JPH04504467A - アルブミン―テトラゾリウム相互作用を使用するアッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 アルブミン−テトラゾリウム　互　るアッセイ本発明は、テトラゾリウム化合物 を着色ホルマザンに還元する改善された方法と、この方法を分析物質（ｌｎ＠１ ｙｔｅｓ）、特にアルブミンのアッセイ（即ち検出及び／または定量分析）に使 用することとに係わる。

テトラゾリウム塩はカチオン性テトラゾリウム核：を含んでおり、これが還元に よって開裂されると、開環基：を含むホルマザンが生成される。

テトラゾリウム塩は多くは無色であるが、ホルマザンが生成されると、ホルマザ ン基は強力な着色発色団であるので色の変化を惹起する。従って生成されたホル マザンの存在及び／または量は、例えば５０５〜６６０ｎｍの範囲、特に５９０ ｎｍ近傍における吸収変化を観察することにより目視または比色分析によって都 合良く検出することができる。一般に弱還元荊は、タンパク質性物質の不在下で はテトラゾリウム塩をホルマザンに還元するのみである。この還元時の色変化は 、例えば特許第ＷＯ３８１０８８８２号に記載のごときアッセイ方法に使用する ことができる。

アルブミンは、１つの形態においては相対分子量６７０００を有し、５８４個の アミノ酸単鎖からなるタンパク質である。アルブミンは、他のどの単一のタンパ ク質よりも高い濃度でヒト血清中に存在する。血清中のアルブミンの主な機能と しては、浸透圧を維持することと、ビリルビンのような代謝物、脂肪酸、カルシ ウムのような無機化合物、ホルモン及び多くの薬剤のための担体タンパク質とし て作用することとを挙げることができる。更にアルブミンはアミノ酸源をも提供 する。　。

幾つかの理由により、アルブミンは臨床生化学検査室において分析されることが 多い１例えばアルブミンは、肝疾患の指標として使用されたり、アルブミン置換 療法における必須要因であったり、未結合（未抱合）ビリルビンのレベルを指示 できたり、骨髄種の症例を指示できたり、栄養療法レジンに使用することもでき る（Ｗｈｉｃｈｅｒ及び５ｐｅｎｃｅ　ｒ、Ａｎｎ、ＣＩ　ｉ　ｎ、Ｂ　ｉ　ｏ ｃｈｅｍ、２４５７２（１９８７））。

血清アルブミンを定量的に測定する方法としては幾つがが公知である。血清アル ブミンは、電気泳動によってまたは免疫学的方法によって測定することができる 。しがしながら最も一般に使用されている方法の１つは、ブロモクレゾールグリ ーン（ＢＣＧ）（Ｒｏｄｋｅｙ、Ｆ、Ｌ、、Ｃ１ｊｎ、ｃｈｅｍ、よユ　４７８ （１９６５））またはブロモクレゾールパープル（ＢＣＰ）（Ｌｏｕｄｅ　ｒｂ ａｃｋ、Ａ、。

Ｍｅａ　Ｉｅｙ、Ｅ、Ｈ，、＆Ｔａｙｌｏｒ、Ｎ、Ａ、、ＣＩ　ｉｎ、Ｃｈｅｍ 、１４　７９３（１９６８））のいずれがを使用する染料結合に基づくものであ る。ブロモクレゾールグリーン法は、高アルブミン濃度においては回収量が低く 、また低アルブミン濃度においては回収量が高（（Ｗｅｂｓｔｅｒ、Ｄ、、Ｂｉ ｇｎｅｌ　ｌ、Ａ、Ｈ，Ｃ，＆Ａｔｗｏｏｄ。

Ｅ、Ｃ，、Ｃｌ１ｎ、Ｃｈｅｍ、Ａｃｔａ、５３　１０１（１９７４））、一般 に非特異的である（Ｓｌａｔｅｒ、Ｌ、、Ｃａｒｔｅｒ、Ｐ、Ｍ、＆Ｈｏｂｂｓ 、Ｊ、Ｒ，，Ａｎｎ、Ｃｈｉｎ、Ｂｉｏｃｈｉｍ、上ユ　３３（１９７５））、 ブロモクレゾールパープルに基づく方法は一般により特異的である（Ｐｆｎｎｅ 　ｌ　ｌ、Ａ、Ｅ、＆Ｎｏｒｔｈａｍ、Ｂ、Ｅ、。

Ｃｌ　ｉ　ｎ、Ｃｈｅｍ、２４　８０（１９７８））、Ｌかしながらブロモクレ ゾールパープルは種間のアルブミン特異性を示さず、多くのカリブレーターは、 重要なヒトアルブミンよりずっと低い吸収しか示さないウシまたはウマいずれか のアルブミン基準を含む。更にヘパリンは干渉すると報告されており（Ｐｅｒｒ ｙ、Ｂ、Ｗ、＆Ｄｏｕｍａｎ、Ｂ、Ｔ、。

Ｃ１ｉｎ、Ｃｈｅｍ、　１５１５２０（１９７９））、従ってヘパリン化血液の 使用は除外される。ビリルビンも干渉すると考えられている。

従って、着色生成物の形成が試料中に存在し得る他の成分の干渉を受けることな くアルブミンの存在及び濃度に応答していることに基づく方法は、実用的に極め て有利となろう。本発明の目的は、上述の欠点を有さず、着色生成物を生成する 作業によるアルブミンの定量化に使用し得る新規の方法を提供することである。

本発明の他の目的及び長所は以下の説明から明らかとなるであろう。

本発明の第１の態様によれば、カチオン性核：を含むテトラゾリウム化合物を還 元し、基：を含む開環ホルマザン化合物を生成する方法は、テトラゾリウム化合 物をアルブミンと相互作用させ、テトラゾリウム化合物−アルブミン相互作用生 成物をｐＨ６〜１０の水溶液中で還元剤を用いて還元するステップを特徴とする 。

本発明は、弱還元剤はアルブミンの不在下且つ１０以上のｐＨでのみ多くのテト ラゾリウムを還元し得るが、本発明のより低い範囲のＰＨにおいては、アルブミ ンとの相互作用によりテトラゾリウム塩の還元が実質的に増強されるという予想 外の発見に基づく０本発明の方法は特に、２−（２′−ベンゾチアゾリル）−５ −スチリル−３−（４°−フタルヒドラジジル）−テトラゾリウム（本明細書中 “ＢＳＰＴ”と略記する）のロイコ形態、特に塩酸塩の還元に適用し得る。

ＢＳＰＴはテトラゾリウムカチオン： を含む、テトラゾリウム塩とアルブミンとの相互作用は、テトラゾリウム塩の着 色ホルマザン染料への還元作用を増強、加速または触媒する結果を与えるもので ある１本発明の方法におけるテトラゾリウム塩とアルブミンとの相互作用の厳密 な特性は完全には理解されていないが、この相互作用は塩とアルブミンとの間の 複合体形成を含み得ると考えられる。相互作用及び／または複合体形成は、テト ラゾリウム核上の置換基の存在から生じ得る。従って本発明の方法は、その核が 、ＢＳＰＴ中に存在する１つ以上の置換基、即ちそれ自体が環系上に１換基を有 するベンゾチアゾリル、スチリルもしくはフタルヒドラジジル基またはこれらの 基の組合せによって置換されているテトラゾリウム塩に適用し得る。

多くの還元剤が本発明の方法に使用するのに適しているが、弱還元剤を使用する のが好ましい、適していると判明している還元剤の例としてはジチオトレイトー ル（“ＤＴＴ″）、メルカプトエタノール（例えばベータメルカプトエタノール ）、システィン、ニコチンアミドアデニンジヌクに好ましい還元剤はＮＡＤＨに コチンアミドアデニンジヌクレオチドの還元形’Ｉりである。

還元剤とテトラゾリウム塩との間の電子伝達の速度を増強するために、本発明の 方法の反応媒質中に電子伝達体を使用することもできる。好ましい電子伝達体は ツェナジニウム塩、即ちカチオン性核二 〔式中、Ｒは水素またはアルキルである〕を含む化合物である。好ましいツェナ ジニウム塩はメトキシ−Ｎ−メチルツェナジニウムメチルサルフェート（“ＭＰ ＭＳ”　）、即ち であるが、他の適してはいるがやや好ましくないツェナジニウム塩としては、ツ ェナジニウムメトサルフェート（“ＰＭＳ”　）及びツェナジニウムエトサルフ ェート（ＰＥ５２）を挙げることができる。

ｐＨを６〜１０に維持し得る任意のｍＷ液を使用することができるが、好ましい 緩衝液は、トリスしドロキシメチルアミノメタンＨＣＩ（“Ｔｒｙｓ−ＨＣＩ” ）である。

溶液の好ましいｐＨは８．５である。

界面活性剤は生成されたホルマザンの溶解を助成するので、本発明の方法の反応 溶液中には界面活性剤を含むことも好ましい、好ましい界面活性剤は非イオン性 界面活性剤、特にポリオキシエチレンソルビトールエステル、なかでもＴｗｅｅ ｎ　８０（登録商標）である。

テトラゾリウム化合物の還元及びその結果のホルマザン形成の程度は、反応溶液 中に存在するアルブミン及び／または還元剤の量に定量的に関係し、従ってこれ ら２つのうち１つが反応における制限因子となると、即ち他の全ての反応物質を 過剰に存在させると、アルブミンまたは還元剤に対するアッセイのベースとして 本発明の方法を使用することができる。

従って第２の態様において、本発明は、アルブミンと相互作用し得るテトラゾリ ウム塩を、ｐＨ，６〜１０の水溶液中で試料の存在下に還元剤と反応させてホル マザンを生成し、生成されたホルマザンの存在及び／または量を試料中のアルブ ミンの存在及び／または量と関係づけることからなる、試料中のヒトまたは哺乳 動物アルブミンをアッセイする方法を提供する。

アルブミンと相互作用した後にｐＨ６〜１０中で弱還元剤によって（臨床分析に 容認され得る時間内に）実質的に還元され得る他のテトラゾリウム塩を使用する こともできるが、好ましいテトラゾリウム塩はＢＳＰＴ、特にその塩酸塩、また は、その核が、それ自体が環系上に置換基を有し得る前述のごときＢＳＰＴ中に 存在する１つ以上の置換基またはかかる基の組合せで置換されている他のテトラ ゾリウム塩である。

上記アルブミンアッセイ方法は、試料液が水溶液となっていなくとも、そこに含 まれるアルブミンの少なくとも一部分が溶解して必要な水溶液を形成し得るとい う条件で、アルブミンを含むと考えられるいかなる試料に使用するのにも適して いる。即ち該方法は、アルブミンを含むと考えられる水性試料、特に体液のよう な生物学試料、なかでも何の前処理もなく直接使用し得る血清、または尿などの アッセイに最も適している。

該アッセイ方法を実施する際には、反応混合物中に存在させるテトラゾリウム塩 及び還元剤の量は、存在するアルブミンの量が制限因子となるように、試料中の アルブミンと相互作用すると推定される量より過剰であるのが望ましい。

本発明のアルブミンアッセイ方法に適当で好ましい反応条件及び試薬は、還元剤 の選択、電子伝達体の使用、緩衝液及びＰＨ１並びに界面活性剤の使用など本発 明の第１の態様に照らして上述したものと同様である。これらのパラメーターを 下記の表１にまとめて示す。

表１ テトラゾリウム塩の濃度　ｉｏｐｍ−１０ｈＨ７５−９５ｕＮ還元剤の濃度　１ ｕＨ−１００ｍＭ　Ｏ，０５−０，２ｍＭ電子伝達体の濃度　１μＮ−１＠Ｈ５ ＆１Ｍ−０，５ｍ１４ｐＨＩｌ［衝液（７）濃度ｔｍＭ　−ＬＭ　５０−１５０ ｍＭ界面活性剤の濃度（ｗ／ｖ）　０．０１−５％　０．２−０．５％温度　５ −６０℃　２０−３７℃ 上記条件下で、テトラゾリウム塩の還元は、アッセイが臨床用途に都合の良い時 間スケールである数分の間に実施されるのに十分に迅速に行われる。

本発明の方法は臨床的に有意なレベル以下のアルブミンレベルに高感度を示し、 比色分析は、元の血清試料の約１００　ｍ　ｇ　／　ｍ　１までの初期アルブミ ンレベルと直線関係を有する。血清自体は測定に使用される範囲の波長において 実質的に吸収しないので、通常はブランク試料は必要でない、この方法はアルブ ミンに特異的と見られ、血清試料を前処理する必要もなく、実質的に干渉を受け ることもない。

本発明のアルブミンを測定する方法は多くの用途を有するが、とりわけ臨床化学 の分野において迅速で且つ日常的な分析方法が必要とされる場合に特に有効であ る。他の用途としては、アルブミン生産における品質管理測定、他の血液製剤中 のアルブミン含有量の評価及びアルブミンの構造研究を挙げることができる。

従って第３の態様において、本発明は、アルブミンと相互作用し得るテトラゾリ ウム塩を、ｐＨ６〜１０の水溶液中でアルブミン存在下に試料と反応させ、生成 されたホルマザンの存在及び／または量を試料中の還元物質（還元剤）の存在及 び／または量と関係づけることからなる試料中の還元物質をアッセイする方法で あって、使用するテトラゾリウム塩の量が試料中の還元物質によって還元される と推定されるより過剰の量である方法を提供する。

上記還元物質のアッセイ方法に適当で好ましい反応条件及び試薬は、テトラゾリ ウム塩の選択、電子伝達体の使用、Ｍｉｌ液及びｐＨ，並びに界面活性剤の使用 など本発明の第１及び第２の態様に照らして上述したものと同様である。

この方法の反応溶液のパラメーターは、試料中の還元物質のおおよその濃度を前 置て概算し得るならば１表１に記載の範囲にあるようにすることが望ましい、最 高約１００ｍｇ　／　ｍ　Ｉまでのアルブミン濃度が適当であると思われる。

上記還元物質アッセイ方法は、多種の化学的還元物質をアッセイするのに使用す ることができるが、例えばアミンフェノール、ＮＡＤＨまたは補酵素Ａ（Ｃｏ− Ａ）といった生化学的臨床または診断に重要な還元物質のアッセイに特に適して いる。該方法を使用し、血清、尿などの体液試料中の前記還元物質をアッセイす ることができる。

更なる変形態様として、還元物質アッセイ方法は、本発明の方法によってアッセ イされ且つ化合物の存在及び／または量と関係づけされ得る還元物質が形成され る化学反応に関与し得る化合物をアッセイするのに使用することもできる。

このような反応においてアッセイされるべき化合物はそれ自体が還元物質に変換 され得る０例えば薬剤バラセタモール（ｐ−ヒドロキシアセトアニリド）は、例 えばアリールアシルアミダーゼ酵素を使用し良く知られた反応で還元物質バラ− アミノフェノールに定量的に変換することができる１次いで、形成されたバラ− アミノフェノールをアッセイし、パラセタモールの量と関係づけることができる 。

或いはこのような反応において、該化合物以外の１種以上の関与試薬を還元物質 に、存在する該化合物の量に関係する量で変換することもできる。

例えば、最終的にＣｏ−Ａに変換されるアセチルＣｏ−Ａをアセチル化試薬とし て使用する反応において、抗生物質であるクロラムフェニコール及びチアムフエ ニコールやゲンタマイシンをアセチル化することもできる。かかる反応は、それ ぞれ酵素クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（“ＣＡＴ”）また はゲンタマイシンアセチルトランスフェラーゼ（“ＧＡＴ”）の媒介下で容易に 進行する。各ケースで、生成されたＣｏ−Ａの存在及び／または量を抗生物質の 存在及び／または量と定量的に関係づけることができる。

これら本発明のアッセイ方法は、多数の方法で手作業でまたは自動化して実施す ることができる１例えば、前述のｐＨにおいて少なくとも試料と、テトラゾリウ ム塩と、適宜還元剤またはアルブミンとを含有し、必要によっては前述のごとき 他の試薬も含有する水溶液を作製し、適当な温度でインキュベートすることがで きる０次いで発色を検出し、例えば基準値と比較したりまたは比色分析法によっ て測定する０反応溶液は水性であるが、全ての試薬、特にテトラゾリウム塩の溶 解を助成するために別の水混和性溶剤を含有することも必要となり得る。このよ うな溶剤の１つの好ましい例はジメチルホルムアミド（“ＤＭＦ”）である。

このようにして本発明の方法を実施する上で、試薬及び試料を混合する順序は重 要ではないと考えられる。

或いは、テトラゾリウム塩、適宜還元剤またはアルブミン、緩衝液などの適当な 試薬は、例えば含浸、吸着または吸収によって面相支持体上に固定することもで きる０次いで、適宜アルブミンまたは還元剤を含む液体試料に暴露して支持体に 色変化を惹起し、それを検出することもできる。

本発明のアッセイ方法を実験用及び臨床用途に都合の良いようにするために、更 に本発明は、本発明の方法を実施するための上述の試薬の既製品を１種以上組み 合わせて含むアッセイキットをも提供する。例えばキットは、アルブミンと相互 作用し得るテトラゾリウム塩、緩衝液、及び適宜還元剤またはアルブミンを本発 明の方法に容易に使用し得るのに適当な濃度で、また必要によっては前述したよ うな界面活性剤、電子伝達体などの他の試薬をそれぞれに含む個別溶液からなり 得る。或いはこのようなキットは、適当な試薬がその上に固定されている固相支 持体を含むこともできる。更にキットは、色比較チャートを含み得る基準物質及 び操作手順書をも含む得る。このような試験キットにおいて、試薬は最低で３０ 日間保管しても安定であることが判っているが、長期保存時の安定性のためには 、テトラゾリウム塩の酸性溶液、例えばｐＨ３〜６の０．０１−０．２Ｍ塩酸、 リンゴ酸または特にクエン酸の溶液を製造することが望ましい。本発明の方法を 実施するかかるキットを製造する方法は当業者には明らかであろう。

以下、図面を参照し本発明を示す実施例を説明する。

図１は、ＢＳＰＴ−アルブミン相互作用生成物の還元における濃色変化を示す。

図２は、実施例１の方法について５９０ｎｍにおける吸収対アルブミン濃度を示 す。

図３は、保管時の試薬の安定性を示す。

図４は、手作業で実施した本発明の方法と従来方法との比較を示す。

図５は、自動化装置で実施した本発明の方法と従来方法との比較を示す。

図６は、本発明の方法と従来の免疫学的方法との比較を示す。

図７は、吸収対Ｃｏ−Ａ濃度を示す。

図８は、吸収対パラセタモール濃度を示す。

図９は、吸収体クロラムフェニコール濃度を示す。

１　アルブミン　餐　ット　Ｉ ■ 駁粂人＝ テトラゾリウム塩の標準原液二 （ｉ）ＢＳＰＴ塩酸塩＋１０．５ｍｌのジメチルホルムアミドに１０ｍｇを溶解 したもの ＜１ｉ）９．４ｍｌ　１２ｍｍｏｌ／Ｌのクエン酸テトラゾリウム塩の作業標準 液 （ｉ）標準原液１８ｍ１を、７６ｍ１の１２ｍｍ。

１／Ｌクエン酸、４ｍｌの１５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０及び２ｍｌの１ｍｍ ｏｌ／ＬＭＰＭＳで希釈したもの ＫＩ上： ２０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ、ｐＨ８，５にム工： ５ｍｍｏｌ／Ｌ　ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（還元形態） １迭 １．０．５ｍｌの試薬Ａに、０．５ｍｌの試薬Ｂと４０μｌの試薬Ｃとを加える 。

２、室温で３分間、平衡させる。

３、試料５０μｌを加え、よく混合する。

４．１分後に５９０ｎｍにおける吸収を読取る。

種々の初期濃度のアルブミンによって与えられたＡ５９０ｎｍにおける結果は図 ２の較正曲線において示される。

発した色は少なくとも１時隔安定であった。

２　ルブ々ン　・・　！■ ■ ！！ｃＪＬＡ： １２ｍｍｏｌ／Ｌ　クエン酸 ０．１８ｍｍｏｌ／Ｌ　ＢＳＰＴ塩酸塩０．５ｍｍｏｌ／ＩＬ　ＭＰＭＳ 区１１： ２０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ、ｐＨ８，５３５％ｖ／ｖ　Ｔｗｅｅｎ　 ８０ １夷旦： ２．５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮＡＤＨ １迭 １．５０ｍ１の試薬Ａ、５０ｍ１の試薬Ｂ及び４．０ｍｌの試薬Ｃを加えること により作業標準試薬を調製する。この混合液は少なくとも１２時間安定である。

２．０．１ｍｌの作業標準試薬に５μｌの血清（またはアルブミンを含む試料） を加える。１分後に試薬ブランクに対する５９０ｎｍにおける吸収を読取る。

別々に調製され保存された試薬Ａ、Ｂ及びＣは、記載の期間だけ保存された試薬 から調製した作業標準試薬に種々の濃度のアルブミンを加えた結果である図３の ５９０ｎｍにおける吸収の安定性によって示されるように、最低３０日間は安定 である。

の　−　い　の　ルブ々ンア・・セイ 下記の表２は、ＮＡＤＨ以外の還元剤を記載の濃度で使用した場合を示す、ホル マザン生成とアルブミン濃度との関係が直線であるアルブミン濃度の範囲も示し てあり、ＮＡＤＨも比較用基準として使用している。各ケースで、テトラゾリウ ム塩はＢＳＰＴ塩酸塩とした。

轟ユ 還元剤　濃度　直線性　Ａ３９０　色 ＩＩＮＩＩＩＩＬ　％ ＮＡＤＨ５，００−８０１，７０１００，０ＯＬ−システィン　２．５　０−５ ５　１．０５　６１．７６Ｌ−システィン　５．０　０−７０　１．５０　８８ ．２４Ｌ−システィン　１０．０　０−７０　１．５８　９２．９４メルカプト エタノール　２．５　０−６０　０．９９　５８．２４メルカプトエタノール　 ５．０　０−７０　１．４２　８３゜５３メルカプトエタノール　１０．０　０ −８０　１．４８　８７．０６ＤＴＴ　１．０　０−５０　１．０　５８．８２ ＤＴＴ　２．５　０−８０　１．６７　９８．２４ＤＴ７　５．０　０−８０　 １．６９　９９．４４　アルブミン　ッセイにお番　゛ 種々の潜在的干渉物質を含む試験試料を比較することにより、実施例１または２ のキットを使用するアルブミンアッセイへの干渉を調査した。結果は下記の表３ に示す。

表１ １浪皿分　１皮１１　９ トランスフエリン　１．６７−７．１４ｍｇ／醜１　なしクレアチニン　０．０ ５−０．３論Ｎ　なしクレアチン　０．０５−０．３　ｍＨなし尿素　０．０２ −０．３　ｍｇ／ｓｌ　僅かにありグルコース　０．３　１．５．ｓｇ／ｍｌ　 なしＭｇＣｌ２　０．３　１．５−Ｈなし ＮａＣｌ　１００−２００　ｓＮ　なしＫＣＩ　２−８　輪Ｎ　なし アスコルビン酸　１０ｄｌ　なし アルコルビン酸塩　１０１１Ｍ　なし ビリルビン　０．００１−０．３　ｍｇ／＋ｓｌ　なしヘパリン　３−２５　単 位／１　なし 液！春１　１皮思１　玉捷 すリチル酸　０゜１　−０．４醜ｇ／＠１　なしテオフィリン　０．１　−０． ５１１１１／＠Ｉ　なしアセトアミノフェン　０．０２−１．０　ｍｇ／ｍｌ　 なしリドカイン　０．００２−０．０１ｉ＋ｇ／＋ｓｌ　なしバルビタール　０ ．０１−０．１−ｇ／輸１　なしカフェイン　０．１　細ｇ／輸１　なし直丘威 溌　１皮藍朋　玉捗 トランスフェリン　１．６７−２．８６ｍｇ／請１　なしクレアチニン　５Ｇ　 −３００ｅｇｇ／ｍｌ　なし１痰叉Ｚバグ１　濃度［ｌ１ｄ　ジ グロブリンウシ　２０　なし ウシグロブリン　２０　なし インシュリンラン　２０　なし １渡叉Ｚバヱ厘　１工［１！ＬＪＬ、償Ｕ　吸収ぶ男匝蛙アルブミン（対照）　 ５０　０．５４１インシユリンウシ　２０　０．５５６ グロブリンウシ　２０　０．５４２ ウシグロブリン　２０　０．５４２ 上記したように、全ての血液成分は干渉を示さなかった。

調査した濃度は、血液に通常認められる範囲以上であった。

凝固を段階化するためにヘパリンを濃度６．７単位／ｍｌで血液に加えた。

認識可能な干渉は尿素のみでみられた。

５　“の”アルブタンアッセイ　゛　の　１アルブミン測定のＢＳＰＴ法を、病 院内で一般に使用されている他の方法と比較した。これらの方法は、ブロモクレ ゾールグリーン（ＢＣＧ）に基づく染料結合方法と免疫学的方法とであった。全 部で７１個の病因学血清試料を、ＢＳＰＴ法を使用して手作業で試験し、自動化 ＢＣＧ法と比較した。これらの試料においてアルブミンの量を約１５〜６０　ｍ 　ｇ　／　ｍ　１の範囲で変化させた０次いでこのデータを統計的に解析し、Ｂ ＳＰＴ法とＢＣＧ法との間に優れた相関を示唆する回帰式Ｙ＝９．２６８＋０． ７Ｘを得た。このデータは手作業によるＢＳＰＴ法及びＢＣＧ法の使用に係わっ ており、この結果は図４に示されている。

上記使用した方法（ＢＳＰＴ及びＢＣＧ）は自動化装置にもおいても使用するこ とができる。“ＭｕｌｔｉｓｔａｔＩＩＩ　ｐ　ｌ　ｕ　ｓ”における自動化作 業としてＢＳＰＴ法及びＢＣＧ法を使用し同様の解析を実施した。この結果は図 ５に示されている。

更にＢＳＰＴ法は、図６に示したように免疫学的方法ともよく相関する（結果の データは示さない）。

６　Ａの　ツセ ＢＳＰＴ塩酸塩、アルブミン、ＭＰＭＳ、Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣ１＠＠液及びＴｗ ｅｅｎ−８０を表１に示した範囲内の濃度で含有する溶液を調製した。このアリ コートにＣｏ−Ａを、Ｃｏ−Ａの終濃度が０．２５ｍＭまでの濃度範囲で加えた ０図７は、この範囲内で５９０ｎｍにおける吸収がＣｏ−Ａ濃度に関して直線で あることを示している。

７　バーセタモニ反曵Ｉユ±Ａ 酵素アリールアシルアミダーゼを使用し公知の反応でパラセタモールを定量的に 清澄化し、ｐ−アミノフェノールを形成した。ＢＳＰＴ塩酸塩、アルブミン、Ｍ ＰＭＳ、Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ＠＠液及びＴｗｅｅｎ−８０を表１に示した範囲内の 濃度で含有する溶液を調製した。このアリコートにｐ−アミノフェノールを加え た。４−アミンフェノール濃度対５９０ｎｍにおける吸収のグラフは、ｐ−アミ ンフェノールの終濃度３．０ｍＭまでの濃度における吸収変化を示している。こ れは、図８から判るように、バラセタモール濃度対５９０ｎｍにおける吸収は濃 度２．０ｍＭまで優れた直線関係を示すと関係づけることができよう。

８　ロームフェニコールのアッセイ アセチルＣｏ−Ａ及び酵素ＣＡ、Ｔを使用し、公知の反応によってクロラムフェ ニコールをアセチル化した。この結果、当初存在したクロラムフェニコールの量 に定量的に関係する量のＣｏ−Ａが生成された。生成されたＣｏ−Ａを実施例６ の作゛業手順を使用しアッセイした０図９に示したように、クロラムフェニコー ル濃度に対する５９０ｎｍにおける吸収は、１ＯＮ２０μＭのクロラムフェニコ ールの範囲で直線であった。

呵（ｑ尺 ８〔６ ＩＭＭＵＮＯ 国際調査報告 国際調査報告 ＧＢ　９０００５５２ ＳＡ　３６０８９

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. １．カチオン性核： ▲数式、化学式、表等があります▼ を含むテトラゾリウム化合物を還元し、基：▲数式、化学式、表等があります▼ を含む開環ホルマザン化合物を生成する方法であって、前記テトラゾリウム化合 物をアルブミンと相互作用させ、テトラゾリウム化合物−アルブミン相互作用生 成物を、ｐＨ６〜１０の水溶液中で還元剤を用いて還元するステップを特徴とす る方法。
2. ２．前記核が、それ自体が環系上に置換基を有し得るベンゾチアゾリル、スチリ ルまたはフタルヒドラジジルから選択される１つ以上の置換基またはかかる基の 組合せによって置換されていることを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. ３．前記テトラゾリウム化合物が、２−（２′−ベンゾチアゾリル）−５−スチ リル−３−（４′−フタルヒドラジジル）−テトラゾリウム（ＢＳＰＴ）のロイ コ形態の塩であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
4. ４．試料中のヒトまたは哺乳動物アルブミンをアッセイする方法であって、アル ブミンと相互作用し得るテトラゾリウム塩を、ｐＨ６〜１０の水溶液中で試料の 存在下に還元剤と反応させてホルマザンを生成し、生成されたホルマザンの存在 及び／または量を前記試料中のアルブミンの存在及び／または量と関係づけるこ とを特徴とする方法。
5. ５．試料中の還元物質をアッセイする方法であって、アルブミンと相互作用し得 るテトラゾリウム塩を、ｐＨ６〜１０の水溶液中でアルブミンの存在下に試料と 反応させ、生成されたホルマザンの存在及び／または量を前記試料中の還元物質 の存在及び／または量と関係づけ、前記テトラゾリウム塩の使用量が、前記試料 中の還元物質によって還元されると推定される量より過剰であることを特徴とす る方法。
6. ６．前記還元物質がアミノフェノール、ＮＡＤＨまたは補酸素Ａであることを特 徴とする請求項５に記載の方法。
7. ７．還元物質が形成される化学反応に関与する化合物をアッセイする方法であっ て、形成された前記還元物質を請求項５に記載の方法を使用してアッセイし、次 いでそれを該化合物の存在及び／または量と定量的に関係づけることを特徴とす る方法。
8. ８．前記アッセイされるべき化合物がそれ自体還元物質に変換されることを特徴 とする請求項７に記載の方法。
9. ９．前記アッセイされるべき化合物が、還元物質ｐ−アミノフェノールに変換さ れるパラセタモール（ｐ−ヒドロキシアセトアニリド）であることを特徴とする 請求項８に記載の方法。
10. １０．前記アッセイされるべき化合物以外の１種以上の関与試薬が還元物質に変 換されることを特徴とする請求項７に記載の方法。
11. １１．前記アッセイされるべき化合物が、アセチルＣｏ−Ａが関与する反応にお いてアセチル化され、還元物質Ｃｏ−Ａに変換されるクロラムフェニコールもし くはチアムフェニコールまたはゲンタマイシンであることを特徴とする請求項１ ０に記載の方法。
12. １２．前記還元剤がＮＡＤＨであることを特徴とする請求項４に記載の方法。
13. １３．前記還元剤が、ジチオトレイトール、メルカプトエタノール、システイン またはアミノフェノールであることを特徴とする請求項４に記載の方法。
14. １４．前記テトラゾリウム塩の濃度が１０μＭ〜１００μＭの範囲にあり、還元 剤の濃度が１μＭ〜１００ｍＭの範囲にあることを特徴とする請求項４に記載の 方法。
15. １５．前記テトラゾリウム塩が、それ自体が環系上に置換基を有し得るベンゾチ アゾリル、スチリルまたはフタルヒドラジジルから選択される１つ以上の置換基 またはかかる基の組合せによって置換されている核を有するものであることを特 徴とする請求項４から１４のいずれか一項に記載の方法。
16. １６．前記テトラゾリウム塩がＢＳＰＴの塩であることを特徴とする請求項１５ に記載の方法。
17. １７．前記アッセイされるべきアルブミン、還元物質または化合物（適宜）が体 液中に含まれていることを特徴とする請求項４から１４のいずれか一項に記載の 方法。
18. １８．前記体液が血清であることを特徴とする希求項１８に記載の方法。
19. １９．前記テトラゾリウム塩、還元物質またはアルブミン（適宜）及びｐＨ緩衝 液が、アルブミンまたは還元剤（適宜）を含有する液体試料に暴露される固相支 持体上に固定されていることを特徴とする請求項４から１４のいずれか一項に記 載の方法。
20. ２０．テトラゾリウム塩、還元剤またはアルブミン（適宜）及びｐＨ緩衝液がそ の上に固定されており、請求項１９に記載の方法に使用するのに適していること を特徴とする固相支持体。
21. ２１．（ｉ）アルブミンと相互作用し得るテトラゾリウム塩、（ｎ）ｐＨ緩衝液 、及び（ｌｉｉ）還元剤を含む別個の溶液を組み合わせて含むことを特徴とする 請求項４に記載の方法を使用するアルブミンアッセイのためのアッセイキット。
22. ２２．前記テトラゾリウム塩が、それ自体が環系上に置換基を有し得るベンゾチ アゾリル、スチリルまたはフタルヒドラジジルから選択される１つ以上の置換基 またはかかる基の組合せによって置換されている核を有するものであることを特 徴とする請求項２１に記載のアッセイキット。
23. ２３．前記テトラゾリウム塩がＢＳＰＴの塩であることを特徴とする請求項２２ に記載のアッセイキット。
24. ２４．（ｉ）アルブミンと相互作用し得るテトラゾリウム塩、（ｉｉ）緩衝液、 及び（ｉｉｉ）アルブミンを含む別個の溶液を組み合わせて含むことを特徴とす る請求項５または７に記載の方法を使用する還元物質または化合物（適宜）のア ッセイのためのアッセイキット。