアルブミンの構造研究を挙げることができる。
従って第3の態様において、本発明は、アルブミンと相互作用し得るテトラゾリ
ウム塩を、pH6〜10の水溶液中でアルブミン存在下に試料と反応させ、生成
されたホルマザンの存在及び/または量を試料中の還元物質(還元剤)の存在及
び/または量と関係づけることからなる試料中の還元物質をアッセイする方法で
あって、使用するテトラゾリウム塩の量が試料中の還元物質によって還元される
と推定されるより過剰の量である方法を提供する。
上記還元物質のアッセイ方法に適当で好ましい反応条件及び試薬は、テトラゾリ
ウム塩の選択、電子伝達体の使用、Mil液及びpH,並びに界面活性剤の使用
など本発明の第1及び第2の態様に照らして上述したものと同様である。
この方法の反応溶液のパラメーターは、試料中の還元物質のおおよその濃度を前
置て概算し得るならば1表1に記載の範囲にあるようにすることが望ましい、最
高約100mg / m Iまでのアルブミン濃度が適当であると思われる。
上記還元物質アッセイ方法は、多種の化学的還元物質をアッセイするのに使用す
ることができるが、例えばアミンフェノール、NADHまたは補酵素A(Co−
A)といった生化学的臨床または診断に重要な還元物質のアッセイに特に適して
いる。該方法を使用し、血清、尿などの体液試料中の前記還元物質をアッセイす
ることができる。
更なる変形態様として、還元物質アッセイ方法は、本発明の方法によってアッセ
イされ且つ化合物の存在及び/または量と関係づけされ得る還元物質が形成され
る化学反応に関与し得る化合物をアッセイするのに使用することもできる。
このような反応においてアッセイされるべき化合物はそれ自体が還元物質に変換
され得る0例えば薬剤バラセタモール(p−ヒドロキシアセトアニリド)は、例
えばアリールアシルアミダーゼ酵素を使用し良く知られた反応で還元物質バラ−
アミノフェノールに定量的に変換することができる1次いで、形成されたバラ−
アミノフェノールをアッセイし、パラセタモールの量と関係づけることができる
。
或いはこのような反応において、該化合物以外の1種以上の関与試薬を還元物質
に、存在する該化合物の量に関係する量で変換することもできる。
例えば、最終的にCo−Aに変換されるアセチルCo−Aをアセチル化試薬とし
て使用する反応において、抗生物質であるクロラムフェニコール及びチアムフエ
ニコールやゲンタマイシンをアセチル化することもできる。かかる反応は、それ
ぞれ酵素クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(“CAT”)また
はゲンタマイシンアセチルトランスフェラーゼ(“GAT”)の媒介下で容易に
進行する。各ケースで、生成されたCo−Aの存在及び/または量を抗生物質の
存在及び/または量と定量的に関係づけることができる。
これら本発明のアッセイ方法は、多数の方法で手作業でまたは自動化して実施す
ることができる1例えば、前述のpHにおいて少なくとも試料と、テトラゾリウ
ム塩と、適宜還元剤またはアルブミンとを含有し、必要によっては前述のごとき
他の試薬も含有する水溶液を作製し、適当な温度でインキュベートすることがで
きる0次いで発色を検出し、例えば基準値と比較したりまたは比色分析法によっ
て測定する0反応溶液は水性であるが、全ての試薬、特にテトラゾリウム塩の溶
解を助成するために別の水混和性溶剤を含有することも必要となり得る。このよ
うな溶剤の1つの好ましい例はジメチルホルムアミド(“DMF”)である。
このようにして本発明の方法を実施する上で、試薬及び試料を混合する順序は重
要ではないと考えられる。
或いは、テトラゾリウム塩、適宜還元剤またはアルブミン、緩衝液などの適当な
試薬は、例えば含浸、吸着または吸収によって面相支持体上に固定することもで
きる0次いで、適宜アルブミンまたは還元剤を含む液体試料に暴露して支持体に
色変化を惹起し、それを検出することもできる。
本発明のアッセイ方法を実験用及び臨床用途に都合の良いようにするために、更
に本発明は、本発明の方法を実施するための上述の試薬の既製品を1種以上組み
合わせて含むアッセイキットをも提供する。例えばキットは、アルブミンと相互
作用し得るテトラゾリウム塩、緩衝液、及び適宜還元剤またはアルブミンを本発
明の方法に容易に使用し得るのに適当な濃度で、また必要によっては前述したよ
うな界面活性剤、電子伝達体などの他の試薬をそれぞれに含む個別溶液からなり
得る。或いはこのようなキットは、適当な試薬がその上に固定されている固相支
持体を含むこともできる。更にキットは、色比較チャートを含み得る基準物質及
び操作手順書をも含む得る。このような試験キットにおいて、試薬は最低で30
日間保管しても安定であることが判っているが、長期保存時の安定性のためには
、テトラゾリウム塩の酸性溶液、例えばpH3〜6の0.01−0.2M塩酸、
リンゴ酸または特にクエン酸の溶液を製造することが望ましい。本発明の方法を
実施するかかるキットを製造する方法は当業者には明らかであろう。
以下、図面を参照し本発明を示す実施例を説明する。
図1は、BSPT−アルブミン相互作用生成物の還元における濃色変化を示す。
図2は、実施例1の方法について590nmにおける吸収対アルブミン濃度を示
す。
図3は、保管時の試薬の安定性を示す。
図4は、手作業で実施した本発明の方法と従来方法との比較を示す。
図5は、自動化装置で実施した本発明の方法と従来方法との比較を示す。
図6は、本発明の方法と従来の免疫学的方法との比較を示す。
図7は、吸収対Co−A濃度を示す。
図8は、吸収対パラセタモール濃度を示す。
図9は、吸収体クロラムフェニコール濃度を示す。
1 アルブミン 餐 ット I
■
駁粂人=
テトラゾリウム塩の標準原液二
(i)BSPT塩酸塩+10.5mlのジメチルホルムアミドに10mgを溶解
したもの
<1i)9.4ml 12mmol/Lのクエン酸テトラゾリウム塩の作業標準
液
(i)標準原液18m1を、76m1の12mm。
1/Lクエン酸、4mlの15%(w/v)Tween80及び2mlの1mm
ol/LMPMSで希釈したもの
KI上:
20mmol/L Tris HCI、pH8,5にム工:
5mmol/L ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(還元形態)
1迭
1.0.5mlの試薬Aに、0.5mlの試薬Bと40μlの試薬Cとを加える
。
2、室温で3分間、平衡させる。
3、試料50μlを加え、よく混合する。
4.1分後に590nmにおける吸収を読取る。
種々の初期濃度のアルブミンによって与えられたA590nmにおける結果は図
2の較正曲線において示される。
発した色は少なくとも1時隔安定であった。
2 ルブ々ン ・・ !■
■
!!cJLA:
12mmol/L クエン酸
0.18mmol/L BSPT塩酸塩0.5mmol/IL MPMS
区11:
20mmol/L Tris HCI、pH8,535%v/v Tween
80
1夷旦:
2.5mmol/L NADH
1迭
1.50m1の試薬A、50m1の試薬B及び4.0mlの試薬Cを加えること
により作業標準試薬を調製する。この混合液は少なくとも12時間安定である。
2.0.1mlの作業標準試薬に5μlの血清(またはアルブミンを含む試料)
を加える。1分後に試薬ブランクに対する590nmにおける吸収を読取る。
別々に調製され保存された試薬A、B及びCは、記載の期間だけ保存された試薬
から調製した作業標準試薬に種々の濃度のアルブミンを加えた結果である図3の
590nmにおける吸収の安定性によって示されるように、最低30日間は安定
である。
の − い の ルブ々ンア・・セイ
下記の表2は、NADH以外の還元剤を記載の濃度で使用した場合を示す、ホル
マザン生成とアルブミン濃度との関係が直線であるアルブミン濃度の範囲も示し
てあり、NADHも比較用基準として使用している。各ケースで、テトラゾリウ
ム塩はBSPT塩酸塩とした。
轟ユ
還元剤 濃度 直線性 A390 色
IINIIIIL %
NADH5,00−801,70100,0OL−システィン 2.5 0−5
5 1.05 61.76L−システィン 5.0 0−70 1.50 88
.24L−システィン 10.0 0−70 1.58 92.94メルカプト
エタノール 2.5 0−60 0.99 58.24メルカプトエタノール
5.0 0−70 1.42 83゜53メルカプトエタノール 10.0 0
−80 1.48 87.06DTT 1.0 0−50 1.0 58.82
DTT 2.5 0−80 1.67 98.24DT7 5.0 0−80
1.69 99.44 アルブミン ッセイにお番 ゛
種々の潜在的干渉物質を含む試験試料を比較することにより、実施例1または2
のキットを使用するアルブミンアッセイへの干渉を調査した。結果は下記の表3
に示す。
表1
1浪皿分 1皮11 9
トランスフエリン 1.67−7.14mg/醜1 なしクレアチニン 0.0
5−0.3論N なしクレアチン 0.05−0.3 mHなし尿素 0.02
−0.3 mg/sl 僅かにありグルコース 0.3 1.5.sg/ml
なしMgCl2 0.3 1.5−Hなし
NaCl 100−200 sN なしKCI 2−8 輪N なし
アスコルビン酸 10dl なし
アルコルビン酸塩 1011M なし
ビリルビン 0.001−0.3 mg/+sl なしヘパリン 3−25 単
位/1 なし
液!春1 1皮思1 玉捷
すリチル酸 0゜1 −0.4醜g/@1 なしテオフィリン 0.1 −0.
51111/@I なしアセトアミノフェン 0.02−1.0 mg/ml
なしリドカイン 0.002−0.01i+g/+sl なしバルビタール 0
.01−0.1−g/輸1 なしカフェイン 0.1 細g/輸1 なし直丘威
溌 1皮藍朋 玉捗
トランスフェリン 1.67−2.86mg/請1 なしクレアチニン 5G
−300egg/ml なし1痰叉Zバグ1 濃度[l1d ジ
グロブリンウシ 20 なし
ウシグロブリン 20 なし
インシュリンラン 20 なし
1渡叉Zバヱ厘 1工[1!LJL、償U 吸収ぶ男匝蛙アルブミン(対照)
50 0.541インシユリンウシ 20 0.556
グロブリンウシ 20 0.542
ウシグロブリン 20 0.542
上記したように、全ての血液成分は干渉を示さなかった。
調査した濃度は、血液に通常認められる範囲以上であった。
凝固を段階化するためにヘパリンを濃度6.7単位/mlで血液に加えた。
認識可能な干渉は尿素のみでみられた。
5 “の”アルブタンアッセイ ゛ の 1アルブミン測定のBSPT法を、病
院内で一般に使用されている他の方法と比較した。これらの方法は、ブロモクレ
ゾールグリーン(BCG)に基づく染料結合方法と免疫学的方法とであった。全
部で71個の病因学血清試料を、BSPT法を使用して手作業で試験し、自動化
BCG法と比較した。これらの試料においてアルブミンの量を約15〜60 m
g / m 1の範囲で変化させた0次いでこのデータを統計的に解析し、B
SPT法とBCG法との間に優れた相関を示唆する回帰式Y=9.268+0.
7Xを得た。このデータは手作業によるBSPT法及びBCG法の使用に係わっ
ており、この結果は図4に示されている。
上記使用した方法(BSPT及びBCG)は自動化装置にもおいても使用するこ
とができる。“MultistatIII p l u s”における自動化作
業としてBSPT法及びBCG法を使用し同様の解析を実施した。この結果は図
5に示されている。
更にBSPT法は、図6に示したように免疫学的方法ともよく相関する(結果の
データは示さない)。
6 Aの ツセ
BSPT塩酸塩、アルブミン、MPMS、Tr i 5−HC1@@液及びTw
een−80を表1に示した範囲内の濃度で含有する溶液を調製した。このアリ
コートにCo−Aを、Co−Aの終濃度が0.25mMまでの濃度範囲で加えた
0図7は、この範囲内で590nmにおける吸収がCo−A濃度に関して直線で
あることを示している。
7 バーセタモニ反曵Iユ±A
酵素アリールアシルアミダーゼを使用し公知の反応でパラセタモールを定量的に
清澄化し、p−アミノフェノールを形成した。BSPT塩酸塩、アルブミン、M
PMS、Tris−HCL@@液及びTween−80を表1に示した範囲内の
濃度で含有する溶液を調製した。このアリコートにp−アミノフェノールを加え
た。4−アミンフェノール濃度対590nmにおける吸収のグラフは、p−アミ
ンフェノールの終濃度3.0mMまでの濃度における吸収変化を示している。こ
れは、図8から判るように、バラセタモール濃度対590nmにおける吸収は濃
度2.0mMまで優れた直線関係を示すと関係づけることができよう。
8 ロームフェニコールのアッセイ
アセチルCo−A及び酵素CA、Tを使用し、公知の反応によってクロラムフェ
ニコールをアセチル化した。この結果、当初存在したクロラムフェニコールの量
に定量的に関係する量のCo−Aが生成された。生成されたCo−Aを実施例6
の作゛業手順を使用しアッセイした0図9に示したように、クロラムフェニコー
ル濃度に対する590nmにおける吸収は、1ON20μMのクロラムフェニコ
ールの範囲で直線であった。
呵(q尺
8〔6
IMMUNO
国際調査報告
国際調査報告
GB 9000552
SA 36089
Claims (24)
- 1.カチオン性核: ▲数式、化学式、表等があります▼ を含むテトラゾリウム化合物を還元し、基:▲数式、化学式、表等があります▼ を含む開環ホルマザン化合物を生成する方法であって、前記テトラゾリウム化合 物をアルブミンと相互作用させ、テトラゾリウム化合物−アルブミン相互作用生 成物を、pH6〜10の水溶液中で還元剤を用いて還元するステップを特徴とす る方法。
- 2.前記核が、それ自体が環系上に置換基を有し得るベンゾチアゾリル、スチリ ルまたはフタルヒドラジジルから選択される1つ以上の置換基またはかかる基の 組合せによって置換されていることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 3.前記テトラゾリウム化合物が、2−(2′−ベンゾチアゾリル)−5−スチ リル−3−(4′−フタルヒドラジジル)−テトラゾリウム(BSPT)のロイ コ形態の塩であることを特徴とする請求項2に記載の方法。
- 4.試料中のヒトまたは哺乳動物アルブミンをアッセイする方法であって、アル ブミンと相互作用し得るテトラゾリウム塩を、pH6〜10の水溶液中で試料の 存在下に還元剤と反応させてホルマザンを生成し、生成されたホルマザンの存在 及び/または量を前記試料中のアルブミンの存在及び/または量と関係づけるこ とを特徴とする方法。
- 5.試料中の還元物質をアッセイする方法であって、アルブミンと相互作用し得 るテトラゾリウム塩を、pH6〜10の水溶液中でアルブミンの存在下に試料と 反応させ、生成されたホルマザンの存在及び/または量を前記試料中の還元物質 の存在及び/または量と関係づけ、前記テトラゾリウム塩の使用量が、前記試料 中の還元物質によって還元されると推定される量より過剰であることを特徴とす る方法。
- 6.前記還元物質がアミノフェノール、NADHまたは補酸素Aであることを特 徴とする請求項5に記載の方法。
- 7.還元物質が形成される化学反応に関与する化合物をアッセイする方法であっ て、形成された前記還元物質を請求項5に記載の方法を使用してアッセイし、次 いでそれを該化合物の存在及び/または量と定量的に関係づけることを特徴とす る方法。
- 8.前記アッセイされるべき化合物がそれ自体還元物質に変換されることを特徴 とする請求項7に記載の方法。
- 9.前記アッセイされるべき化合物が、還元物質p−アミノフェノールに変換さ れるパラセタモール(p−ヒドロキシアセトアニリド)であることを特徴とする 請求項8に記載の方法。
- 10.前記アッセイされるべき化合物以外の1種以上の関与試薬が還元物質に変 換されることを特徴とする請求項7に記載の方法。
- 11.前記アッセイされるべき化合物が、アセチルCo−Aが関与する反応にお いてアセチル化され、還元物質Co−Aに変換されるクロラムフェニコールもし くはチアムフェニコールまたはゲンタマイシンであることを特徴とする請求項1 0に記載の方法。
- 12.前記還元剤がNADHであることを特徴とする請求項4に記載の方法。
- 13.前記還元剤が、ジチオトレイトール、メルカプトエタノール、システイン またはアミノフェノールであることを特徴とする請求項4に記載の方法。
- 14.前記テトラゾリウム塩の濃度が10μM〜100μMの範囲にあり、還元 剤の濃度が1μM〜100mMの範囲にあることを特徴とする請求項4に記載の 方法。
- 15.前記テトラゾリウム塩が、それ自体が環系上に置換基を有し得るベンゾチ アゾリル、スチリルまたはフタルヒドラジジルから選択される1つ以上の置換基 またはかかる基の組合せによって置換されている核を有するものであることを特 徴とする請求項4から14のいずれか一項に記載の方法。
- 16.前記テトラゾリウム塩がBSPTの塩であることを特徴とする請求項15 に記載の方法。
- 17.前記アッセイされるべきアルブミン、還元物質または化合物(適宜)が体 液中に含まれていることを特徴とする請求項4から14のいずれか一項に記載の 方法。
- 18.前記体液が血清であることを特徴とする希求項18に記載の方法。
- 19.前記テトラゾリウム塩、還元物質またはアルブミン(適宜)及びpH緩衝 液が、アルブミンまたは還元剤(適宜)を含有する液体試料に暴露される固相支 持体上に固定されていることを特徴とする請求項4から14のいずれか一項に記 載の方法。
- 20.テトラゾリウム塩、還元剤またはアルブミン(適宜)及びpH緩衝液がそ の上に固定されており、請求項19に記載の方法に使用するのに適していること を特徴とする固相支持体。
- 21.(i)アルブミンと相互作用し得るテトラゾリウム塩、(n)pH緩衝液 、及び(lii)還元剤を含む別個の溶液を組み合わせて含むことを特徴とする 請求項4に記載の方法を使用するアルブミンアッセイのためのアッセイキット。
- 22.前記テトラゾリウム塩が、それ自体が環系上に置換基を有し得るベンゾチ アゾリル、スチリルまたはフタルヒドラジジルから選択される1つ以上の置換基 またはかかる基の組合せによって置換されている核を有するものであることを特 徴とする請求項21に記載のアッセイキット。
- 23.前記テトラゾリウム塩がBSPTの塩であることを特徴とする請求項22 に記載のアッセイキット。
- 24.(i)アルブミンと相互作用し得るテトラゾリウム塩、(ii)緩衝液、 及び(iii)アルブミンを含む別個の溶液を組み合わせて含むことを特徴とす る請求項5または7に記載の方法を使用する還元物質または化合物(適宜)のア ッセイのためのアッセイキット。
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