JPH06505393A - 被検体を測定するための改善された方法および試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 被検体を測定するための改善された方法および試薬発明の分野 この発明は、一般的に、試料中の被検体を測定する方法、およびその方法に有用 な試薬組成物に関するものである。より特定的には、この発明は、改善された安 定性を有する試薬、および応答特性または応答曲線変化の動的幅が増大した試薬 に関するものである。

背景および先行技術 臨床化学の主な関心事は試料中の特定の被検体の定性的および定量的な測定にあ る。特に、血液、血清、尿その他の体液試料の分析に関心が持たれる。種々の被 検体の存在および／または量を測定し、続いて既定のパラメータと比較すること によって、疾病または異常状態の診断が行なわれる。

体液試料の定量分析に関する文献は多数あるが、例えばこの分野で、血液、血清 、尿その他の試料中のグルコース、コレステロール、クレアチン、サルコシン、 尿素その他の物質の測定について研究されてきた。

こうした定量分析を行なうためには、多くのタイプの検定法がある。検定の１タ イプに、一連の反応に基づいたものがある。最初の反応は被検体とこの被検体に 特異的な酵素との反応である。

この反応において、酵素は被検体を、電子１こを失わせることによって”酸化” する。続く反応において、その電子はあるメディエータ−に受容され、すなわち このメディエータ−は還元される。

さらにこの還元されたメディエータ−が種々の指示薬系で使用されて、被検体の 存在および濃度が測定される。

こうした指示薬系の１つが、共通に譲渡された米国特許第４９２９５４５号に記 載されている。この系においては、被検体から失われた電子によって、フェリシ アン化物が還元されて、フェロシアン化物になる。そのフェロシアン化物が鉄（ ＩＩＩ）化合物と結合して呈色する。変色の出現およびその度合いが、それぞれ 試料中の被検体の存在および濃度の指標となる。

変色の度合いは、反射率光度計により測定することができる。

光度計は通常、反射率の変化を被検体濃度に換算するための”ルック−アップ（ ｌｏｏｋ−ｕｐ）”表またはアルゴリズムを内部に備えた測定器の一部分となっ ている。

他の同様の系では、メディエータ−として、フェロセンまたはその類似体を使用 している。

被検体の存在または濃度を測定するのに還元されたメディエータ−を使用する別 の系が、共通に譲渡された係属中の米国特許出願ＵＳＳＮ　０７／４５１６７１ 　（１９８９年１２月１５日出願）に記載されている。この系においては、還元 されたメディエータ−が電流を通すことによって再酸化され、一定時間後の電流 の減少度を測定して、被検体の濃度の測定に使用する。

いずれの系においても、メディエータ−を含む試薬の安定性の向上が、常に要求 される。安定性は、実用上有効な保存期間を得るために必要である。米国特許第 ４９４９５４５号に記載された系においても、光反射率の変化をある幅で測定す る他の系におけると同様に、その幅を増大させることが望まれる。幅が大きくな るほど、測定される反射率の変化量が増大し、つまり精度が増大被還元性メディ エータ−を含んでいる試薬の安定性の向上が、この発明の一つの目的である。

被還元性メディエータ−とこのメディエータ−の還元に応答して変色をする成分 を含んでいる試薬の光反射率の変化の幅を増大させることもまた、この発明の目 的である。

これらおよびその他の目的は、被還元性メディエータ−とともに、検定に使用す る前の試薬の安定性を高め、検定の実施中のメディエータ−の還元を事実上妨げ ないような酸化剤を含んでいる試薬組成物によって達成される。

この発明は、ある酸化剤が選択され、そしてこの選択された酸化剤がメディエー タ−の還元に応答して変色をする成分の光反射率の変化の幅を増大させるという 、驚くべき、また予期しない発見に基づいている。

被還元性メディエータ−の使用前の還元を阻止するが、検定の実施中のメディエ ータ−の還元とは首尾よく競合しないような酸化剤であれば、何でもこの発明に 使用できる。米国特許第４９４９５４５号に記載された呈色検定において、メデ ィエータ−がフェリシアン化物、指示薬が塩化第二鉄や硫酸第二鉄のような可溶 性の鉄（ＩＮ）化合物、酵素がグルコースオキシダーゼまたはコレステロールオ キシダーゼであるとき、重クロム酸ナトリウムまたはカリウムのような重クロム 酸のアルカリ金属塩が本発明の使用に適していることが、発見された。

血液中のグルコースについてのこうした呈色検定での使用に好適な試薬は、フェ リシアン化カリウム、可溶性鉄（ＩＩＩ）化合物、グルコースオキシダーゼおよ びグルコースオキシダーゼ１ｋＵあたり微量ないし約１７．５　Ｘ　１０−’ｇ 濃度の重クロム酸カリウムを含むものである。このような試薬は重クロム酸塩を 含まない同様な試薬よりも数倍の安定性を有し、問題の反射率領域の変化の動的 幅を増大させると考えられる。

この酸化剤は、指示薬の早期変色の原因と考えられる他の試薬成分中の不純物を 酸化するものと思われるが、安定性の向上に関しての酸化剤の作用機序は完全に はわかっていない。酸化剤が、メディエータ−を光、熱および湿気による還元作 用に対しては安定化するが、被検体と酵素との反応によって生成する電子による 還元作用に対しては安定化しないこと、そして驚くべきことに、酵素を全熱不活 性化しないことも考えられる。

この酸化剤が試薬用量応答曲線の動的幅を増大させる作用機序は、現在のところ 完全にはわかっていない。それは観察された作用であるが、例えば好適な実施態 様において、酸化剤は還元されたフェロシアン化物に作用して、フェロシアン化 物と鉄（ＩＩＩ）化合物が反応してプルシアンブルーを生成するのを妨げ、変色 の幅を制限するだろうと予想される。

実験によって、微量の重クロム酸塩でも試薬の安定性を改善すること、酵素１ｋ Ｕあたり１．３　Ｘ　１０−’ｇでは加温下で約１２倍安定性を増大させること 、そして酵素１ｋＵあたり１７．５　Ｘ　１０−’ｇの量でも発色を妨げずに使 用できることがわかった。

重クロム酸塩量が酵素１ｋＵあたりわずかに０．９　Ｘ　１０−’ｇでも問題の 反射率領域の動的幅を約５％ポイント増大させること、すなわちこの幅の大きさ の約１０％の増加となることもわかった。

この発明の試薬組成物は液体試料の成分の検定に実用上有用である。好ましい用 途として、Ｒａ１ｐｈ　ＭｃＣｒｏｓｋｅｙ他によりＵＳＳＮ同日付で出願され 、共通に譲渡された特許出願に記載されたような検定器具があり、ここでは試薬 が新し、い試験片の形態をなしている支持体に塗布されている。この例において は、試薬層があらかじめ定められた容量で試薬層に保持される全血と接触する。

詳細な説明および実施例 この発明の好ましい実施態様を以下の実施例によって説明するが、これらは内容 を明らかにするためのものであって、これらに限定するものではない。この発明 の範囲にある他の実施態様は、この技術分野の通常の知識を有する者にとって、 容易に想起されるであろう。

実施例１ 反射率検定におけるこの発明の利用を示すために、試験片を調製し、使用した。

塗布用物質１ｋｇあたり４−アミノ酪酸３０ｇ、硫酸第二鉄３．９ｇ、フェリシ アン化塩３６ｇおよびグルコースオキシダーゼ１０００ｋＵからなる塗布用物質 を調製した。塗布用物質のその他の不活性成分として、白色顔料Ｔ　ｉ　Ｏｔ、 ＴＷＥＥＮ−２０（非イオン性界面活性剤’）　、ＰＲＯＰＩＯＦＡＮ−７０Ｄ 　（膜形成剤）およびＮＡＴＲＯ８ＯＬ　（増粘剤）を含ませた。この物質のｐ Ｈは４．１であった。

この塗布用物質のアリコートに、重クロム酸カリウムを、下記表１ａおよびｌｂ に示すように、微量から１７．５２　Ｘ　１０−’ｇまでの濃度で添加した。ア リコートのいくつかを、さらに熱ストレス室での分解促進試験に供した。この促 進試験は、通常の保存期間を予知するために、試薬を加温するものである。

熱ストレスを加えた後、このアリコートの安定性を試験した。

酵素に特異的な被検体を含んでいる液体試料に接触させる前の試薬の変色は、不 安定性および保存期間の減少を示すものである。

種々のアリコートにおける重クロム酸塩の濃度、試験の持続時間、ストレス室の 温度および重クロム酸塩を添加しないアリコートに対する保存期間の増大の結果 を下記表１ａに示す。観察の結果、重クロム酸塩を微量添加しただけでも有意な 改善が見られること、もっと多量ではより長期にわたる安定性の改善が得られる であろうということが示された。

他のアリコートについても、正常なヒトの血液と同じ程度にグルコースを含有す る標準溶液の試料に供した。表１ｂは、種々のアリコートの重クロム酸塩濃度を 示し、発色が許容されるか妨害されるかを示している。この結果は、重クロム酸 塩はかなり高濃度になるまで、試薬の発色を妨害しないことを示している。

（本頁以下余白） 表１ａ 重クロム酸塩濃度　安定性 （ｇ／ｋＵ酵素）　（標準化） 微量　３Ｘ Ｙ ０．４　Ｘ　１０−’　５　Ｘ Ｙ １．３　Ｘ　１０−’　６　Ｘ ２Ｙ 重クロム酸塩　発色 （ｇ／ｋＵ酵素） ４．８３　Ｘ　１０−’　許容 ８．７６　Ｘ　１０−’　許容 １３．１４　Ｘ　１０−’　許容 １７．１４　Ｘ　１０−’　発色が遅延この実験は、メディエータ−１被検体に 特異的な酵素およびメディエータ−の還元型と反応して呈色する指示薬を含む試 薬に対し可溶性の重クロム酸塩を添加すると、有用な濃度範囲にわたって、酵素 を不活性化することも発色を妨げることもなく、試薬の安定性が改善されること を示している。

実施例２ 重クロム酸塩酸化剤を試薬に添加したとき、反射率変化の幅が改善されることを 示すため、試験片を調製し、使用した。

実施例１と同様に、試験片試薬を２バツチ調製した。１バツチは重クロム酸塩を 含まず、他のバッチは酵素１ｋＵあたり重クロム酸塩０．９　Ｘ　１０−’ｇ金 含有ている。それぞれをアリコートに分けて、試験片を構成している透明な担体 層に塗布する。各バッチの試薬より調製した試験片を、グルコース濃度を変えた グルコース溶液試料に供する。そして塗布面の反対側から反射率光度計でこれら の層を測定した。重クロム酸塩を含む試薬および含まない試薬についての６６０ ｎＭにおける光反射率の幅を、下記表２に示す。

（本頁以下余白） 表２ 試薬　反射率　％　反射率　％ （グルコースＯ１ｇ／ｄｌ）　（グルコース５００ｍｇ／ｄｌ）重クロム酸塩　 ５３　１８ 非含有 重クロム酸塩　５８　１８ 含有 この実験は、試薬に重クロム酸塩を添加すると、反射率変化の動的幅が５％ポイ ント増大すること、すなわちこの幅の大きさの約ｌθ％の増加となることを示し ている。

この発明は、上の記述と実施例によって、この技術分野の当業者がこの発明を実 施、使用し、実用上の最適条件を定め、他の発明および以前の技術との差異を認 めることができるように、十分明快簡潔に開示された。この発明の多くの変形お よび自明な応用はすぐに想起されるものと考えられるが、それらは下記の請求の 範囲に示される本発明の範囲内に入るものである。

補正書の写しく翻訳文）提出書 （特許法　第１８４条の８） 平成５年　８月２７日

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. １．液体試料中の被検体の存在または濃度測定に使用する吸光度変化の動的幅が 改善された試薬組成物であって、酵素、被検体と酵素との反応に応答して還元さ れるメディエーター、メディエーターの還元型と反応して組成物の光反射率をあ る幅で変化させる反応物、そしてメディエーターのこの反応に応答した還元と首 尾よく競合しない酸化剤を含む組成物。
2. ２．メディエーターが可溶性のフェリシアン化化合物、酸素がグルコースオキシ ダーゼまたはコレステロールオキシダーゼ、そして酸化剤が重クロム酸のアルカ リ金属塩である、請求の範囲１の試薬組成物。
3. ３．重クロム酸のアルカリ金属塩が重クロム酸ナトリウムまたは重クロム酸カリ ウムである、請求の範囲２の試薬組成物。
4. ４．酵素がグルコースオキシダーゼ、そして重クロム酸のアルカリ金属塩が酵素 １ｋＵあたり微量から約１７．５×１０−４ｇ濃度の重クロム酸カリウムである 、請求の範囲３の試薬組成物。
5. ５．試料中の被検体の測定に使用する吸光度変化の動的幅が改善された組成物で あって、 （ａ）被検体と特異的に反応する酵素、（ｂ）酵素と被検体との反応下で、還元 されてフェロシアン化化合物に変化する可溶性のフェリシアン化化合物、（ｃ） フェロシアン化化合物と反応して、被検体の濃度に比例して試薬組成物の吸光度 を変化させ、可視的にまたは光学的に検知できる反応生成物を生成する、可溶性 鉄（ＩＩＩ）化合物、 （ｄ）反応生成物の生成を阻害せず、組成物のｐＨを約３．０から約７．０にす る緩衝剤、そして （ｅ）フェリシアン化化合物の還元と首尾よく競合しない濃度の重クロム酸のア ルカリ金属塩酸化剤を含む組成物。
6. ６．重クロム酸のアルカリ金属塩が重クロム酸カリウムまたは重クロム酸ナトリ ウムである、請求の範囲５の組成物。
7. ７．酵素がグルコースオキシダーゼまたはコレステロールオキシダーゼである、 請求の範囲６の組成物。
8. ８．酵素がグルコースオキシダーゼ、そして重クロム酸のアルカリ金属塩が酸素 １ｋＵあたり微量から約１７．５×１０−４ｇ濃度の重クロム酸カリウムである 、請求の範囲７の組成物。
9. ９．担体に塗布された、請求の範囲１または５の組成物。
10. １０．液体試料中の被検体の存在または濃度測定に使用する、酵素、被検体と酵 素との反応に応答して還元されるメディエーター、メディエーターの還元型と反 応して組成物の吸光度をある幅で変化させる反応物を含む組成物の吸光度変化の 動的幅を改善するための方法であって、メディエーターのこの反応に応答した還 元と首尾よく競合しない酸化剤を添加することによって、吸光度変化の動的幅を 増大させる方法。
11. １１．メディエーターが可溶性のフェリシアン化化合物、酸素がグルコースオキ シダーゼまたはコレステロールオキシダーゼ、そして酸化剤が重クロム酸のアル カリ金属塩である、請求の範囲１０の方法。
12. １２．重クロム酸のアルカリ金属塩が重クロム酸ナトリウムまたは重クロム酸カ リウムである、請求の範囲１１の方法。
13. １３．酵素がグルコースオキシダーゼ、そして重クロム酸のアルカリ金属塩が酵 素１ｋＵあたり微量から約１７．５×１０−４ｇ濃度の重クロム酸カリウムであ る、請求の範囲１２の方法。
14. １４．（ａ）被検体と特異的に反応する酵素、（ｂ）酵素と被検体との反応下で 、還元されてフェロシアン化化合物に変化する可溶性のフェリシアン化化合物、 （ｃ）フェロシアン化化合物と反応して、可視的にまたは光学的に検知できる反 応生成物を生成する、可溶性鉄（ＩＩＩ）化合物、そして（ｄ）反応生成物の生 成を阻害せず、組成物のｐＨを約３．０から約７．０にする緩衝剤、を含む組成 物の吸光度の動的幅を改善する方法であって、この組成物にフェリシアン化化合 物の還元と首尾よく競合しない濃度の重クロム酸のアルカリ金属塩酸化剤を添加 することからなる方法。
15. １５．重クロム酸のアルカリ金属塩が重クロム酸カリウムおよび重クロム酸ナト リウムから選択されたものである、請求の範囲１４の方法。
16. １６．酵素がグルコースオキシダーゼまたはコレステロールオキシダーゼである 、請求の範囲１５の方法。
17. １７．酵素がグルコースオキシダーゼ、そして重クロム酸のアルカリ金属塩が酵 素１ｋＵあたり微量から約１７．５×１０−４ｇ濃度の重クロム酸カリウムであ る、請求の範囲１６の方法。
18. １８．液体試料中の、請求の範囲１または５の組成物の酵素と反応する被検体を 測定する方法であって、液体試料を請求の範囲１または５の組成物と接触させて 、この反応生成物を被検体の尺度として測定することからなる方法。
19. １９．液体試料が体液である、請求の範囲１８の方法。
20. ２０．被検体がグルコースまたはコレステロールである、請求の範囲１８の方法 。
21. ２１．液体試料中の被検体の存在を測定する方法であって、液体試料を被検体と 反応する酵素を含有する請求の範囲１または５の組成物と接触させて、試料中の 被検体の存在の指標となる反応生成物の生成を測定することからなる方法。
22. ２２．（ａ）支持担体、そして （ｂ）支持体に塗布した、請求の範囲１または５の組成物を含む試薬層、 からなる、試料中の被検体を測定するのに有効な分析要素。